JP2002504380A - ワクチン、免疫療法剤およびそれらの使用法 - Google Patents

ワクチン、免疫療法剤およびそれらの使用法

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ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルベニア
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Abstract

(57)【要約】 制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む改良されたワクチンが開示されている。改良されたワクチンにはＤＮＡワクチン、外来抗原を送達するための組換え体ワクチンおよび弱毒化生ワクチンが含まれる。個体を免疫する方法が開示されている。自己免疫疾患を患っている個体を処置する組成物および方法が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】技術分野 本発明は改良されたワクチン、免疫原に対して個体を予防的および／または治
療的に免疫化するための改良された方法、および改良された免疫療法組成物およ
び改良された免疫療法に関している。背景技術 本出願は１９９８年２月２８日に”改良されたワクチン”と題して出願された
仮出願第６０／０７６，２０７号（本明細書において援用される）に対して優先
権を請求する。免疫療法とは身体の免疫応答を調節して望まれる治療効果を与え
ることを指している。免疫療法剤とは、個体に投与された場合、望ましくない免
疫応答により起こされる症状および症状の原因を減少させ、または望ましい免疫
応答を増加させることにより症状を緩和または症状の原因を除去／減少させるの
に十分なように個体の免疫を調節するような組成物を指している。いくつかの場
合、免疫療法はワクチン接種プロトコールの一部であり、そこでは個体にワクチ
ンが投与されて個体が免疫原にさらされる。そのような場合、免疫療法は特定の
状態、感染または疾患を処置または予防するのに望ましい免疫応答を増加させお
よび／または免疫応答の一部を選択的に促進させる。いくつかの場合、免疫療法
剤は免疫原なしで送達される。そのような場合免疫療法剤は、免疫応答を減少ま
たは抑制させ、免疫応答を促進または増加させ、免疫応答の一部を減少または抑
制させ、または免疫応答の一部を促進または増加させることにより免疫系を調節
するために提供される。いくつかの場合、免疫療法剤は抗体を含んでおり、それ
はインビボで投与された場合に免疫応答調節に関係するタンパク質に結合する。
抗体およびそのようなタンパク質の相互作用は免疫応答の変化を生じさせる。も
しタンパク質が自己免疫疾患に関係しているならば、抗体は自己免疫疾患におけ
るタンパク質の活性を阻害でき、症状または疾患を軽減または除去できる。
【０００２】 ワクチンはアレルゲン、病因抗原またはヒト疾患に関係する細胞に関連した抗
原のような標的抗原に対して個体を免疫化するのに有用である。 そのようなワクチンの設計においては、ワクチン接種された個体の細胞中に標
的抗原を産生するようなワクチンは免疫系の細胞兵器誘導に有効であることが認
められている。特に、弱毒化ワクチン、無発病性ベクターを使用する組換えワク
チンおよびＤＮＡワクチンはすべてワクチン接種された個体の細胞に抗原の産生
を導き、免疫系の細胞兵器を誘導する。一方、タンパク質および殺したまたは不
活性化したワクチンのみから成り、ヒトでの応答を誘導しないサブユニットワク
チンは良好な細胞性免疫応答を誘導しない。
【０００３】 細胞性免疫応答はしばしば、病原体感染に対しての保護に、および病原体感染
、癌または自己免疫疾患を処置するための有効な免疫仲介治療に必要とされる。
従って、弱毒化生ワクチン、無発病性ベクターを使用する組換えワクチンおよび
ＤＮＡワクチンのような、ワクチン接種された個体の細胞中に標的抗原を産生す
るようなワクチンが好まれている。
【０００４】 そのようなワクチンはしばしば、病原体感染またはヒト疾患に対して予防的ま
たは治療的に個体を免疫化するのに有効であるので、改良されたワクチンが必要
とされている。促進された免疫応答を産生する組成物および方法が必要とされて
いる。発明の要約 本発明は免疫応答を促進および／または調節する免疫調節タンパク質またはそ
れをコードしている核酸分子を含む組成物、ならびにそのようなタンパク質およ
び核酸分子の使用法に関している。免疫調節タンパク質の送達は免疫療法ならび
にワクチン送達に関連した免疫応答を促進またはさもなければ適合させることに
有用である。免疫調節タンパク質とは以下のものであろう：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ
−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳを含むケモカイン；Ｌ−セ
レクチン、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンのようなセレクチンを含む接着
分子、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１およびＭａｄＣＡＭ−１のようなムチン様分
子、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１およびｐ１５０．９５のようなインテ
グリンファミリーの一員；およびＰＥＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ類（ＩＣＡＭ−１、
ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３）、ＣＤ２およびＬＦＡ−３のようなイムノグ
ロブリンスーパーファミリーの一員；Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＳＦ、ＩＬ−
４、ＩＬ−１８の突然変異形のようなサイトカイン；ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ
のような共刺激分子；血管成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子および血管内皮細
胞増殖因子を含む増殖因子；Ｆａｓ、ＴＮＦレセプター、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、
ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、Ｎ
ＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、Ｄ
Ｒ６を含むレセプター分子；カスパーゼ（ＩＣＥ）を含むその他のもの。
【０００５】 本発明は真核細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結され
た免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列および真核細胞におけ
る発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された免疫原をコードしている
ヌクレオチド配列を含むプラスミドに関している。免疫原とは好適には病原体抗
原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関係した細胞に関連した抗原である。
【０００６】 本発明は個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結さ
れた免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列および個体の細胞に
おける発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された免疫原をコードして
いるヌクレオチド配列を含むプラスミドを個体に投与する工程から成る、免疫原
に対して個体の免疫応答を誘導する方法に関している。
【０００７】 本発明はまた、個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように
連結された免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列および個体の
細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された免疫原をコー
ドしているヌクレオチド配列を含むプラスミドを個体に投与する工程から成る、
病原体、癌または自己免疫疾患に対して個体を免疫化する方法に関しており、こ
こで、免疫原とは好適には病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関係し
た細胞に関連した抗原である。
【０００８】 本発明は真核細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結され
た免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む第一のプラスミ
ドおよび真核細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された
免疫原をコードしているヌクレオチド配列を含む第二のプラスミドを含んでいる
組成物に関している。いくつかの好適な態様において、免疫原とは好適には病原
体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関係した細胞に関連した抗原である。
【０００９】 本発明は個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結さ
れた免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む第一のプラス
ミドおよび個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結さ
れた免疫原をコードしているヌクレオチド配列を含む第二のプラスミドを含んで
いる組成物を個体に投与する工程から成る、病原体、癌または自己免疫疾患に対
して個体を免疫化する方法に関しており、ここで、免疫原とは好適には病原体抗
原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関係した細胞に関連した抗原である。
【００１０】 本発明は個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結さ
れた免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む第一のプラス
ミドおよび個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結さ
れた免疫原をコードしているヌクレオチド配列を含む第二のプラスミドを含んで
いる組成物を個体に投与する工程から成る、免疫原に対する免疫応答を誘導する
方法に関している。
【００１１】 本発明は真核細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結され
た免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列および真核細胞におけ
る発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された標的抗原をコードしてい
るヌクレオチド配列を含む改良された組換え体ワクチンに関している。好適な態
様において、標的抗原は病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関係した
細胞に関連した抗原である。
【００１２】 本発明は個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結さ
れた免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列および個体の細胞に
おける発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された標的抗原をコードし
ているヌクレオチド配列を含む組換え体ワクチンベクターを個体に投与する工程
から成る、病原体、癌または自己免疫疾患に対して個体を免疫化する方法に関し
ており、ここで、標的抗原とは好適には病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫
疾患に関係した細胞に関連した抗原である。
【００１３】 本発明は個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結さ
れた免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列および個体の細胞に
おける発現に必要な制御要素に作動可能なように連結された標的抗原をコードし
ているヌクレオチド配列を含む組換え体ワクチンベクターを個体に投与する工程
から成る、標的抗原に対する免疫応答を誘導する方法に関している。
【００１４】 本発明は真核細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結され
た免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む改良された弱毒
化生ワクチンに関している。
【００１５】 本発明は個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結さ
れた免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む弱毒化された
ワクチンを個体に投与する工程から成る、病原体、癌または自己免疫疾患に対し
て個体を免疫化する方法に関している。
【００１６】 本発明は個体の細胞における発現に必要な制御要素に作動可能なように連結さ
れた免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む弱毒化された
ワクチンを個体に投与する工程から成る、個体において免疫原に対する免疫応答
を誘導する方法に関している。
【００１７】 本発明は個体の免疫系を調節するための組成物および方法に関している。本発
明の方法はタンパク質の投与、または発現ベクターまたは発現可能な形で個体へ
ヌクレオチド配列を送達できる他の運搬体の一部として免疫調節タンパク質をコ
ードしているヌクレオチド配列の投与により個体へ免疫調節タンパク質を送達す
ることから成っている。
【００１８】 本発明は自己免疫疾患を持つ個体を処置する組成物および方法に関している。
本発明の方法はそのような個体へＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、Ｉ
Ｌ−８およびＲＡＮＴＥＳを含むケモカインへ特異的に結合する抗体を含んでい
る組成物を投与することから成っている。好適な態様の詳細な説明 本発明は特定のタンパク質が免疫応答を促進および／または調節するという発
見から考え出された。従って、そのようなタンパク質は免疫療法剤としてまたは
ワクチン中の成分として送達されるであろう。
【００１９】 本明細書で使用される場合、用語”免疫調節タンパク質”とは、免疫応答を促
進および／または調節する本発明に従ったタンパク質および核酸分子発現産物を
指すことを意味している。従って、免疫調節タンパク質は免疫療法剤としてまた
はワクチン中の成分として送達されるであろう。
【００２０】 免疫調節タンパク質にはケモカイン、接着分子、サイトカイン、共刺激分子、
増殖因子およびレセプター分子が含まれる。 免疫調節タンパク質であるケモカインにはＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡ
ＮＴＥＳ、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１が含まれる。
【００２１】 免疫調節タンパク質である接着分子にはセレクチンファミリー構成物、ムチン
様分子、インテグリンファミリー構成物およびイムノグロブリンスーパーファミ
リー構成物が含まれる。
【００２２】 免疫調節タンパク質であるセレクチンファミリー構成物にはＬ−セレクチン、
Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンが含まれる。 ムチン様分子はセレクチンファミリー構成物のリガンドである。免疫調節タン
パク質であるムチン様分子にはＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１およびＭａｄＣＡＭ
−１が含まれる。
【００２３】 免疫調節タンパク質であるインテグリンファミリーの構成物にはＬＦＡ−１、
ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１およびｐ１５０．９５が含まれる。 免疫調節タンパク質であるイムノグロブリンスーパーファミリー構成物にはＰ
ＥＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ類、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ
２およびＬＦＡ−３が含まれる。
【００２４】 免疫調節タンパク質であるサイトカインにはＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−
ＣＳＦ、ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＩＬ−１８の突然変異形（タンパク質の前形に
は存在するが成熟形には存在しない最初の約３５アミノ酸残基の欠失を含んでい
る）が含まれる。
【００２５】 免疫調節タンパク質である共刺激分子にはＣＤ４０およびＣＤ４０リガンド（
ＣＤ４０Ｌ）が含まれる。 免疫調節タンパク質である増殖因子には血管成長因子、ＩＬ−７、神経成長因
子および血管内皮細胞増殖因子が含まれる。
【００２６】 免疫調節タンパク質であるレセプター分子にはＦａｓ”致死遺伝子”発現産物
、腫瘍壊死因子ＴＮＦレセプター、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、
ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ
５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６が含まれる。
【００２７】 他の分子としてはカスパーゼ（ＩＣＥ）が含まれる。 本発明のいくつかの態様によると、免疫調節タンパク質は核酸分子（それは細
胞に取り込まれた場合、発現されて免疫調節タンパク質を発現する）を投与する
ことにより送達される。本発明のいくつかの態様では、免疫調節タンパク質はタ
ンパク質それ自身を投与することにより送達される。本発明のいくつかの態様で
は、免疫調節タンパク質は核酸かまたはタンパク質を投与することにより送達さ
れる。本発明のいくつかの態様では、免疫調節タンパク質は核酸およびタンパク
質を同時に投与することにより送達される。
【００２８】 本発明のいくつかの態様では、免疫調節タンパク質（タンパク質またはタンパ
ク質をコードしている核酸分子として）は組成物またはさもなくばワクチン組成
物とともに補給物として投与される。ワクチンはサブユニット、不活性化ワクチ
ン、弱毒化生ワクチン、細胞ワクチン、組換え体ワクチン、または核酸またはＤ
ＮＡワクチンのいずれかであろう。弱毒化生ワクチン、細胞ワクチン、組換え体
ワクチン、または核酸またはＤＮＡワクチンの場合、免疫調節タンパク質はこれ
らのワクチンの核酸分子によりコードされているであろう。
【００２９】 免疫調節タンパク質は細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を誘導および促進し、
および／または抗体応答を誘導および促進し、および／またはＴ細胞増殖応答を
誘導および促進するのに有用である。
【００３０】 ＣＴＬ応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は、細胞内病原体に対す
る、または自己免疫疾患または癌に関係する細胞に対するワクチンとともにまた
はそのの一部として投与された場合に特に有用である。ＣＴＬ応答を誘導および
促進する免疫調節タンパク質は、弱毒化生ワクチン、細胞ワクチン、組換え体ワ
クチン、および核酸／ＤＮＡワクチンとともに投与された場合に特に有用である
。もしくは、ＣＴＬ応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は、癌または
細胞内感染を患っている患者に投与される免疫療法剤として有用である。ＣＴＬ
応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は免疫無防備状態の患者に投与さ
れた場合に有用である。
【００３１】 抗体応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は細菌、他の細胞外病原体
、またはＢ型肝炎ウイルスのような抗体応答が保護的であるウイルスに対するワ
クチンとともにまたはその一部として投与された場合に特に有用である。抗体応
答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は、サブユニットワクチンとともに
投与された場合に特に有用である。もしくは、抗体応答を誘導および促進する免
疫調節タンパク質は、望ましくないＣＴＬ免疫応答を示している患者に投与され
る免疫療法剤として有用である。抗体応答を誘導および促進する免疫調節タンパ
ク質は免疫無防備状態の患者に投与された場合に有用である。
【００３２】 Ｔ細胞増殖応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は、ワクチンととも
にまたはその一部として投与された場合に特に有用である。もしくは、Ｔ細胞増
殖応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は免疫療法剤として有用である
。Ｔ細胞増殖応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は免疫無防備状態の
患者に投与された場合に有用である。 ケモカイン： ケモカインまたはケモカインをコードしている核酸分子の投与は細胞によるケ
モカインの発現を増加させる。
【００３３】 ＭＣＰ−１はＣＤ８＋ＣＴＬを誘導および促進するのに特に有用である。 ＭＩＰ−１αは抗体の誘導に特に有用である。 ＩＬ−８は抗体の誘導に特に有用であり、Ｔヘルパー応答の強力な誘導剤であ
る。
【００３４】 ＲＡＮＴＥＳはＴＨ１ならびにＣＴＬ応答を誘導する。 ＭＩＰ−１β（ｐＣＤＮＡ３内へクローン化されｐＣＤＮＡ３−ＭＩＰ−１β
を発生させた構築物として）も使用されるであろう。 接着分子： セレクチンファミリー構成物 Ｌ−セレクチン Ｐ−セレクチン Ｅ−セレクチン。
【００３５】 ムチン様分子 ＣＤ３４ ＧｌｙＣＡＭ−１（ｐＣＤＮＡ３内へクローン化されｐＣＤＮＡ３−Ｇ
ｌｙＣＡＭ−１を発生させた構築物として） ＭａｄＣＡＭ−１。
【００３６】 インテグリンファミリー構成物 ＬＦＡ−１ ＶＬＡ−１ Ｍａｃ−１ ｐ１５０．９５。
【００３７】 イムノグロブリンスーパーファミリー構成物 ＰＥＣＡＭ−１ ＩＣＡＭ類 ＩＣＡＭ−１ ＩＣＡＭ−２ ＩＣＡＭ−３ ＣＤ２ ＬＦＡ−３。
【００３８】 接着分子は核酸分子として投与された場合に最も有用である。 接着分子は核酸分子として、ワクチン、特に弱毒化生ワクチン、細胞ワクチン
、組換え体ワクチン、および核酸／ＤＮＡワクチンとともにまたはその一部とし
て投与された場合に最も有用である。
【００３９】 接着分子は核酸分子として腫瘍内または病巣内に送達された場合に有用である
。 好適な接着分子にはＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＥ−セレクチンが挙げら
れる。
【００４０】 ＩＣＡＭ−１はＣＴＬ増殖には最適である。 サイトカイン： Ｍ−ＣＳＦ Ｇ−ＣＳＦ ＧＳＦ ＩＬ−４ ＩＬ−１８の突然変異形。 共刺激分子： ＣＤ４０（ＣＤ４０をコードしているｃＤＮＡがｐＣＤＮＡ３内へクロ
ーン化され、ｐＣＤＮＡ３−ＣＤ４０を発生させた構築物として使用される） ＣＤ４０Ｌ。 増殖因子： 血管成長因子（血管成長因子をコードしているｃＤＮＡがｐＣＤＮＡ３
内へクローン化され、ｐＣＤＮＡ３−ＶＧＦを発生させた構築物として使用され
る） ＩＬ−７ 神経成長因子 血管内皮細胞増殖因子。 レセプター分子： Ｆａｓ”致死遺伝子”発現産物 ＴＮＦレセプター Ｆｌｔ Ａｐｏ−１ ｐ５５ ＷＳＬ−１ ＤＲ３ ＴＲＡＭＰ Ａｐｏ−３ ＡＩＲ ＬＡＲＤ ＮＧＲＦ ＤＲ４ ＤＲ５ ＫＩＬＬＥＲ ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ ＴＲＩＣＫ２ ＤＲ６。 その他 カスパーゼ（ＩＣＥ）。
【００４１】 表１は前記免疫調節タンパク質の各々のおよびＣＤ８６（Ｂ７．２）のヌクレ
オチドおよびアミノ酸配列のためのＧＥＮＢＡＮＫ受託番号および引用雑誌が一
覧表になっている。
【００４２】 ＤＮＡワクチンはＰＣＴ／ＵＳ９０／０１５１５、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０２３
３８、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４８１３１およびＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９に
記載されており、優先出願がそこに引用されている（それらは各々本明細書にお
いて援用される）。これらの出願に記載されている送達プロトコールに加え、Ｄ
ＮＡ送達の別の方法が米国特許第４，９４５，０５０号および５，０３６，００
６号（両方とも本明細書において援用される）に記載されている。
【００４３】 本発明のいくつかの態様は遺伝子構成要素によりコードされているタンパク質
およびペプチドに対する免疫応答を誘導するために、個体の細胞内へ遺伝子構成
要素を導入する方法に関している。本方法は所望のペプチドまたはタンパク質を
コードしているヌクレオチド配列および免疫調節タンパク質をコードしているヌ
クレオチド配列を含む単一の核酸分子、または二つの核酸分子（一つは所望のペ
プチドまたはタンパク質をコードしてヌクレオチド配列を含んでおりおよび一つ
は免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる）を持っ
ている組成物を該個体の組織へ投与する工程を含んでいる。核酸分子はプラスミ
ドＤＮＡ（組換え体ベクターの核酸分子）として、または弱毒化または細胞ワク
チンに含まれる遺伝子構成要素の一部として提供されるであろう。もしくはいく
つかの態様においては、免疫調節タンパク質はタンパク質として送達されるであ
ろう。
【００４４】 いくつかの態様によると、二つまたはそれ以上の免疫調節タンパク質の組み合
わせが個体に投与される。いくつかの態様において、二つまたはそれ以上の免疫
調節タンパク質の組み合わせをコードしている遺伝子が、免疫原および／または
免疫原性タンパク質をコードしている遺伝子と一緒にワクチンプロトコールの一
部として個体に投与される。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質およ
び免疫調節タンパク質をコードしている遺伝子の組み合わせが、免疫原および／
または免疫原性タンパク質をコードしている遺伝子と一緒にワクチンプロトコー
ルの一部として個体に投与される。いくつかの態様において、二つまたはそれ以
上の免疫調節タンパク質が、免疫原および／または免疫原性タンパク質をコード
している遺伝子と一緒にワクチンプロトコールの一部として個体に投与される。
【００４５】 いくつかの態様によると、免疫調節タンパク質は共刺激分子ＣＤ８６（Ｂ７．
２）と組み合わせて個体へ投与される。いくつかの態様において、ＣＤ８６およ
び一つまたはそれ以上の免疫調節タンパク質の組み合わせをコードしている遺伝
子が、免疫原および／または免疫原性タンパク質をコードしている遺伝子と一緒
にワクチンプロトコールの一部として個体に投与される。いくつかの態様におい
て、ＣＤ８６タンパク質および免疫調節タンパク質をコードしている遺伝子の組
み合わせが、免疫原および／または免疫原性タンパク質をコードしている遺伝子
と一緒にワクチンプロトコールの一部として個体に投与される。いくつかの態様
において、免疫調節タンパク質およびＣＤ８６タンパク質をコードしている遺伝
子の組み合わせが、免疫原および／または免疫原性タンパク質をコードしている
遺伝子と一緒にワクチンプロトコールの一部として個体に投与される。いくつか
の態様において、ＣＤ８６および一つまたはそれ以上の免疫調節タンパク質の組
み合わせが、免疫原および／または免疫原性タンパク質をコードしている遺伝子
と一緒にワクチンプロトコールの一部として個体に投与される。いくつかの態様
において、ＣＤ８６および一つまたはそれ以上のケモカインおよび／または接着
分子の組み合わせが、免疫原および／または免疫原性タンパク質をコードしてい
る遺伝子と一緒にワクチンプロトコールの一部として個体に投与される。いくつ
かの態様において、ＣＤ８６およびＩＣＡＭ−１の組み合わせをコードしている
