JP2004515213A - ワクチン、免疫療法剤及びそれらの利用 - Google Patents
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Abstract
Description
発明の分野
本発明は、改良されたワクチン、個体を免疫原に対して予防のため及び/又は治療のために免疫化するための改良された方法、並びに改良された免疫療法用組成物及び改良された免疫療法に関係する。
【0002】
発明の背景
免疫療法は、個体の免疫応答を調節して、望ましい治療効果を与えることをいう。免疫療法剤は、個体に投与した場合に、その個体の免疫系を調節して、最終的に、望ましくない免疫応答と関連する症状を低減させ又は最終的に、望ましい免疫応答を増大させることにより症状を緩和させるのに十分な組成物をいう。
【0003】
幾つかの事例においては、免疫療法は、予防接種プロトコールの部分であり、該プロトコールにおいては、個体が免疫応答を生じる免疫原に、その個体をさらすワクチンを、その個体に投与する。かかる事例においては、免疫療法剤は、免疫応答を増大させ及び/又は免疫応答(細胞性アーム又は液性アーム)の一部分を選択的に増強させ、それは、特定の状態、感染又は疾患の治療又は予防に望ましいものである。
【0004】
幾つかの事例においては、免疫療法剤は、免疫原なしで送達される。かかる事例においては、免疫療法剤は、免疫応答を減少させ若しくは抑制し、増強し若しくは増大させ、免疫系の一部分を減少させ若しくは抑制し、又は免疫系の一部分を増強し若しくは増大させることによって免疫系を調節するように与える。
【0005】
幾つかの事例においては、免疫療法剤は、免疫応答の調節に関与するタンパク質にイン・ビボで結合させるために投与する場合には、抗体を含む。抗体と免疫応答の調節に関与するタンパク質との相互作用は、その個体における免疫応答の変化を生じる。例えば、もしこのタンパク質が自己免疫疾患に関与するならば、これらの抗体は、その役割における活性を阻止することができ、それらの症状又は疾患を低減させ又は排除することができる。
【0006】
ワクチンは、個体を、標的抗原例えばアレルゲン、病原性抗原又はヒトの病気に関与する細胞と結合した抗原に対して免疫化するのに有用である。ヒトの病気に関与する細胞と結合した抗原には、癌結合性腫瘍抗原及び自己免疫疾患に関与する細胞と結合した抗原が含まれる。
【0007】
かかるワクチンのデザインにおいて、予防接種された個体の細胞内で標的抗原を生成するワクチンは、免疫系の細胞性アームの誘導において効果的である。特に、生弱毒化ワクチン、組換えワクチン(無発病性ベクター使用)及びDNAワクチンは、各々、予防接種された個体の細胞における抗原の生成へと導き、これは、免疫系の細胞性アームの誘導を生じる。他方、死滅させ又は不活性化したワクチン及びサブユニットワクチン(タンパク質だけを含む)は、液性応答を誘導するが、十分な細胞性免疫応答を誘導しない。
【0008】
細胞性免疫応答は、しばしば、病原体感染に対する防御を与えるのに及び病原体感染、癌又は自己免疫疾患の治療に有効な免疫媒介療法を与えるのに必要である。従って、予防接種した個体の細胞において標的抗原を生成するワクチン例えば生弱毒化ワクチン、組換えワクチン(無発病性ベクター使用)及びDNAワクチンは、しばしば、好ましい。
【0009】
かかるワクチンは、しばしば、個体を、病原体感染又はヒトの病気に対する予防又は治療のために免疫化するのに有効であるが、改良されたワクチンに対する要求がある。増強された免疫応答を生じる組成物及び方法に対する要求がある。
【0010】
同様に、幾つかの免疫療法剤は、患者における免疫応答を調節するのに有用であるが、改善された免疫療法剤組成物及び方法に対する要求がある。
【0011】
発明の概要
本発明は、単離されたRANTESタンパク質及び/又はRANTESタンパク質をコードする核酸分子を、単離されたIL−8タンパク質及び/又はIL−8タンパク質をコードする核酸分子と共に含む組成物に関係する。
【0012】
本発明は、更に、単離されたRANTESタンパク質及び/又はRANTESタンパク質をコードする核酸分子を、単離されたIL−8タンパク質及び/又はIL−8タンパク質をコードする核酸分子と共に含み、更に、標的タンパク質及び/又は標的タンパク質をコードする核酸分子をも含む組成物にも関係する。
【0013】
本発明は、単離されたRANTESタンパク質及び/又はRANTESタンパク質をコードする核酸分子を、単離されたIL−8タンパク質及び/又はIL−8タンパク質をコードする核酸分子と共に含む注射用医薬組成物に関係する。
【0014】
本発明は、単離されたRANTESタンパク質及び/又はRANTESタンパク質をコードする核酸分子を、単離されたIL−8タンパク質及び/又はIL−8タンパク質をコードする核酸分子と共に含み、更に、標的タンパク質及び/又は標的タンパク質をコードする核酸分子をも含む注射用医薬組成物に関係する。
【0015】
本発明は、更に、個体において免疫原に対する免疫応答を誘導する方法であって、単離されたRANTESタンパク質及び/又はRANTESタンパク質をコードする核酸分子を、単離されたIL−8タンパク質及び/又はIL−8タンパク質をコードする核酸分子と共に含み、更に、標的タンパク質及び/又は標的タンパク質をコードする核酸分子をその個体に投与することを含む当該方法に関係する。
【0016】
本発明は、更に、個体の免疫系を調節する方法であって、その個体に、単離されたRANTESタンパク質及び/又はRANTESタンパク質をコードする核酸分子を、単離されたIL−8タンパク質及び/又はIL−8タンパク質をコードする核酸分子と共に投与することを含む当該方法に関係する。
【0017】
本発明は、更に、調節エレメントに操作可能に結合された免疫原をコードするヌクレオチド配列、IL−8をコードするヌクレオチド配列、及びRANTESをコードするヌクレオチド配列を含む組換えワクチン、並びにかかる組換えワクチンを個体に投与することを含む、個体において免疫原に対する免疫応答を誘導する方法に関係する。
【0018】
本発明は、更に、IL−8をコードするヌクレオチド配列及びRANTESをコードするヌクレオチド配列を含む生弱毒化病原体、並びに生弱毒化病原体を個体に投与することを含む、個体において病原体に対する免疫応答を誘導する方法に関係する。
【0019】
好適具体例の詳細な説明
ここで用いる場合、用語「免疫調節タンパク質」は、RANTESタンパク質及びIL−8タンパク質を指すことを意味する。
【0020】
ここで用いる場合、用語「標的タンパク質」は、免疫応答の標的タンパク質として作用する本発明の遺伝子構築物によりコードされるペプチド及びタンパク質を指すことを意味する。用語「標的タンパク質」及び「免疫原」は、交換可能に用いられ、それに対する免疫応答が誘出されうるタンパク質である。この標的タンパク質は、病原体又は望ましくない細胞型例えば癌細胞若しくは自己免疫疾患に関与する細胞(該細胞に対する免疫応答が望まれる)に由来するタンパク質と少なくとも一つのエピトープを共有する免疫原性タンパク質である。この標的タンパク質に対する免疫応答は、個体を、標的タンパク質が関係する特異的感染又は疾患から防護し且つ/又は治療するであろう。
【0021】
ここで用いる場合、用語「遺伝子構築物」は、標的タンパク質又は免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むDNA又はRNA分子をいう。コード配列は、核酸分子を投与された個体の細胞中で発現を指示することのできるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに操作可能に結合された開始及び終止シグナルを含む。
【0022】
ここで用いる場合、用語「発現可能形態」は、個体の細胞中に存在した場合にコード配列が発現されるように、標的タンパク質又は免疫調節タンパク質をコードするコード配列に操作可能に結合された必要な調節エレメントを含む遺伝子構築物をいう。
【0023】
ここで用いる場合、用語「エピトープの共有」は、他のタンパク質のエピトープと同一であるか又は実質的に類似する少なくとも一つのエピトープを含むタンパク質をいう。
【0024】
ここで用いる場合、用語「実質的に類似するエピトープ」は、一つのタンパク質のエピトープと同一ではないが、それにもかかわらず、そのタンパク質に対して交差反応する細胞性又は液性免疫応答を呼び出す構造を有するエピトープを指すことを意味する。
【0025】
ここで用いる場合、用語「細胞内病原体」は、その生殖周期又は生活環の少なくとも部分において宿主細胞中に存在して病原性タンパク質を生成し又は生成されるウイルス又は病原性有機体を指すことを意味する。
【0026】
ここで用いる場合、用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖により特徴付けられる疾患を指すことを意味する。
【0027】
ここで用いる場合、用語「過剰増殖関連タンパク質」は、過剰増殖性疾患と関係するタンパク質を指すことを意味する。
【0028】
この発明は、IL−8とRANTESの組合せが免疫応答を調節するという発見から生まれた。従って、これらのタンパク質及び/又はこれらのタンパク質をコードする核酸分子の組合せは、免疫療法剤として、又はワクチンの成分と組合せて若しくは該成分として送達することができる。RANTESとIL−8との組合せは、抗原特異的なTh1型免疫応答を駆動すること及びワクチンの部分として投与した場合に防護免疫を増強することが見出されている。
【0029】
CTL応答を誘導して増強する免疫調節タンパク質は、細胞内病原体に対する又は自己免疫疾患若しくは癌に関係する細胞に対するワクチンと共に若しくは該ワクチンの部分として投与した場合に、特に有用である。CTL応答を誘導して増強する免疫調節タンパク質は、生弱毒化ワクチン、細胞ワクチン、組換えワクチン及び核酸/DNAワクチンと共に投与した場合に、特に有用である。或は、CTL応答を誘導して増強する免疫調節タンパク質は、癌又は細胞内感染症を患っている患者に投与する免疫療法剤として有用である。CTL応答を誘導して増強する免疫調節タンパク質は、免疫無防備状態の患者に投与する場合に、有用である。
【0030】
T細胞増殖応答を誘導して増強する免疫調節タンパク質は、ワクチンと共に又はワクチンの部分として投与した場合に、特に有用である。或は、T細胞増殖応答を誘導して増強する免疫調節タンパク質は、免疫療法剤として有用である。T細胞増殖応答を誘導して増強する免疫調節タンパク質は、免疫無防備状態の患者に投与する場合に、有用である。