遺伝子が、免疫原および／または免疫原性タンパク質をコードしている遺伝子と
一緒にワクチンプロトコールの一部として個体に投与される。
【００４６】 本発明のいくつかの態様によると、病原体または異常な疾患関連細胞に対して
個体を予防的におよび／または治療的に免疫化する組成物および方法が提供され
る。ペプチドまたはタンパク質をコードしている遺伝子構成要素は標的とされる
べき病原体または細胞に観察される免疫原性タンパク質および免疫調節タンパク
質をコードしている遺伝子構成要素と少なくともエピトープを共有している。も
しくは、いくつかの態様において、免疫調節タンパク質はタンパク質として送達
されるであろう。
【００４７】 遺伝子構成要素は個体の細胞で発現され、免疫応答が惹起される免疫原性標的
として働く。生じる免疫応答は広範囲のものである：体液性免疫応答に加え、細
胞性免疫応答の両方の力が惹起される。本発明の方法は予防的および治療的免疫
性を与えるのに有用である。従って、免疫化の方法には、免疫原に対して免疫化
しおよび従って例えば、病原体攻撃または特定の細胞の存在または増殖から個体
を保護する方法、ならびに病原体感染、過増殖性疾患または自己免疫疾患を患っ
ている個体を処置する方法の両方が含まれている。
【００４８】 本明細書で使用される場合、用語”標的タンパク質”とは免疫応答の標的タン
パク質として働く本発明の遺伝子構築物によりコードされているペプチドおよび
タンパク質を指していることを意味している。用語”標的タンパク質”および”
免疫原”は相互交換的に使用され、それに対して免疫応答が惹起できるタンパク
質を指している。標的タンパク質は、免疫化が必要とされる病原体または癌細胞
または自己免疫疾患に関係している細胞のような望まれない細胞型のタンパク質
と少なくともエピトープを共有している免疫原性タンパク質である。標的タンパ
ク質に対する免疫応答は、標的タンパク質が関係する特定の感染または疾患から
個体を保護し、それらを患っている個体を処置できるであろう。
【００４９】 本発明は標的タンパク質に対する広い免疫応答を惹起するのに有用である、即
ち、特に病原体、アレルゲンまたは個体自身の”異常な”細胞に関係するタンパ
ク質。本発明は病原体タンパク質に対する免疫応答が病原体に対する保護的免疫
性を与えるように、病原性因子および生物体に対して個体を免疫化するのに有用
である。本発明は、特に過増殖性細胞に関連する標的タンパク質に対する免疫応
答を惹起することにより、癌のような過増殖性疾患および障害と戦うのに有用で
ある。本発明は特に自己免疫状態に関与する細胞関連の標的タンパク質に対する
免疫応答を惹起することにより、自己免疫疾患および障害と戦うのに有用である
。
【００５０】 本発明のいくつかの態様によると、標的タンパク質および免疫調節タンパク質
をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡが個体の組織細胞内へ導入され、そこで発
現され、標的タンパク質を生成する。標的タンパク質および免疫調節タンパク質
をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡ配列は個体の細胞中での発現に必要とされ
る制御要素に連結されている。ＤＮＡ発現のための制御要素にはプロモーターお
よびポリアデニル化シグナルが含まれる。加えて、コザック領域のような他の要
素もまた遺伝子構築物に含まれているであろう。
【００５１】 本明細書で使用される場合、用語”遺伝子構築物”とは、標的タンパク質をコ
ードし、およびワクチン接種された個体の細胞内での発現を指示できる、プロモ
ーターおよびポリアデニル化シグナルを含んでいる制御要素に作動可能なように
連結された開始および終止シグナルを含むヌクレオチド配列、および／または免
疫調節タンパク質をコードし、およびワクチン接種された個体の細胞内での発現
を指示できる、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含んでいる制御要
素に作動可能なように連結された開始および終止シグナルを含むヌクレオチド配
列を含んでいる。いくつかの態様において、標的タンパク質をコードしている発
現可能形配列および免疫調節タンパク質をコードしている発現可能形配列は同一
の核酸分子上に存在しており、それが個体へ送達される。いくつかの態様におい
て、標的タンパク質をコードしている発現可能形配列は、免疫調節タンパク質を
コードしている発現可能形配列を含む核酸分子とは別の核酸分子上に存在する。
そのような場合、両方の分子が個体へ送達される。
【００５２】 本明細書で使用される場合、用語”発現可能形”とは、個体の細胞中に存在す
る場合にコード配列が発現されるであろうように、標的タンパク質または免疫調
節タンパク質をコードしているコード配列へ作動可能に連結された必要制御要素
を含んでいる遺伝子構築物を指している。
【００５３】 本明細書で使用される場合、用語”エピトープを共有している”とは、別のタ
ンパク質のエピトープと同一であるまたは実質的に同じである少なくとも一つの
エピトープを含むタンパク質を指している。
【００５４】 本明細書で使用される場合、用語”実質的に同じであるエピトープ”とは、タ
ンパク質のエピトープとは同一の構造を持ってはいないが、それにも関わらず、
そのタンパク質と交叉反応する細胞性または体液性免疫応答を引き起こすエピト
ープを指すことを意味している。
【００５５】 遺伝子構築物は、遺伝子発現に必要とされる制御要素に作動可能なように連結
された標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド
配列を含んでいる。本発明によると、標的タンパク質をコードしているヌクレオ
チド配列の発現可能形から成る遺伝子構築物および免疫調節タンパク質をコード
しているヌクレオチド配列の発現可能形から成る遺伝子構築物を含む遺伝子構築
物の組み合わせが提供される。遺伝子構築物の組み合わせを含むＤＮＡまたはＲ
ＮＡの生きている細胞内への取り込みにより、ＤＮＡまたはＲＮＡの発現および
標的タンパク質および免疫調節タンパク質の産生が生じる。標的タンパク質に対
する促進された免疫応答が生じる。
【００５６】 細胞により取り込まれた場合、遺伝子構築物は機能的染色体外分子として残存
し、および／または細胞の染色体ＤＮＡへ組み込まれる。ＤＮＡは細胞内へ導入
され、プラスミド形の別の遺伝子成分として残っているかもしれない。もしくは
、染色体内へ組み込むことができる直鎖状ＤＮＡが細胞内へ導入されてもよい。
ＤＮＡが細胞内へ導入された時、染色体内へのＤＮＡ組込みを促進する試薬が加
えられる。組込みを促進するために有用なＤＮＡ配列はＤＮＡ分子に含まれてい
てもよい。もしくは、ＲＮＡが細胞に投与されてもよい。遺伝子構築物は動原体
、テロメアおよび複製起点を含んでいる線状ミニクロモソームとして提供される
ことも意図されている。遺伝子構築物は弱毒化生ワクチンまたは組換え体微生物
ベクター中に遺伝子構成要素の一部として残存し、細胞中で生きている。遺伝子
構築物は組換え体ウイルスワクチンのゲノムであってもよく、遺伝子構成要素は
細胞の染色体内へ組み込まれるかまたは染色体外に残存する。
【００５７】 遺伝子構築物は核酸分子の遺伝子発現に必要な制御要素を含んでいる。その要
素には：プロモーター、開始コドン、停止コドンおよびポリアデニル化シグナル
が含まれる。加えて、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードしてい
る配列の遺伝子発現にエンハンサーがしばしば必要とされる。これらの要素は所
望のタンパク質をコードしている配列へ作動可能なように連結されていること、
および制御要素はそれらが投与された個体で作動可能であることが必要である。
【００５８】 開始コドンおよび停止コドンは一般的に所望のタンパク質をコードしているヌ
クレオチド配列の一部であると考えられている。しかしながら、これらの要素は
遺伝子構築物が投与された個体中で機能的であることが必要である。開始および
停止コドンはコード配列の読み枠内に存在しなければならない。
【００５９】 使用されるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは個体の細胞内で機能
的でなければならない。 本発明の実施に有用なプロモーターの例としては（特にヒトに対する遺伝子ワ
クチンの製造において）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳腺腫瘍
ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（ＨＩＶ
長い末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターのような）、モロニーウイルス、ＡＬ
Ｖ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶ前初期プロモーター、エプスタイ
ンバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）からのプロモーター
類、ならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレア
チンおよびヒトメタロチオネインのようなヒト遺伝子からのプロモーター類が挙
げられるが、これらに制限されるわけではない。
【００６０】 本発明の実施に有用なポリアデニル化シグナルの例としては（特にヒトに対す
る遺伝子ワクチンの製造において）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル
、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびＬＴＲポリアデニル化シグナルが挙げ
られるが、これらに制限されるわけではない。特に、ｐＣＥＰ４プラスミド中に
存在するＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄ
ｉｅｇｏ，ＣＡ、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと称される）が使用される。
【００６１】 ＤＮＡ発現に必要とされる制御要素に加え、他の要素もＤＮＡ分子に含まれて
いるであろう。そのような追加の要素にはエンハンサーが含まれる。エンハンサ
ーは：ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンお
よびＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶからのエンハンサーのようなウイルスエンハン
サーから成る群より選択されるであろうが、それらに制限されるわけではない。
【００６２】 遺伝子構築物を染色体外に維持するためおよび細胞中で構築物の多数のコピー
を生成するために、構築物は哺乳類複製起点とともに提供できる。Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのプラスミドｐＣＥＰ４およびｐＲ
ＥＰ４はエプスタインバーウイルス複製起点および組込みなしで高コピーエピソ
ーム複製を生み出す核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含んでいる。いくつかの態
様において、免疫調節タンパク質をコードしているｃＤＮＡがｐＣＤＮＡ３内へ
挿入される。
【００６３】 免疫化応用に関するいくつかの好適な態様において、標的タンパク質、免疫調
節タンパク質、およびそのうえにそのような標的タンパク質に対する免疫応答を
さらに促進するタンパク質のための遺伝子をコードしているヌクレオチド配列を
含んでいる核酸分子が送達される。そのような遺伝子の例はα−インターフェロ
ン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ、上
皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、
ＩＬ−１０およびＩＬ−１２のような他のサイトカインおよびリンホカインをコ
ードしているものである。いくつかの態様において、ＧＭ−ＣＳＦの遺伝子が免
疫化組成物で使用される遺伝子構築物に含まれていることが好適である。
【００６４】 何らかの理由で遺伝子構築物を受けている細胞を除去することが望ましいので
あれば、細胞破壊の標的として働く追加の要素が加えられるであろう。発現可能
形のヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を遺伝子構築物に含ませることが
できる。薬剤ガングシクロビルが個体へ投与でき、本薬剤はｔｋを産生している
細胞を選択的に殺すので、遺伝子構築物を含む細胞を選択的に破壊する手段が提
供される。
【００６５】 タンパク質産生を最大にするため、構築物が投与される細胞内での遺伝子発現
に適した制御配列が選択される。さらに、細胞内で最も効率的に転写されるコド
ンが選択されるであろう。当業者は細胞内で機能的であるＤＮＡ構築物を製造で
きる。
【００６６】 投与経路には筋肉内、鼻腔内、腹腔内、経皮、皮下、静脈内、動脈内、眼内お
よび経口ならびに局所、経皮、吸入または坐剤により、または膣、直腸、尿管、
口腔および舌下組織への潅注によるような粘膜組織へなどが含まれるが、それら
に制限されるわけではない。好適な投与経路には粘膜組織、筋肉内、腹腔内、皮
内および皮下注射が挙げられる。遺伝子構築物は伝統的注射器、針無し注入装置
または”微小弾丸衝撃遺伝子銃”を含む（それらに制限されるわけではない）手
段によって投与されてもよい。
【００６７】 本発明による医薬組成物は約１ナノグラムから約２０００マイクログラムのＤ
ＮＡを含んでいる。いくつかの好適な態様において、本発明による医薬組成物は
約５ナノグラムから約１０００マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。いくつか
の好適な態様において、本発明による医薬組成物は約１０ナノグラムから約８０
０マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。いくつかの好適な態様において、本発
明による医薬組成物は約０．１から約５００マイクログラムのＤＮＡを含んでい
る。いくつかの好適な態様において、本発明による医薬組成物は約１から約３５
０マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。本発明による医薬組成物は約２５から
約２５０マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。本発明による医薬組成物は約１
００から約２００マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。
【００６８】 本発明の医薬組成物は使用されるべき投与様式に従って処方される。医薬組成
物が注射可能な医薬組成物である場合、それらは無菌であり、発熱物質および粒
子状物質を含んでいない。好適には等張処方が使用される。一般に、等張性のた
めの添加物には塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール
およびラクトースが使用できる。いくつかの場合、リン酸緩衝液のような等張溶
液が好適である。安定化剤にはゼラチンおよびアルブミンが含まれる。いくつか
の態様において、処方に血管収縮剤が添加される。
【００６９】 いくつかの態様において、核酸分子はポリヌクレオチド機能促進剤または遺伝
子ワクチン助長剤の投与と連結して細胞へ送達される。ポリヌクレオチド機能促
進剤は１９９３年１月２６日に出願された米国特許番号第０８／００８，３４２
号、１９９３年３月１１日に出願された米国特許番号第０８／０２９，３３６号
、１９９３年９月２１日に出願された米国特許番号第０８／１２５，０１２号、
および１９９４年１月２６日に出願された国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０
０８９９号（これらは各々が本明細書において援用される）に説明されている。
遺伝子ワクチン助長剤は１９９４年４月１日に出願された米国特許番号第０８／
２２１，５７９号（本明細書において援用される）に説明されている。核酸分子
とともに投与される共薬剤は核酸分子との混合物として投与されるか、または核
酸分子と同時に、投与前にまたは投与後に別々に投与される。さらに、トランス
フェクト剤および／または複製剤および／または催炎物質として機能するであろ
う、およびＧＶＦと共投与されるであろう他の物質にはα−インターフェロン、
ガンマ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ、上皮増
殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ
−１０およびＩＬ−１２のような成長因子、サイトカインおよびリンホカインが
含まれ、ならびに線維芽細胞成長因子、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）のよう
な表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ
）を含むＬＰＳ類似体、ムラミールペプチド、キノン類似体およびスクアレンお
よびスクアレンのようなベシクル、およびヒアルロン酸もまた遺伝子構築物とと
もに投与されるのに使用されるであろう。いくつかの態様において、免疫調節タ
ンパク質はＧＶＦとして使用されるであろう。
【００７０】 本発明により細胞へ送達される核酸分子は、予防的および／または治療的免疫
化剤として機能するタンパク質のための鋳型として働くであろう。好適な態様に
おいて、核酸分子は動物の細胞内でのコード領域の転写および翻訳のために必要
な制御配列を含んでいる。
【００７１】 本発明はウイルス、原核生物および真核生物体（単細胞病原性生物体および多
細胞寄生虫のような）のようなすべての病原体に対して個体を免疫化するために
使用されるであろう。本発明は細胞に感染し、およびウイルスおよび原核生物（
淋菌、リステリアおよび赤痢菌のような）のような被包性でない病原体に対して
個体を免疫化するのに特に有用である。加えて、本発明はまた、それらが細胞内
病原体である生活周期の段階を含む原虫に対して個体を免疫化するのにも有用で
ある。本明細書で使用される場合、用語”細胞内病原体”とはその生殖または生
活周期の少なくとも一部で、宿主細胞内に存在しおよびそこで病原タンパク質を
産生するまたは産生する原因となるウイルスまたは病原性生物体を指すことを意
味している。表２は本発明によるワクチンが作製できるいくつかのウイルスファ
ミリーおよび属のリストである。表に掲げた抗原のような病原体抗原上に示され
るエピトープと同一かまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを
含むペプチドをコードしているＤＮＡ配列含有ＤＮＡ構築物はワクチンに有用で
ある。さらに、本発明はまた、原核生物および真核生物を含む他の病原体ならび
に表３に掲げてあるような多細胞寄生虫に対して個体を免疫化するのにも有用で
ある。
【００７２】 病原体感染に対して保護する遺伝子ワクチンを製造するため、保護的免疫応答
が準備できる免疫原性タンパク質をコードしている遺伝子構成要素は、標的のた
めのコード配列として遺伝子構築物中に含まれていなければならない。病原体感
染が細胞内（それに対して本発明は特に有用である）であるにせよまたは細胞外
であるにせよ、すべての病原体抗原が保護的応答を惹起することはありそうもな
い。ＤＮＡおよびＲＮＡは両方とも比較的小さくおよび比較的容易に製造できる
ので、本発明は多病原体抗原を含むワクチン接種を可能にするさらなる利点を提
供する。遺伝子ワクチンに使用される遺伝子構築物は多くの病原体抗原をコード
している遺伝子構成要素を含むことができる。例えば、数個のウイルス遺伝子を
単一の構築物に含ませてもよく、それにより複数の標的を持つものが提供される
。
【００７３】 表２および３は、感染から個体を保護するために遺伝子ワクチンが製造される
いくつかの病原性因子および生物体のリストである。いくつかの好適な態様にお
いて、病原体に対して個体を免疫化する方法はＨＩＶ、ＨＴＬＶまたはＨＢＶに
向けられたものである。
【００７４】 本発明の別の態様は、過増殖性疾患に特徴的である過増殖している細胞に対す
る広範囲な保護的免疫応答を与える方法、および過増殖性疾患を患っている個体
を処置する方法を提供する。本明細書で使用される場合、用語”過増殖性疾患”
とは細胞の過増殖により特徴付けられるような疾患および障害を指していること
を意味している。過増殖性疾患の例にはすべての形の癌および乾癬が含まれる。
【００７５】 免疫原性の”過増殖している細胞”関連タンパク質をコードしているヌクレオ
チド配列を含む遺伝子構築物を個体の細胞内へ導入すると、ワクチン接種された
個体の細胞にこれらのタンパク質が産生されることが見いだされている。本明細
書で使用される場合、用語”過増殖性関連タンパク質”とは過増殖性疾患に関連
するタンパク質を指していることを意味している。過増殖性疾患に対して免疫す
るため、過増殖性疾患に関連したタンパク質をコードしているヌクレオチド配列
を含む遺伝子構築物が個体に投与される。
【００７６】 過増殖性関連タンパク質が有効な免疫原性標的であるようにするため、それは
正常な細胞と比較して、過増殖性細胞中で独占的にまたは高レベルで産生される
ようなタンパク質でなければならない。標的抗原にはそのようなタンパク質に観
察される少なくとも一つのエピトープを含むタンパク質、それらの断片およびペ
プチドが含まれる。いくつかの場合、過増殖性関連タンパク質はタンパク質をコ
ードしている遺伝子の突然変異による生成物である。突然変異した遺伝子は正常
のタンパク質とほとんど同じであるが、正常タンパク質では観察されない異なっ
たエピトープを生じるわずかに異なったアミノ酸配列を持つタンパク質をコード
している。そのような標的タンパク質にはｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎのような癌遺
伝子、および転座遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔ
ｒｋおよびＥＧＲＦによりコードされているようなタンパク質が含まれる。標的
抗原としての癌遺伝子生成物に加え、抗癌処置および保護的計画のための標的タ
ンパク質には、Ｂ細胞リンパ球により作られる抗体の可変領域およびＴ細胞リン
パ球のＴ細胞レセプター可変領域が含まれ、それらはいくつかの態様において自
己免疫疾患のための標的抗原としても使用される。腫瘍細胞において高レベルで
観察されるタンパク質（モノクローナル抗体１７−１Ａにより認識されるタンパ
ク質および葉酸結合タンパク質を含む）のような他の腫瘍関連タンパク質が標的
タンパク質として使用できる。
【００７７】 本発明は一つまたはそれ以上の癌のいくつかの形に対して個体を免疫化するた
めに使用されるであろうが、本発明は特定の癌が発現しやすい人または以前に癌
を発病し、従って再発しやすい人のような個体を予防的に免疫化するのに特に有
用である。遺伝学および技術ならびに疫学の発展は、個体における癌発生の可能
性および危険事前評価の決定を可能にしている。遺伝子スクリーニングおよび／
または家族健康履歴を用いて、特定の個人がいくつかの型の癌のどれか一つを発
生する可能性を予測することが可能である。
【００７８】 同様に、すでに癌が発生している、および癌を取り除く処置を受けたまたは寛
解期にある個体は特に再発しやすい。処置計画の一部として、そのような個体は
再発と戦うために、持っていると診断された癌に対して免疫できる。従って、個
体が癌の一つの型を持っていたことがあり、再発の危険性があることが解ったら
、癌の将来の出現と戦う免疫系を準備するために免疫化できる。
【００７９】 本発明は過増殖性疾患を患っている個体を処置する方法を提供する。そのよう
な方法において、遺伝子構築物の導入は、標的タンパク質を産生する過増殖性細
胞と戦うために個体の免疫系を向けさせるおよび促進する免疫療法剤として働く
。
【００８０】 本発明は、自己免疫性に関係し、細胞レセプターおよび”自己”指向性抗体を
産生する細胞を含んだ標的に対して広範囲な保護的免疫応答を与えることにより
、自己免疫疾患および障害を患っている個体を処置するための方法を提供する。
【００８１】 Ｔ細胞仲介自己免疫疾患にはリウマチ様関節炎（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ
）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インシュリン依存性糖尿病（ＩＤ
ＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋
炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェグナー肉芽腫症、クローン病および潰瘍性大
腸炎が含まれる。これらの疾患の各々は、内因性抗原に結合し、自己免疫疾患に
関連した炎症性カスケードを開始させるＴ細胞レセプターにより特徴付けられる
。Ｔ細胞の可変領域に対するワクチン接種はＣＴＬが関与する免疫応答を惹起し
、これらのＴ細胞を除去する。
【００８２】 ＲＡにおいて、この疾患に関与するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）のいくつかの
特異的可変領域が同定されている。これらのＴＣＲにはＶβ−３、Ｖβ−１４、
Ｖβ−１７、およびＶα−１７が含まれる。従って、これらのタンパク質の少な
くとも一つをコードしているＤＮＡ構築物でのワクチン接種はＲＡに関与するＴ
細胞を標的とするであろう免疫応答を惹起するであろう。Ｈｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｄ
．ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８８：１０９２１−１０９２５；Ｐａｌｉａｒｄ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，１９９
１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３２５−３２９；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｗ．Ｖ．，
ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：３２６−３３３
（これらの各々は本明細書において援用される）を参照されたい。
【００８３】 ＭＳにおいて、この疾患に関与する抗体のいくつかの特異的可変領域が同定さ
れている。これらのＴＣＲにはＶβ−７、およびＶα−１０が含まれる。従って
、これらのタンパク質の少なくとも一つをコードしているＤＮＡ構築物でのワク
チン接種はＭＳに関与するＴ細胞を標的とするであろう免疫応答を惹起するであ
ろう。Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ，Ｋ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２４８：１０１６−１０１９；Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｒ．，ｅ
ｔ ａｌ．，１９９０ Ｎａｔｕｒｅ ３４５：３４４−３４６（これらの各々
は本明細書において援用される）を参照されたい。
【００８４】 強皮症において、この疾患に関与するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）のいくつか
の特異的可変領域が同定されている。これらのＴＣＲにはＶβ−６、Ｖβ−８、
Ｖβ−１４、およびＶα−１６、Ｖα−３Ｃ、Ｖα−７、Ｖα−１４、Ｖα−１
５、Ｖα−１６、Ｖα−２８、およびＶα−１２が含まれる。従って、これらの
タンパク質の少なくとも一つをコードしているＤＮＡ構築物でのワクチン接種は
強皮症に関与するＴ細胞を標的とするであろう免疫応答を惹起するであろう。
【００８５】 Ｔ細胞仲介自己免疫疾患を患っている患者を処置するためには（特にＴＣＲの
可変領域がまだ同定されていない場合）、滑液生検が実施できる。存在するＴ細
胞の試料を取り出すことができ、それらのＴＣＲの可変領域が標準法を使用して
同定される。遺伝子ワクチンはこの情報を用いて製造できる。
【００８６】 Ｂ細胞仲介自己免疫疾患には狼蒼（ＳＬＥ）、グレーブス病、重症筋無力症、
自己免疫性血小板減少症、喘息、クリオグロブリン血症、原発性胆汁性硬化症、
および悪性貧血が含まれる。これらの疾患の各々は、内因性抗原に結合し、自己
免疫疾患に関連した炎症性カスケードを開始させる抗体により特徴付けられる。
抗体の可変領域に対するワクチン接種はＣＴＬが関与する免疫応答を惹起し、こ
の抗体を産生するＢ細胞を除去する。
【００８７】 Ｂ細胞仲介自己免疫疾患を患っている患者を処置するためには、自己免疫活性
に関与する抗体の可変領域を同定しなければならない。生検が実施でき、炎症部
位に存在する抗体の試料を取り出すことができる。抗体の可変領域が標準法を使
用して同定できる。遺伝子ワクチンはこの情報を用いて製造できる。
【００８８】 ＳＬＥの場合、一つの抗原がＤＮＡであると信じられている。従ってＳＬＥに
対して免疫化されるべき患者においては、血清を抗ＤＮＡ抗体でスクリーニング
し、血清中に観察されたそのような抗ＤＮＡ抗体の可変領域をコードしているＤ
ＮＡ構築物を含むワクチンが製造できる。
【００８９】 ＴＣＲおよび抗体両方の可変領域間に共通の構造的特色はよく知られている。
特定のＴＣＲまたは抗体をコードしているＤＮＡ配列は一般的にＫａｂａｔ，ｅ
ｔ ａｌ．，１９８７ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ ＭＤ（本明細書において援用される）に説明されているようなよく知られ
た方法に従って見出すことができる。加えて、抗体からの機能的可変領域クロー
ニングの一般法はＣｈａｕｄｈａｒｙ，Ｖ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１０６６（本明細書にお
いて援用される）に見ることができる。
【００９０】 遺伝子ワクチンを改良するために免疫調節タンパク質コード配列の発現可能形
を使用するのに加え、本発明は抗原をコードしている外来遺伝子を送達するため
に改良された弱毒化生ワクチンおよび組換え体ベクターを使用する改良されたワ
クチンに関している。外来抗原を運ぶための弱毒化生ワクチンおよび組換え体ベ
クターを使用するワクチンの例は米国特許第４，７７２，８４８；５，０１７，
４８７；５，０７７，０４４；５，１１０，５８７；５，１１２，７４９；５，
１７４，９９３；５，２２３，４２４；５，２２５，３３６；５，２４０，７０
３；５，２４２，８２９；５，２９４，４４１；５，２９４，５４８；５，３１
０，６６８；５，３８７，７４４；５，３８９，３６８；５，４２４，０６５；
５，４５１，４９９；５，４５３，３６４；５，４６２，７３４；５，４７０，
７３４および５，４８２，７１３号（これらの各々は本明細書において援用され
る）に説明されている。発現を達成するためにワクチン中で機能できる制御配列
へ作動可能なように連結されている免疫調節タンパク質をコードしているヌクレ
オチド配列を含む遺伝子構築物が提供される。遺伝子構築物は弱毒化生ワクチン
および組換え体ワクチンへ取り込まれて本発明に従った改良されたワクチンが製
造される。
【００９１】 本発明は、ワクチン組成物（ＤＮＡワクチン、弱毒化生ワクチンおよび組換え
体ワクチンを含む）の一部として個体の細胞へ遺伝子構築物を送達する工程から
成る、個体を免疫化する改良された方法を提供する。遺伝子構築物は免疫調節タ
ンパク質をコードしおよびそれが発現を達成するためにワクチン中で機能できる
制御配列へ作動可能なように連結されているヌクレオチド配列から成っている。
改良されたワクチンは高められた細胞性免疫応答を生じる。
【００９２】 本発明の別の態様は強い抗体応答またはヘルパーＴ細胞応答が特に望まれるＤ
ＮＡワクチンと組み合わされたＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦをコードしてい
る核酸分子またはそれらの両方の使用に関している。そのようなワクチンの一つ
の例はＢ型肝炎に対するワクチンである。他の例としては細胞外病原体およびア
レルゲンが挙げられる。ＤＮＡワクチンと組み合わされたＧＭ−ＣＳＦまたはＧ
Ｍ−ＣＳＦをコードしている核酸分子またはそれらの両方の投与はまた免疫無防
備状態であると同定された個体のワクチン接種にも有用である。
【００９３】 本発明の別の態様は自己免疫疾患を患っている患者を処置するための抗ケモカ
イン抗体の使用に関している。自己免疫疾患は前に簡単に説明されている。抗ケ
モカイン抗体にはＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８またはＲ
ＡＮＴＥＳに特異的な抗体が含まれる。抗ケモカイン抗体はそのような疾患を患
っていると疑われる患者に症状を軽減または緩和するのに十分な量で投与される
であろう。
【００９４】 自己免疫疾患を処置するために医薬組成物はケモカインに特異的な抗体および
医薬として受容可能な担体を含んでいる。無菌で、発熱物質および粒子状物質を
含んでいない注射可能組成物は一つまたはそれ以上のケモカインに特異的な抗体
および医薬として受容可能な担体または注射賦形剤を含んでいる。
【００９５】 抗体はモノクローナル抗体を製造するための通常の方法に従って作製される。
担体は当業者にはよく知られているものから選択される。担体の一つの例は無菌
塩類溶液である。
【００９６】 当業者は標準技術および容易に入手可能な材料を用いてＭＣＰ−１、ＭＩＰ−
１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８またはＲＡＮＴＥＳに特異的に結合するモノクロ
ーナル抗体を製造することができる。モノクローナル抗体を製造するための技術
はＨａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＤ．Ｌａｎｅ，（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＮＹ
（本明細書において援用される）に説明されており、ハイブリドーマおよび標的
タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体製造のための詳細な手引きが
示されている。
【００９７】 簡単には、ケモカインをマウスに注射する。マウスの脾臓を除去し、脾臓細胞
を単離して不死化マウス細胞と融合させる。ハイブリッド細胞（またはハイブリ
ドーマ）を培養し、抗体を分泌する細胞を選択する。抗体を分析し、問題とする
タンパク質に特異的に結合することが観察されたら、それらを産生するハイブリ
ドーマを培養して抗原特異的抗体を連続的に供給する。
【００９８】 本発明に従うと、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８または
ＲＡＮＴＥＳに特異的な抗体は自己免疫疾患を処置するために使用される。従っ
て、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８またはＲＡＮＴＥＳは
ハイブリドーマを発生させるために使用される。これらのタンパク質をコードし
ている遺伝子は広く知られており、当業者は容易に入手可能である。従って、当
業者は本発明の実施に有用な抗体を作製できる。齧歯類抗体に加えて、本発明は
ヒト抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂｓおよびキメラ抗体に関しており、ＭＣＰ−１、
ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８またはＲＡＮＴＥＳに特異的に結合する
Ｆａｂｓは当業者により日常的に製造されているであろう。
【００９９】 当業者は自己免疫疾患を患っているまたは疑われる患者を容易に同定できる。 組成物はそれをより有効にするための追加の成分を含んでいてもよい。例えば
、本発明の組成物は異なったケモカインに特異的な抗体および同一のケモカイン
の異なったエピトープに特異的な抗体を含む多数の抗ケモカイン抗体を含んでい
てもよい。
【０１００】 約５μｇから５０００ｍｇの抗体が投与されるであろう。いくつかの好適な態
様においては、５０μｇから５００ｍｇの抗体が投与されるであろう。別の好適
な態様においては、５００μｇから５０ｍｇの抗体が投与されるであろう。好適
な態様においては、５ｍｇの抗体が投与される。
【０１０１】 組成物は、例えば、経口、鼻腔内、筋肉内、腹腔内または皮下投与のような適
した経路により投与されるであろう。いくつかの態様において、静脈内投与が好
適である。
【０１０２】 最初の投与に続いて、個体は再投与により追加免疫されるであろう。いくつか
の好適な態様において、多数回投与が実施される。実施例 実施例１ 序 免疫応答におけるケモカインの特異的役割を分子的に詳細に検討するため、α
−ケモカインＩＬ−８をコードしているｃＤＮＡならびにβ−ケモカインＭＩＰ
−１α、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１をコードしているｃＤＮＡを個々に発現
ベクター内へクローン化し、ＨＩＶ−１エンベロープまたはｇａｇ／ｐｏｌタン
パク質をコードしているＤＮＡ免疫原と一緒に共免疫感作した。モデル抗原とし
てこれらのＤＮＡワクチン構築物を用い、そのような免疫感作に続いて誘導され
た抗原特異的体液性および細胞性免疫応答の分析を通して免疫応答の発生に果た
すケモカイン遺伝子発現の特異的役割を検討した。ケモカインは抗原特異的免疫
応答の活性化および調節に特異的で同定可能な役割を持っていることが観察され
た。結果 ＤＮＡワクチン接種によるケモカインの誘導 マウスを５０μｇのｐＣＤＮＡ３（対照）、ｐＣＥｎｖまたはｐＣＧａｇ／ｐ
ｏｌで免疫した。２週間後、マウスを殺し、それらの脾臓をとり、リンパ球を単
離した。これらの細胞は抗原特異的刺激（固定化組換え体ワクシニア感染刺激細
胞を用いて）によりインビトロで５日間刺激した。エフェクター細胞からの培養
上清液を集め、ケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳの放
出を試験した。ｐＣＥｎｖまたはｐＣＧａｇ／ｐｏｌによるＤＮＡ免疫感作は対
照ベクターと比較してβ−ケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮ
ＴＥＳ発現レベルの著しい増加を誘導した。この増加は最初の免疫感作後早くも
２週間で存在しており、β−ケモカインがインビボで免疫応答を調節できたこと
を示唆している。抗原特異的応答に対するケモカインの影響を決定するため、次
にＤＮＡワクチンにより誘導される免疫応答に対するそれらの影響を調べた。ケモカイン発現カセットの構築 ケモカインＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−１α、ＭＣＰ−１およびＲＡＮ
ＴＥＳ遺伝子をＫｉｍ，Ｊ．Ｊ．，Ｄ／Ｂ／Ｗｅｉｎｅｒ（１９９７）Ｓｐｒｉ
ｎｇｅｒ Ｓｅｍ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ １９，１７４−１９５；Ｋｉｍ
，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔ．１５，６４
１−６４５；およびＫｉｍ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１５８，８１６−８２６（これらの各々は本明細書において援用され
る）に説明されている方法を用いてｐＣＤＮＡ３プラスミド発現ベクター内へ個
々にクローン化した。これらのケモカイン発現カセットは全挿入物（５’および
３’両方の隣接配列を含んで）の配列分析により確認された。加えて、これらの
ケモカイン構築物はインビトロでＲＤ細胞へトランスフェクトされ、これらの構
築物の発現が関連抗体を使用する免疫沈降により、またはケモカインＥＬＩＳＡ
により確認された。ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−１およびＲＡＮＴＥＳの
ための発現構築物はまたワクチンとしても使用され、マウスを免疫した。材料お
よび方法に説明されているインビボ発現技術により、これらの構築物はインビボ
でマウス筋肉組織中にそれらがコードしているケモカインを発現したことが決定
された。ＩＬ−８はＴヘルパー応答の強力な誘導剤である ワクチン誘導応答に対する種々のケモカインの影響が個々に分析された。ｐＣ
ＥｎｖおよびｐＣＥｎｖ＋ＩＬ−８免疫マウスからの抗血清を集め、ＥＬＩＳＡ
によりＨＩＶ−１ ｇｐ１２０タンパク質に対する特異的抗体応答を分析した。
ＤＮＡ免疫感作後０、２、４および６週に集められた血清からのｇｐ１２０特異
的抗体力価が測定された。１：１２８希釈において、ｐＣＥｎｖ＋ＩＬ−８で免
疫した群からの血清はｇｐ１２０タンパク質に対する抗体応答を示し、それはｐ
ＣＥｎｖ単独で免疫した群からの応答よりも高かった。同様の結果がｐＣＧａｇ
／ｐｏｌで免疫した群で観察された。さらに、ＩＬ−８遺伝子の共投与により誘
導されたｇｐ１２０特異的ＩｇＧのサブクラスが決定された。ＩｇＧ１型の生成
はＴｈ２型サイトカインにより誘導されるが、ＩｇＧ２型の生成はＴｈ１型サイ
トカインにより誘導される。ＩｇＧ２ａに対するＩｇＧ１（Ｔｈ１に対するＴｈ
２）の相対比が測定された。ｐＣＥｎｖ免疫化群はＩｇＧ２ａに対するＩｇＧ１
の比が１．３であった。一方、ｐＣＥｎｖ＋ＩＬ−８の共注射は相対比を０．９
に減少させ、Ｔｈ１型応答への移行を示している。従って、ＩＬ−８は抗原特異
的応答の質および量の両方に影響を及ぼした。
【０１０３】 Ｔヘルパー細胞増殖応答に対するＩＬ−８発現の影響もまた試験された。ＨＩ
Ｖ−１免疫原（ｐＣＥｎｖまたはｐＣＧａｇ／ｐｏｌ）とＩＬ−８の共発現は抗
原特異的Ｔヘルパー細胞増殖応答の劇的なレベルを生じた。増殖の増加は４から
６倍の間であった（抗原特異的応答の著しい亢進）。加えて、誘導されたＣＴＬ
応答に対するＩＬ−８共発現の影響も調べられた。対照動物からはバックグラウ
ンドレベルの特異的溶解が観察されたが、ｐＣＥｎｖ単独で免疫した動物は小さ
いが、しかし一貫したレベルのＣＴＬ応答を示した。ＩＬ−８共投与は抗原特異
的ＣＴＬ応答に対して促進効果を持っていなかった。同様なＣＴＬ結果がｐＣＧ
ａｇ／ｐｏｌ＋ＩＬ−８共免疫感作で観察された。
【０１０４】 サイトカインは免疫応答の間、免疫細胞の方向付けおよび標的化に鍵となる役
割を果たしている、例えば、ＩＦＮ−γはＴ細胞仲介細胞障害性免疫応答の制御
に複雑に関与しており、一方、ＩＬ−４はＢ細胞仲介免疫応答において支配的な
役割を果たしている。ＴＮＦ−αは活性化マクロファージおよび単球、好中球、
活性化リンパ球およびＮＫ細胞により産生され、他の前炎症性サイトカイン合成
の制御に中枢の役割を果たしていると示唆されている。我々はＣＴＬアッセイの
ためにインビトロで刺激されたエフェクター細胞からの上清を分析し、サイトカ
インＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αの放出を試験した。ＩＬ−８発現は
ＴＮＦ−αレベルをほんのわずか増加させたが、サイトカインＩＦＮ−γおよび
ＩＬ−４レベルには影響しなかった。体液性応答に対するＩＬ−８の共送達の劇
的な影響は、ＩＬ−４に対する顕著な影響を持っていることを期待させるのでこ
のことは幾分驚くべきことである。しかしながら、それは観察されなかった。ＭＩＰ１−αは抗体応答の強力な誘導剤である ＭＩＰ１−αの共発現は抗原特異的体液性応答の誘導においてＩＬ−８よりも
劇的な影響を示した。ｐＣＥｎｖ＋ＭＩＰ−１α共免疫感作はエンベロープ特異
的抗体応答の劇的な促進を生じた。同様な結果がｐＣＧａｇ／ｐｏｌで免疫した
群で観察された。ｐＣＥｎｖ＋ＭＩＰ−１αを共投与した後のＩｇＧ２ａに対す
るＩｇＧ１の相対比が決定された。ｐＣＥｎｖ免疫群はＩｇＧ２ａに対するＩｇ
Ｇ１の比が１．３であった。一方、ｐＣＥｎｖ＋ＭＩＰ−１αの同時注射は相対
比を１．７に上昇させ、Ｔｈ２型応答への移行を示している。ＨＩＶ−１免疫原
（ｐＣＥｎｖまたはｐＣＧａｇ／ｐｏｌ）とＭＩＰ−１αの共発現は抗原特異的
Ｔヘルパー細胞増殖応答の促進を生じた。対照的に、ＭＩＰ−１α免疫感作は抗
原特異的ＣＴＬ応答またはサイトカイン誘導にはほとんど影響しなかった。ＩＬ
−８の分析で観察されたように、サイトカイン産生に対する影響については、Ｉ
Ｌ−４レベルには再び何の影響も観察されなかった。ＲＡＮＴＥＳはＴｈ１ならびにＣＴＬ応答を誘導する 次にワクチン誘導免疫応答に対するＲＡＮＴＥＳ共送達の影響が試験された。
ＩＬ−８およびＭＩＰ−１αと異なりｐＣＥｎｖとＲＡＮＴＥＳの共発現はＨＩ
Ｖ−１エンベロープ特異的抗体応答を促進しなかった。加えて、ｐＣＥｎｖ＋Ｒ
ＡＮＴＥＳ共免疫感作は、ｐＣＥｎｖ単独での免疫化群と比較した場合、ＩｇＧ
１−ＩｇＧ２ａ比に対して何の影響も与えなかった。抗体応答とは対照的に、Ｈ
ＩＶ−１免疫原（ｐＣＥｎｖまたはｐＣＧａｇ／ｐｏｌ）とＲＡＮＴＥＳの共ワ
クチン接種は抗原特異的Ｔヘルパー細胞増殖応答の著しい増加を生じた。さらに
、ｐＣＥｎｖ＋ＲＡＮＴＥＳを共投与した群からは２倍高いレベルのＴｈ１サイ
トカインＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α発現が観察された。ＣＴＬ活性には極微の
影響しか与えないｐＣＥｎｖ＋ＩＬ−８またはｐＣＥｎｖ＋ＭＩＰ−１αでの共
注射と異なり、ＨＩＶ−１エンベロープを発現しているワクシニア（ｖＭＮ４６
２）感染標的の特異的溶解のより劇的な増加がｐＣＥｎｖ＋ＲＡＮＴＥＳの共注
射後に観察された。５０：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でｐＣＥｎｖ＋
ＲＡＮＴＥＳを共注射後、標的細胞の３６％を超える特異的溶解が観察された。
同様に、ｐＣＧａｇ／ｐｏｌ＋ＲＡＮＴＥＳで免疫したマウスではＨＩＶ−１
ｇａｇ／ｐｏｌを発現しているワクシニア（ｖＶＫ１）感染標的の抗原特異的Ｃ
ＴＬ溶解が著しく促進された。ＲＡＮＴＥＳ共送達は生じる応答をＴｈ１型表現
型に偏らせるが、再び、ＩＬ−４に対しては影響を及ぼさなかった。ＭＣＰ−１はＣＴＬ応答を誘導する 次にＭＣＰ−１ ｃＤＮＡのアジュバント特性が観察された。ＭＣＰ−１はｐ
ＣＥｎｖ免疫感作により誘導される特異的抗体結合プロフィールには極微の影響
しか及ぼさないようである。さらに、ＨＩＶ−１免疫原（ｐＣＥｎｖまたはｐＣ
Ｇａｇ／ｐｏｌ）とＭＣＰ−１の共発現は抗原特異的Ｔヘルパー細胞増殖応答の
促進に対して陽性ではあるが比較的小さな（２倍）促進を示した。ｐＣＥｎｖ＋
ＭＣＰ−１を共投与した後のＩｇＧ２ａに対するＩｇＧ１の相対比が決定された
。ｐＣＥｎｖ免疫群はＩｇＧ２ａに対するＩｇＧ１の比が１．３であった。一方
、ｐＣＥｎｖ＋ＭＣＰ−１の共注射は相対比を１．０に減少させ、Ｔｈ１型応答
への移行を示している。ｐＣＥｎｖ＋ＭＣＰ−１の共注射後に特異的溶解のより
劇的な増加が観察された。５０：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でｐＣＥ
ｎｖ＋ＭＣＰ−１を共注射後、標的細胞の３６％を超える特異的溶解が観察され
た。同様に、ｐＣＧａｇ／ｐｏｌ＋ＭＣＰ−１で免疫したマウスではＨＩＶ−１
ｇａｇ／ｐｏｌを発現している標的の抗原特異的ＣＴＬ溶解が著しく促進され
た。ｐＣＥｎｖ＋ＭＣＰ−１免疫マウスによるＩＦＮ−γ放出レベルは、ｐＣＥ
ｎｖ免疫または対照群よりも著しく高かった。再び、すべての群からのＩＬ−４
放出レベルは同様であった。さらに、ｐＣＥｎｖ＋ＭＣＰ−１免疫マウス群によ
るＴＮＦ−α放出レベルは、ｐＣＥｎｖ免疫または対照群よりも著しく高かった
。これらのサイトカイン放出データはＣＤ８+ ＣＤＬの活性化におけるＭＣＰ −１の役割を明瞭にする我々のＣＴＬ結果を支持している。ＣＴＬ応答におけるＣＤ８制限の決定 ＭＣＰ−１およびＲＡＮＴＥＳでの共発現によるＣＴＬ応答の増加がＣＤ８+ Ｔ細胞に制限されていたかどうかを決定するため、ｂａｌｂ／ｃマウスでＭＨＣ
クラスＩ制限ＣＴＬの特異的エピトープであることが示されているＨＩＶ−１エ
ンベロープペプチド（ＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮ）を用いてＣＴＬアッセ
イが実施された。マウスは５０μｇの各々のＤＮＡ構築物で２週間あけて免疫感
作し、第二の免疫感作１週間後に脾臓を採取した。ＣＴＬアッセイはインビトロ
でエンベロープ特異的ペプチドを用いて刺激した後に脾臓細胞に対して実施され
た。ＭＣＰ−１およびＲＡＮＴＥＳでの共注射後の両方において、５０：１のＥ
：Ｔ比で各々３５％および２６％特異的溶解でのＣＴＬ応答の著しい促進が観察
された。補体溶解によりエフェクター細胞集団からＣＤ８+Ｔ細胞を除去した後 にＣＴＬ活性を測定することにより前記の観察を確認した。ＣＤ８+Ｔ細胞の除 去はＭＣＰ−１およびＲＡＮＴＥＳでの共注射後に観察された抗原特異的ＣＴＬ
促進を抑制した。これらの結果は、細胞溶解活性の促進は抗原特異的、クラスＩ
制限およびＣＤ８+Ｔ細胞依存的であったことを示している。ケモカイン発現の促進 これらの特異的ケモカイン抗原増強免疫原のケモカイン産生それ自身に対する
影響を決定するのは重要である（もしあれば）。免疫化動物から集められた刺激
された細胞によるケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳおよび
ＭＣＰ−１の発現を調べた。ケモカイン共注射はケモカイン特異的パターンでケ
モカイン産生を調節した。いくつかの重要な観察が行われた。さらに、ケモカイ
ン遺伝子との共免疫感作により刺激された細胞によるケモカイン発現が増加する
ことが観察された。例えば、ＭＩＰ−１α発現はｐＣＥｎｖ＋ＭＣＰ−１の共免
疫感作により、ｐＣＥｎｖ免疫感作単独により発現されたレベルより劇的に促進
できたことが観察された。加えて、ＭＩＰ−１β発現はｐＣＥｎｖ＋ＭＣＰ−１
およびｐＣＥｎｖ＋ＲＡＮＴＥＳ免疫感作（二つの最も顕著なＣＴＬ応答の誘導
剤）により劇的に促進されたことも観察された。さらに、ｐＣＥｎｖ＋ＭＩＰ−
１α、ｐＣＥｎｖ＋ＭＣＰ−１およびｐＣＥｎｖ＋ＲＡＮＴＥＳ共免疫感作は刺
激された細胞によるＲＡＮＴＥＳ発現を著しく促進させた。最後に、ＭＣＰ−１
の発現はｐＣＥｎｖ＋ＭＩＰ−１αおよびｐＣＥｎｖ＋ＭＣＰ−１共免疫感作で
最も高かった。 考察 炎症性反応の免疫の開始は、細胞性接着分子、サイトカインおよびケモカイン
の厳しく調整された発現を含んだ複雑な過程である。ケモカインは血管から宿主
防御の末端部位への白血球やりとりの分子的制御に特に重要である。ケモカイン
のスーパーファミリーは２０を超す関連タンパク質のアレイから成っている。ケ
モカインは保存されているシステイン残基の存在および位置に基づいて大きく三
つのファミリー、Ｃ−Ｘ−Ｃ（α）、Ｃ−Ｃ（β）およびＣ（γ）、に分割され
る。αファミリー構成物においては、最初の二つのシステインが別のアミノ酸に
より引き離されており、一方βファミリー構成物ではお互いに隣に置かれている
。これまでのところ、γファミリーは二つの構成物しか同定されていないが、そ
れらの両方ともそのＮ末端には二つのシステインの代わりに一つのシステインし
か含まれていない。
【０１０５】 各々のサブファミリーの構成物は独特のならびに重複する活性を持っている。
正確な生理学的および病理学的機能は未だに明確には定義されていないが、文献
からある種の簡単な一般性は作成することができる。一般に、Ｃ−Ｘ−Ｃファミ
リー構成物は、好中球、好酸球および好塩基球を含む多形核白血球の化学誘引剤
および活性化剤であると報告されている。対照的に、Ｃ−Ｃファミリーは単球お
よびリンパ球のような単核細胞の走化性因子として働く。一方、Ｃ−Ｘ−Ｃケモ
カイン、ＩＬ−８およびＩＬ−１０はＴリンパ球の走化性因子として伝えられて
おり、Ｃ−Ｃケモカイン、ＭＣＰ−１、ＭＰＣ−３、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ
−１αもまた好塩基球の走化性因子である。一般に、ケモカインの機能は炎症部
位での白血球の補充および活性化であるようである。
【０１０６】 炎症性および免疫応答におけるそれらの機能に加え、いくつかのケモカインは
ＡＩＤＳの原因であるＨＩＶ−１および２の伝播および進行に重要な役割を果た
している。１０年の間、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０のＣＤ４０
への結合はウイルス融合および進入には十分ではないと予想されており、ＨＩＶ
感染のための追加の細胞表面補因子の必要性が示唆されている。最近の研究から
Ｔ細胞指向性およびマクロファージ指向性ウイルスとそれらの標的細胞の融合に
必要とされる補レセプターは各々ＣＸＣＲ−４およびＣＣＲ−５であると同定さ
れた。
【０１０７】 ＣＸＣＲ−４（ＬＥＳＴＲとしても知られている）は元々ケモカインレセプタ
ーと構造類似性を持つオーファンレセプターとして発見された。ＣＸＣＲ−４は
続いてＴ細胞指向性ＨＩＶウイルスのＣＤ４+細胞内への侵入のために必要な補 因子として同定された。β−ケモカインＳＤＦ−１はＣＸＣＲ−４のリガンドで
あり、Ｔ細胞指向性ＨＩＶ−１株による感染の強力な阻害剤である。同様に、β
−ケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳはＣＣＲ−５の天
然のリガンドであり、マクロファージ指向性（しかしＴ細胞指向性ではない）Ｈ
ＩＶ単離物のためのＣＤ８+Ｔ細胞により産生される主ＨＩＶ抑制因子の一つで ある。
【０１０８】 これらの研究において、ＤＮＡ免疫原を注射した後に著しいレベルのケモカイ
ン発現が観察されている。これらの結果は、免疫応答の重要な活性化剤および制
御剤としてのケモカインの潜在的役割を暗示している。免疫誘導および調節にお
けるこれらのケモカインの特異的役割を評価するため、抗原送達モデルとしてケ
モカインＤＮＡ発現カセットの共送達を利用した。ＤＮＡワクチンはＭＨＣクラ
スＩおよびＩＩ経路を経て体液性および細胞性免疫応答の両方を誘導するので、
ＤＮＡ共免疫感作はケモカインのインビボでの機能を調べるのに適したモデルで
ある。さらに、我々および他の研究者はＤＮＡワクチンに対する抗原特異的免疫
応答が、共刺激性分子およびサイトカイン遺伝子とＤＮＡ免疫原カセットを共注
射することにより調節できることを示している。従って、ケモカイン発現ベクタ
ーとＨＩＶ−１ ＤＮＡ免疫原を共免疫感作し、免疫活性化に対するケモカイン
発現の影響を調べた。α−ケモカインＩＬ−８およびβ−ケモカインＭＩＰ１−
α、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１は抗原特異的免疫応答の活性化に特異的で同
定可能な役割を持っていた。
【０１０９】 例えば、ＩＬ−８は好中球の走化性因子であり、それらを血流中から放出して
周囲の組織へ移行させる。ＩＬ−８はＣＤ４+Ｔ細胞の強力な誘導剤であること が観察され、それは強いＴヘルパー細胞増殖応答ならびに抗体応答により示され
た。ＩＬ−８共発現はまた、免疫応答型のＴｈ−１型への移行を調節し、それは
ＩｇＧ２ａに対するＩｇＧ１の比の減少および促進されたＩＦＮ−γ発現により
示された。一方、ＩＬ−８共発現はＣＴＬ応答に対して何の促進効果を持ってい
なかったので、ＣＤ８+Ｔ細胞に対しては注目に値する影響を及ぼさない。
【０１１０】 ＭＩＰ−１αは好酸球を化学誘引および脱顆粒できる。ＭＩＰ−１αはまた、
好塩基球および肥満細胞からのヒスタミン放出を誘導し、好塩基球およびＢ細胞
の走化性因子でもある。これらの報告はＭＩＰ−１αが抗体応答に対して最も大
きな効果を持っているという我々の観察を支持している。加えて、ＭＩＰ−１α
はまたＣＤ４+Ｔ細胞の強力な誘導剤でもあり、良好なＴヘルパー細胞増殖応答 を示した。ＭＩＰ−１α共発現はまた、免疫応答のＴｈ−２型への移行も調節し
、それはＩｇＧ２ａに対するＩｇＧ１の比の増加により示された。対照的に、Ｍ
ＩＰ−１α共発現はＣＤ８+Ｔ細胞に対しては軽微な影響しか示さなかった。
【０１１１】 ＩＬ−８およびＭＩＰ−１αの効果と異なり、ＲＡＮＴＥＳ共免疫感作は抗体
応答に対して軽微な影響しか示さなかった。ＲＡＮＴＥＳは単球化学誘引剤であ
る。加えて、ＲＡＮＴＥＳは非刺激ＣＤ４+／ＣＤ４５ＲＯ+記憶Ｔ細胞および刺
激ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞を化学誘引できる。ＤＮＡ免疫感作部位へＣＤ４ + およびＣＤ８+Ｔ細胞を化学誘引するＲＡＮＴＥＳの能力がＴヘルパー細胞増殖
応答およびＣＴＬ応答の誘導において重要な役割を果たすことが観察された。Ｔ
ｈ１応答の促進された活性化は、Ｔｈ１サイトカインＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−
α発現の増加により支持された。ＲＡＮＴＥＳ発現により誘導された高レベルの
ＣＴＬ応答は、クラスＩ制限およびＣＤ８+Ｔ細胞依存性であることから決定さ れた。
【０１１２】 単球の強力な走化性因子であるので、ＭＣＰ−１は慢性炎症性疾患の最も重要
なケモカインの一つと考えられる。ＭＣＰ−１は単球を血流から移動させて組織
マクロファージにすることを誘導する。ＭＣＰ−１は活性化された記憶サブセッ
トのＴリンパ球を化学誘引することが観察されている。試験されたすべてのケモ
カインの中で、ＭＣＰ−１はＣＤ８+ＣＴＬの最も強力な活性化剤である。ＭＣ Ｐ−１発現により誘導されるＣＴＬ応答の促進は、クラスＩ制限およびＣＤ８+ Ｔ細胞依存性であると決定された。促進されたＣＴＬ結果はＴｈ１サイトカイン
ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α発現の増加およびＩｇＧ２ａに対するＩｇＧ１の比
の減少により支持される。ＲＡＮＴＥＳと異なり、ＭＣＰ−１は陽性、しかし中
程度のＴヘルパー細胞増殖応答に対する効果を持っていた。この比較から、体液
性ＴヘルパーおよびＴ細胞毒性応答はお互いに独立して調節できることが強調さ
れる。
【０１１３】 免疫応答に対する直接的な影響に加え、ケモカイン遺伝子の共発現は自己分泌
様式での発現が増加した。例えば、ＭＩＰ−１α発現がｐＣＥｎｖ＋ＭＩＰ−１
αで共免疫感作することにより、ｐＣＥｎｖ免疫感作単独で発現されるレベルよ
りも劇的に促進できたことが観察された。ＲＡＮＴＥＳの同様の増加がＲＡＮＴ
ＥＳ共送達で観察され、ＭＣＰ−１が増加した。
【０１１４】 さらに、ケモカインの共発現でもまた他のケモカインの発現が促進された。こ
れらの結果は、これらのケモカインは免疫応答を調節する直接的な役割を持って
いるばかりではなく、他のケモカインの産生を制御するようにも働くことを暗示
している。