【0031】
RANTESのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のGENBANK受入れ番号は、M21121であり、参考として、本明細書中に取り込む。RANTESは、Schall,T.J.等、J.Immunol.141, 1018−1025(1988)に記載されており、参考として、本明細書中に取り込む。
【0032】
IL−8のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のGENBANK受入れ番号は、M28130であり、参考として、本明細書中に取り込む。IL−8は、Mukaida,N.等、J.Immunol.143(4),1366−1371(1989)に記載されており、参考として、本明細書中に取り込む。
【0033】
この発明の幾つかの具体例により、IL−8とRANTESの組合せを個体に送達して、その個体の免疫系の活性を調節する。これらのIL−8及びRANTESは、各々独立に、タンパク質形態で及び/又はそのタンパク質をコードするその個体における発現に必要な調節エレメントに操作可能に結合されたヌクレオチド配列を含む核酸分子として、直接送達することができる。これらの核酸分子がその個体の細胞により取り込まれると、このタンパク質をコードするヌクレオチド配列が細胞中で発現され、それにより、そのタンパク質がその個体に送達される。この発明の幾つかの面は、IL−8タンパク質及び/又はIL−8をコードする核酸分子をRANTESタンパク質及び/又はRANTESをコードする核酸分子と共に送達する方法並びに送達のための組成物を提供する。従って、この発明の幾つかの具体例は、RANTESタンパク質及び/又はRANTESタンパク質をコードする核酸分子並びにIL−8タンパク質及び/又はIL−8をコードする核酸分子を含む組合せに関係する。幾つかの具体例により、これらの組成物は、1)RANTESタンパク質及びIL−8タンパク質;2)RANTESタンパク質をコードする核酸分子及びIL−8タンパク質をコードする核酸分子;3)RANTESタンパク質、及びIL−8タンパク質をコードする核酸分子;4)IL−8タンパク質、及びRANTESタンパク質をコードする核酸分子;5)RANTESタンパク質、IL−8タンパク質、及びIL−8タンパク質をコードする核酸分子;6)RANTESタンパク質及びIL−8タンパク質、及びRANTESタンパク質をコードする核酸分子;7)RANTESタンパク質及びRANTESタンパク質をコードする核酸分子並びにIL−8タンパク質をコードする核酸分子;8)IL−8タンパク質、及び/又はRANTESタンパク質をコードする核酸分子並びにIL−8をコードする核酸分子;9)RANTESタンパク質及びRANTESタンパク質をコードする核酸分子並びにIL−8タンパク質及びIL−8タンパク質をコードする核酸分子よりなる群から選択する組合せを含む。
【0034】
この発明の幾つかの具体例により、個体の免疫系の活性を調節するためにその個体に送達されるIL−8とRANTESの組合せを、ワクチンと共に投与する。本発明の幾つかの面により、個体を、予防のため及び/又は治療のために、病原体又は異常な、病気に関係する細胞に対して免疫化する組成物及び方法を提供する。これらのIL−8及びRANTESは、各々独立に、タンパク質形態で、及び/又はそのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を個体における発現に必要な調節エレメントに操作可能に結合して含む核酸分子として、直接送達することができる。核酸分子が個体の細胞により取り込まれると、このタンパク質をコードするヌクレオチド配列がそれらの細胞中で発現され、それにより、そのタンパク質が個体に送達される。このワクチンは、任意の種類のワクチンであってよく、例えば、サブユニットワクチン若しくはタンパク質ワクチン、殺菌若しくは不活性化したワクチン、生弱毒化ワクチン、細胞ワクチン、組換えワクチン、又は核酸若しくはDNAワクチンであってよい。生弱毒化ワクチン、細胞ワクチン、組換えワクチン、又は核酸若しくはDNAワクチンの場合には、RANTESタンパク質及び又はIL−8タンパク質は、これらのワクチンの核酸分子によってコードされうる。IL−8タンパク質及び/又はIL−8をコードする核酸分子をRANTESタンパク質及び/又はRANTESをコードする核酸分子と組合せて送達することにより、ワクチンにより誘導される免疫応答を、特に細胞性アームを増強することにより、調節することができる。幾つかの具体例により、これらの組成物は、ワクチン例えばタンパク質ワクチン及び/又は殺菌したワクチン及び/又は不活性化したワクチン及び/又は生弱毒化ワクチン及び/又は組換えワクチン及び/又はDNAワクチンを、1)RANTESタンパク質及びIL−8タンパク質;2)RANTESタンパク質をコードする核酸分子及びIL−8タンパク質をコードする核酸分子;3)RANTESタンパク質、及びIL−8タンパク質をコードする核酸分子;4)IL−8タンパク質、及びRANTESタンパク質をコードする核酸分子;5)RANTESタンパク質、IL−8タンパク質、及びIL−8タンパク質をコードする核酸分子;6)RANTESタンパク質及びIL−8タンパク質、及びRANTESタンパク質をコードする核酸分子;7)RANTESタンパク質及びRANTESタンパク質をコードする核酸分子並びにIL−8タンパク質をコードする核酸分子;8)IL−8タンパク質、及び/又はRANTESタンパク質をコードする核酸分子並びにIL−8をコードする核酸分子;9)RANTESタンパク質及びRANTESタンパク質をコードする核酸分子並びにIL−8タンパク質及びIL−8タンパク質をコードする核酸分子よりなる群から選択する組合せと組合せて及び/又は包含して含む。
【0035】
下記は、タンパク質形態の免疫調節タンパク質の製造及び投与の説明と、それに続く、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子の製造及び投与の説明である。ここに記載のように、この発明の組成物及び方法は、タンパク質及び核酸の組合せ並びにタンパク質のみを含む組成物及び方法並びに核酸のみを含む組成物及び方法を含むことができる。従って、以下に示す説明は、タンパク質と核酸の組合せの利用を含む組成物及び方法を含むことを意図している。
【0036】
上記のように、RANTESタンパク質及び/又はIL−8タンパク質は、免疫療法及び/又は免疫応答を調節するためのワクチンプロトコールの部分として投与することができる。免疫調節タンパク質は、組換え技術により製造することができ、標準的タンパク質合成技術によって合成することができ、そして天然起源から精製することができる。このタンパク質に結合する抗体を産生するハイブリドーマを生成することができ、単離精製手順において利用することができる。このタンパク質をコードするcDNAを単離して、配列決定し、発現ベクターを含むベクターに取り込ませてあり、それらを宿主細胞に導入してから、これらのタンパク質を組換えにより発現させた。
【0037】
これらの免疫調節タンパク質をコードする単離したcDNAは、その組換えタンパク質を生成することのできる組換え発現ベクターの構築の出発物質として有用である。このcDNAを発現ベクターを含むベクターに組み込み、それらを宿主細胞に導入してから、これらのタンパク質を組換えにより発現させる。
【0038】
標準的技術及び用意に入手可能な出発物質を用いて、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子を製造することができる。この核酸分子は、発現ベクターに組み込むことができ、次いで、それを宿主細胞に取り込ませる。タンパク質の製造のための周知の組換え発現系で使用するための宿主細胞は、周知であり、容易に入手できる。宿主細胞の例には、細菌細胞例えば大腸菌、酵母細胞例えばS.セレビシエ、昆虫細胞例えばS.フルギペルダ、非ヒト哺乳動物組織培養細胞チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞及びヒト組織培養細胞例えばHeLa細胞が含まれる。
【0039】
幾つかの具体例において、例えば、当業者は、周知の技術を用いて、DNA分子を周知の発現系で使用するための市販の発現ベクターに挿入することができる。例えば、市販のプラスミドpSE420(Invitrogen, カリフォルニア、San Diego)を大腸菌における免疫調節タンパク質の製造に利用することができる。例えば、市販のプラスミドpYES2(Invitrogen, カリフォルニア、San Diego)を酵母のS.セレビシエ株における製造に利用することができる。例えば、市販のMAXBAC(商標)完全バキュロウイルス発現系(Invitrogen, カリフォルニア、San Diego)を、昆虫細胞における製造に利用することができる。例えば、市販のプラスミドpcDNA I又はpcDNA3(Invitrogen, カリフォルニア、San Diego)を、哺乳動物細胞例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞における製造に利用することができる。当業者は、これらの市販の発現ベクター及び系その他を利用して免疫調節タンパク質を、日常的技術及び容易に入手できる出発材料によって製造することができる。(例えば、Sambrook等、Molecular Cloning a Laboratory Mannual, 第二版、Cold Spring Harbor Press (1989)参照、参考として本明細書中に援用する。) こうして、これらの所望のタンパク質を、原核生物及び真核生物の系の両方で製造することができ、このタンパク質のプロセッシングを受けた型のスペクトルが見出される。
【0040】
当業者は、他の市販の発現ベクター及び系を利用することができ、又は周知の方法及び用意に入手できる出発物質を利用してベクターを作ることができる。必要な制御配列例えばプロモーター及びポリアデニル化シグナル及び好ましくはエンハンサーを含む発現系は、様々な宿主について容易に入手でき、当分野で公知である。例えば、Sambrook等、Molecular Cloning a Laboratory Manual, 第二版、Cold Spring Harbor Press (1988)を参照されたい。
【0041】