【０１１５】 重要な観察は、ケモカインＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１がＴＮＦ−α発現を
誘導する役割であった。ＴＮＦ−αは活性化マクロファージおよび単球、好中球
、活性化リンパ球およびＮＫ細胞により産生され、一方ＴＮＦ−βはリンパ球に
より産生される。ＴＮＦ−αはまたグラム陰性細菌感染後の敗血症性ショックお
よびリウマチ様関節炎にも暗示されている。さらに、ＴＮＦ−αは他の前炎症性
サイトカイン合成の制御に中枢の役割を果たしている。種々の病気におけるＴＮ
Ｆ−αの決定的な役割を仮定し、リウマチ様関節炎のような状態の処置可能性と
して、インビボでＴＮＦ−αレベルを低下させることが努力されてきた。我々の
実験において、ＲＡＮＴＥＳまたはＭＣＰ−１の共発現はＴＮＦ−α発現の促進
が生じることが観察された。これらの結果は、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１を
阻害することで、インビボでＴＮＦ−α発現を変化させるための適切な戦略を組
み立てることができることを暗示している。
【０１１６】 Ｔｈ１対Ｔｈ２表現型は独立して他の免疫機能を分離するように見えることは
興味が持たれる。ＩＬ−８は体液性応答を押し上げるが、これらの応答をＴｈ１
型の方へ駆り立て、ＩｇＧ／ＩｇＧ２ａ比を半分にする。一方、ＭＩＰ−１α（
多分血清学での最も多くの駆動体）はＩｇＧ／ＩｇＧ２ａ比を劇的にＴｈ２応答
の方へ変化させる。この操作はお互いに独立して、一次抗原特異性免疫応答の誘
導を所望の表現型ならびにイムノグロブリンアイソタイプへ方向付けることがで
きることは明らかである。さらに、細胞性に対してより高い体液性応答の誘導は
比較的偏向された免疫機能であるようである。それらのケモカインは体液性応答
に対して最も劇的な効果を示す。ＩＬ−８およびＭＩＰ−１αはＣＴＬ応答に対
してはほとんど影響を与えないが、一方、ＣＴＬ応答に対して最も劇的な影響を
仲介するもの、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１は血清学的には極微の影響しか与
えない。同一のＣＴＬ駆動ケモカインＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１は両方とも
ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを刺激し、その間、体液性応答発生剤は免疫活性化
のこれらのサイトカイン刺激剤に対して極微の影響しか及ぼさない。実施例２ ＩＬ−８をコードしているヌクレオチド配列がワクチンまたは免疫療法剤の一
部としてある種の細胞へ送達された場合、完全長形では不活性であり成熟形にプ
ロセッシングされた場合にのみ活性になるのであまり有効ではない。図１Ａに示
したように、ＩＬ−８の最初の３５アミノ酸はカスパーゼ−１（ＩＣＥ）により
切断される。突然変異体ＩＬ−１８ヌクレオチド配列が構築され、それは図１Ｂ
に示した突然変異体ＩＬ−１８へ翻訳される。このＩＬ−１８の突然変異体形は
本発明による有効な免疫調節タンパク質として働く。免疫原をコードしているヌ
クレオチド配列と組み合わされた突然変異体ＩＬ−１８をコードしているヌクレ
オチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。突然変異体形をコー
ドしているヌクレオチド配列はｐＣＤＮＡ３内へ挿入されるであろう。実施例３ 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＣＤ４０をコード
しているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。
【０１１７】 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＣＤ４０をコード
しているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＣＤ４０Ｌをコー
ドしているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。
【０１１８】 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＦａｓをコードし
ているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＩＣＡＭ−１をコ
ードしているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。
【０１１９】 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＩＣＡＭ−１をコ
ードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＬＦＡ−３をコー
ドしているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。
【０１２０】 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＬＦＡ−３をコー
ドしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＶＣＡＭ−１をコ
ードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
【０１２１】 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＰＥＣＡＭ−１を
コードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される
。
【０１２２】 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＥ−セレクチンを
コードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される
。
【０１２３】 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＭ−ＣＳＦをコー
ドしているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＧ−ＣＳＦをコー
ドしているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。
【０１２４】 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＭ−ＣＳＦをコー
ドしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＧ−ＣＳＦをコー
ドしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
【０１２５】 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＩＬ−４をコード
しているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＥ−セレクチンを
コードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される
。
【０１２６】 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＩＬ−７をコード
しているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＮＧＦをコードし
ているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。
【０１２７】 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＶＥＧＦをコード
しているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＩＬ−７をコード
しているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
【０１２８】 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＮＧＦをコードし
ているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＶＥＧＦをコード
しているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
【０１２９】 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＭＣＰ−１をコー
ドしているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＲＡＮＴＥＳをコ
ードしているヌクレオチド配列の送達によりＣＴＬ応答が促進される。
【０１３０】 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＭＣＰ−１をコー
ドしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＲＡＮＴＥＳをコ
ードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
【０１３１】 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＭＩＰ−１αをコ
ードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＩＬ−８をコード
しているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーＴ細胞応答が促進される。
【０１３２】 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＭＣＰ−１、ＲＡ
ＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＩＬ−８の任意の一つの送達により抗体応答が促
進される。
【０１３３】 ＭＣＰ−１またはＲＡＮＴＥＳの任意の一つの送達によりＴＮＦ−α産生が促
進される。 免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたＭＣＰ−１、ＲＡ
ＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＩＬ−８の任意の一つの送達によりＩＦＮ−γ産
生が促進される。実施例４ Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージ−コロニー刺激因子）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球−Ｃ
ＳＦ）およびＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球／単球−ＣＳＦ）のための遺伝子発現カセッ
トならびにＨＩＶ−１ ＤＮＡ免疫原構築物の共送達後の抗原特異的免疫応答に
対する影響を試験した。これらのサイトカインのための遺伝子は個々にサイトメ
ガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター制御下の発現ベクター内へクローン化した
。遺伝子プラスミド発現カセットは次にＨＩＶ−１免疫原のためのＤＮＡワクチ
ンカセットとともにマウスに注射された。抗原特異的免疫応答の方向性および程
度に対するこれらの遺伝子アジュバントカセットでの共注射の免疫学的効果を分
析した；これらの結果は原型Ｔｈ１およびＴｈ２型サイトカイン（各々ＩＬ−１
２およびＩＬ−４）遺伝子の共送達で観察された結果と比較された。モデル抗原
としてこれらのＤＮＡワクチン構築物を用い、ＣＳＦがインビボで抗原特異的免
疫応答を劇的におよび明白に制御でき、およびワクチン特異的様式でβ−ケモカ
イン産生を駆動していることが観察された。材料および方法 ＤＮＡプラスミド ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（ｐＣＥｎｖ）およびｇａｇ／ｐｏｌタン
パク質（ｐＣＧａｇ／Ｐｏｌ）を発現しているＤＮＡワクチンはＢｏｙｅｒ，Ｊ
．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３，５２６−５３２
（本明細書において援用される）に説明されているように製造された。ヒトＧ−
ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦならびにマウスＧＭ−ＣＳＦのための遺伝子はＫｉｍ，
Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８，１０
８９−１１０３およびＫｉｍ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉ ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ．１０２，１１１２−１１２４（本明細書において援用される
）に説明されているようにｐＣＤＮＡ３発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，
Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）内へクローン化された。ヒトＧ−ＣＳＦ
およびＭ−ＣＳＦはマウス細胞中で活性であることが報告されている。きれいな
プラスミドは細菌中で製造され、Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐキット（Ｑ
ｉａｇｅｎ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて精製された。試薬および細胞株 マウス肥満細胞腫Ｐ８１５細胞株はＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）か
ら入手した。ＨＩＶ−１エンベロープ（ｖＭＮ４６２）、ｇａｇ／ｐｏｌ（ｖＶ
Ｋ１）およびβ−ガラクトシダーゼ（ｖＳＣ８）を発現している組換え体ワクチ
ンはＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅ
ａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍから入手した。組換え体ｇｐ１２０またはｐ２４タ
ンパク質はＩｍｍｕｎｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ，
ＭＡ）から入手した。マウスのＤＮＡ接種 ６から８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄ
ａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の大腿４頭筋にリン
酸緩衝液（ＰＢＳ）および０．２５％ブピバカイン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ
．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に処方した問題とする各々のＤＮＡ構築物５０μｇを注射
した。種々の遺伝子発現カセットの投与は、注射前に選択されたプラスミドを混
合することにより行った。対照マウスは５０μｇのｐＣＤＮＡ３ベクターで免疫
した。各々の研究の組は３度実施され、代表的な組の結果が示されている。マウ
スには２回の免疫感作（各々５０ｍｇ）を２週間の間隔で行った。追加注射１週
間後、マウスを殺し、脾臓を採取してリンパ球を単離し、細胞応答を試験した（
ＴｈまたはＣＴＬ）。すべての動物は温度制御し、明暗を反復させたペンシルバ
ニア大学の施設で飼い、それらの世話は米国国立保健研究所およびペンシルバニ
ア大学のガイドラインに沿っていた。ＥＬＩＳＡ ０．１Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）で２ｍｇ／ｍｌ濃度に希釈し
た１５μｇのｐ２４またはｇｐ１２０タンパク質を４℃で一夜、マイクロタイタ
ーウェルに吸着させた。プレートはＰＢＳ−０．０５％トウィーン−２０で洗浄
し、３７℃で１時間３％ＢＳＡのＰＢＳ−０．０５％トウィーン−２０溶液でブ
ロックした。マウス抗血清は０．０５％トウィーン−２０で希釈し、３７℃で１
時間インキュベートし、次にＨＲＰ−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とインキュベートした。プレートを洗浄し、３’３’５
’５’ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）緩衝溶液で発色させた。ｇｐ１２０特異的ＩｇＧサ
ブクラスの相対レベルの決定には、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを抗マウスＩｇＧ１
およびＩｇＧ２ａ結合ＨＲＰ（Ｚｙｒｎｅｄ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃ
Ａ）に置換した。続いてＡＢＴＳ基質溶液（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌ
ａ，ＣＡ）が添加された。各々の工程において、プレートは洗浄緩衝液（ＰＢＳ
＋０．０５％トウィーン−Ｘ）で３回洗浄された。プレートはＤｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ５０００プレートリーダー上、４５０ｎｍの光学密度が読みとられた。Ｔヘルパー細胞増殖アッセイ リンパ球は脾臓から採取され、赤血球を除去することによりおよび新鮮な培地
で数回洗浄することによりエフェクター細胞として調製された。単離された細胞
懸濁液は５ｘ１０6細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。５ｘ１０5細胞を含んでいる
１００μｌをすぐに９６ウェルマイクロタイター平底プレートの各々へ加えた。
５μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの最終濃度で組換え体ｐ２４またはｇｐ１２０
タンパク質をウェルに３重に加えた。細胞は５％ＣＯ2中、３７℃で３日間イン キュベートした。各々のウェルに１ｍＣｉのトリチウム化チミジンを加え、細胞
は３７℃で１２から１８時間インキュベートした。プレートをとり、取り込まれ
たトリチウム化チミジンの量をＢｅｔａ Ｐｌａｔｅリーダー（Ｗａｌｌａｃ，
Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定した。刺激指数は式： 刺激指数（ＳＩ）＝（実験的カウント／自発的カウント） から決定された。自発的カウントウェルは不適切タンパク質対照として働く１０
％ウシ胎児血清を含んでいる。細胞障害性Ｔリンパ球アッセイ ワクシニア感染標的を使用して５時間の51Ｃｒ放出ＣＴＬアッセイが実施され
た。アッセイはインビトロでのエフェクター刺激で実施され、エフェクターは適
切なワクシニア感染細胞（エンベロープに対してはｖＭＮ４６２およびｇａｇ／
ｐｏｌに対してはｖＶＫ１）で刺激され、それは５日間、ＣＴＬ培養培地中５ｘ
１０6細胞／ｍｌで、０．１％グルタルアルデヒドを用いて固定された。エフェ クターはＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，
ＮＹ）、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）およびＣｏｎ Ａを含まな
い１０％ＲＡＴ−Ｔ−ＳＴＩＭ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗ
ａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から成るＣＴＬ培養培地で２日間、非特異的に
刺激された。ワクシニア感染標的は３７℃で５から１２時間、１０−２０の感染
多重度（ＭＯＩ）で３ｘ１０6のＰ８１５細胞を感染させることにより調製され た。標準クロム放出アッセイが実施され、そこで標的細胞は１００ｍＣｉ／ｍｌ
Ｎａ2 51ＣｒＯ2で６０から１２０分間標識され、刺激エフェクター脾臓細胞と
３７℃で６時間インキュベートされた。ＣＴＬ溶解は５０：１から１２．５：１
の範囲のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で決定された。上清を採取し、ＬＫＢ
ＣｌｉｎｉＧａｍｍａガンマ−カウンターで計数された。パーセント特異的溶
解は式： １００ｘ実験的放出−自発的放出 最大放出−自発的放出 から決定された。最大放出は１％トリトンＸ−１００含有培地中の標的細胞の溶
解により決定された。”自発的放出”のカウントが”最大放出”の２０％を超え
たならば、アッセイは正当とは考えられなかった。ＣＤ８+Ｔ細胞の補体溶解 ＣＤ８+Ｔ細胞はα−ＣＤ８モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓ ａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）による処理により脾臓細胞から取り出され、続いてウ
サギ補体（Ｓｉｇｍａ）と３７℃で４５分間インキュベートした。サイトカイン／ケモカイン発現分析 ＣＴＬアッセイのために刺激されたエフェクターからの上清が６日目に集めら
れ、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）およびＭＩＰ−１α（Ｒ＆Ｄ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、ＭＩＰ−ｌβおよびＲＡＮＴ
ＥＳ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ，Ｐａｃｅ，ＮＹ）のためのＥＬＩＳＡキットを使用し
てサイトカインおよびケモカインプロフィールが試験された。結果 サイトカイン発現カセットの構築 サイトカイン遺伝子は個々にｐＣＤＮＡ３プラスミド発現ベクター内へクロー
ン化された。サイトカイン構築物がそれらの適切なタンパク質を発現しているか
どうかを試験するため、それらをＲＤ筋肉細胞株内へトランスフェクトし、これ
らの構築物の発現をサイトカインＥＬＩＳＡにより分析した。結果は各々の発現
カセットが特異的サイトカインを産生していることを示している（Ｇ−ＣＳＦ
〜４０−６０ｐｇ／ｍｌ；ＧＭ−ＣＳＦ ＞７０ｐｇ／ｍｌ；Ｍ−ＣＳＦ 〜６
０−７０ｐｇ／ｍｌ）。Ｇ−ＣＳＦはＴヘルパー応答の促進を誘導する Ｇ−ＣＳＦはマクロファージ、線維芽細胞、内皮細胞および骨髄間質細胞によ
り産生される増殖因子である。Ｇ−ＣＳＦは好中球、内皮細胞および血小板を活
性化するが、抗原提示細胞には直接的な影響をほとんど及ぼさないと考えられて
いる。抗原特異的抗体応答に対するＧ−ＣＳＦ共発現の影響が試験された。ｐＣ
ＥｎｖおよびｐＣＥｎｖ＋Ｇ−ＣＳＦ免疫マウスからの抗血清を集め、ＥＬＩＳ
ＡによりＨＩＶ−１ ｇｐ１２０タンパク質に対する特異的抗体応答を分析した
。ＤＮＡ免疫感作６週間後に集められた血清からのｇｐ１２０特異的抗体力価が
測定された。Ｇ−ＣＳＦ共免疫感作はｇｐ１２０特異的抗体応答レベルには有意
な影響を与えなかった。同様な結果がｐＣＧａｇ／ｐｏｌで免疫した群で観察さ
れた。さらに、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の共投与により誘導されたｇｐ１２０特異的Ｉ
ｇＧのサブクラスが決定された。ＩｇＧ１型の産生はＴｈ２型サイトカインによ
り誘導され、一方、ＩｇＧ２ａ型の産生はＴｈ１型サイトカインにより誘導され
ることが報告されている。ＩｇＧ１（Ｔｈ２）に対するＩｇＧ２ａ（Ｔｈ１）の
相対比が測定された。ｐＣＥｎｖ免疫群は０．８のＩｇＧ１に対するＩｇＧ２ａ
の比を持っていた。一方、原型Ｔｈ１サイトカインＩＬ−１２遺伝子の共免疫感
作は比を１．２８に増加させ、Ｔｈ２サイトカインＩＬ−４遺伝子は比を０．６
８に減少させた。Ｇ−ＣＳＦの共投与は比を１．１に増加させ、Ｔｈ１型応答へ
の移行を示している。
【０１３４】 Ｔヘルパー細胞増殖応答に対するＧ−ＣＳＦの影響もまた試験された。Ｔヘル
パーリンパ球はＢ細胞を経る体液性免疫応答およびＣＤ８+細胞障害性Ｔ細胞を 経る細胞性免疫応答の両方に決定的な役割を果たしている。ＩＬ−１２遺伝子の
共免疫感作は抗原特異的Ｔｈ増殖応答レベルを劇的に促進した。対照的に、ＩＬ
−４遺伝子の共注射はＴｈ増殖応答に極微な影響しか及ぼさなかった。ＨＩＶ−
１免疫原とのＧ−ＣＳＦ共発現は抗原特異的Ｔヘルパー細胞増殖応答の正の促進
を生じた。
【０１３５】 加えて、ＣＴＬ応答に対するサイトカイン共発現の影響も調べられた。対照動
物からはバックグラウンドレベルの特異的溶解が観察されたが、ｐＣＥｎｖまた
はｐＣＧａｇ／ｐｏｌで免疫した動物は小さいがしかし陽性のレベルの抗原特異
的ＣＴＬ応答を示した。ＩＬ−１２遺伝子の共注射は抗原特異的ＣＴＬ応答のレ
ベルを劇的に促進した。対照的に、ＩＬ−４遺伝子の共免疫感作はこの応答には
極微な影響しか及ぼさなかった。同様に、Ｇ−ＣＳＦ共投与は抗原特異的ＣＴＬ
応答に何の促進効果も持っていなかった。
【０１３６】 サイトカインは免疫応答の間、免疫細胞の方向付けおよび標的化に鍵となる役
割を果たしている、例えば、ＩＦＮ−γはＴ細胞仲介細胞障害性免疫応答の制御
に複雑に関与しており、一方、ＩＬ−４はＢ細胞仲介免疫応答において支配的な
役割を果たしている。ＣＴＬアッセイのためにインビトロで刺激されたエフェク
ター細胞からの上清液を分析し、サイトカインＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の放出
を試験した。Ｇ−ＣＳＦ発現はＩＦＮ−γレベルを増加させるが（２倍）、ＩＬ
−４産生には影響しないことが見いだされた。ＧＭ−ＣＳＦは抗体およびＴヘルパー応答の強力な誘導剤である ＧＣ−ＣＳＦは顆粒球細胞を活性化および分化させ、内皮細胞、赤血球系細胞
、巨核球およびＴヘルパー細胞の増殖因子として働くことができる。ＧＭ−ＣＳ
ＦがキラーＴ細胞に影響を及ぼすことができるかどうかは明確ではない。Ｇ−Ｃ
ＳＦ共発現と対照的に、ＧＭ−ＣＳＦ共発現は抗原特異的体液性応答の誘導にお
いて著しい促進効果（すべての群で最も高い）を持っていた。ＩＬ−４共注射と
同様に、ＧＭ−ＣＳＦ共免疫感作は最も高いレベルのエンベロープ特異的抗体応
答を生じさせた。同様な結果がｐＣＧａｇ／ｐｏｌで免疫した群で観察された。
一方、ｐＣＥｎｖ＋ＧＭ−ＣＳＦ共免疫感作はｐＣＥｎｖ単独で免疫した群と比
較した場合、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比には何の影響も及ぼさなかった。さらに、
ＩＬ−１２共免疫感作とともに、ＨＩＶ−１免疫原（ｐＣＥｎｖまたはｐＣＧａ
ｇ／ｐｏｌ）とのＧＭ−ＣＳＦ共発現は最も高いレベルの抗原特異的Ｔヘルパー
細胞増殖応答を生じた。ＧＭ−ＣＳＦ発現はＩＦＮ−γレベルを増加させるが（
２倍）、ＩＬ−４産生には影響しないことも観察された。対照的に、ＧＭ−ＣＳ
Ｆ共免疫感作は抗原特異的ＣＴＬ応答にはわずかな影響しか及ぼさなかった。Ｍ−ＣＳＦはＣＴＬ応答の強力な誘導剤である Ｍ−ＣＳＦはマクロファージならびにマクロファージ前駆細胞の強力な活性化
剤である。Ｍ−ＣＳＦレセプターは制限された発現パターンを持っており、再び
マクロファージに限られている。そういうものであるので、このＡＰＣ集団に対
するＭ−ＣＳＦ共送達の直接効果が評価できる。ＧＭ−ＣＳＦと異なり、ｐＣＥ
ｎｖとのＭ−ＣＳＦの共発現はＨＩＶ−１エンベロープ特異的抗体応答に対して
陽性の促進効果を持っていた（しかしＩＬ−４またはＧＭ−ＣＳＦよりは小さい
）。ｐＣＥｎｖ＋Ｍ−ＣＳＦでの共投与後のＩｇＧ１に対するＩｇＧ２ａの相対
比が決定された。ｐＣＥｎｖ免疫群は０．８のＩｇＧ１に対するＩｇＧ２ａの比
を持っていた。一方、ｐＣＥｎｖ＋Ｍ−ＣＳＦの共注射は比を１．２に増加させ
、Ｔｈ１型応答への強い移行を示している。さらに、ＨＩＶ−１免疫原（ｐＣＥ
ｎｖまたはｐＣＧａｇ／ｐｏｌ）とのＭ−ＣＳＦ共発現は抗原特異的Ｔヘルパー
細胞増殖応答の著しい増加を生じた。ＣＴＬ活性にほとんど影響を及ぼさないｐ
ＣＥｎｖ＋Ｇ−ＣＳＦまたはｐＣＥｎｖ＋ＧＭ−ＣＳＦ共注射と異なり、ｐＣＥ
ｎｖ＋Ｍ−ＣＳＦ共注射後に、ＨＩＶ−１エンベロープを発現しているワクシニ
ア感染標的（ｖＭＮ４６２）の特異的溶解における、より劇的な増加が生じた。
５０：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でのｐＣＥｎｖ＋Ｍ−ＣＳＦ共注射
後に、標的細胞のほとんど４０％の特異的溶解が観察された。同様に、ｐＣＧａ
ｇ／ｐｏｌ＋Ｍ−ＣＳＦで免疫したマウスでは、ＨＩＶ−１ ｇａｇ／ｐｏｌを
発現しているワクシニア感染標的（ｖＶＫ１）の抗原特異的ＣＴＬ溶解の著しい
促進が生じた。ｐＣＥｎｖ＋Ｍ−ＣＳＦで免疫したマウスによるＩＦＮ−γ放出
レベルは、ｐＣＥｎｖ免疫または対照群よりも著しく高かった。一方、これらの
群のＩＬ−４レベルは類似していた。Ｍ−ＣＳＦ共免疫感作によるＣＴＬ応答の促進はＣＤ８Ｔ細胞制限的である Ｍ−ＣＳＦ共発現を経るＣＴＬ応答の増加がＣＤ８+Ｔ細胞に制限されている かどうかを決定するため、ｂａｌｂ／ｃマウスでＭＨＣクラスＩ制限ＣＴＬの特
異的エピトープであることが示されているＨＩＶ−１エンベロープペプチド（Ｒ
ＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮ）を用いてＣＴＬアッセイが実施された。マウス
は５０μｇの各々のＤＮＡ構築物で２週間あけて免疫感作し、第二の免疫感作１
週間後に脾臓を採取した。ＣＴＬアッセイは前記のようにインビトロでエンベロ
ープ特異的ペプチドを用いて刺激した後に単離脾臓細胞に対して実施された。Ｍ
−ＣＳＦ両方の共注射後、５０：１のＥ：Ｔ比で４０％の特異的溶解を示すＣＴ
Ｌ応答の著しい促進が観察された。補体溶解によりエフェクター細胞集団からＣ
Ｄ８+Ｔ細胞を除去した後にＣＴＬ活性を測定することによりこの観察を確認し た。ＣＤ８+Ｔ細胞の除去はＭ−ＣＳＦの共注射後に観察された抗原特異的ＣＴ Ｌ促進を抑制した。これらの結果は、細胞溶解活性の促進は抗原特異的、クラス
Ｉ制限およびＣＤ８+Ｔ細胞依存的であったことを示している。Ｍ−ＣＳＦ遺伝子の共送達は刺激されたＴ細胞によるβ−ケモカイン産生を調節 する 刺激されたＴ細胞からのβ−ケモカイン（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−βおよびＲ
ＡＮＲＥＳ）発現プロフィールが試験された。これらのβ−ケモカインはマクロ
ファージ指向性（しかしＴ細胞指向性ではない）ウイルスに対してＣＤ８+Ｔ細 胞により産生される主ＨＩＶ抑制因子である。さらに、これらのＣＤ８+Ｔ細胞 産生ケモカインは末梢における細胞性免疫展開に決定的な役割を果たしているこ
とが示されている。特に、我々はｐＣＥｎｖによるＤＮＡ免疫感作はβ−ケモカ
インＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−βおよびＲＡＮＲＥＳを誘導することを観察した。
さらに、造血サイトカイン遺伝子による共免疫感作は、刺激されたＴ細胞による
ケモカインの発現を増加させることが観察された。例えば、ＭＩＰ−α発現はｐ
ＣＥｎｖ＋Ｇ−ＣＳＦによる共免疫感作により、ｐＣＥｎｖ単独の免疫感作によ
り発現されるレベルよりも劇的に促進できることが観察された。加えて、ＭＩＰ
−β発現はｐＣＥｎｖ＋Ｍ−ＣＳＦ共免疫感作により劇的に促進されることが観
察された。一方、ｐＣＥｎｖ＋Ｍ−ＣＳＦ、ｐＣＥｎｖ＋Ｇ−ＣＳＦおよびｐＣ
Ｅｎｖ＋ＧＭ−ＣＳＦ共免疫感作は、刺激されたエフェクター細胞によるＲＡＮ
ＴＥＳ発現の促進を、ＤＮＡワクチンカセット単独により誘導されるレベルより
も著しく高めなかった。しかしながら、興味あることに、Ｍ−ＣＳＦは遺伝子免
疫感作それ自身により誘導されるよりも低いレベルにＭＩＰ−１αを下方調節す
るようである。このデータはＭＩＰ−１αはＣＴＬ応答の駆動に直接的に関与し
ているのではなく、実際にはその誘導を妨害しているのであろう。考察 局所免疫環境（注入部位または筋肉中の局所リンパ節の末梢）の処置は免疫応
答の程度および方向性の両方に影響されるであろう。ＤＮＡワクチンのための分
子アジュバントとしてＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦ遺伝子共送達
により引き出される免疫効果が試験された。
【０１３７】 Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦ構築物はすべてＤＮＡワクチンの
免疫プロフィールを独自に調節することが観察された。Ｇ−ＣＳＦは好中性顆粒
球系列の造血細胞の増殖、分化および活性化に特異的効果が最も知られている多
面発現性サイトカインである。それは主として、エンドトキシン、ＩＬ−１，Ｔ
ＮＦ−αおよびＩＮＦ−γを含む種々の刺激による活性化により単球およびマク
ロファージで産生される。それは好中性顆粒球前駆体の増殖および成熟を制御し
、成熟好中球に直接的に作用して食細胞活動、ＡＤＣＣ、スーパーオキシド発生
、細胞遊走および細胞表面接着分子の発現を促進する。Ｇ−ＣＳＦのインビトロ
投与は、骨髄造血前駆細胞からの好中球コロニー形成を刺激できる。臨床的には
、Ｇ−ＣＳＦは化学療法および放射線療法誘導好中球減少症の処置のために最も
普通に投与される。Ｇ−ＣＳＦ共免疫感作は抗体応答全体にほとんど影響を及ぼ
さないことが観察された。Ｇ−ＣＳＦ共発現は免疫応答をＴｈ１型への移行を調
節し、それはＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比の増加およびＩＮＦ−γの促進された発現
により示された。総合的にいえば、Ｇ−ＣＳＦは直接的に抗原提示には影響しな
いが、最善の状態では抗原特異的免疫応答に中程度の効果を持っている。
【０１３８】 ＧＭ−ＣＳＦは種々の造血細胞の増殖、成熟および機能を刺激できる多面発現
性サイトカインである。ＧＭ−ＣＳＦは最初は好中球、単球／マクロファージお
よび好酸球コロニー形成を刺激するその能力で認知された。それはサイトカイン
または免疫および炎症性刺激に応答して、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、肥
満細胞、内皮細胞および線維芽細胞を含む種々の細胞型により産生される。ＧＭ
−ＣＳＦはＣＤ４＋Ｔｈ細胞の強力な誘導剤であることが観察され、それは強い
Ｔヘルパー増殖応答ならびに抗体応答の強い押し上げにより示された。一方、ｐ
ＣＥｎｖ＋ＧＭ−ＣＳＦ共免疫感作はＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比に対しては何の効
果も持っていなかった。加えて、ＧＭ−ＣＳＦ共投与はＣＤ８+Ｔ細胞に対して 注目に値する影響を及ぼさないようであり、そらは抗原特異的ＣＴＬ応答誘導に
対して影響を及ぼさないことにより示された。従って、このサイトカインによる
ワクチン補助は全面的にＴヘルパー細胞に焦点が当てられる。これらの結果は、
分子アジュバントとしてのＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡ構築物の使用に関する以前の
研究を支持および拡張するものである。狂犬病ウイルス糖タンパク質を発現して
いるプラスミドおよびマウスＧＭ−ＣＳＦをコードしているプラスミドの筋肉内
共接種はＢおよびＴヘルパー細胞活性を促進したことが報告されている。同様に
、我々はＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡとＤＮＡワクチン構築物の共免疫感作は抗原特
異的抗体およびＴｈ細胞増殖応答を増加させたことを報告した。対照的に、これ
らの研究ではＧＭ−ＣＳＦ遺伝子ではＣＴＬ誘導に対してはほとんど効果がなか
ったことが観察されている。同様な発見がインフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）
をコードしているＤＮＡ免疫原とのＧＭ−ＣＳのＦ共送達を用いて報告されてい
る。我々はまたＨＳＶ−２ｇＤタンパク質をコードしているＤＮＡ発現構築物と
ＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡ構築物を共送達した。生じる免疫表現型およびＨＳＶ致
死的感染後の免疫化動物の死亡率および罹患率が分析された。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝
子共投与は生存率を高めるだけでなく、膣内ＨＳＶ感染に続くヘルペス性病変の
頻度および重症度が減少することが観察された。
【０１３９】 Ｍ−ＣＳＦは単核食細胞の成長、分化および機能の制御因子であることが示さ
れている。それはまた、接着分子およびＦｃレセプターの発現を増加させ、殺腫
瘍性活性を増加させ、ＩＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βを含むサイトカイ
ンの二次放出を促進する。Ｍ−ＣＳＦは元々血清、尿および他の生物学的液体中
に、骨髄造血前駆細胞からのマクロファージコロニー形成を刺激できる因子とし
て発見された。線維芽細胞、子宮内膜の分泌上皮細胞、骨髄間質細胞、脳アスト
ロサイト、骨芽細胞、腎メサンギウム細胞、ケラチノサイトおよびＬＳＰまたは
サイトカイン活性化マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞および内皮細胞を含む多く
の細胞がＭ−ＣＳＦを産生できる。試験されたＣＳＦの中で、Ｍ−ＣＳＦは最も
強力なＣＤ８+ＣＴＬの活性化剤であった。Ｍ−ＣＳＦ発現により誘導されたＣ ＴＬ応答の促進は、ＭＨＣクラスＩ制限およびＣＤ８+Ｔ細胞両方に依存性であ った。促進されたＣＴＬの結果は、促進されたＩＮＦ−γの産生および増加した
ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比により支持された。ＧＭ−ＣＳＦの影響と異なり、Ｍ−
ＣＳＦ共発現は抗体応答には弱い影響しか及ばさなかった。ＧＭ−ＣＳＦの影響
と同様に、ＨＩＶ−１免疫原とのＭ−ＣＳＦ共発現は抗原特異的Ｔヘルパー細胞
増殖応答の増加を生じた（ただしより低い程度で）。ＣＴＬ経路はこのサイトカ
インにより特に影響を受けるようである。
【０１４０】 Ｔｈ１／Ｔｈ２型サイトカインおよびＣＳＦ遺伝子の免疫調節効果を比較する
のは興味を持たれた。例えば、ＧＭ−ＣＳＦ共注射は、ＩＬ−４共免疫感作と同
様に抗体応答レベルを正に調節した。一方、ＩＬ−４共免疫感作はＩｇＧ２ａ／
ＩｇＧ１比の劇的な減少に見られるように、より高いＴｈ２型応答を導いた。さ
らに、Ｔｈ増殖性応答に対するＧＭ−ＣＳＦ共注射の劇的な促進効果は、ＩＬ−
１２共投与の効果とのみ一致した。一方、Ｍ−ＣＳＦ遺伝子の共送達は、ＣＤ８ + Ｔ細胞制限ＣＴＬ応答の著しい促進を生じたが、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳ Ｆでは生じなかった。これらの結果は、免疫活性化部位でのこれらの増殖因子の
産生がインビボでＤＮＡワクチン誘導免疫応答レベルを制御できることを示して
いる。さらに、これらの結果はこれらの増殖因子は、伝統的なＴｈ１およびＴｈ
２型サイトカインの分野で以前に考えられていた免疫応答カスケードにおける役
割よりもより活性な役割を果たすことができることを暗示している。
【０１４１】 細胞に基づいた応答の分析に加え、ＣＳＦ遺伝子の共発現により生じるケモカ
イン産生の調節も試験された。ケモカインは免疫および炎症性応答の重要な調節
因子である。それらは血管から宿主防御末梢部位への白血球やりとりの分子調節
に特に重要である。さらに、いくつかのケモカインは末梢における免疫発現の制
御に決定的な役割を果たしていることが示されている。ＣＤ８+エフェクターＴ 細胞はケモカイン発現を上昇させる間にそれらは免疫応答を開始することが観察
され、抗原特異的免疫応答の拡大段階におけるこれらの最終段階エフェクター細
胞に対する制御的役割を示唆している。炎症性および免疫応答におけるそれらの
機能に加え、いくつかのケモカインはＡＩＤＳの伝播および進行に重要な役割を
果たしているであろう。１０年の間、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２
０のＣＤ４０への結合はウイルス融合および進入には十分ではないと予想されて
おり、ＨＩＶ感染のための追加の細胞表面補因子の必要性が示唆されている。最
近の研究からＴ細胞指向性およびマクロファージ指向性ウイルスとそれらの標的
細胞の融合に必要とされる補レセプターは各々ＣＸＣＲ−４およびＣＣＲ−５で
あると同定された。β−ケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴ
ＥＳはＣＣＲ−５の天然のリガンドであり、マクロファージ指向性（しかしＴ細
胞指向性ではない）ＨＩＶ単離物のためのＣＤ８+Ｔ細胞により産生される主Ｈ ＩＶ抑制因子の一つである。
【０１４２】 インビボ刺激細胞によるＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳの発
現が試験され、ＣＳＦ遺伝子の共免疫感作により抗原刺激Ｔ細胞によるケモカイ
ン発現の増大が生じることが観察された。ＭＩＰ−１α産生はｐＣＥｎｖ＋Ｇ−
ＣＳＦによる共免疫感作により、ｐＣＥｎｖ単独の免疫感作により産生されるレ
ベルよりも劇的に促進することができることが観察された。特に、ＭＩＰ−１β
発現はｐＣＥｎｖ＋Ｍ−ＣＳＦ共免疫感作により劇的に促進されたことが見いだ
された。対照的に、刺激されたエフェクター細胞によるＲＡＮＴＥＳ発現の有意
な促進は共注射法のいずれによっても生じなかった。観察された別の一つの新規
効果はＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１βの劇的な上昇、および同じ時期のＭＩＰ
−１αの減少であった。実際、Ｍ−ＣＳＦにより誘導されたＭＩＰ−１αレベル
は本当に対照レベルより低かった。このデータはＣＣＲ１、ＣＣＲ４およびＣＣ
Ｒ５を通したＭＩＰ−１α信号伝達は、ＣＣＲ３またはＣＣＲ９を通して送達さ
れる信号とは異なった信号を生じていることを示唆している。この発見から免疫
応答に対するこれらの推定レセプター効果が識別されるかもしれない。
【０１４３】 これらの結果は増殖因子ｃＤＮＡ構築物の共送達は体液性および細胞性（ケモ
カインの産生を含んで）免疫応答の両方を調節することを示している。特に、Ｍ
−ＣＳＦの共注射は抗原特異的ＣＴＬ誘導およびケモカイン産生に最も大きい制
御効果を持っていた。実施例５：ＩＣＡＭ−１はＴ細胞共刺激およびケモカイン産生を提供する ケモカインにより密接に制御されている三つの特異的接着分子の免疫調節効果
が試験された。インビボでの免疫活性化におけるＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およ
びＶＣＡＭ−１の役割を探査するためにＤＮＡワクチン技術を利用した。特定的
に、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＶＣＡＭ−１の遺伝子を個々にサイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にある発現ベクター内へクローン化
した。これらの構築物は次にＨＩＶ−１エンベロープまたはｇａｇ／ｐｏｌ抗原
をコードしているＤＮＡ免疫原とともに共免疫感作された。抗原特異的免疫応答
レベルに対するこれらの接着分子カセット共注射の免疫学的影響が分析された。
【０１４４】 抗原特異的Ｔ細胞応答がＤＮＡ免疫原と接着分子ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−
３の共発現により促進できた。しかしながら、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３は
抗原特異的体液性応答の発現には何の役割も果たしていないようである。ＬＦＡ
−３はＣＤ４+Ｔ細胞応答を促進し、ＣＤ８+Ｔ細胞機能にはほとんど影響を及ぼ
さなかった。より重要なことは、ＩＣＡＭ−１共投与はＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ
細胞応答の両方を劇的に増加させた。ＩＣＡＭ−１共発現はまた、抗原特異的β
−ケモカイン産生を劇的に促進し、末梢Ｔ細胞展開におけるＬＦＡ−１の結合に
対する重要な役割を示唆している。これらの分子の活性化表現型は原型ＣＤ８０
／ＣＤ８６共刺激分子とは異なっているようである。これらの結果は、サイトカ
イン、ケモカインおよび接着分子の末梢ネットワークがエフェクター機能部位で
エフェクターＴ細胞応答を整合的に制御していることを支持している。材料および方法 ＤＮＡプラスミド ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（ｐＣＥｎｖ）およびｇａｇ／ｐｏｌタン
パク質（ｐＣＧａｇ／Ｐｏｌ）を発現しているＤＮＡワクチンはＫｉｍ，Ｊ．Ｊ
．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔ．１５，６４１−６４５（本明細書に
おいて援用される）に説明されているように製造された。ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ
−３およびＶＣＡＭ−１の遺伝子はｐＣＤＮＡ３発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）内へクローン化され、きれいな
プラスミドＤＮＡはＫｉｍ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８，１０８９−１１０３に説明されているように製造された
。試薬および細胞株 ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）およびマウス肥満細胞腫Ｐ８１５細胞株はＡＴＣＣ（
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。ＨＩＶ−１エンベロープ（ｖＭＮ４
６２）、ｇａｇ／ｐｏｌ（ｖＶＫ１）およびβ−ガラクトシダーゼ（ｖＳＣ８）
を発現している組換え体ワクチンはＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎ
ｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍから入手した。組換
え体ｇｐ１２０またはｐ２４タンパク質はＩｍｍｕｎｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ
，Ｉｎｃ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から入手した。接着分子発現構築物の発現 ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、およびＶＣＡＭ−１構築物の発現はそれらをＲＤ
細胞へトランスフェクトすることにより分析された。細胞はトランスフェクショ
ン７２時間後に採取し、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＶＣＡＭ−１のための
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合モノクローナル抗体（Ｐｈ
ａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で分析された。マウスのＤＮＡ接種 ６から８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄ
ａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の大腿４頭筋にリン
酸緩衝液（ＰＢＳ）および０．２５％ブピバカイン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ
．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に処方した問題とする各々のＤＮＡ構築物５０μｇを注射
した。種々の遺伝子発現カセットの投与は、注射前に選択されたプラスミドを混
合することにより行った。対照マウスは５０μｇのｐＣＤＮＡ３ベクターで免疫
した。各々の研究の組は３度実施され、代表的な組の結果が示されている。マウ
スには２回の免疫感作（各々５０ｍｇ）を２週間の間隔で行った。追加注射１週
間後、マウスを殺し、脾臓を採取してリンパ球を単離し、細胞応答を試験した（
ＴｈまたはＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球））。ＥＬＩＳＡ ０．１Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）で２ｍｇ／ｍｌ濃度に希釈し
た１５μｇのｐ２４またはｇｐ１２０タンパク質を４℃で一夜、マイクロタイタ
ーウェルに吸着させた。プレートはＰＢＳ−０．０５％トウィーン−２０で洗浄
し、３７℃で１時間３％ＢＳＡのＰＢＳ−０．０５％トウィーン−２０溶液でブ
ロックした。マウス抗血清は０．０５％トウィーン−２０で希釈し、３７℃で１
時間インキュベートし、次にＨＲＰ−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とインキュベートした。プレートを洗浄し、３’３’５
’５’ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）緩衝溶液で発色させた。プレートはＤｙｎａｔｅｃ
ｈ ＭＲ５０００プレートリーダー上、４５０ｎｍの光学密度が読みとられた。 Ｔヘルパー細胞増殖アッセイ リンパ球を脾臓から採取し、赤血球を除去することによりおよび新鮮な培地で
数回洗浄することによりエフェクター細胞として調製された。単離された細胞懸
濁液は５ｘ１０6細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。５ｘ１０5細胞を含んでいる１
００μｌをすぐに９６ウェルマイクロタイター平底プレートの各々へ加えた。５
μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの最終濃度で組換え体ｐ２４またはｇｐ１２０タ
ンパク質をウェルに３重に加えた。細胞は５％ＣＯ2中、３７℃で３日間インキ ュベートした。各々のウェルに１ｍＣｉのトリチウム化チミジンを加え、細胞は
３７℃で１２から１８時間インキュベートした。プレートを採取し、取り込まれ
たトリチウム化チミジンの量をＢｅｔａ Ｐｌａｔｅリーダー（Ｗａｌｌａｃ，
Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定した。刺激指数は式： 刺激指数（ＳＩ）＝（実験的カウント／自発的カウント） から決定された。自発的カウントウェルは不適切タンパク質対照として働く１０
％ウシ胎児血清を含んでいる。加えて、ｐＣＥｎｖまたは対照免疫動物は決まり
きってＰｒ５５タンパク質に対して１のＳＩを持っている。同様に、ｐＣＧａｇ
／ｐｏｌまたは対照は決まりきってｇｐ１２０タンパク質に対して１のＳＩを持
っている。細胞が健康であるのを確かめるため、ＰＨＡまたはｃｏｎＡ（Ｓｉｇ
ｍａ）がポリクローナル刺激物質陽性対照として使用された。ＰＨＡまたはｃｏ
ｎＡ対照試料は２０−４０のＳＩを持っていた。細胞障害性Ｔリンパ球アッセイ ワクシニア感染標的を使用して５時間の51Ｃｒ放出ＣＴＬアッセイが実施され
た。アッセイはインビトロでのエフェクター刺激で実施され、エフェクターは適
切なワクシニア感染細胞（エンベロープに対してはｖＭＮ４６２およびｇａｇ／
ｐｏｌに対してはｖＶＫ１）で刺激され、ＣＴＬ培養培地中（５ｘ１０6細胞／ ｍｌ）で、０．１％グルタルアルデヒドを用いて５日間固定された。エフェクタ
ーはＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ
）、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）およびＣｏｎ Ａを含まない１
０％ＲＡＴ−Ｔ−ＳＴＩＭ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒ
ｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から成るＣＴＬ培養培地で２日間、非特異的に刺激
された。ワクシニア感染標的は３７℃で５から１２時間、１０−２０の感染多重
度（ＭＯＩ）で３ｘ１０6のＰ８１５細胞を感染させることにより調製された。 標準クロム放出アッセイが実施され、そこで標的細胞は１００ｍＣｉ／ｍｌ Ｎ
ａ2 51ＣｒＯ2で６０から１２０分間標識され、刺激エフェクター脾臓細胞と３７
℃で６時間インキュベートされた。ＣＴＬ溶解は５０：１から１２．５：１の範
囲のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で決定された。上清を採取し、ＬＫＢ Ｃ
ｌｉｎｉＧａｍｍａガンマ−カウンターで計数された。パーセント特異的溶解は
式： １００ｘ実験的放出−自発的放出 最大放出−自発的放出 から決定された。最大放出は１％トリトンＸ−１００含有培地中の標的細胞の溶
解により決定された。”自発的放出”のカウントが”最大放出”の２０％を超え
たならば、アッセイは正当とは考えられなかった。ＣＤ８+Ｔ細胞の補体溶解 ＣＤ８+Ｔ細胞はα−ＣＤ８モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓ ａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）による処理により脾臓細胞から取り出され、続いてウ
サギ補体（Ｓｉｇｍａ）と３７℃で４５分間インキュベートした。サイトカイン／ケモカイン発現分析 ＣＴＬアッセイのために刺激されたエフェクターからの上清が６日目に集めら
れ、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４、およびＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−ｌβおよびＲＡ
ＮＴＥＳのためのＥＬＩＳＡキットを使用して発現が試験された（Ｂｉｏｓｏｕ
ｒｃｅ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐ
ｏｌｉｓ，ＭＮ；Ｉｎｔｅｒｇｅｎ，Ｐｕｒｃｈａｓｅ，ＮＹ）。結果 ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＶＣＡＭ−１はトランスフェクトされた細胞に より発現できる ＩＣＡＭ−１（ｐＣＩＣＡＭ−１）、ＬＦＡ−３（ｐＣＬＦＡ−３）およびＶ
ＣＡＭ−ｌ（ｐＣＶＣＡＭ−１）遺伝子は個々にｐＣＤＮＡ３発現ベクター（図
２）内へクローン化された。ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＶＣＡＭ−１構築
物がそれらの適切なタンパク質を発現できるかどうかを試験するため、それらを
ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞株内へトランスフェクトした。ＦＡＣＳ分析を使用
し、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＶＣＡＭ−１発現カセットのトランスフェ
クションが、各々ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＶＣＡＭ−１の特異的発現を
生じさせたことが観察された。また、二つのＤＮＡ発現カセットの筋肉内共免疫
感作により、同じ筋肉細胞内で両方のコードされたタンパク質が共発現している
こともインビボで観察した。接着分子の共発現はＡｇ特異的体液性免疫応答に影響しない 次に、抗原特異的免疫応答の誘導に対する接着分子共発現の影響を調べた。す
べての実験において、５０μｇの各々のＤＮＡ発現構築物が、週０および２にＢ
ＡＬＢ／ｃマウスの筋肉内へ注射された。調べられた第一の免疫パラメーターは
抗原特異的体液性応答であった。週０、２および６に免疫マウスからの抗血清が
集められ、ＥＬＩＳＡによりＨＩＶ−１ｇｐ１２０タンパク質に対する特異的抗
体応答が分析された。ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＶＣＡＭ−１の共発現は
ｐＣＥｎｖ免疫感作により誘導された特異的抗体結合プロフィールに極微の影響
しか及ぼさなかったようである。同様の結果がｐＣＧａｇ／ｐｏｌで共免疫した
群で観察された。ＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−３の共発現はＡｇ特異的Ｔｈ増殖性応答を促進する 細胞性免疫応答の程度に対する接着分子共発現の影響もまた調べられた。ＣＤ
４+Ｔヘルパー細胞増殖性応答の誘導は、Ｔｈ細胞がＢ細胞を経る体液性免疫応 答およびＣＤ８+Ｔ細胞を経るＣＴＬ応答の両方に決定的な役割を果たしている ので重要である。ｐＣＧａｇ／ｐｏｌで免疫したマウスのＴｈ増殖性応答および
ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＶＣＡＭ−１で共免疫した該応答が測定された
。組換え体ｇｐ１２０ ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（５μｇ／ｍｌおよ
び１μｇ／ｍｌ）がＴ細胞増殖の特異的刺激のために各々のウェルに加えられた
。また、無関係なタンパク質を用いてＴ細胞の非特異的刺激をこれらの群で分析
し、非特異的抗原はインビトロでＴ細胞増殖性応答を誘導しないことを観察した
。バックグラウンドレベルの増殖が対照ベクターで免疫した対照群で観察され、
中レベルの増殖がｐＣＥｎｖ単独で免疫した群で観察された。対照的に、ｐＣＩ
ＣＡＭ−１またはｐＣＬＦＡ−３で共免疫した群は著しく高いレベルの増殖性応
答を持っていた。一方、ＶＣＡＭ−１遺伝子で共免疫した群は抗原特異的Ｔｈ応
答の促進を示さなかった。同様の結果がｐＣＧａｇ／ｐｏｌで共免疫した群で観
察された。どちらか一方の免疫原を使用した反復実験で、ｐＣＩＣＡＭ−１また
はｐＣＬＦＡ−３の共送達は抗原特異的増殖性応答の３から４倍の増加を生じた
。ＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−３の共発現はＡｇ特異的ＣＴＬ応答を促進する 細胞免疫性の促進をさらに調べるため、ｐＣＥｎｖおよびｐＣＧａｇ／ｐｏｌ
で共免疫したマウスの脾臓細胞を使用してＣＴＬアッセイを実施した。特異的お