免疫調節タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターを用いて、適合性の宿主をトランスフォームし、次いで、それを、外来DNAの発現が起きる条件下で培養して維持する。こうして生成された本発明のタンパク質を培養物から、細胞を溶解させることにより又は適宜培養培地(当業者に公知)から回収する。当業者は、かかる発現系を利用して生成した免疫調節タンパク質を、周知の技術を用いて単離することができる。天然起源からタンパク質を、抗体を用いて精製する方法は、組換えDNA技術により生成されたタンパク質を精製するために同様に適用することができる。
【0042】
こ(れら)の免疫調節タンパク質は、医薬組成物中に配合することができる。適当な製薬用キャリアーは、この分野の標準的参考書Remington’s Pharmaceutical Sciences, A. Osol, に記載されている(参考として、本明細書中に取り込む)。本発明の医薬組成物は、活性剤を標的細胞に到達させることのできる任意の手段により投与することができる。ペプチドは、経口投与した場合には、消化されるものであるので、非経口投与(即ち、静脈、皮下、経皮、筋肉内投与)が、通常、吸収を最適化するために用いられる。静脈投与は、注入ポンプの助成により達成することができる。本発明の医薬組成物は、乳濁液として配合することができる。或は、それらを、鼻腔内投与又は吸入投与のためにエアゾール医薬として配合することができる。幾つかの場合には、局所投与が望ましいであろう。
【0043】
投与する投薬量は、次のような因子によって変化する:薬力学的特徴;投与の方法及び経路;レシピエントの年齢、健康状態及び体重;症状の性質及び程度;並行する治療の種類;及び治療の頻度。通常、タンパク質の投薬量は、体重50kg当たり約1〜3000ミリグラムであり;好ましくは、体重50kg当たり10〜1000ミリグラムであり;一層好ましくは、体重50kg当たり25〜800ミリグラムである。通常、一人に、1日当たり8〜800ミリグラムを、1日1〜6回の分割投与量で投与し、又は所望の結果を得るのに十分な持続的放出形態で投与する。局所投与のための配合物には、経皮的パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体及び粉末が含まれる。慣用の製薬用キャリアー、水性、粉末又は油性ベース、増粘剤等が、必要であり又は望ましいであろう。経口投与のための組成物には、粉末若しくは顆粒、懸濁液若しくは溶液(水又は非水性媒質中)、カプセル、サッシェ又は錠剤が含まれる。増粘剤、調味剤、希釈剤、乳化剤、分散剤又は結合剤は、望ましいであろう。非経口投与、静脈投与、くも膜下投与又は脳室内投与のための組成物には、無菌水溶液が含まれうる(緩衝剤、希釈剤及び他の適当な添加剤をも含むことができ、これらは、好ましくは、無菌的であり且つ発熱物質を含まない)。この発明による静脈投与に適した医薬組成物は、無菌的であり且つ発熱物質を含まない。
【0044】
非経口投与のためには、タンパク質を、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液又は凍結乾燥粉末として、製薬上許容しうる非経口投与用ビヒクルと共に配合することができる。かかるビヒクルの例は、水、塩溶液、リンゲル液、デキストロース溶液及び5% ヒト血清アルブミンである。リポソーム及び非水性ビヒクル例えば固定油も又、利用することができる。このビヒクル又は凍結乾燥粉末は、等張性(例えば、塩化ナトリウム、マンニトール)及び化学的安定性(例えば、緩衝剤及び防腐剤)を維持する添加剤を含むことができる。この配合物を、一般に用いられている技術により殺菌することができる。例えば、注射による投与に適した非経口投与用組成物は、1.5重量%の活性成分を0.9% 塩化ナトリウム溶液中に溶解させることにより調製することができる。
【0045】
本発明の医薬組成物は、活性剤を哺乳動物の身体内の該剤の作用部位に到達させることのできる任意の手段により投与することができる。本発明の医薬組成物は、局所的治療が望まれるか全身的治療が望まれるか及び治療すべき領域に依存して、多くの方法により投与することができる。投与は、局所的投与(眼投与、膣内投与、直腸投与、鼻腔内投与、経皮投与を含む)、経口投与又は非経口投与であってよい。非経口投与には、静脈内点滴、皮下注射、腹腔内注射若しくは筋肉注射、肺投与(例えば、吸入若しくは吹送法による)、又はくも膜下若しくは脳室内投与が含まれる。
【0046】
幾つかの具体例においては、IL−8及び/又はRANTESタンパク質は、各々、該タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を投与することにより送達され、該核酸分子は、細胞により取り込まれた際に発現されて該タンパク質を生成する。この発明のIL−8及びRANTESタンパク質が、各々該タンパク質自体を投与することにより送達される具体例に加えて、幾つかの具体例は、これらのタンパク質自体の送達に加えて及び/又は該送達に代えて、これらのタンパク質をコードする核酸分子の送達を含む。幾つかの具体例においては、両タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、一本鎖核酸分子上にある。幾つかの具体例においては、組成物は、2つの核酸分子を含み、一つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、一つの核酸分子上にあり、他のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、他の核酸分子上にある。幾つかの具体例において、組成物は、2つの核酸分子を含み、一つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、一つの核酸分子上にあり、両タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、他の核酸分子上にある。
【0047】
本発明は、更に、免疫調節タンパク質を送達するための組成物及びそれの利用方法に関係する。本発明の面は、調節エレメントに操作可能に結合されたIL−8をコードするヌクレオチド配列及び/又は調節エレメントに操作可能に結合されたRANTESをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関係する。本発明は、更に、かかる核酸分子を含む注射用医薬組成物に関係する。
【0048】
調節エレメントに操作可能に結合されたIL−8をコードするヌクレオチド配列及び/又は調節エレメントに操作可能に結合されたRANTESをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子は、DNA注入(DNAワクチン接種とも呼ばれる)、組換えベクター例えば組換えアデノウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス及び組換えワクシニアを含む幾つかの周知技術の何れかを用いて送達することができる。
【0049】
DNAワクチンは、米国特許第5,593,972号、5,739,118号、5,817,637号、5,830,786号、5,962,428号、5,981,505号、5,580,859号、5,703,055号、5,676,594号及びこれらにおいて引用されている優先権出願に記載されている(これらの各々を、参考として本明細書中に取り込む)。これらの出願に記載された送達用プロトコールに加えて、DNA送達のための別報は、米国特許第4、945、050号及び5,036,006号に記載されている(これら両者を、参考として本明細書中に取り込む)。
【0050】
投与の経路には、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮内、皮下、静脈、動脈、眼及び口内並びに局所的、経皮的経路(吸入又は坐薬による)又は粘膜組織への経路(膣、直腸、尿道、頬及び舌下組織への洗浄による等)が含まれるが、これらに限らない。好適な投与経路には、粘膜組織への経路、筋肉内、腹腔内、皮内及び皮下注射が含まれる。遺伝子構築物を、伝統的注射器、ニードルレス注射用デバイス又は「マイクロインジェクタブルボンバードメントジーンガン」を含む手段(これらに限らない)により投与することができる。
【0051】
これらの遺伝子構築物は、細胞により取り込まれた場合に、機能性染色体外分子として細胞内に存在し続けることができ及び/又は細胞の染色体DNA中に組み込まれうる。DNAを細胞内に導入することができ、そこでは該DNAは、プラスミド形態で、別個の遺伝物質であり続ける。或は、染色体に組み込むことのできる線状DNAをこの細胞に導入することができる。DNAを細胞に導入する場合には、DNAの染色体への組込みを促進する試薬を加えることができる。組込みの促進に有用なDNA配列も又、そのDNA分子に含ませることができる。或は、RNAを細胞に投与することができる。遺伝子構築物をセントロメア、テロメア及び複製起点を有する線状ミニ染色体として提供することも企図される。遺伝子構築物は、遺伝物質の部分を弱毒化した生きた微生物中に又は細胞中に存続する組換え微生物用ベクター中に保持することができる。遺伝子構築物は、組換えウイルスワクチンのゲノムの部分であってよく、遺伝物質は、細胞の染色体に組み込まれるか又は染色体外に存続し続ける。
【0052】
遺伝子構築物は、核酸分子の遺伝子発現に必要な調節エレメントを含む。これらのエレメントには、プロモーター、開始コドン、停止コドン及びポリアデニル化が含まれる。加えて、標的タンパク質又は免疫調節タンパク質をコードする配列の遺伝子発現には、しばしば、エンハンサーが必要とされる。これらのエレメントは、所望のタンパク質をコードする配列に操作可能に結合されていること及びそれらを投与する個体において調節エレメントが操作可能であることが必要である。
【0053】
開始コドン及び停止コドンは、一般に、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の部分と考えられる。しかしながら、これらのエレメントは、遺伝子構築物を投与する個体において機能的であることが必要である。これらの開始及び停止コドンは、コード配列とイン・フレームでなければならない。
【0054】
用いるプロモーター及びポリアデニル化シグナルは、個体の細胞中で機能的でなければならない。
【0055】