よび非特異的ワクシニア感染またはペプチド処理標的からのクロム放出測定に先
立ってエフェクター脾臓細胞のインビトロ刺激が実施された。標的の特異的溶解
を計算するため、特異的標的のパーセント溶解から無関係標的のパーセント溶解
が差し引かれた。バックグラウンドレベルの特異的溶解がｐＣＤＮＡ３、ｐＣＩ
ＣＡＭ−１、ｐＣＬＦＡ−３またはｐＣＶＣＡＭ−１で免疫感作した対照動物で
観察され、ｐＣＥｎｖで免疫感作した動物は低レベルのＣＴＬ応答を示した。一
方、ｐＣＥｎｖ＋ｐＣＩＣＡＭ−１による共免疫感作はＣＴＬ活性の劇的な増加
を生じた。ＨＩＶ−１エンベロープワクシニア（ｖＭＮ４６２）感染標的の４０
％を超える特異的溶解が、５０：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でのｐＣ
Ｅｎｖ＋ｐＣＩＣＡＭ−１による共免疫感作後に観察された。ＣＴＬ活性は１２
．５：１のＥ：Ｔ比では２０％特異的溶解に減少した。対照的に、ｐＣＥｎｖ＋
ｐＣＬＦＡ−３による共免疫感作はＣＴＬ活性のより穏やかな増加を生じた。同
様のＣＴＬの結果がｐＣＧａｇ／ｐｏｌ＋ｐＣＩＣＡＭ−１およびｐＣＧａｇ／
ｐｏｌ＋ｐＣＬＦＡ−３による共免疫感作後に観察された。
【０１４５】 ｐＣＩＣＡＭ−１およびｐＣＬＦＡ−３の共発現を経るＣＴＬ応答の増加がＣ
Ｄ８+Ｔ細胞に限定されているかどうかを決定するため、補体溶解によりエフェ クター細胞集団からＣＤ８+Ｔ細胞を除去してまたは除去しないでＣＴＬ活性を 測定することによるＣＴＬアッセイが実施された。ＣＤ８+Ｔ細胞の除去はｐＣ ＩＣＡＭ−１およびｐＣＬＦＡ−３の共注射後に観察された抗原特異的ＣＴＬ促
進の抑制を生じた。これらの結果は細胞溶解性活性の促進は抗原特異的およびＣ
Ｄ８+Ｔ細胞依存的であったことを示している。ＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−３の共発現は刺激Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生を増 加させる 免疫化動物における刺激ＣＴＬによるサイトカイン産生の分析は観察されたＣ
ＴＬの結果を支持している。サイトカインは免疫応答発生の間、免疫細胞の方向
付けおよび標的化に鍵となる役割を果たしている、例えば、ＩＦＮ−γはＴ細胞
仲介細胞障害性免疫応答の制御に複雑に関与しており、一方、ＩＬ−４はＢ細胞
仲介免疫応答において支配的な役割を果たしている。ＣＴＬアッセイのためにイ
ンビトロで刺激されたエフェクター細胞からの上清液を分析し、サイトカインＩ
ＦＮ−γおよびＩＬ−４の放出を試験した。ｐＣＩＣＡＭ−１の共注射はＩＦＮ
−γレベルを著しく増加させることが観察された。ｐＣＬＦＡ−３の共注射では
ＩＦＮ−γ産生の増加はより穏やかなものであった。一方、すべての群から放出
されたＩＬ−４のレベルは同様であった。ＩＣＡＭ−１の共発現は刺激Ｔ細胞によるβ−ケモカイン産生を増加させる 最近、我々は感染末梢部位での特定のケモカイン産生を通してインビボでのＣ
Ｄ８+エフェクターＴ細胞が抗原特異的応答を拡大させることを報告した。従っ て、刺激ＣＴＬによるβ−ケモカインの産生を分析した。ＣＴＬのためにインビ
トロで刺激されたエフェクター細胞からの上清を分析し、β−ケモカインＭＩＰ
−１α、ＭＩＰ−βおよびＲＡＮＴＥＳの放出が試験された。前に観察されたよ
うに、ｐＣＥｎｖでのＤＮＡ免疫感作は、対照ベクターよりも著しく高いＭＩＰ
−１α、ＭＩＰ−βおよびＲＡＮＴＥＳ発現レベルを誘導した。さらに、ｐＣＥ
ｎｖ＋ｐＣＬＦＡ−３の共注射は、ｐＣＥｎｖ免疫群よりもβ−ケモカイン産生
レベルを増加させた。なおさらに著しいことに、ｐＣＥｎｖ＋ｐＣＩＣＡＭ−１
による共免疫感作ではｐＣＥｎｖ免疫群よりもβ−ケモカイン産生の劇的な促進
が生じた。対照的に、ｐＣＩＣＡＭ−１による共投与はケモカイン発現を促進し
なかった。これらの結果は、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３は直接的Ｔ細胞共刺
激を提供するということを支持している。ＩＣＡＭ−１およびＣＤ８６の共発現はＡｇ特異的ＣＴＬ応答を相乗的に促進す る Ｂ７（ＣＤ８０およびＣＤ８６）経路はＴ細胞応答を開始および拡大するため
の決定的な第二のシグナル送達のための主共刺激経路であると考えられている。
これらの分子はＤＮＡワクチン関連では調節因子として試験されてきた。この関
連において、ＣＤ８６分子はワクチンアジュバントとして送達された場合、ＣＤ
８+細胞障害性Ｔリンパ球の抗原特異的誘導に突出した役割を果たしているよう である。ＤＮＡ免疫原とともにＣＤ８６ｃＤＮＡを共投与すると抗原特異的ＣＤ
８+ＣＴＬ応答が劇的に増加した。ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３の効果はＢ７ −ＣＤ２８シグナル依存的であるかもしれないし、またはインビボでＣＴＬ誘導
を駆動するための別の相乗的経路を代表しているかもしれない。従って、ＩＣＡ
Ｍ−１およびＬＦＡ−３分子がＣＤ８６分子と共発現された場合、ＣＴＬ誘導レ
ベルを相乗的に促進することができるかどうかをさらに探査した。ＩＣＡＭ−１
およびＣＤ８６分子の共発現は抗原特異的ＣＴＬ応答を相乗的に促進できること
が観察された。一方、ＬＦＡ−３およびＣＤ８６分子の共発現はＣＴＬ応答レベ
ルを改良しなかった。これらの結果は、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３経路はＣＤ８
６／ＣＤ２８経路と独立したＴ細胞共刺激シグナルを提供することを示しており
、インビボではそれらはＴ細胞応答を拡大するために相乗的に働いているのであ
ろう。
【０１４６】 刺激されたＣＴＬによるＩＦＮ−γおよびβ−ケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩ
Ｐ−βおよびＲＡＮＴＥＳ産生レベルはさらにこれらの結果を支持しており、Ｉ
ＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１シグナルはＣＤ８６／ＣＤ２８シグナルと独立して働き
、Ｔ細胞応答を拡大するために調和して働くことを示している。前記の方法を用
いてエフェクターＴ細胞からの上清を分析した場合、ＬＦＡ−３およびＣＤ８６
の共投与は劇的に高いレベルのＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−βおよびＲ
ＡＮＴＥＳを生じさせた。これらの結果はさらにＴ細胞活性化におけるＩＣＡＭ
−１およびＣＤ８６の相乗的性質を暗示している。考察 免疫または炎症性反応の間、抗原がふれた部位へリンパ球が運ばれる。リンパ
球および内皮細胞の接着分子が、直接の細胞接触および白血球の移動の方向付け
に重要な役割を果たしている。加えて、接着分子はＡＰＣへのＴリンパ球の結合
に重要な役割を果たしている。ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）は９０−１１４ｋＤの
分子であり、内皮細胞、マクロファージおよび樹状細胞上に発現され、ＬＦＡ−
１およびＭａｃ−１に結合する。Ｔリンパ球を含むほとんどすべての白血球はＬ
ＦＡ−１を発現するが、Ｍａｃ−１発現は単球、マクロファージおよび顆粒球に
制限されている。ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）はＡＰＣを含む種々の細胞型により発
現される５５−７０ｋＤの表面分子である（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ
ａｌ．１９８７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２２３−２５２、本
明細書において援用される）。血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）は活性化
内皮細胞および平滑筋細胞上に発現される１１０ｋＤの表面分子である（Ｏｓｂ
ｏｍ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．１９８９．Ｃｅｌｌ．５９：１２０３−１２１１、本
明細書において援用される）。ＶＣＡＭ−１は、好酸球、リンパ球、単球および
好塩基球を含むほとんどの単核白血球で構成的に発現される最後期抗原−４（Ｖ
ＬＡ−４）を認識し結合するが、好中球には存在しない（Ｅｌｉｃｅｓ，Ｍ．Ｊ
．，ｅｔ ａｌ．１９９０ Ｃｅｌｌ．６０：５７７−５８４、本明細書におい
て援用される）。ＶＣＡＭ−１／ＶＬＡ−４相互作用は白血球移動および血管外
遊出に重要な役割を果たしている。
【０１４７】 本研究においては、Ｔ細胞活性化および展開に必要とされる刺激シグナルの提
供におけるこれらの細胞表面接着分子の役割を調べるためにＤＮＡ免疫原モデル
が利用された。二つのシグナルＴ細胞活性化モデルにおいて、第一の活性化シグ
ナルはＴ細胞レセプターへの抗原性ペプチド−ＭＨＣ複合体の結合により仲介さ
れる。第二の共刺激シグナルはＣＤ８０／ＣＤ８６共刺激分子とＴ細胞上に存在
するそれらのレセプター（ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４）との結合を通して提供され
る。この２シグナルモデルは概念的に簡単であり、実験結果からよく支持されて
いるが、Ｔ細胞活性化過程間に供給される共刺激シグナルはＢ７（ＣＤ８０／Ｃ
Ｄ８６）分子のみに制限されているわけではない。ＡＰＣ上の接着分子のような
追加の細胞表面分子もまた共刺激の提供に重要な機能を持っているであろうが、
ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞への直接的シグナルの提供におけるそれらの役割は
調査中である。
【０１４８】 接着分子は白血球のやりとり、炎症性細胞の補充および免疫監視に重要である
。最近、Ｔ細胞活性化における接着分子の役割が示唆された。接着分子のサブセ
ット（すべてＴ細胞上のリガンドに結合する）を使用してその役割が調べられた
。三つの関連分子ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）およびＶ
ＣＡＭ−１（ＣＤ１０６）が選択された。ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＶＣ
ＡＭ−１をコードしているＤＮＡ発現カセットをＤＮＡ免疫原とともに利用し、
抗原に加えた接着分子の共発現の特異的効果を捜し求めた。抗原特異的Ｔ細胞（
ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞の両方）応答はＤＮＡ免疫原および接着分子ＩＣＡ
Ｍ−１およびＬＦＡ−３の共発現により促進できたことが観察された。ＤＮＡ免
疫原に加えたＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−３の共発現はＴｈ細胞増殖性応答の著
しい促進を生じた。加えて、ｐＣＩＣＡＭ−１の共免疫感作はＣＤ８限定ＣＴＬ
応答の劇的な促進を生じた（ｐＣＬＦＡ−３ではより穏やかな）。これらの観察
結果は、ＬＦＡ−３の共注射で刺激されたＣＤ８+Ｔ細胞によるＩＦＮ−γなら びにβ−ケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−βおよびＲＡＮＴＥＳの産生レベル
が増加したという発見によりさらに支持された。より印象的なことは、ＩＣＡＭ
−１の共免疫感作はＩＦＮ−γおよびβ−ケモカインのより劇的な促進が生じた
ことである。増加した細胞接触または細胞の並置だけでは抗原特異的Ｔ細胞仲介
応答を促進するには十分でないことに注目するのも重要である。ＩＣＡＭ−１お
よびＶＣＡＭ−１は同じような分子量を持ってはいるが、ＶＣＡＭ−１の共注射
はＴ細胞応答に測定可能な影響を与えなかった。一方、ＩＣＡＭ−１共発現はＣ
Ｄ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞の両方のレベルを劇的に促進させた。これらの結果は
Ｔ細胞刺激効果はそれらの接着特性または分子の大きさに固有のものではないこ
とを暗示している。ＣＴＬを促進する両方のＣＴＬ駆動接着分子（ＩＣＡＭ−１
およびＬＦＡ−３）が種々のＡＰＣで発現されるのは興味深い。実際、最も良好
なＣＴＬ促進接着分子、ＩＣＡＭ−１、は樹状細胞上で発現されていることは重
要なことであろう。
【０１４９】 促進されたＣＴＬ誘導と、ＣＤ８６発現で促進されたＣＴＬ誘導を比較した。
ＣＤ８６分子とＩＣＡＭ−１の発現を一緒にすると抗原特異的ＣＴＬ応答を促進
できた（ＬＦＳ−３分子ではできなかった）ことが観察された。これらの結果は
末梢で免疫活性化の重要な役割を果たしているＩＦＮ−γならびにβ−ケモカイ
ンＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−βおよびＲＡＮＴＥＳの著しく促進された産生により
さらに支持された。これらの分子の生物学的重要性の評価はさらなる研究を必要
とするけれども、最近の研究でケモカインＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳとＣ
ＴＬ応答間の関係が見いだされている。追加の研究がこれらの分子の共刺激的役
割についてのさらなる見識を提供することができるであろうが、これらの結果は
ＩＣＡＭ−１分子はＣＤ８６とは独立した経路でＴ細胞共刺激シグナルを提供で
き、Ｔ細胞へ提供される共刺激シグナルの全体のレベルを相乗的に増幅するよう
に働くことを示している。全体として、これらの結果は接着分子、ＩＣＡＭ−１
およびＬＦＡ−３は重要な共刺激シグナルを提供できることを支持しており、Ｔ
細胞活性化の単純２シグナルモデルは不十分であり（しかしながら概念的には有
用である）、共刺激の多供給源を持つより新しいモデルをさらに考慮および研究
すべきであることを示している。これらの結果はまた、他の表面分子のＴ細胞共
刺激機能を利用することを目的としたさらなる研究を保証している。
【０１５０】 これらの研究に関した一つの重要な論点はまさにこれらの分子が細胞性免疫応
答を促進するように機能しているかどうかである。最近の研究で、プラスミドＤ
ＮＡの注射がマクロファージおよび樹状細胞を含む定住ＡＰＣをトランスフェク
トできることが報告されている。これらの結果はさらに、ＤＮＡ免疫応答を起動
させるために骨髄由来細胞の要求性を例示する骨髄キメラを使用した研究により
さらに支持される。本研究で観察されたいくつかの共刺激がトランスフェクショ
ンおよび定住する専門のＡＰＣにより起動される増強されたＴ細胞を通して起こ
すことができることは文献と一致している。
【０１５１】 従来の報告とともに、これらの結果はＴ細胞共刺激におけるＩＣＡＭ−１およ
びＬＦＡ−３の役割を支持している。ＬＦＡ−３はクラスＩＩ応答に特別な効果
を持っており、一方、一般にＩＣＡＭ−１はβ−ケモカインの促進された産生に
より示されるようにＣＴＬ誘導およびＣＤ８+エフェクター機能の劇的に強力な 駆動剤であった。これらの結果もまた、末梢におけるＴ細胞エフェクターの補充
および拡大の調和仮説を支持している。最近我々はそれらの化学誘引機能に加え
て、ケモカインが末梢部位での抗原特異的免疫応答の調節および拡大を制御する
ことを報告している。ＣＤ８+Ｔエフェクター細胞は免疫応答を起動する間に、 ケモカイン発現レベルを制御することを我々は観察している。従って、走化性に
おいて、ケモカインは濃度勾配によりリンパ球の移動を制御している。さらに、
リンパ球の末梢への方向付けにおいて、接着分子拡大の相応の再分布が直接的細
胞−細胞接触を行わせる。加えて、接着分子の発現は種々の炎症性サイトカイン
およびケモカインにより調節されている。例えば、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α
は内皮および筋肉細胞上のＩＣＡＭ−１発現を上方制御することが示されている
。
【０１５２】 従って、ＣＤ８+Ｔエフェクター細胞はケモカインを生産し、それは炎症部位 により多くのＡＰＣおよびＴ細胞を補充するであろう。これらのＴ細胞はβ−ケ
モカイン産生により刺激され、ＩＦＮ−γ産生を駆動しおよびＴ細胞共刺激を可
能にするように働くことができる接着分子の発現を促進する。従って、炎症部位
で、エフェクター機能のレベルを拡大するであろう特異的ケモカインおよび接着
分子の発現を通してこれらのエフェクターＣＴＬはさらに制御されるであろう。
これらの結果は、抗原特異的免疫応答の拡大期における最終段階エフェクターＴ
細胞はこれらの分子の調和した発現および放出により運命が方向付けできること
をさらに支持している。実施例６：接着および共刺激分子は異なった抗原特異的免疫応答を誘導し、イン ビボでヘルペス単純ウイルス−２に対する保護的免疫性を増強する Ｔ細胞上のＣＤ４０リガンドおよび白血球機能関連タンパク質（ＬＦＡ）は各
々ＡＰＣ上のＣＤ４０および細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）と相互作用する。共刺
激分子ＣＤ４０およびＣＤ４０リガンド、および接着分子ＬＦＡ−３およびＩＣ
ＡＭ−１を共免疫感作し、ｇＤプラスミドワクチンおよびＨＳＶ−２による致死
的感染に対する保護についての免疫調節効果を分析した。全身的ｇＤ特異的Ｉｇ
Ｇ産生がＣＤ４０、ＣＤ４０リガンドおよびＩＣＡＭ−１の共注射により著しく
促進されたことが観察された。しかしながら、ＩｇＧ産生の変化はＣＤ４０、Ｃ
Ｄ４０リガンドおよびＩＣＡＭ−１の共注射によってもほとんど観察されなかっ
た。さらに、Ｔｈ１型細胞性応答がＣＤ４０リガンドにより起こり、これに対し
、Ｔｈ１およびＴｈ２型免疫応答の両方がＬＦＡ−３により起こされた。ＣＤ４
０リガンドおよびＬＦＡ−３の共送達はまた、致死的ＨＳＶ−２感染での生存率
を高めた。これらの研究は共刺激および接着分子は異なった共刺激経路を持って
おり、それらは保護的抗原特異的免疫性の発生に重要な役割を果たすことを示し
ている。
【０１５３】 抗原特異的免疫応答の誘導における共刺激および接着分子の特異的役割、なら
びにマウスＨＳＶ−２感染モデル系におけるＤＮＡワクチン誘導保護的免疫性を
駆動するためのプラスミド送達の一部として共刺激および接着分子を使用するワ
クチン効果が試験された。共刺激および接着分子は特異的に抗原特異的免疫応答
を調節した。特に、共刺激分子（ＣＤ４０リガンド）および接着分子（ＬＦＡ−
３）の共送達は抗原依存性様式で著しいＣＤ４+Ｔ細胞活性を誘導し、致死的Ｈ ＳＶ−２感染での生存率を高めた。材料および方法 マウス −メス４−６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスはＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−
Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）から購入された。それら
は米国国立保健研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）およびペンシルバニア大学
ＩＡＣＵＣ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）のガイドラインに沿って世話
された。試薬 −ＨＳＶ−２株１８６（Ｐ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ、ペンシルバニア大学、Ｐｈ
ｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．、から親切にも寄贈された）はベロ細胞株（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖ
ｉｌｌｅ，Ｍｄ．）中で繁殖させた。組換え体ＨＳＶ−２ｇＤタンパク質が本研
究で組換え体抗原として使用された。ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞株はＡＴＣＣ
（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）から入手した。プラスミドおよびＤＮＡ調製 −ＤＮＡワクチン、ＨＳＶ−２ｇＤタンパク質をコ
ードしているｐＡＰＬ−ｇＤ２はＰａｃｈｕｋ，ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２６，７９
（本明細書において援用される）に記載されているように調製された。ｐＣＤＮ
Ａ３−ＣＤ４０、ｐＣＤＮＡ３−ＣＤ４０リガンド、ｐＣＤＮＡ３−ＬＦＡおよ
びｐＣＤＮＡ３−ＩＣＡＭ−１を作製するためにＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、
ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１のｃＤＮＡの各々が発現ベクターｐＣＤＮＡ３内
へクローン化された。プラスミドＤＮＡは細菌中で産生され、二重バンドＣｓＣ
ｌ処方により精製された。ＣＤ４０およびＣＤ４０リガンド遺伝子構築物のインビトロ発現 −ＣＤ４０、Ｃ
Ｄ４０リガンド、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１構築物の発現はそれらをＲＤ細
胞内へトランスフェクトすることにより分析された。細胞はトランスフェクショ
ン７２時間後に採取し、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ４０およびＣＤ４０リ
ガンドのためのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合モノクロー
ナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によるＦＡＣＳ
分析を使用して発現が試験された。マウスのＤＮＡ接種 −ＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿４頭筋に１００μｌのリン酸緩
衝液および０．２５％ブピバカイン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
Ｍｏ．）に処方したｇＤ ＤＮＡ構築物を２８ゲージ注射針（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）を通して注射し
た。種々のケモカインおよびサイトカイン遺伝子発現カセット試料は注射前にｐ
ｇＤプラスミド溶液と混合させた。ＥＬＩＳＡ −ｇＤ特異的ＩｇＧサブクラスの相対レベルを決定するため、酵素結
合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）がＨＲＰと結合された抗マウスＩｇＧ１およ
びＩｇＤ２ａ（Ｚｙｒｎｅｄ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を使用して
実施された。ＥＬＩＳＡ力価は天然マウス血清と同一の光学密度を示している最
も高い血清希釈を基準にして決定された。ケモカイン、Ｔｈ１およびＴｈ２型サイトカイン −６ｘ１０6脾臓細胞を含んで いる１ｍｌを２４ウェルプレートに加えた。次に、各々のウェルに１μｇのＨＳ
Ｖ−２ｇＤを加えた。５％ＣＯ2中、３７℃で２日間インキュベートした後、細 胞上清液を確保し、細胞外液体をサイトカインまたはケモカイン特異的ＥＬＩＳ
Ａプレートに加えることにより市販のサイトカインキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ
，Ｉｎｔｌ．，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，Ｃａ．およびＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍ
ｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｄ．）を使用してＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ
、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−ｌおよびＭＩＰ−１αのレベルを検出するために使用
した。膣内ＨＳＶ−２感染 −ウイルスを接種する前に。膣内領域を０．１ＭＮａＯＨ溶
液に浸した綿付き塗布具（Ｈａｒｄｗｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｍｐａｎ
ｙ，Ｇｕｉｆｏｒｄ，ＭＥ）でふきとり、乾燥綿付き塗布具で清浄した。マウス
は生存率を評価するため毎日検査された。統計分析 −統計分析は対応のあるスチューデントｔ検定およびＡＮＯＶＡを用い
て行われた。異なった免疫感作群間の値が比較された。ｐ値＜０．０５が有意で
あると考えられた。結果 ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１はトランスフェク トされた細胞により発現できる −ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＦＡ−３およ
びＩＣＡＭ−１は個々にｐＣＤＮＡ３発現ベクター内へクローン化された。ＣＤ
４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１構築物がそれらの適切
なタンパク質を発現することができるかどうかを試験するため、それらをインビ
トロでヒトＲＤ細胞内へトランスフェクトした。ＦＡＣＳ分析を用い、ＣＤ４０
、ＣＤ４０リガンド、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１発現カセットが各々ＣＤ４
０、ＣＤ４０リガンド、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１の特異的発現を生じてい
ることが観察された。ＲＤ細胞はｐＣＤＮＡ３（対照）またはＣＤ４０、ＣＤ４
０リガンド、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１を発現しているｐＣＤＮＡ３でトラ
ンスフェクトされた。トランスフェクションして３日後、細胞をプレートから除
き、トランスフェクトされた遺伝子産物の発現を検出するため、α−ＣＤ４０、
α−ＣＤ４０リガンド、α−ＬＦＡ−３およびα−ＩＣＡＭ−１抗体を用いるＦ
ＡＣＳ分析により分析した。ＬＦＡ−３は全身的ＩｇＧ応答を促進する −ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＦ
Ａ−３およびＩＣＡＭ−１発現ベクターとｇＤ遺伝子ワクチンの共注射がｇＤに
対する全身的ＩｇＧ応答に影響するかどうかを決定するため、ＤＮＡ接種後の血
清の１００倍希釈液がＥＬＩＳＡで試験された。マウスの各々の群（ｎ＝８）を
共刺激分子遺伝子（４０μｇ）を加えたｇＤ ＤＮＡワクチン（６０μｇ）で２
回免疫した。２回目のＤＮＡ注射から２週間後にマウスから採血し、血清をｇＤ
との反応のために１：１００に希釈した。ＣＤ４０またはＣＤ４０リガンドプラ
スミドＤＮＡ（マウス当たり４０μｇ）を加えたｇＤ ＤＮＡワクチン（マウス
当たり６０μｇ）の共注射は全体のＩｇＧレベルにはほとんど影響しなかった。
群当たり等しくプールした血清はＥＬＩＳＡ力価を決定するために連続的に希釈
した。均等にプールされた第二の免疫感作２週間後のＥＬＩＳＡ力価もまた６，
４００（ＣＤ４０）、６，４００（ＣＤ４０リガンド）および６，４００（ｇＤ
ＤＮＡワクチン単独）であることが決定された。これらの共刺激分子（マウス
当たり４０μｇ）を加えたｇＤ ＤＮＡワクチン（マウス当たり１０μｇ）で１
回共注射して１ヶ月後に得られた血清を試験した場合にも同様の結果が得られた
。
【０１５４】 マウスの各々の群（ｎ＝８）をＬＦＡ−３接着分子遺伝子（４０μｇ）を加え
たｇＤ ＤＮＡワクチン（６０μｇ）で０および２週目に免疫した。２週間ごと
にマウスから採血し、血清をｇＤとの反応のために１：１００に希釈した。ＬＦ
Ａ−３ ｃＤＮＡとの共注射はｇＤ ＤＮＡワクチン単独よりも著しく高く全身
性ＩｇＧ応答を促進したが、ＩＣＡＭ−１ ｃＤＮＡとの共注射ではほとんど変
化は観察されなかった。群当たり均等にプールした血清はＥＬＩＳＡ力価を決定
するために連続的に希釈した。光学密度は４０５ｎｍで測定された。値およびバ
ーは平均値（ｎ＝８）および標準偏差を示している。ＥＬＩＳＡ力価は天然マウ
ス血清と同一の光学密度を示している最も高い血清希釈を基準にして決定された
。均等にプールされた第二の免疫感作２週間後のＥＬＩＳＡ力価もまた２５，６
００（ＬＦＡ−３）、６，４００（ＩＣＡＭ−１）および６，４００（ｇＤ Ｄ
ＮＡワクチン単独）であると決定された。ＣＤ４０リガンドおよびＬＦＡ−３はＩｇＧアイソタイプパターンに影響する −
ＩｇＧサブクラスは誘導された免疫応答のＴｈ１対Ｔｈ２特性の指標を与える。
ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１での共注射により
誘導されたＩｇＧサブクラスを分析した。ＤＮＡベクターで免疫されたマウスに
おけるｇＤ特異的ＩｇＧアイソタイプレベルが測定された。マウスの各々の群（
ｎ＝８）を共刺激分子遺伝子（４０μｇ）かまたは接着分子遺伝子（４０μｇ）
を加えたｇＤ ＤＮＡワクチン（６０μｇ）で２回免疫した。２回目のＤＮＡ注
射から２週間後にマウスから採血し、群当たり均等にプールした血清をｇＤとの
反応のために１：１００に希釈した。光学密度は４０５ｎｍで測定された。ＣＤ
４０リガンド遺伝子での共注射はＩｇＧ１に対するｇＤ特異的ＩｇＧ２ａの相対
的産生を増加させたが、ＣＤ４０遺伝子での共注射はｇＤ ＤＮＡワクチン単独
と類似のＩｇＧアイソタイプパターンを示した。ＩｇＧ産生におけるこの移行は
、より高いＴｈ１型応答はＣＤ４０リガンドＤＮＡでの共注射でのみ誘導される
ことを示している。しかしながら、ＬＦＡ−３の共注射は、ｇＤ ＤＮＡワクチ
ン単独またはＩＣＡＭ−１共注射よりもＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａアイソタイプ
両方を著しく高く増加させた。この増加はＬＦＡ−３ ｃＤＮＡでの共注射によ
りＴｈ１およびＴｈ２型応答の両方が誘導されたことを示している。ＣＤ４０リガンドおよびＬＦＡ−３はＴｈ細胞増殖応答を促進する −Ｔヘルパー
細胞はＡｇ刺激Ｂ細胞の増殖およびＣＤ８+Ｔ細胞の増殖を経る各々体液性およ び細胞性免疫応答の惹起に重要な役割を果たしている。ＣＤ４活性化の特異的指
標としてＴ細胞増殖が試験された。インビトロにおいて特異的抗原で刺激された
場合、サイトカイン遺伝子による共免疫感作後に得られるＴ細胞の増殖レベルを
測定することが重要である。ｇＤ−２タンパク質（１および５μｇ／ｍｌ）がＴ
細胞の抗原特異的刺激に使用された。陽性対照として、５μｇ／ｍｌ ＰＨＡが
ポリクローナル刺激剤として使用された。陰性対照では低いバックグラウンドレ
ベルのＴｈ細胞増殖が観察された。しかしながら、ｇＤ ＤＮＡワクチン接種は
陰性対照よりも高いＴｈ細胞増殖応答を誘導した。ＣＤ４０リガンドおよびＬＦ
Ａ−３ ｃＤＮＡで共注射した場合、Ｔｈ細胞増殖レベルはさらに後押しされた
。しかしながら、ＣＤ４０およびＩＣＡＭ−１が共注射された動物ではＴｈ細胞
応答の増加はほとんど検出されなかった。この傾向は試験された二つの異なった
抗原濃度で観察され、この効果はＣＤ４０リガンドおよびＬＦＡ−３仲介である
ことを反映している。ｇＤプラスミドワクチン接種は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにお
けるＣＴＬエピトープの欠損のためＣＴＬ応答を生じなかった。しかしながら、
細胞性効果をより詳細に評価するため、サイトカイン産生プロフィールを次に試
験した。ＣＤ４０リガンドおよびＬＦＡ−３はＴｈ１およびＴｈ２型サイトカインの産生 に影響する −Ｔｈ１サイトカイン（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）およびＴｈ２サ
イトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０）は免疫応答偏向についての
我々の理解における主な支えであってきた。Ｔｈ１免疫応答は細胞免疫性の誘導
を駆動すると考えられ、一方、Ｔｈ２免疫応答は優先的に体液性免疫を駆動する
。従って、共刺激分子とのまたはそれなしでのｇＤ ＤＮＡワクチン接種がＴｈ
１またはＴｈ２免疫応答を誘導するかどうかを試験した。共刺激分子または接着
分子で共免疫されたマウスの脾臓細胞からのＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ
、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＣＰ−１の産生レベルが測定された。マ
ウスの各々の群（ｎ＝２）を共刺激分子遺伝子かまたは接着分子遺伝子（４０μ
ｇ）を加えたｇＤ ＤＮＡワクチン（６０μｇ）で０および２週目に免疫した。
最後にＤＮＡ注射して２週間後、２匹のマウスを殺し、脾臓細胞をプールした。
脾臓細胞は１μｇ／ｍｌのｇＤ−２タンパク質で２日間刺激した。ＩＬ−２およ
びＩＦＮ−γ産生はＣＤ４０リガンドｃＤＮＡの共注射により著しく促進された
が、ＩＬ−１０産生はこの共注射で減少した。しかしながら、ＣＤ４０にｇＤ遺
伝子を加えたものの共注射はこのアッセイにおいてＩＦＮ−γをわずかに増加さ
せた。しかしながら、ＩＬ−２、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γ産生がＬＦＡ−３
ｃＤＮＡの共注射により、ｇＤ ＤＮＡワクチンよりも著しく高くすべて促進
されたが、ＩＣＡＭ−１にｇＤ遺伝子を加えた共注射はこのアッセイにおいてわ
ずかな増強効果しか持っていなかった。このことはＣＤ４０リガンドはＴｈ１表
現型に対して免疫応答を駆動するが、ＬＦＡ−３はインビボにおいてＴｈ１およ
びＴｈ２の両方に影響することを支持している。ＣＤ４０リガンドおよびＬＦＡ−３はβ−ケモカインの産生に影響する −ＲＡＮ
ＴＥＳ（活性化が制御されている、正常Ｔ細胞から発現および分泌値される）、
ＭＩＰマクロファージ炎症性タンパク質）−１αおよびＭＣＰ（単球走化性タン
パク質）−１を含むベータケモカイン（ＣＣ型）は特に単球性食細胞を化学誘引
し、Ｔ細胞、好塩基球、好酸球および単核食細胞ならびに他の可溶性免疫調節物
質を活性化する。ＭＣＰ−１と比較して、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αはま
た主ＨＩＶ抑制因子であると報告されている。これらの分子は炎症性免疫応答の
調節に重要であると考えられている。しかしながら、感染性疾患におけるそれら
の直接的役割は研究中である。インビボにおけるケモカイン産生に対して、ＣＤ
４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１分子のワクチンアジュ
バントとしての関係は知られていない。ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＦＡ−
３およびＩＣＡＭ−１ ｃＤＮＡを加えたｇＤ ＤＮＡワクチンの共注射により
誘導されるケモカイン（ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１およびＭＩＰ−１α）のレベ
ルが調べられた。ｇＤ ＤＮＡワクチン単独でＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１および
ＭＩＰ−１αの産生を抗原特異的様式で促進した。さらに、ＣＤ４０リガンド
ｃＤＮＡの共注射はＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１α産生をｇＤ ＤＮＡワクチ
ン単独よりも著しく高く促進した。対照的に、ＣＤ４０分子の共注射はβ−ケモ
カイン産生に対してわずかな増強効果しか示さなかった。ＬＦＡ−３ ｃＤＮＡ
の共注射はＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１α産生をｇＤ ＤＮＡワクチン単独よ
りも著しく高く促進したデータが得られた。同様に、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ
−１αの産生はＩＣＡＭ−１共注射により促進された。対照的に、ＭＣＰ−１産
生はＩＣＡＭ−１共注射により阻害された。この調節は共刺激および接着分子は
βケモカインファミリーの個々の構成物の産生に特異的効果を持つことができる
ことを支持している。ＣＤ４０リガンドおよびＬＦＡ−３は膣内（ｉ．ｖａｇ．）ＨＳＶ感染の保護を 促進する 。 ＨＳＶ−２（１８６）の致死量（ＬＤ50）は以前に測定されている
。ｇＤ ＤＮＡワクチンに分子アジュバントとしてＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド
、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１ ｃＤＮＡを使用するとＨＳＶ−２感染の保護
に影響できるかどうかを決定するため、マウスをＤＮＡワクチンおよび個々の共
刺激および接着分子ｃＤＮＡの両方で免疫し、続いて４ＬＤ50のＨＳＶ−２でｉ
．ｖａｇ．感染させた。膣内感染経路は、ＨＳＶ−２が粘膜を通して感染し、泌
尿性器感染を起こすので選択された。共刺激および接着分子遺伝子を加えたｇＤ
ＤＮＡワクチンを２倍量にして免疫したマウスの生存率が測定された。マウス
の各々の群（ｎ＝１０）を共刺激または接着分子遺伝子（４０μｇ）を加えたｇ
Ｄ ＤＮＡワクチン（１０μｇ）で１回免疫した。ＤＮＡ免疫感作４週間後、マ
ウスを４ＬＤ50のＨＳＶ−２株１８６（１．４ｘ１０4ｐｆｕ）でｉ．ｖａｇ． 感染させた。マウスをｇＤ ＤＮＡワクチンで免疫した場合、６０％の生存が記
録されたが、すべての天然のマウスはウイルス感染後１３日以内に死亡した。Ｃ
Ｄ４０リガンドの共注射は生存率を１００％に上げたが（保護率の４０％の上昇
）、ＣＤ４０ｃＤＮＡの共注射はｇＤ ＤＮＡワクチン単独と比較して極微の保
護効果しか示さなかった。さらに、ＬＦＡ−３ｃＤＮＡの共注射は生存率を９０
％に上げた。しかしながら、ＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡの共注射はＨＳＶ−２感染に
わずかに良好な効果を示しただけであった。考察 抗原提示の間、ＡＰＣの共刺激分子はＴ細胞応答の開始および分化に重要であ
る。特に、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用はＡＰＣからのＢ７およびＩＬ−１２
発現を誘導する。ＩＬ−１２はまたＴ細胞からのＣＤ４０リガンド発現を促進さ
せるが、一方、ＩＦＮ−γはＣＤ４０リガンド発現を阻害し、それらはＴ細胞上
のＣＤ４０リガンド誘導の自己制御機構であるらしいことを示している。さらに
、サイトカインＩＬ−２およびＩＬ−４もまた抗ＣＤ３刺激Ｔ細胞上のＣＤ４０
リガンド発現を促進し、インビボでの免疫応答の仲介における共刺激分子および
サイトカイン間の協調制御が存在することを示している。さらに、ＣＤ４０−Ｃ
Ｄ４０リガンド相互作用はＴｈ細胞依存性抗体応答、前炎症性サイトカイン産生
を増加させ、マクロファージの殺腫瘍性および殺微生物活性に必要とされる。特
に、ＣＤ４０リガンドは休止Ｔ細胞では発現されないが、ＣＤ３−ＴＣＲが引き
金を引く過程により誘導される。ＣＤ４０（４５−５０ｋＤ糖タンパク質）はＴ
ＮＦレセプタースーパーファミリーの構成物であり、Ｂ細胞、単球および樹状細
胞上に発現される。しかしながら、そのリガンド、ＣＤ４０リガンド（ｇｐ３９
）はＴＮＦ−αと配列相同性を持つタイプＩＩ膜内外タンパク質であり、活性化
Ｔ細胞上に過渡的に発現される。接着分子の相互作用、Ｔ細胞上のＬＦＡ−３と
ＡＰＣ上のＩＣＡＭ−１、はＩＣＡＭ−１に高い親和性および結合活性を持つＬ
ＦＡ−３のコンホメーション変化により高度に制御されている。ＣＤ３モノクロ
ーナル抗体またはクラスＩＩと抗原に関係したＬＦＡ−３の共刺激はＴ細胞増殖
およびＴ細胞からの種々のサイトカインのより高い産生を生じることが知られて
いる。さらに、ＬＦＡ−３とＩＣＡＭ−１の相互作用はシグナル経路の引き金を
引く。共刺激性ＣＤ４０／ＣＤ４０リガンド分子と比較して、これらの接着分子
および抗ＣＤ３または抗ＴＣＲ抗体の表面上での共局在化がＴ細胞への適切なシ
グナリングに必要とされる。
【０１５５】 ＤＮＡワクチンと一緒のＡＰＣ刺激または誘引分子の共注射は、免疫性の両方
向のより有効な誘導を生じる。筋肉内（ｉ．ｍ．）注射では、ＤＮＡは筋繊維内
へ取り込まれ、続いての内因性発現で免疫系へ天然形抗原の提示を導く。分泌さ
れた抗原は食作用により摂取され、次にペプチド−ＭＨＣ ＩＩ複合体としてマ
クロファージにより提示され、それは一次活性化シグナル、天然のＴ細胞の刺激
に必要な共刺激性リガンドおよびサイトカインを提供できる。最近の実験的証拠
もまた、ＤＮＡのｉ．ｍ．または皮膚送達に続くインビボでのＡＰＣ直接的トラ
ンスフェクションを支持している。ＤＮＡワクチンとＢ７．１およびＢ７．２の
ような共刺激分子の共注射は、Ｔｈ細胞増殖性応答および細胞障害性Ｔ細胞活性
のような抗原特異的細胞性免疫応答を劇的に促進した。同様に、ＧＭ−ＣＳＦ遺
伝子の共注射はウイルスＤＮＡワクチンモデルにおいて抗体および細胞性免疫応
答の両方を促進する。ｐＬａｃＺにＣＤ４０リガンドｃＤＮＡを加えた共注射は
体液性および細胞性免疫応答の両方を、特にＣＴＬを抗原依存性様式で促進する
。しかしながら、共刺激および接着分子の共送達によるＨＳＶ感染研究は存在し
ない。ＨＳＶ−２に対する抗原特異的免疫応答および保護的免疫性の誘導におけ
るこれら二つの異なった経路を比較することも興味が持たれる。
【０１５６】 ＣＤ４０およびＣＤ４０リガンド遺伝子によるワクチン修飾によってはｇＤ特
異的抗体産生の有意な増加は観察されなかった。しかしながらこのことは、ＤＮ
Ａベクター（β−ガラクトシダーゼ）で送達された場合、ＣＤ４０リガンドの共
注射が抗原に対する抗体産生を促進するという以前の発見と一致してしない。こ
の矛盾は試験された抗原の性質によるものであろう。しかしながら、ＣＤ４０リ
ガンド共注射により同様のＩｇＧアイソタイプ産生パターンが誘導されたという
類似の発見も存在する。我々の研究において、ＣＤ４０リガンド共注射は、Ｔｈ
１型免疫応答により仲介されると信じられているＩｇＧ１アイソタイプと比較し
て、ＩｇＧ２ａ産生の著しい増加を誘導した。このことは、ＣＤ４０リガンドの
発現を駆動するプラスミドベクターを共注射することによりＴｈ１型へのｇＤ特
異的免疫応答の偏向が達成されることを暗示している。対照的に、ｇＤ ＤＮＡ
ワクチン単独またはＩＣＡＭ−１共注射と比較して、ＬＦＡ−３の共注射により
ｇＤ特異的ＩｇＧ産生の著しい増加が観察された。このことは、ＬＦＡ−３はイ
ンビボで抗体応答を促進できることを示している。また、ＬＦＡ−３共注射はＩ
ｇＧ１およびＩｇＧ２ａアイソタイプの増加した産生により示されるＴｈ１およ
びＴｈ２両方の産生を促進し、ＬＦＡ−３はインビボでＴｈ１およびＴｈ２両方
の免疫応答を駆動できることを暗示している。
【０１５７】 増加したＴｈ細胞増殖はＣＤ４０リガンドをコードしているプラスミドＤＮＡ
の共注射により達成された。このことは再び、ＣＤ４０リガンド分子は抗原特異
的Ｔｈ細胞増殖およびＩＦＮ−γ産生ならびにＣＴＬ応答を増加させるという他
のモデルにおける以前の発見と一致している。このパターンは、ＣＤ４０リガン
ドｃＤＮＡの共注射はＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌を促進させるが、ＩＬ−１
０産生を阻害することが観察されたサイトカイン産生レベルと一致している。従
って、ｇＤ ＤＮＡワクチン接種におけるＣＤ４０リガンドｃＤＮＡの使用は、
Ｔｈ１型へ免疫応答を偏向させ、細胞仲介免疫性を増加させることに有効である
。しかしながら、ＬＦＡ−３の共注射はＩＬ−２、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γ
の産生を促進し、ＩＣＡＭ−１の共注射はサイトカイン産生をわずかに促進する
。このことは、ＬＦＡ−３はＴｈ１およびＴｈ２表現型の両方へ免疫応答を駆動
するＩｇＧアイソタイプパターンを支持している。
【０１５８】 ケモカインは免疫および炎症性応答においてサイトカインをしのばせる様式で
重要な役割を果たしていると最近報告されている。ＨＳＶ感染により仲介される
眼性炎症疾患がＴｈ２型サイトカインタンパク質（ＩＬ−１０）の局所投与によ
り抑制された。この適用はケモカイン産生の抑制を生じた。この疾患（眼の炎症
）はまた抗ＭＩＰ−１αの注射（しかしＭＣＰ−１ではない）でも改善され、Ｍ
ＩＰ−１αがＴｈ１型ケモカインとして区別されることを再び示している。しか
しながら、感染性状態に対するケモカインの役割は研究中である。本研究におい
て、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αの産生がＣＤ４０リガンドの共送達により
ＣＤ４０より高く促進され、ＣＤ４０リガンド分子はＴ細胞からのβケモカイン
産生の制御に重要な役割を果たしていることを示唆している。ＬＦＡ−３および
ＩＣＡＭ−１の両方がＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳの産生を促進した。対照
的に、ＭＣＰ−１産生はＬＦＡ−３には影響を受けず、またはＩＣＡＭ−１では
阻害され、接着分子はまたインビボでβケモカイン産生を制御できることを示し
ている。
【０１５９】 体液性、細胞性または両方がＨＳＶ感染に対する保護的免疫性に関与できるこ
とが報告されている。ＨＳＶ特異的モノクローナル抗体による受動免疫法は致死
的ＨＳＶ感染からの保護を行った。ウイルス感染の間、中和抗体は遊走性ウイル
ス粒子を不活性化できるが、細胞内ＨＳＶ感染を阻害することはできない。抗体
依存性補体仲介および抗体依存性細胞仲介細胞毒性（ＡＤＣＣ）はＨＳＶ感染を
制御するには不十分なようである。従って、ＨＳＶ特異的細胞仲介免疫性がＨＳ
Ｖ感染細胞を撲滅するおよびＨＳＶ感染を制御するための主たるエフェクター機
能を果たすであろうことが示唆されている。ＨＳＶ感染の制御に対するＣＤ４+ および／またはＣＤ８+Ｔ細胞により仲介される細胞性免疫応答の重要性がよく 記述されている。
【０１６０】 ＣＤ４０リガンド分子の共注射はＨＳＶ−２感染により生じる死亡からの著し
く増強された保護を誘導することが観察された。このことは、保護的免疫性とＴ
ｈ１型細胞性免疫性の間の正の相関があることを示唆しており、それはＣＤ４０
リガンド分子と共注射された場合の増加したＴｈ細胞増殖性応答およびＩＦＮ−
γ産生により支持される。我々の観察は、ＣＤ４０リガンド共注射がリーシュマ
ニア メジャーまたは抗原を発現している転移性腫瘍からの攻撃に対する保護的
免疫性を増強するという以前の発見と一致している。ＬＦＡ−３はＨＳＶ−２感
染により生じる死亡からの著しく増強された保護を誘導することが観察された。
細胞性および／または体液性免疫性のＬＦＡ−３増強はこの系におけるＨＳＶ−
２由来死亡率を減少することに関係しているように思われる。ＣＤ４０リガンド
またはＬＦＡ−３誘導ＩＦＮ−γがインビボで抗ＨＳＶ−２活性に部分的に関与
することも可能である。従って、ＣＤ４０リガンドおよびＬＦＡ−３駆動細胞性
または体液性仲介免疫性はＨＳＶ感染の保護と関係しているようである。
【０１６１】 最後に、本明細書に示されたデータは共刺激および接着分子は抗原特異的免疫
応答の誘導において異なった共刺激性経路を持っていることを示唆している。特
に、ＣＤ４０リガンドは免疫応答をＴｈ１型へ向け、それに対し、ＬＦＡ−３は
Ｔｈ１およびＴｈ２免疫型の両方を援助する。そのような活性は従来サイトカイ
ンのみに付随していたものである。これらのデータは共刺激分子は抗原特異的免
疫性の誘導におけるサイトカインのような中心的な役割を持っていることを示し
ている。また、ＣＤ４０リガンドおよびＬＦＡ−３はｇＤ ＤＮＡワクチン接種
において致死的ＨＳＶ−２感染に対する増強された保護を仲介する。この発見は
感染性疾患のための我々の武器を豊富にしている。実施例７ 免疫表現型およびＨＳＶ−２による致死的感染に対する保護についてのケモカ
イン（ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１およびＭＩＰ−１α）
の調節効果が分析された。ＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳ共注射は抗原特異的免疫
応答および致死的ＨＳＶ−２感染からの保護を劇的に促進した。しかしながら、
ＩＬ−８およびＩＰ−１０による共注射は感染マウスの死亡率を増加させた。こ
れらの研究は、保護的抗原特異的免疫性の発生に重要な役割を果たしているサイ
トカインをより思い出させる様式で、ケモカインが免疫応答を支配および駆動で
きることを示している。
【０１６２】 免疫および炎症性反応の開始は共刺激分子、細胞性接着分子、サイトカインお
よびケモカインの厳しく調整された発現を含んだ複雑な過程である。特に、ケモ
カインは血管から宿主防御の末端部位への白血球やりとりの分子的制御に重要で
ある。ケモカインのスーパーファミリーは二つのシステイン残基を分離している
一つのアミノ酸配列の存在（αファミリー）または不在（βファミリー）に基づ
く二つのサブファミリーから成っている。αおよびβケモカインは好中球、好酸
球、好塩基球および単球を含む種々の免疫細胞型の直接的遊走を誘導することが
示されている。最近、ケモカインファミリー（ＣＸＣ型）、インターロイキン（
ＩＬ−８）およびインターフェロン−γ−誘導可能タンパク質（ＩＰ−１０）、
およびβケモカインファミリー（ＣＣ型）、ＲＡＮＴＥＳ（活性化が制御されて
いる、正常Ｔ細胞発現および分泌）、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１）およ
びマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１α）がＴリンパ球を化学誘引す
ることが示されている。特に、ＩＬ−８およびＩＰ−１０は好中球を化学誘引し
、血流からそれらの放出を誘導して周囲の組織へ移行させることが知られている
。同様に、ＲＡＮＴＥＳは単球（ＣＤ４+／ＣＤ４５ＲＯ+記憶Ｔ細胞）を化学誘
引し、ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞を刺激する。ＭＩＰ−１αは好酸球を化学誘
引および脱顆粒することが知られている。ＭＩＰ−１αはまた、好塩基球および
肥満細胞からのヒスタミン放出を誘導し、好塩基球およびＢ細胞を化学誘引する
。ＭＣＰ−１は慢性炎症性疾患で重要なケモカインである。ＭＣＰ−１は単球が
血流から移行して組織マクロファージになるのを誘導する。ＭＣＰ−１はまた活
性化記憶サブセットのＴリンパ球を化学誘引する。最近の研究は、ケモカインレ
セプターはＴ細胞サブセットに印を付けることおよびケモカインは抗原特異的免
疫応答の発生に関与していることを支持している。
【０１６３】 免疫応答の調節および保護的免疫性を調べるため、ＨＳＶ−２ｇＤタンパク質
をコードしているＤＮＡ発現構築物とケモカイン（ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＲＡ
ＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α）をコードしているプラスミドを共送達し
た。次に、それらの抗原特異的免疫誘導および感染に対する保護における調整効
果を分析した。第一に、抗原特異的抗体応答の誘導に対する選択されたケモカイ
ンのインビボでの効果が調べられた。対照として、ｇＤワクチンおよび二つの前
炎症性サイトカイン、ＴＮＦファミリー遺伝子（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）
で動物を免疫した。これらの前炎症性サイトカインは、初期免疫応答に同様に関
与し、陽性対照として働くに違いないと考えられたので研究された。ＤＮＡベク
ターで免疫したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）における全身性ｇＤ特異的ＩｇＧレベル
を測定するためにＥＬＩＳＡが使用された。マウスの各々の群（ｎ＝１０）を０
および２週目にケモカイン遺伝子（マウス当たり４０μｇ）またはＴＮＦ遺伝子
（マウス当たり４０μｇ）を加えたｇＤ ＤＮＡワクチン（マウス当たり６０μ
ｇ）で免疫した。ｇＤ抗原およびケモカインを発現するＤＮＡ構築物は以前にク
ローン化されている（Ｐａｃｈｕｋ，ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．２２６，７９；Ｋｉｍ，
ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２，１１１２；およ
びＫｉｍ，ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８，１０８
９）。２回目の免疫感作２週間後にマウスから採血し、群当たり均等にプールし
た血清をｇＤとの反応のために連続的に希釈した。ＥＬＩＳＡ力価は天然のマウ
スの血清と同一の光学密度を示している最も希釈した血清を基準にして決定され
た。吸光度（Ｏ．Ｄ．）は４０５ｎｍで測定された。２回目の免疫感作２週間後
に集められた均等にプールした血清のＥＬＩＳＡ力価はＩＬ−８に対しては１２
．０００、ＩＰ−１０に対しては６，４００、ＲＡＮＴＥＳに対しては６，４０
０、ＭＣＰ−１に対しては６，４００、ＭＩＰ−１αに対しては１２．０００、
ＴＮＦ−αに対しては２５，６００、ＴＮＦ−βに対しては６，４００およびｇ
Ｄ ＤＮＡワクチン単独に対しては６，４００であると決定された。このことは
ＩＬ−８およびＭＩＰ−１α遺伝子の共注射で中程度の、しかし著しくはないｇ
Ｄ特異的ＩｇＧ抗体促進を示している。対照的に、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳま
たはＭＣＰ−１はｐｇＤワクチン接種単独と同じレベルの抗体応答を示した。Ｔ
ＮＦ−αｃＤＮＡ対照は、ｇＤ ＤＮＡワクチン単独のレベルよりも著しく高い
全身性ＩｇＧレベルを生じた。
【０１６４】 ＩｇＧ１アイソタイプの誘導はＴｈ２型サイトカインにより誘導され、一方、
ＩｇＧ２ａアイソタイプ産生はインビボでＴｈ１型サイトカインにより影響およ
び駆動されることが報告されている。このことは、免疫応答がＴｈ１またはＴｈ
２サイトカインのどちらの制御下にあるのかを決定するための指標として使用さ
れてきた。共注射により誘導されたＩｇＧサブクラスが分析された。各々の免疫
感作群により誘導されたＩｇＧアイソタイプが測定された。マウスの各々の群（
ｎ＝１０）を０および２週目にケモカイン遺伝子（マウス当たり４０μｇ）また
はＴＮＦ遺伝子（マウス当たり４０μｇ）を加えたｇＤ ＤＮＡワクチン（マウ
ス当たり６０μｇ）で免疫した。最後の免疫感作２週間後にマウスから採血し、
血清をｇＤとの反応のために１：１００に希釈した。ｇＤ特異的ＩｇＧサブクラ
スの相対レベルを決定するため、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰをＨＲＰと結合された
抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ３（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａ
ｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）に置換した。吸光度（Ｏ．Ｄ．）は４０５ｎｍ
で測定された。相対光学密度は、各々のＩｇＧサブクラスの光学密度／全体の光
学密度で計算された。ラインは各々のマウスＩｇＧサブクラスの光学密度の平均
（ｎ＝１０）を示している。ＩｇＧ１に対するＩｇＧ２ａ（Ｔｈ２に対するＴｈ
１）の相対比が測定された。ｐｇＤ免疫群は０．６２のＩｇＧ１に対するＩｇＧ
２ａ比を持っていた。ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳまたはＴＮＦ−α遺伝子での共注
射はＩｇＧ１に対するｇＤ特異的ＩｇＧ２ａの相対比を０．８に増加させた。一
方、ＩＰ−１０およびＭＩＰ−１αによる共注射はＩｇＧ１に対するＩｇＧ２ａ
の相対比を減少させ（０．３および０．４）、ＭＣＰ−１またはＴＮＦ−β遺伝
子はｐｇＤワクチン接種単独と同じＩｇＧサブタイプパターンを生じた。この分
析はＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳがインビボでγ−ＩＦＮ型サイトカインと同様
の様式でＴｈ１表現型の方へ免疫応答を動かすことを支持している。それ故、こ
れらの結果は、Ｔｈ１またはＴｈ２への体液性免疫応答の移行はケモカインによ
り調節できるというＨＩＶモデルの以前の発見に拡張され、ケモカインがインビ
ボでサイトカイン産生を調節できるということを再び示唆している。
【０１６５】 細胞増殖は、細胞仲介免疫性の能力を評価するために使用される標準パラメー
ターである。ケモカイン遺伝子での共免疫感作に続くＴｈ細胞増殖性応答が、免
疫動物からの脾臓細胞をインビトロでｇＤタンパク質により刺激することにより
測定された。α−ケモカインｃＤＮＡ、β−ケモカインｃＤＮＡおよびＴＮＦ対
照で共免役したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）におけるインビトロｇＤ刺激後の脾臓細
胞のＴｈ細胞増殖レベル。マウスの各々の群（ｎ＝２）を０および２週目にケモ
カイン遺伝子（マウス当たり４０μｇ）またはＴＮＦ遺伝子（マウス当たり４０
μｇ）を加えたｇＤ ＤＮＡワクチン（マウス当たり６０μｇ）で免疫した。最
後のＤＮＡ注射２週間後に２匹のマウスを殺し、脾臓細胞を増殖アッセイにため
にプールした。脾臓細胞はｍｌ当たり１および５μｇのｇＤ−２タンパク質、お
よび陽性対照としてｍｌ当たり５μｇのＰＨＡで刺激された。刺激して３日後、
細胞を採取し、ｃｐｍが計数された。試料は３重にアッセイされた。ＰＨＡ対照
試料は４０−５０の刺激指数を示した。ｐｇＤ ＤＮＡワクチン接種単独でｇＤ
特異的Ｔｈ細胞増殖性応答を生じた。ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳおよびＴＮＦ−α
ｃＤＮＡの共注射によりｇＤ ＤＮＡワクチン単独よりも著しく促進されたＴｈ
細胞増殖性応答も観察された。ＴＮＦ−β遺伝子の共注射では増殖のわずかな促
進が観察された。対照的に、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１およびＭＩＰ−１α遺伝子
の共免疫感作はＴｈ細胞増殖性応答レベルにほとんど影響を及ぼさないようであ
る。しかしながら、共注射はＰＨＡ誘導非特異的Ｔｈ細胞増殖性応答には何の影
響も与えなかった（Ｓ．Ｉ．範囲は４０から５０であった）。ｇＤプラスミドワ
クチン接種はＢａｌｂ／ｃマウスにＣＴＬエピトープが存在しないためＣＴＬ応