本発明の実施に有用な、特に、ヒト用の遺伝子ワクチンの製造に有用なプロモーターの例には、シミアンウイルス40(SV40)、マウス乳癌ウイルス(MMTV)プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来のプロモーター、例えばHIVロングターミナルリピート(LTR)プロモーター、モロニーウイルス、ALV、サイトメガロウイルス(CMV)例えばCMV最初期プロモーター、エプスタイン−バールウイルス(EBV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)並びにヒト遺伝子例えばヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン及びヒトメタロチオネインに由来するプロモーターが含まれるが、これらに限らない。
【0056】
本発明の実施に有用な、特に、ヒト用の遺伝子ワクチンの製造に有用なポリアデニル化シグナルの例には、SV40ポリアデニル化シグナル及びLTRポリアデニル化シグナルが含まれるが、これらに限らない。特に、SV40ポリアデニル化シグナルが用いられ、これは、pCEP4プラスミド(Invitrogen, カリフォルニア、San Diego)中にあり、SV40ポリアデニル化シグナルとして言及される。
【0057】
DNA発現に必要な調節エレメントに加えて、他のエレメントも又このDNA分子中に含まれうる。かかる追加的エレメントには、エンハンサーが含まれる。このエンハンサーは、次を含む群から洗濯することができるが、これらに限らない:ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン及びウイルスエンハンサー例えばCMV、RSV及びEBV由来のもの。
【0058】
この構築物を染色体外に維持してその複数のコピーを細胞内で生成するために、哺乳動物の複製起点を有する遺伝子構築物を提供することができる。Invitrogen(カリフォルニア、San Diego)のプラスミドpCEP4及びpREP4は、エプスタイン−バールウイルスの複製起点及び核抗原EBNA−1コード領域を含み、該領域は、組込みを起こさずに高コピー数のエピソーム性の複製を生じる。
【0059】
免疫化応用に関係する幾つかの好適具体例においては、標的タンパク質、免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列及び、追加的に、かかる標的タンパク質に対する免疫応答を更に増強するタンパク質の遺伝子を含む核酸分子を送達する。かかる遺伝子の例は、他のサイトカイン及びリンホカイン例えばα−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来成長因子(PDGF)、TNF、上皮成長因子(EGF)、IL−1、IL−2、IL−4、IL−6、IL−10及びIL−12をコードするものである。幾つかの具体例においては、GM−CSFの遺伝子が、免疫化組成物中で用いる遺伝子構築物に含まれるのが好ましい。
【0060】
もし何らかの理由により遺伝子構築物を受ける細胞を除去することが望ましいならば、細胞破壊のための標的として役立つ追加のエレメントを加えることができる。発現可能な形態のヘルペスのチミジンキナーゼ(tk)遺伝子を、この遺伝子構築物に含ませることができる。薬物ガングシクロバーを個体に投与することができ、該薬物は、tkを生成する任意の細胞を選択的に殺し、それ故、遺伝子構築物を有する細胞の選択的破壊のための手段を提供する。
【0061】
タンパク質生成を最大にするために、この構築物を投与する細胞内での遺伝子発現によく適合した調節配列を選択することができる。その上、この細胞内で最も効率的に転写されるコドンを選択することができる。当業者は、これらの細胞内で機能的であるDNA構築物を生成することができる。
【0062】
本発明の一つの方法は、核酸分子を、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮下、皮内に投与し、又は局所的に若しくは吸入、膣、直腸、尿道、頬及び舌下よりなる群から選択する粘膜組織への洗浄により投与するステップを含む。
【0063】
幾つかの具体例においては、この核酸分子を、これらの細胞に、ポリヌクレオチド機能エンハンサー又は遺伝子ワクチン促進剤の投与と共に送達する。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許出願第08/008,342号(1993年1月26日出願)、米国特許出願第08/029,336号(1993年3月11日出願)、米国特許出願第08/125,012号(1993年11月21日出願)及び国際特許出願PCT/US94/00899号(1994年1月26日出願)に記載されている(各々を、参考として、本明細書中に組み込む)。遺伝子ワクチン促進剤は、米国特許出願第08/221,579号(1994年4月1日出願)に記載されている(参考として、本明細書中に組み込む)。核酸分子と共に投与される協力剤を、それらの核酸分子との混合物として投与することができ、又は核酸分子の投与の前若しくは後に別個に同時に投与することができる。加えて、トランスフェクション剤及び/又は複製剤及び/又は炎症剤として機能して且つGVFと同時に投与することのできる他の薬剤には、成長因子、サイトカイン及びリンホカイン例えばα−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来成長因子(PDGF)、TNF、上皮成長因子(EGF)、IL−1、IL−2、IL−4、IL−6、IL−10及びIL−12並びに繊維芽細胞成長因子、表面活性剤例えば免疫刺激複合体(ISCOMS)、フロイントの不完全アジュバント、モノホスホリルリピドA(MPL)を含むLPS類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、及びスクアレンなどの小胞が含まれ、ヒアルロン酸も又用いられ、遺伝子構築物と共に投与されうる。幾つかの具体例においては、免疫調節タンパク質を、GVFとして用いることができる。
【0064】
本発明による医薬組成物は、約1ナノグラムから約2000マイクログラムのDNAを含む。幾つかの好適具体例において、本発明による医薬組成物は、約5ナノグラムから約1000マイクログラムのDNAを含む。幾つかの好適具体例において、これらの医薬組成物は、約10ナノグラムから約800マイクログラムのDNAを含む。幾つかの好適具体例においては、これらの医薬組成物は、約0.1〜500マイクログラムのDNAを含む。幾つかの好適具体例において、これらの医薬組成物は、約1〜350マイクログラムのDNAを含む。幾つかの好適具体例において、これらの医薬組成物は、約25〜250マイクログラムのDNAを含む。幾つかの好適具体例において、これらの医薬組成物は、約100〜200マイクログラムのDNAを含む。
【0065】
本発明による医薬組成物は、使用する投与方法に従って配合される。医薬組成物が注射用医薬組成物である場合には、それらは、無菌的で、発熱物質を含まず且つ粒子を含まない。好ましくは、等張配合物を用いる。一般に、等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを含むことができる。幾つかの場合には、等張溶液例えばリン酸緩衝塩溶液が好適である。安定剤には、ゼラチン及びアルブミンが含まれる。幾つかの具体例においては、血管収縮剤をこの配合物に添加する。
【0066】
この発明の幾つかの具体例により、免疫原に対する免疫応答を、免疫原、IL−8及びRANTESの組合せを個体に送達することにより誘導する方法を提供する。この発明の幾つかの具体例により、IL−8及びRANTESを送達するための薬剤(タンパク質又はそのタンパク質をコードする核酸分子)を、ワクチン組成物の成分として投与し或は補足物としてワクチン成分と共に投与する。このワクチンは、サブユニットワクチン、殺菌したワクチン、生弱毒化ワクチン、細胞ワクチン、組換えワクチン又は核酸若しくはDNAワクチンであってよい。生弱毒化ワクチン、細胞ワクチン、組換えワクチン又は核酸若しくはDNAワクチンの場合には、IL−8及びRANTESは、これらのワクチンの核酸分子によりコードされうる。別法として又は追加的に、IL−8及び/又はRANTESタンパク質を、アジュバントとして用いることができる。
【0067】
幾つかの具体例により、免疫原、IL−8及びRANTESを、各々独立に、タンパク質形態で及び/又は個体における発現に必要な調節エレメントに操作可能に結合されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子として直接送達することができる。この核酸分子が個体の細胞により取り込まれた場合には、このタンパク質をコードするヌクレオチド配列はそれらの細胞中で発現され、それにより、このタンパク質はその個体に送達される。
【0068】
以下に示すように、免疫原、IL−8及びRANTESを送達する方法は、免疫原、IL−8及びRANTESの一つをそれぞれコードする遺伝子構築物の送達により達成することができる。以下で論じるように、この免疫原は、標的タンパク質として言及されうる。免疫原の投与を含まない具体例においては、以下の記載を、標的タンパク質をコードする遺伝子構築物の準備又は送達なしで実施することができる。
【0069】
本発明は、標的タンパク質(即ち、病原体、アレルゲン又は個体自身の「異常な」細胞と特異的に結合しているタンパク質)に対する広い免疫応答を誘出するのに有用である。本発明は、病原性因子及び生物体に対して個体を免疫化して、病原体タンパク質に対する免疫応答がその病原体に対する防護免疫を与えるようにするのに有用である。本発明は、過剰増殖性細胞と特異的に結合した標的タンパク質に対する免疫応答を誘出することにより、過剰増殖性疾患例えば癌と戦うために有用である。本発明は、自己免疫疾患に関与する細胞と特異的に結合している標的タンパク質に対する免疫応答を誘出することにより、自己免疫疾患と戦うために有用である。
【0070】
本発明の幾つかの面により、標的タンパク質及び免疫調節タンパク質をコードするDNA又はRNAを、それが発現される個体の組織の細胞に導入し、そうして、コードされたタンパク質を生成する。これらの標的タンパク質及び免疫調節タンパク質の一方又は両方をコードするDNA又はRNAは、個体の細胞内での発現に必要な調節エレメントに結合されている。DNA発現のための調節エレメントには、プロモーター及びポリアデニル化シグナルが含まれる。加えて、他のエレメント(コザック領域など)も又、この遺伝子構築物に含ませることができる。