答を生じなかった。しかしながら、細胞性効果をより詳細に評価するため、サイ
トカイン産生プロフィールを次に試験した。
【０１６６】 Ｔｈ１サイトカイン（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）およびＴｈ２サイトカイン
（ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０）は免疫応答偏向についての我々の理解
における主な支えであってきた。Ｔｈ１免疫応答は細胞免疫性の誘導を駆動する
と考えられ、一方、Ｔｈ２免疫応答は優先的に体液性免疫を駆動する。ＩｇＧ表
現型の結果に基づいて、直接的サイトカイン放出を分析することによりＴｈ１対
Ｔｈ２問題をさらに評価した。表４に示したように、ＩＬ−８ｃＤＮＡの共注射
によりＩＬ−２産生がほとんど７倍に劇的に増加した。ＩＬ−２はまたＴＮＦ−
αｃＤＮＡの共注射およびＭＩＰ−１αカセットの共注射によっても誘導された
。特に、ＩＦＮ−γ産生はＲＡＮＴＥＳ（２０倍）およびＩＬ−８（６倍）の共
送達により最も著しく促進され、さらにアイソタイプ分類結果を支持し、および
ＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳがＴｈ型細胞性免疫応答を抗原依存性様式で仲介し
ていることを示している。ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−
β共注射もまたＩＬ−１０産生をｐｇＤワクチン単独よりも著しく高く促進した
。このことはＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳはＴｈ２型よりも主としてＴｈ１型で
動かしていることを示している。
【０１６７】 ケモカイン共注射がβケモカイン産生を抗原依存性様式で誘導できるかどうか
を決定するため、共免疫し、および次に組換え体ｇＤ抗原または対照抗原でイン
ビトロ刺激後の脾臓細胞のβケモカイン放出レベルを分析した。表５に示されて
いるように、ＭＣＰ−１産生はＩＬ−８ｃＤＮＡの共注射では劇的に増加したが
、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αカセットの共注射では減少した。特に、ＭＩ
Ｐ−１αの産生はＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−８の共送達により最も著しく促進さ
れた。ＲＡＮＴＥＳの場合、ＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳ共注射はＲＡＮＴＥＳ
産生をｐｇＤワクチン単独よりも高く促進した。このことは、ＲＡＮＴＥＳはＨ
ＳＶモデルにおけるＩＬ−８とは異なるように抗原特異的免疫応答を調節するこ
とを示している。このことはケモカイン分子がそれら自身の産生を調節すること
も支持している。
【０１６８】 ＨＳＶは口唇ヘルペス、眼性感染、脳炎および生殖器感染のようなヒト疾患ス
ペクトルの原因因子である。ＨＳＶはウイルス潜伏を確立でき、宿主でしばしば
再発する。ウイルス感染の間、中和抗体はウイルス粒子を不活性化できるが、細
胞内ＨＳＶ感染を制御することはできない。むしろ、細胞仲介免疫性がインビボ
でＨＳＶ感染細胞の撲滅およびＨＳＶ拡大の主たるエフェクター機能を果たして
いる。ＨＳＶに対して高められた細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の適応輸送は
動物における致死的ＨＳＶ感染からの完全な保護を生じる。さらに、Ｔｈ１型Ｃ
Ｄ４+Ｔ細胞がＨＳＶ−２感染の保護により決定的な役割を果たしているという いくつかの報告がある。ＣＤ４+Ｔ細胞がインビボで枯渇した場合、ＨＳＶに対 する保護的免疫性が喪失した。さらに、Ｔｈ１型ＣＤ４+Ｔ細胞は大量のＩＦＮ −γを発生する。ＩＦＮ−γはＨＳＶ感染細胞上のクラスＩおよびＩＩ発現を上
方制御し、細胞障害性ＣＤ４+Ｔ細胞およびＣＤ８+ＣＴＬによるより良好な認識
を可能にするので、直接的抗ＨＳＶ効果を持っている。Ｔｈ１型サイトカインｃ
ＤＮＡの共送達は致死的ＨＳＶ感染からの生存を促進したが、Ｔｈ２型サイトカ
インｃＤＮＡの共送達は疾患状態を悪化させた。同様に、原型Ｔｈ１型サイトカ
インＩＬ−１２ｃＤＮＡの共送達により促進された保護はＨＳＶ感染モデルのＴ
ｈ１型ＣＤ４+Ｔ細胞により仲介され、ＨＳＶ感染に対するＴｈ１型Ｔ細胞仲介 保護的免疫性の重要性を強調している。
【０１６９】 抗原特異的免疫調節が病原体複製に影響することが重要である。α−ケモカイ
ンｃＤＮＡ、β−ケモカインｃＤＮＡおよびＴＮＦ対照を加えたｇＤ ＤＮＡワ
クチンで免疫したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）の生存率が測定された。マウスの各々
の群（ｎ＝８）を０および２週目にケモカイン遺伝子（マウス当たり４０μｇ）
またはＴＮＦ遺伝子（マウス当たり４０μｇ）を加えたｇＤ ＤＮＡワクチン（
マウス当たり６０μｇ）で免疫した。第二の免疫感作して３週間後、マウスを２
００ＬＤ50のＨＳＶ−２株１８６（７ｘ１０5ｐｆｕ）でｉ．ｖａｇ．感染させ た。ウイルスを接種する前に。膣内領域を０．１ＭＮａＯＨ溶液に浸した綿付き
塗布具（Ｈａｒｄｗｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｇｕｉｆｏｒ
ｄ，ＭＥ）でふきとり、乾燥綿付き塗布具で清浄した。マウスは生存率を評価す
るため毎日検査された。生き残っているマウスはウイルス感染に続く６１日にわ
たって計数した。これは一度繰り返され、期待された結果が得られた。マウスヘ
ルペス感染モデルにおけるケモカイン共注射の保護的有効性を分析した。マウス
はｉ．ｍ．で０および２週目にＤＮＡベクターで共免疫され、続いて第二の免疫
感作３週間後にＨＳＶ−２を感染させた。ＨＳＶ−２が粘膜を経て感染するので
膣内感染経路が選択された。ｇＤ ＤＮＡワクチン単独では、２００ＬＤ50のＨ
ＳＶ−２膣内感染で６３％のマウスの生存が得られた。ＩＬ−８およびＲＡＮＴ
ＥＳ ｃＤＮＡの共注射は生存率を８８％に上げ、保護率をほとんど３０％上昇
させたが、ＭＣＰ−１およびＩＰ−１０の共投与は生存率を２５％に減少させ、
ｇＤワクチン単独から全体の生存を５０％以上減少させた。同様に、ＭＩＰ−１
α共投与もワクチン接種動物の生存率に負に影響した。これらの観察結果は、各
々のケモカイン群で試験された動物の総数を考えると印象的である（ｇＤ単独の
生存率、１８匹中の１１匹、６１％；ＩＬ−８の生存率、１８匹中の１７匹、９
４％；ＩＰ−１０の生存率、１８匹中の５匹、２８％；ＲＡＮＴＥＳの生存率、
１８匹中の１７匹、９４％；ＭＣＰ−１の生存率、１８匹中の６匹、３３％；Ｍ
ＩＰ−１αの生存率、１８匹中の８匹、４４％）。このことは、ＩＬ−８および
ＲＡＮＴＥＳケモカイン遺伝子の共注射は致死的ＨＳＶ感染からの保護を促進す
るが、それに対し、ＩＰ−１０およびＭＣＰ−１の共注射は動物に免疫応答を誘
導する代わりにウイルス感染に対してより感受性を高くした（ＭＩＰ−１αはよ
り少ない程度で）。これはケモカインＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳが抗原特異的
免疫調節を通してＨＳＶ−２感染からの保護を促進したことを支持している。こ
れらの研究は、ケモカインが重要な免疫応答および疾患進行をサイトカインを思
わせる様式（Ｔｈ１対Ｔｈ２）で働くおよび調節できることを支持している。有
意な免疫調節が共送達されたケモカインｃＤＮＡの使用を通して達成でき、免疫
応答だけでなく疾患保護にも影響を与えている。さらに、ケモカイン遺伝子送達
アジュバントの使用（特に、ＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳ）は、より有効なワク
チン技術またはＨＳＶのための免疫治療に重要にちがいない。我々は以前に、Ｔ
ｈ１型サイトカイン遺伝子の共注射は致死的ＨＳＶ感染からの保護率を増加させ
るが、それに対し、Ｔｈ２型サイトカイン共注射はウイルス感染に対する動物の
感受性を増加させることを報告している。病因論研究において、病原感染抵抗性
に対するＴｈ１様サイトカイン応答の重要性が報告されている。それ故、Ｔｈ１
および／またはＴｈ２型免疫応答はこれらのケモカインにより駆動されており、
免疫応答の質に基づいてＨＳＶ感染性攻撃からの保護に影響を生じているようで
ある。
【０１７０】 ヘルペス感染モデルにおけるＴＮＦファミリー共注射の保護的効能を比較した
。ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β遺伝子両方の共注射もまた感染マウスの生存率を
２５％に低下させた（ｇＤワクチン単独より全体で５０％以上の低下）。ＴＮＦ
−αを共注射したマウスのｇＤ特異的抗体およびＴｈ細胞増殖レベルならびにサ
イトカイン産生レベル（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０）はｇＤ ＤＮＡワ
クチン接種単独よりも高かったが、ＨＳＶ−２感染に対するＴＮＦサイトカイン
仲介感受性がこれらの動物で観察された。この観察結果の理由は不明瞭であるが
、応答の質が病原体感染の制御に特に重要であることを支持している。
【０１７１】 最後に、本明細書に示されたデータはケモカインが抗原依存性様式でＴｈ１お
よび／またはＴｈ２型への免疫応答を調節することができることを示している。
そのような活性は従来はサイトカインに付随するものとして存在し、ケモカイン
は抗原特異的免疫性の誘導にサイトカインのような中心的な役割を持っているこ
とを暗示している。免疫治療およびワクチン接種のために免疫応答を調節するケ
モカインの使用はさらに研究するのに相応しいものである。
【０１７２】
【表１】
【０１７３】
【表２】
【０１７４】
【表３】
【０１７５】
【表４】
【０１７６】
【表５】
【０１７７】
【表６】
【０１７８】
【表７】
【０１７９】
【表８】
【０１８０】
【表９】
【０１８１】
【表１０】
【０１８２】
【表１１】
【０１８３】
【表１２】
【０１８４】
【表１３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａおよび図１Ｂは実施例２で議論されるような再加工された
および成熟ＩＬ−１８を示している。
【図２】 図２はｐＣＤＮＡ３発現ベクター内へクローン化されたＩＣＡＭ
−１（ｐＣＩＣＡＭ−１）、ＬＦＡ−３（ｐＣＬＦＡ−３）およびＶＣＡＭ−１
（ｐＣＶＣＡＭ−１）の遺伝子を示している。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年３月２２日（２００１．３．２２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 39/00 Ｚ 38/00 39/21 38/22 39/245 39/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 39/21 Ａ６１Ｋ 37/02 39/245 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 キム，ジョン・ジェイ アメリカ合衆国ペンシルバニア州19454， ノース・ウェイルズ，オーチャード・ドラ イブ 157 (72)発明者 シン，ジョン−イム アメリカ合衆国ペンシルバニア州19104， フィラデルフィア，スプルース・ストリー ト 3817，アパートメント ナンバー706 Ｆターム(参考） 4B024 BA31 BA35 BA36 CA01 CA04 DA01 DA02 DA03 DA12 EA04 GA11 4C084 AA02 AA13 BA35 DB52 DB59 DB63 MA66 ZB071 ZB261 ZB331 ZC551 4C085 AA03 AA21 BA65 BA78 BB01 EE01 EE03 GG01 4C087 AA01 BC83 CA12 MA02 MA66 ZB07 ZB33 ZC55

Claims (39)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 制御要素に作動可能なように連結された免疫原をコードしてい
    るヌクレオチド配列および制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タン
    パク質をコードしているヌクレオチド配列を含むプラスミド、ここで該免疫調節
    タンパク質は：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＲＡＮＴ
    ＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣ
    ＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１５０
    ．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、Ｌ
    ＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異形、ＣＤ
    ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮細胞増殖
    因子、Ｆａｓ、ＴＮＦレセプター、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、
    ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ
    ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６およびカスパーゼ
    ＩＣＥから成る群より選択される。
  2. 【請求項２】 該免疫原が病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関連
    する細胞に結合されている抗原をコードしている標的タンパク質である請求項１
    に記載のプラスミド。
  3. 【請求項３】 該免疫原が病原体抗原である請求項１に記載のプラスミド。
  4. 【請求項４】 該免疫原がＨＩＶ−１抗原である請求項１に記載のプラスミド
    。
  5. 【請求項５】 該免疫調節タンパク質がＩＣＡＭ−１であり、さらに制御要素
    に作動可能なように連結されたＣＤ８６タンパク質をコードしているヌクレオチ
    ド配列を含んでいる請求項１に記載のプラスミド。
  6. 【請求項６】 請求項１のプラスミドを含んでいる注射可能な医薬組成物。
  7. 【請求項７】 個体へ請求項１のプラスミドを投与することから成る、免疫原
    に対して個体の免疫応答を誘導する方法。
  8. 【請求項８】 制御要素に作動可能なように連結された単純ヘルペス抗原をコ
    ードしているヌクレオチド配列および制御要素に作動可能なように連結された免
    疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含むプラスミド、ここで
    該免疫調節タンパク質は：ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、ＬＦＡ−３およびＣＤ４０
    Ｌから成る群より選択される。
  9. 【請求項９】 該単純ヘルペス抗原がＨＳＶ２ｇＤである請求項８に記載のプ
    ラスミド。
  10. 【請求項１０】 請求項８のプラスミドを含んでいる注射可能な医薬組成物。
  11. 【請求項１１】 個体に請求項８のプラスミドを投与することから成る、単純
    ヘルペスウイルス感染に対して個体を免疫する方法。
  12. 【請求項１２】 二つのプラスミドを含む組成物： 第一のプラスミドは制御要素に作動可能なように連結された免疫原をコードし
    ているヌクレオチド配列を含んでおり；および 第二のプラスミドは制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク
    質をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる、ここで該免疫調節タンパク
    質は：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ
    −セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１
    、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１５０．９５、
    ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３
    、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異形、ＣＤ４０、Ｃ
    Ｄ４０Ｌ、血管成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮細胞増殖因子、Ｆ
    ａｓ、ＴＮＦレセプター、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、
    ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩ
    ＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６およびカスパーゼＩＣＥか
    ら成る群より選択される。
  13. 【請求項１３】 該免疫原が病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関
    連する細胞に結合されている抗原をコードしている標的タンパク質である請求項
    １２に記載の組成物。
  14. 【請求項１４】 該免疫原が病原体抗原である請求項１２に記載の組成物。
  15. 【請求項１５】 該免疫原がＨＩＶ−１抗原である請求項１２に記載の組成物
    。
  16. 【請求項１６】 該免疫調節タンパク質がＩＣＡＭ−１であり、さらに制御要
    素に作動可能なように連結されたＣＤ８６タンパク質をコードしているヌクレオ
    チド配列を含んでいる請求項１２に記載の組成物、ここで該第一のプラスミド、
    該第二のプラスミドまたは第三のプラスミドはＣＤ８６タンパク質をコードして
    いる該ヌクレオチド配列を含んでいる。
  17. 【請求項１７】 請求項１２の組成物を含んでいる注射可能な医薬組成物。
  18. 【請求項１８】 個体へ請求項１２の組成物を投与することから成る、免疫原
    に対して個体の免疫応答を誘導する方法。
  19. 【請求項１９】 二つのプラスミドを含む組成物： 第一のプラスミドは制御要素に作動可能なように連結された単純ヘルペス抗原
    をコードしているヌクレオチド配列を含んでおり；および 第二のプラスミドはＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、ＬＦＡ−３またはＣＤ４０Ｌを
    コードしているヌクレオチド配列を含んでいる。
  20. 【請求項２０】 該単純ヘルペス抗原がＨＳＶ２ｇＤである請求項１９に記載
    の組成物。
  21. 【請求項２１】 請求項１９の組成物を含んでいる注射可能な医薬組成物。
  22. 【請求項２２】 個体に請求項１９のプラスミドを投与することから成る、単
    純ヘルペスウイルス感染に対して個体を免疫する方法。
  23. 【請求項２３】 制御要素に作動可能なように連結された免疫原をコードして
    いるヌクレオチド配列および制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タ
    ンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む組換え体ワクチン、ここで該
    免疫調節タンパク質は：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、
    ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、
    ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、
    ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、Ｃ
    Ｄ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異
    形、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮
    細胞増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦレセプター、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳ
    Ｌ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ
    ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６およびカ
    スパーゼＩＣＥから成る群より選択される。
  24. 【請求項２４】 該免疫原が病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関
    連する細胞に結合されている抗原をコードしている標的タンパク質である請求項
    ２３に記載の組換え体ワクチン。
  25. 【請求項２５】 該免疫原が病原体抗原である請求項２３に記載の組換え体ワ
    クチン。
  26. 【請求項２６】 該免疫調節タンパク質がＩＣＡＭ−１であり、さらに制御要
    素に作動可能なように連結されたＣＤ８６タンパク質をコードしているヌクレオ
    チド配列を含んでいる請求項２３に記載の組換え体ワクチン。
  27. 【請求項２７】 個体へ請求項１の組換え体ワクチンを投与することから成る
    、免疫原に対して個体の免疫応答を誘導する方法。
  28. 【請求項２８】 該組換え体ワクチンが組換え体ワクシニアワクチンである請
    求項２３に記載の組換え体ワクチン。
  29. 【請求項２９】 該免疫原が病原体抗原である請求項２３に記載の組換え体ワ
    クチン。
  30. 【請求項３０】 個体へ請求項２３の組換え体ワクチンを投与することから成
    る、免疫原に対して個体の免疫応答を誘導する方法。
  31. 【請求項３１】 制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質
    をコードしているヌクレオチド配列を含む生きている弱力化した病原体、ここで
    該免疫調節タンパク質は：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８
    、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４
    、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１
    、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、
    ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変
    異形、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内
    皮細胞増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦレセプター、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、Ｗ
    ＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、Ｄ
    Ｒ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６および
    カスパーゼＩＣＥから成る群より選択される。
  32. 【請求項３２】 個体に請求項３１の生きている弱力化した病原体を投与する
    ことから成る、病原体に対して個体を免疫する方法。
  33. 【請求項３３】 免疫原に対して個体の免疫応答を誘導する方法であり、ここ
    で該方法は： 制御要素に作動可能なように連結された該免疫原をコードしているヌクレオチ
    ド配列を含んでいる免疫原および／または核酸分子；および 制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質をコードしている
    ヌクレオチド配列を含んでいる免疫調節タンパク質および／または核酸分子を該
    個体に投与することから成っており、該免疫調節タンパク質は：ＭＣＰ−１、Ｍ
    ＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セ
    レクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、
    ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ
    −１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−Ｃ
    ＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異形、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因
    子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮細胞増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦレセプタ
    ー、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−
    ３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ
    −Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６およびカスパーゼＩＣＥから成る群より選択され
    る。
  34. 【請求項３４】 該免疫原が病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関
    連する細胞に結合されている抗原をコードしている標的タンパク質である請求項
    ３３に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 該免疫原が病原体抗原である請求項３３に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 該免疫原がＨＩＶ−１抗原である請求項３３に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 該免疫調節タンパク質がＩＣＡＭ−１であり、および該方法
    がさらにＣＤ８６タンパク質または制御要素に作動可能なように連結されたＣＤ
    ８６タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を投与する請求項３３に記載
    の方法。
  38. 【請求項３８】 ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＲＡ
    ＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、Ｇｌ
    ｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１
    ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２
    、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異形、
    ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮細胞
    増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦレセプター、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−
    １、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、
    ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６およびカスパ
    ーゼＩＣＥから成る群より選択される免疫調節タンパク質へ特異的に結合する抗
    体を治療に有効量含んでいる注射可能な医薬組成物。
  39. 【請求項３９】 個体に請求項３８の注射可能な医薬組成物を投与する工程か
    ら成る、自己免疫疾患を持つ個体を処置する方法。
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