【0071】
幾つかの具体例においては、標的タンパク質をコードする配列の発現可能型と両免疫調節タンパク質をコードする配列の発現可能型が、同じ核酸分子上に見出され、それは、個体に送達される。幾つかの具体例において、標的タンパク質をコードする配列の発現可能型は、一方又は両方の免疫調節タンパク質をコードする配列の発現可能型を含む核酸分子とは別個の核酸分子上に存在する。幾つかの具体例において、標的タンパク質をコードする配列の表現可能型及び免疫調節タンパク質の一つをコードする配列の発現可能型は、2つの免疫調節タンパク質の他方をコードする配列の発現可能型を含む核酸分子とは別個の一つの核酸分子上に存在する。かかる事例においては、両分子を個体に送達する。幾つかの具体例においては、標的タンパク質をコードする配列の発現可能型は、両免疫調節タンパク質をコードする配列の発現可能型を含む核酸分子とは別個の核酸分子上に存在する。かかる事例においては、両分子を、個体に送達する。幾つかの具体例においては、標的タンパク質をコードする配列の発現可能型は、2つの免疫調節タンパク質の一方をコードする配列の発現可能型を含む核酸分子とは別個の核酸分子上に存在し、該配列は、2つの免疫調節タンパク質の他方をコードする配列の発現可能型を含む核酸分子とは別個の核酸分子上に存在する。かかる事例においては、3分子すべてを個体に送達する。加えて、1つ、2つ又は3つのタンパク質をコードする1つ、2つ又は3つのDNA分子の任意の組合せを送達して、異なる複数の分子の複数の組合せを生成することができる。重要なことに、標的タンパク質、RANTESタンパク質及びIL−8のコード配列のコピーは、少なくとも一つの核酸分子で与えられる。
【0072】
こ(れら)の核酸分子は、プラスミドDNA、組換えベクターの核酸分子として又は弱毒化ワクチン若しくは細胞ワクチン中に与えられた遺伝物質として与えることができる。或は、幾つかの具体例においては、標的タンパク質及び/又は衰退する又は両方の免疫調節タンパク質を、タンパク質として、それらをコードする核酸分子に加えて又はそれらをコードする核酸分子の代わりに送達することができる。
【0073】
遺伝子構築物は、遺伝子発現に必要な調節エレメントに操作可能に結合された標的タンパク質又は免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。この発明により、遺伝子構築物の組合せ(標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現型を含むもの及び免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現型を含むものを含む)を提供する。この遺伝子構築物の組合せを含むDNA又はRNA分子の生きた細胞への取り込みは、該DNA又はRNAの発現並びに標的タンパク質及び免疫調節タンパク質の生成を生じる。標的タンパク質に対して増強された免疫応答を生じる。
【0074】
本発明を利用して、すべての病原体例えばウイルス、原核生物及び病原性真核生物例えば単細胞性の病原性生物及び多細胞性寄生性生物に対して、個体を免疫化することができる。本発明は、特に、個体を、細胞に感染し及び被包性でない病原体例えばウイルス、並びに原核生物例えば淋菌、リステリア菌及び赤痢菌に対して免疫化するのに有用である。加えて、本発明は又、個体を、原生動物病原体(生活環中に細胞内病原体である捨て絵時を含むもの)に対して免疫化するのにも有用である。表1は、本発明によるワクチンを製造することのできる幾つかのウイルスの科及び属の一覧を与える。表に列記された抗原のような病原性抗原上に提示されたエピトープと同じであるか又は実質的に類似する少なくとも一つのエピトープを含むペプチドをコードするDNA配列を含むDNA構築物は、ワクチンにおいて有用である。その上、本発明は又、個体を、原核及び真核原生動物病原体並びに多細胞性寄生性生物(表2に列記したものなど)を含む他の病原体に対して免疫化するのにも有用である。
【0075】
病原体感染に対する防護のための遺伝子ワクチンの製造のためには、免疫原性タンパク質(これに対して防護免疫応答が開始されうるもの)をコードする遺伝物質を、遺伝子構築物中に標的のコード配列として含ませなければならない。病原体が細胞内に感染した (この場合に本発明は特に有用である) か又は細胞外にいるかによらずに、すべての病原性抗原が防護応答を誘出することは、ありそうにないことである。DNA及びRNAは、共に、比較的小分子であり、比較的容易に生成することができるので、本発明は、複数の病原性抗原についてワクチン接種することを可能にする更なる利点を提供する。この遺伝子ワクチンで用いられる遺伝子構築物は、多くの病原性抗原をコードする遺伝物質を含むことができる。例えば、幾つかのウイルス遺伝子を単一の構築物に含ませることができ、それにより、複数の標的を与えることができる。
【0076】
表1及び2は、個体を感染から防護するための遺伝子ワクチンを製造することのできる幾つかの病原性因子及び生物体の一覧を含んでいる。幾つかの好適具体例において、個体を病原体に対して免疫化する方法は、HIV、HTLV又はHBVに対するものである。
【0077】
本発明の他の面は、過剰増殖性疾患に特徴的な過剰増殖性細胞に対する広い防護免疫応答を与える方法及び過剰増殖性疾患を患っている個体を治療する方法を提供する。過剰増殖性疾患の例には、すべての形態の癌及び乾癬が含まれる。
【0078】
免疫原性「過剰増殖性細胞」関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物の、個体の細胞への導入は、個体のワクチン接種された細胞においてそれらのタンパク質の生成を生じるということが発見されている。過剰増殖性疾患に対して免疫化するためには、過剰増殖性疾患と関係するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を個体に投与する。
【0079】
過剰増殖関連タンパク質が有効な免疫原性標的であるためには、それは、過剰増殖性細胞において排他的に生成されるか又は正常細胞と比較して一層高レベルで生成されるタンパク質でなければならない。標的抗原には、かかるタンパク質、その断片及びかかるタンパク質上に見出される少なくとも一つのエピトープを含むペプチドが含まれる。幾つかの事例において、過剰増殖関連タンパク質は、タンパク質をコードする遺伝子の突然変異の産物である。その突然変異した遺伝子は、正常タンパク質では見出されない異なるエピトープを生じる僅かに異なったアミノ酸配列を有すること以外では正常タンパク質と殆ど同じであるタンパク質をコードしている。かかる標的タンパク質には、オンコジーン例えばmyb、myc、fyn、及び転座遺伝子のbcr/abl、ras、src、P53、neu、trk及びEGRFが含まれる。標的抗原としてのオンコジーン生成物に加えて、抗癌治療及び防護養生法のための標的タンパク質は、B細胞リンパ腫により生成された抗体の可変領域及びT細胞リンパ腫のT細胞レセプターの可変領域を含み、幾つかの具体例においては、これらは、自己免疫疾患のための標的抗原でも利用される。他の腫瘍関連タンパク質を、モノクローナル抗体17−1Aにより認識されるタンパク質及びフォレート結合タンパク質を含む腫瘍細胞中で一層高レベルで見出されるタンパク質のような標的タンパク質として利用することができる。
【0080】
本発明を利用して、個体を、幾つかの形態の癌の少なくとも一つに対して免疫化することができるが、本発明は、特定の癌を発生しやすいか又は癌を有していたことがありそれ故再発しやすい個体を、予防的に免疫化するのに、特に有用である。遺伝学及び技術並びに疫学の発達は、個体における癌発生の可能性の測定及び危険の評価を可能にした。遺伝的スクリーニング及び/又は家族病歴を利用して、特定の個体が幾つかの種類の癌の何れの一つを発生するかについての可能性を予想することができる。
【0081】
同様に、既に癌を発生し、治療して癌を除去し或は緩解した個体は、特に、再発しやすい。治療養生法の部分として、かかる個体を、有していたと診断された癌に対して、再発と戦うために免疫化することができる。従って、一度個体がある種の癌を有していたこと及び再発の危険にあることが分かれば、該個体を、免疫系を、その癌の将来の出現と戦うために準備させるために免疫化することができる。
【0082】
本発明は、過剰増殖性疾患を患っている個体の治療方法を提供する。かかる方法において、遺伝子構築物の導入は、標的タンパク質を生成する増殖過剰性細胞と戦うようにその個体の免疫系に指示し、促進する免疫療法剤として役立つ。
【0083】
本発明は、自己免疫疾患を患っている個体を、細胞レセプター及び「自己」に向けられた抗体を生成する細胞を含む自己免疫と関係する標的に対する広域的防護免疫応答を与えることにより治療する方法を提供する。
【0084】
T細胞媒介の自己免疫疾患には、リウマチ様関接炎(RA)、多発性硬化症(MS)、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インシュリン依存性真性糖尿病(IDDM)、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ウェゲナー肉芽腫症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が含まれる。これらの各疾患は、内因性抗原に結合して、自己免疫疾患と関係する炎症カスケードを開始するT細胞レセプターにより特徴付けられる。T細胞の可変領域に対するワクチンの接種は、CTLを含む免疫応答を誘出して、それらのT細胞を排除するであろう。
【0085】
RAにおいては、この病気に関与するT細胞レセプター(TCR)の幾つかの特異的な可変領域が特性決定されている。これらのTCRには、Vβ−3、Vβ−14、Vβ−17及びVα−17が含まれる。従って、これらのタンパク質の少なくとも一つをコードするDNA構築物を用いるワクチン接種は、RAに関与するT細胞を標的とする免疫応答を誘出するであろう。Howell, M.D.等、1991 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10921−10925;Paliard, X.等、1991 Science 253:325−329;Williams, W.V.等、1992 J.Clin.Invest.90:326−333を参照されたい(各々を、参考として、本明細書中に取り込む)。
【0086】
MSにおいては、この病気に関与するTCRの幾つかの特異的な可変領域が、特性決定されている。これらのTCRには、Vβ−7及びVα−10が含まれる。従って、これらのタンパク質の少なくとも一つをコードするDNA構築物を用いるワクチン接種は、MSに関与するT細胞を標的とする免疫応答を誘出するであろう。Wucherpfennig, K.W.等、1990 Science 248:1016−1019;Oksenberg, J.R.等、1990 Nature 345:344−346を参照されたい(各々を、参考として、本明細書中に取り込む)。
【0087】
強皮症においては、この病気に関与するTCRの幾つかの特異的な可変領域が特性決定されている。これらのTCRには、Vβ−6、Vβ−8、Vβ−14及びVα−16、Vα−3C、Vα−7、Vα−14、Vα−15、Vα−16、Vα−28及びVα−12が含まれる。従って、これらのタンパク質の少なくとも一つをコードするDNA構築物を用いるワクチン接種は、強皮症に関与するT細胞を標的とする免疫応答を誘出するであろう。
【0088】
T細胞媒介の自己免疫疾患を患っている患者(特に、そのTCRの可変領域が既に特性決定されている者)を治療するためには、滑液生検を行なうことができる。存在するT細胞の試料を採取して、それらのTCRの可変領域を標準的技術を利用して同定することができる。この情報を利用して、遺伝子ワクチンを製造することができる。
【0089】
B細胞媒介の自己免疫疾患には、狼瘡(SLE)、グレーヴズ病、筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、喘息、クリオグロブリン血症、原発性胆汁性硬化症及び悪性貧血が含まれる。これらの病気の各々は、内因性抗原に結合して、自己免疫疾患と関係する炎症カスケードを開始する抗体により特徴付けられる。抗体の可変領域に対するワクチン接種は、CTLを含む免疫応答を誘出して、その抗体を生成するB細胞を排除するであろう。
【0090】
B細胞媒介の自己免疫疾患を患っている患者を治療するためには、その自己免疫活性に関与する抗体の可変領域を同定しなければならない。生検を行なうことができ、炎症部位に存在する抗体の試料を採取することができる。それらの抗体の可変領域は、標準的技術を利用して、同定することができる。この情報を利用して、遺伝子ワクチンを製造することができる。
【0091】
SLEの場合には、一つの抗原は、DNAであると考えられている。従って、SLEに対して免疫化すべき患者においては、血清を抗DNA抗体についてスクリーニングすることができ、血清中に見出されるかかる抗DNA抗体の可変領域をコードするDNA構築物を含むワクチンを、製造することができる。
【0092】
TCRと抗体の両方の可変領域の間の共通する構造的特徴は、周知である。特定のTCR又は抗体をコードするDNA配列は、一般に周知の方法例えばKabat等、1987 Sequence of Proteins of Immunological Interest U.S. Department of Health and Human Services(メリーランド、Bethesda)に従って、見出すことができる(参考として、本明細書中に取り込む)。加えて、抗体から機能的な可変領域をクローン化する一般的方法は、Chaudhary, V.K.等、1990 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1066に見出すことができる(参考として、本明細書中に取り込む)。
【0093】
遺伝子ワクチンを改良するための免疫調節タンパク質のコード配列の発現可能型の利用に加えて、本発明は、改良された弱毒化生ワクチン及び組換えベクターを利用して抗原をコードする外来遺伝子を送達する改良されたワクチンに関係する。弱毒化生ワクチン及び組換えベクターを利用して外来抗原を送達するものの例は、米国特許第4,722,848号;5,017,487号;5,077,044号;5,110,587号;5,112,749号;5,174,993号;5,223,424号;5,225,336号;5,240,703号;5,242,829号;5,294,441号;5,294,548号;5,310,668号;5,387,744号;5,389,368号;5,424,065号;5,451,499号;5,453,364号;5,462,734号及び5,482,713号に記載されている(各々を、参考として、本明細書中に取り込む)。免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を提供する(該配列は、ワクチン接種を受けた者において機能して発現を達成することのできる調節配列と操作可能に結合されている)。これらの遺伝子構築物を弱毒化生ワクチン及び組換えワクチンに混ぜて、この発明による改良されたワクチンを製造する。
【0094】
本発明は、DNAワクチン、弱毒化生ワクチン及び組換えワクチンを含むワクチン組成物の部分として遺伝子構築物を個体の細胞に送達するステップを含む、個体を免疫化する改良された方法を提供する。これらの遺伝子構築物は、免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、それは、ワクチン接種を受けた者において機能して発現を達成することのできる調節配列と操作可能に結合されている。これらの改良されたワクチンは、増強された細胞性免疫応答を生じる。
【0095】
実施例 ケモカインIL−8及びRANTESをコードするDNAワクチンは、抗原特異的なTh1型免疫応答を駆動して、2型単純ヘルペスウイルスに対する防護免疫をイン・ビボで増強する
導入
免疫又は炎症反応の開始は、共刺激性分子、接着分子、サイトカイン及びケモカインの調和的発現を含む複雑な過程である。特に、ケモカインは、免疫細胞の宿主の防御の末梢部位への交通の分子的調節において重要である。このケモカインスーパーファミリーは、2つのシステイン残基を分けるシグナルアミノ酸配列の存在(αファミリー)又は非存在(βファミリー)に基づく2つのサブファミリーからなる。α及びβケモカインは、好中球、好酸球、好塩基球及び単球を含む様々な免疫細胞型の直接的移動を誘導することが示されている。αケモカインファミリー(CXC型)、インターロイキン(IL)−8及びインターフェロンγ誘導性タンパク質(IP)−10、及びβケモカインファミリー(CC型)、RANTES(regulated on activation, normal T cell expressed and secreted)、単球走化性タンパク質(MCP−1)及びマクロファージ炎症タンパク質(MIP)−1αは、Tリンパ球を化学誘引することが示されている。特に、IL−8及びIP−10は、好中球を化学誘引して、血流から周囲の組織への移動を誘導することが知られている。同様に、RANTESは、単球、未刺激CD4+/CD45RO+記憶T細胞並びに刺激されたCD4+及びCD8+T細胞を化学誘引する。MIP−1αは、好酸球を化学誘引して脱顆粒を生じさせることが知られている。MIP−1αは又、好塩基球及びマスト細胞からのヒスタミン放出をも誘導し、好塩基球及びB細胞を化学誘引する。MCP−1は、慢性の炎症性疾患において重要なケモカインである。MCP−1は、単球を誘導して、血流から組織のマクロファージに移動させる。MCP−1は又、活性化記憶サブセットのTリンパ球を化学誘引する。最近の研究は、ケモカインレセプターがT細胞サブセットを示すこと及びケモカインが抗原特異的な免疫応答の生成に関与しうることを支持している。
【0096】
ここで報告するように、このDNAワクチンモデルを利用して、ケモカインが免疫応答を調節し、次いで、2型単純ヘルペスウイルス(HSV)チャレンジからの防護に影響するかどうかを規定されたマウスモデル系で調べた。免疫応答及び防護免疫の調節を調べるために、HSV−2タンパク質をコードするDNA発現構築物を、ケモカイン(IL−8、IP−10、RANTES、MCP−1、MIP−1α)をコードする遺伝子プラスミドと共に送達した。次いで、抗原特異的な免疫誘導及びチャレンジからの防護における調節効果を分析した。IL−8とRANTESの同時注入は、抗原特異的な免疫応答及びHSVチャレンジからの防護を増強することが認められた。他方、IP−10、MCP−1、MIP−1αの同時注入は、全体的に、防護状況に悪影響を有した。これらの研究は、ケモカインが、サイトカインを暗示する仕方で、重要な免疫応答及び病気の進行に作用して調節することができることを支持している。有意の免疫調節を、ケモカインcDNAの同時送達を利用することにより達成し、免疫応答だけでなく病気の防護にも影響を与えることができた。その上、ケモカイン遺伝子送達アジュバント特にIL−8とRANTESの利用は、一層効き目のあるワクチンの作成において及びHSVに対する免疫療法において重要でありえよう。
【0097】
方法
マウス
4〜6週齢の雌のBALB/cマウスを、Harlan Sprague−Dawley(インジアナ、Indianapolis)から購入した。それらを、National Institute of Health (メリーランド、Bethesda)及びペンシルベニア大学IACUC(ペンシルベニア、Philadelphia)のガイドラインの下で世話した。
【0098】
試薬
HSV−2株186(P. Schaffer, ペンシルベニア大学、ペンシルベニア、Philadelphiaからの寄贈)をVero細胞株(American Type Culture Collection, メリーランド、Rockville)中で増殖させた。HSV−2 gDタンパク質をコードするDNAワクチン、pAPL−gD2(pgD)は、以前に、Pachuk, C.J.等、「Humoral and cellular immune responses to herpes simplex virus−2 glycoprotein D generated by facilitated DNA immunization of mice」Current topics Microbiol.Immunol.1998 226:79−89に記載されたものである(参考として、本明細書中に取り込む)。発現ベクター、pCDNA3−IL−8、pCDNA3−IP−10、pCDNA3−RANTES、pCDNA3−MCP−1、pCDNA3−MIP−1α、pCDNA3−TNF−α及びpCDNA3−TNFβは、以前に、Kim,J.J.等、「CD8 positive T−cell influence antigen−specific immune responses through the expression of chemokines」J.Chem.Invest.1998 102:1112−1124及びKim,J.J.等、「Modulation of amplitude and direction of in vivo immune responses by co−administration of cytokine gene expression cassettes with DNA immunogens」Eur.J.Immunol.1998 28:1089−1103に記載されたように構築された(これらを、参考として、本明細書中に取り込む)。プラスミドDNAを細菌中で生成して、ダブルバンデドCsCl調製物により精製した。組換えHSV−2 gDタンパク質(G.H. Cohen及びR.J. Eisenberg,ペンシルベニア大学、ペンシルベニア、Philadelphiaからの寄贈)を、これらの研究において、組換え抗原として利用した。
【0099】
マウスのDNA接種
BALB/cマウスの大腿四頭筋に、100μlのリン酸緩衝塩溶液及び0.25% ブピバカイン−HCl(Sigma, ミズーリ、St.Louis)中に配合したgD DNA構築物を28ゲージ針(Becton Dickinson, ニュウジャージー、Franklin Lakes)で注射した。様々なケモカイン及びサイトカインの遺伝子発現カセットの試料をgpDプラスミド溶液と混合してから、注射した。
【0100】
ELISA
酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を、以前に、Sin, J.I..等、「In vivomodulation of vaccine−induced immune response toward a Th1 phenotype increases potency and vaccine effectiveness in a herpes simplex virus type 2 mouse model」J.Virol.1999 73:501−509 及び Sin, J.I..等、「Enhancement of protective humoral (Th2) and cell−mediated (Th1) immune responses against herpes simplex virus−2 through co−delivery of granulocyte macrophage−colony stimulating factor expression cassettes」Eur.J.Immunol.1998 28:3530−3540に記載されたようにして行なった(これらを、参考として、本明細書中に取り込む)。特に、gD特異的なIgGサブクラスの相対レベルの測定のために、HRPに結合させた抗マウスIgG1、IgG2a、IgG2b又はIgG3(Zymed, カリフォルニア、San Francisco)を、抗マウスIgG−HRPの代わりに用いた。これらのELISA力価を、ナイーブマウスの血清と同じ光学密度を示す最高希釈度の逆(reverse)として測定した。
【0101】
ヘルパーT細胞(Th)増殖アッセイ
Th細胞増殖アッセイを、以前に、Sin, J.I.等、J.Virol.1999(前出)及びSin, J.I.等、Eur.J.Immunol.1998(前出)に記載されたようにして行なった。単離した細胞の懸濁液を、1×106細胞/mlの濃度に再懸濁させた。1×105細胞を含む100μlのアリコートを、直接、96ウェルミクロ滴定プレート(平底プレート)の各ウェルに加えた。HSV−2 gDタンパク質を、1μg/ml及び5μg/mlの終濃度で、三連で、ウェルに加えた。これらの細胞を、37℃で、5% CO2中で、3日間インキュベートした。1μCiのトリチウム化チミジンを各ウェルに加え、それらの細胞を37℃で12〜18時間インキュベートした。このプレートを収穫して、取り込まれたトリチウム化チミジンの量をベータプレートリーダー(Wallac, フィンランド国、Turki)中で測定した。刺激インデックスを下記式からそくていした:
【数1】
自発的カウントのウェルは、10% ウシ胎児血清を含み、これは、無関係のタンパク質の対照として役立つ。細胞が健康な組織に対しては、5μg/ml PHA(Sigma)を、ポリクローナル刺激物陽性対照として用いた。
【0102】
Th1及びTh2型のサイトカイン及びケモカイン
6×106の脾臓細胞を含む1mlのアリコートを、24ウェルプレートのウェルに加えた。2日間の37℃での5% CO2中でのインキュベーション後に、細胞上清を獲得してから、IL−2、IL−10、IFN−γ、RANTES、MCP−1及びMIP−1αのレベルを、市販のサイトカイン及びケモカインキット(Biosource, Intl., Camarillo, Ca.及びR&D Systems, メリーランド、Minneapolis)を用いて、細胞外液体をこのサイトカイン又はケモカイン特異的なELISAプレートに加えることにより検出するために利用した。
【0103】
膣内HSV−2チャレンジ
マウスに、以前に記載されたMilligan, G.N.等、「Analysis of herpes simplex virus−specific T cells in the murine female genital tract following genital infection with herpes simplex virus type 2」Virol.1995 212:481−489及びMcDermott等、「Immunity in the female genital tract after intravaginal vaccination of mice with an attenuated strain of herpes simplex virus type 2」J.Virol.1984 51:747−753(これらを、参考として、本明細書中に取り込む)に、幾らかの改変を加えて、抗原投与した。ウイルスの接種の前に、膣内領域を先端に綿を付けたアプリケーター(Hardwood Products Company, メイン、Guiford)を0.1M NaOH溶液に浸したもので拭いてから、乾燥した綿アプリケーターで清浄化した。次いで、マウスを、毎日、試験して、病理的状態及び生存率を評価した。
【0104】
統計分析
統計分析を、対スチューデント検定を用いて行なった。種々の免疫化グループ間で値を比較した。0.05未満のp値を、有意とみなした。
【0105】
結果
ケモカインプラスミドの同時投与は、全身のIgG生成に影響を与える
選択したケモカインの抗原特異的な抗体応答に対するイン・ビボでの効果を、先ず調べた。対照として、動物を、gDワクチン及び2つのプロ炎症性サイトカイン、TNFファミリー遺伝子(TNF−α及びTNF−β)で免疫化した。これらのプロ炎症性サイトカインは、初期免疫応答に同様に関与していると考えられ、以前に生成したデータに基づいて陽性対照として役立つはずであるので、それらを研究した。図1に示したように、第2回目の免疫化の2週間後に集めて等しくプールした血清のELISA力価は、12,800(IL−8)、6,400(IP−10)、6,400(RANTES)、6,400(MCP−1α)、TNF−α(25,600)、TNF−β(6,400)及び6,400(gD DNAワクチン単独)と測定された。これは、IL−8及びMIP−1αとの同時注入が、gD特異的IgG抗体の中位の重要でない増強を生じることを示している。対照的に、IP−10、RANTES又はMCP−1は、pgDワクチン接種単独のものと同様のレベルの抗体応答を示した。TNF−α cDNA対照は、以前に正確に観察されたgD DNAワクチン単独のものより有意に高い全身のIgGレベルを生じた。
【0106】
ケモカインプラスミドによる同時免疫化は、IgGサブクラスをTh1又はTh2イソ型にシフトさせる
IgGサブクラスは、誘導された免疫応答のTh1とTh2の性質の指示を与える。同時注入により誘導されたIgGサブクラスを分析した。各免疫化グループにより誘導されたIgGイソ型を図2Aに示し、IgG2aのIgG1に対する相対比(Th1対Th2)を図2Bに示してある。pgDで免疫化されたグループは、IgG2a対IgG1比0.62を有した。IL−8、RANTES又はTNF−α遺伝子との同時注入は、gD特異的なIgG2aのIgG1に対する相対比を0.8まで増大させた。他方、IP−10又はMIP−1αとの同時注入は、IgG2のIgG1に対する相対比を減少させた(0.3及び0.4)が、MCP−1又はTNF−β遺伝子による同時免疫化は、pgDワクチン接種単独と類似したIgGサブタイプパターンを生じた。この分析は、IL−8及びRANTESがTh1表現型に対する免疫応答を、イン・ビボで、γ−IFN型サイトカインと類似の仕方で駆動するという結論を支持する。
【0107】
IL−8とRANTESの同時注入は、Th細胞の増殖応答を増強する
この細胞増殖は、細胞媒介による免疫の潜在能力の評価に利用される標準的パラメーターである。サイトカイン遺伝子による同時免疫化後のこれらの細胞増殖応答を、免疫化した動物由来の脾臓細胞をイン・ビトロでgDで刺激することにより測定した。図3A〜3Cに示したように、pgD DNAワクチン接種単独は、gD特異的なTh細胞の増殖応答を生じた。Th細胞の増殖応答の、gD DNAワクチン単独のそれを超える有意の増強が、IL−8、RANTES又はTNF−α cDNAとの同時注入により観察された。増殖の僅かな増強が、TNF−β遺伝子との同時注入により認められた。対照的に、IP−10、MCP−1又はMIP−1α遺伝子による同時免疫化は、Th細胞の増殖応答のレベルに対して最少の効果を有するようであった。しかしながら、これらの同時注入は、PHA誘導された非特異的なTh細胞の増殖応答に対して効果を示さなかった(S.I.範囲は、40〜50であった)。gDプラスミドワクチン接種は、Balb/cバックグラウンドにおけるCTLエピトープの欠如のために、CTL応答を生じない。しかしながら、一層詳細に細胞性効果を評価するために、サイトカイン生成プロフィルを試験した。
【0108】
ケモカイン同時注入は、Th1及びTh2サイトカインの生成に影響を及ぼす
Th1サイトカイン(IL−2及びIFN−γ)及びTh2サイトカイン(IL−4、IL−5及びIL−10)は、免疫応答の極性化の理解における頼みの綱であった。Th1免疫応答は、細胞性免疫の誘導を駆動すると考えられているが、Th2免疫応答は、優先的に、液性免疫を駆動する。IgG表現型の結果に基づいて、Th1対Th2の問題は、サイトカイン放出を直接分析することにより更に評価された。表3に示したように、IL−2生成は、IL−8cDNAの同時注入によりほぼ7倍に劇的に増加した。IL−2は又、TNF−αcDNAの同時注入によっても、MIP−1αカセットの同時注入によっても誘導された。特に、IFN−γの生成は、RANTESの同時送達により20倍に最も有意に増強され、IL−8の同時送達によって6倍に増強され、更に、イソ型分類結果を支持し且つIL−8及びRANTESが、抗原依存様式でTh1型細胞性免疫応答を媒介することを示している。RANTES、IL−8、TNF−α及びTNF−βの同時注入は又、各々、IL−10生成をも、pgDワクチン単独よりも有意に高く増強した。これは、IL−8及びRANTESが、Th2型よりTh1が優勢のT細胞を駆動することを示している。
【0109】
ケモカイン同時注入は、βケモカインの生成に影響する
ケモカインの同時注入が抗原依存様式でのβケモカインの生成を誘導することができるかどうかを測定するために、動物を同時免疫化して、脾臓細胞のβケモカインの放出レベルを、イン・ビトロで、組換えgD抗原又は対照用抗原で刺激した後に分析した。表4に示したように、MCP−1生成は、IL−8cDNAの同時注入により劇的に増大したが、RANTESとMIP−1αカセットとの同時注入により減少した。特に、MIP−1αの生成は、RANTESとIL−8の同時送達により最も有意に増強される。RANTESの場合には、IL−8とRANTESの同時注入は、RANTES生成をpgDワクチン単独より一層高く増強した。これは、RANTESが、HSVモデルにおいて、抗原特異的な免疫応答をIL−8とは異なる仕方で調節することを示している。これは又、ケモカインが自身の生成を調節することをも支持している。
【0110】
IL−8及びRANTESケモカインの同時注入は、膣内HSV−2チャレンジからの防護を増強する
抗原特異的な免疫調節が病原体の複製に影響することは、重要なことである。ケモカインの同時注入の防護的効力を、マウスヘルペスチャレンジモデルにおいて分析した。マウスを、DNAベクターを用いて、i.m.で、0及び2週目に、同時免疫化してから、第2回目の免疫化の3週間後に、HSV−2を投与した。HSV−2は、粘膜皮膚に感染するので、膣内投与経路を選択した。図4A及び4Bに示すように、gD DNAワクチン(60μg/マウス)のみによる免疫化は、200LD50のHSV−2による膣内チャレンジから63%のマウス生存率を生じた。IL−8及びRANTES cDNAの同時注入は、この生存率を88%に高めた(殆ど30%の防護率の増大)が、40μgのMCP−1及びIP−10との同時注入は、この生存率を25%にまで低下させた(約40%の全体的防護率の減少)。同様に、MIP−1αの同時注入も又、この生存率の低下を生じた。これは、ケモカインIL−8及びRANTESが、HSV−2感染からの防護を、抗原特異的な免疫調節により増強したという結論を支持する。
【0111】
TNFファミリーの同時注入は、膣内HSV−2チャレンジからの防護を悪化させる
TNFファミリーの同時注入の防護的効果を、このヘルペスチャレンジモデルにおいて比較した。TNF−α及びTNF−β cDNAとの同時注入は、25%まで減少した生存率を生じた(防護率の40%の減少)(図4C)。このデータは、更に、ある種の免疫調節cDNAの同時注入がワクチンの効力を低下させるであろうことを支持し、応答の質が特に重要であることを支持している。
【0112】
検討
HSVは、ヒトの病気のあるスペクトル例えば口辺ヘルペス、眼感染症、脳炎及び性器感染症の原因物質である。HSVは、ウイルスの宿主において潜伏期を確立して頻繁に再発することができる。ウイルス感染中、中和抗体は、ウイルス粒子を不活性化するが、細胞内HSV感染を制御することはできない。むしろ、細胞媒介による免疫は、HSV感染細胞を殺す主要なエフェクター機能である。B細胞抑制されたマウスのHSV一次感染を制御する能力又は養子移入されたT細胞のその後のウイルス感染を防止する能力は、更に、細胞媒介による免疫が、ウイルス感染とその拡大の阻止に直接関係しうることを示唆している。CD4+及びCD8+T細胞が、共にHSV感染の阻止に関与することも又、十分に文献記載されている。その上更に、Th1型CD4+T細胞が、HSV−2チャレンジからの防護のための一層決定的な役割を演じているという幾つかの報告が為されている。CD4+T細胞がイン・ビボで涸渇すると、HSVに対する防護免疫は失われた。その上、Th1型CD4+T細胞は、多量のIFN−γを生成する。IFN−γは、HSV感染細胞においてクラスI及びクラスIIをアップレギュレートして、細胞傷害性CD4+T細胞による一層良好な認識を可能にし、抗HSV効果を指示した。Th1型サイトカインcDNAとの同時送達は、病状を悪化させる。同様に、プロトタイプのTh1型サイトカインIL−12cDNAの同時送達により増強された防護は、HSVチャレンジモデルにおいてTh1型CD4+T細胞媒介されており、これは、HSV感染に対するTh1型T細胞媒介の防護免疫の重要性を強調している。
【0113】
動物モデルにおいて、幾つかのHSV糖タンパク質又は特異的ウイルス成分を発現するDNA構築物の免疫化は、ウイルスチャレンジに対する完全な又は部分的な防護を与える。幾つかのHSVウイルスタンパク質は、潜在的な免疫化の標的として分析されている。gC、ICP127又はgDタンパク質をコードするcDNAによる免疫化は、動物におけるHSVのイン・ビボチャレンジに対する抗原特異的な免疫応答及び防護を誘導することが示されている。最近、サブユニットワクチンを用いる臨床的試みが、再発性HSV感染症からの防護に失敗したが、これは、この病原体に対する一層効果的なアプローチをデザインするには、更なる洞察が必要とされることを支持している。
【0114】
選択したケモカインの、HSV−2感染に対する防護免疫の誘導に対するイン・ビボでの効果を、それらをgD DNAワクチン構築物と共にプラスミドカセットとして同時注入することにより調べた。IL−8及びMIP−1αケモカイン遺伝子により同時免疫化したグループは、gDで免疫化したグループよりも僅かに高いIgG応答を有した(ワクチンアジュバントとしてのTNFαと同様の仕方で)。その上更に、抗原特異的なIgGイソ型応答の調節は、分子アジュバントとしてケモカインを利用することにより達成されてきた。IL−8及びRANTESは、gD特異的IgG2aのIgG1に対する相対比を、gD DNAワクチン単独又はMCP−1若しくはTNF−β対照との同時注入と比較して有意に増大させた。しかしながら、IP−10及びMIP−1α遺伝子との同時注入は、IgG2aと比較してIgG1の一層有利な防護を誘導した。従って、これらの結果は、Th1又はTh2に対する液性免疫応答におけるシフトがケモカインにより調節されうるというHIVモデルにおける以前の発見を拡張し、再び、ケモカインがイン・ビボでのサイトカイン生成を調節することができるということを示唆している。
【0115】
イン・ビトロ免疫パラメーター例えばT細胞増殖及びCTL応答は、細胞媒介性免疫の能力の評価に用いられてきた。IL−8及びRANTESとのプラスミド同時注入のみが、一層高いTh細胞増殖を、TNF−α対照と類似の仕方で誘導した。IL−8同時免疫化は又、gD DNAワクチン単独よりも有意に高いIL−2及びINF−γの増大した生成をも生じ、これは、イソ型分類結果を更に支持しており、IL−8がTh1型細胞性免疫応答を抗原依存的様式で媒介することを示している。IL−8同時注入は又、MCP−1、MIP−1及びRANTES生成をも増強し、これは、IL−8がイン・ビボでβケモカイン生成を緒節することができることを示している。RANTES同時注入は、IFN−γ、IL−10、MIP−1α及びRANTESの増大した生成を生じたが、IL−2及びMCP−1の減少した生成を生じた。これは、RANTESが、抗原特異的免疫応答を、HSVモデルにおけるIL−8から異なる仕方で調節することを示している。
【0116】
HSVチャレンジの研究において、単独のgDワクチン接種は、63%の生存率を、200LD50のHSV−2のチャレンジ接種物にて示した。ケモカインIL−8及びRANTES cDNAの同時注入により、一層良好な生存率(88%)及び一層少ない重いヘルペス病変形成が達成された。対照的に、ケモカイン遺伝子(IP−10及びMCP−1)の同時送達は、チャレンジを受けたマウスの生存率を25%まで減少させた(gDワクチン単独よりも全体として50%より大きい減少)。同様に、MIP−1α同時注入も又、ワクチン接種された動物の生存率に負の影響を与えた。これらの観察は、各ケモカイングループにおいて試験された動物の総数(gD単独の生存率、18匹中13匹 [72%];MIP−1αの生存率、18匹中17匹 [94%];IP−10の生存率、18匹中7匹 [39%];MIP−1αの生存率、18匹中10匹 [56%]))を考慮するならばすばらしいものである(図5)。これは、IL−8及びRANTESケモカイン遺伝子の同時注入は致死的HSVチャレンジからの防護を増強するが、IP−10及びMCP−1及びMIP−1α(一層少ない程度)との同時注入は、免疫応答の誘導にもかかわらず、動物を一層ウイルス感染にかかりやすくするということを示している。Th1型サイトカイン遺伝子との同時注入は、致死的HSVチャレンジからの防護率を増大させるが、Th2型サイトカイン同時注入は、動物のウイルス感染への感受性を増大させる。病因論の研究において、病原性感染への抵抗性のためのTh1様サイトカイン応答の重要性が、報告されている。従って、Th1及び/又はTh2型免疫応答がこれらのケモカインによって駆動されるということはありそうなことであり、免疫応答の質に基づくHSV感染性チャレンジに対する防護に対する強い影響を生じる。
【0117】
TNFファミリーの場合には、TNF−α及びTNF−β遺伝子との同時注入も又、チャレンジを受けたマウスの生存率を25%にまで減少させた(gDワクチン単独よりも全体として生存率の50%より大きい減少)。TNF−α遺伝子を同時注入されたマウスのgD特異的な抗体及びTh細胞増殖レベル並びにサイトカイン生成レベル(IL−2、IFN−γ、IL−10)は、gD DNAワクチン接種だけのものよりずっと高かったが、HSV−2感染に対するTNFサイトカイン媒介の感受性は、それらの動物において認められた。この観察の原因は明らかでないが、応答の質が病原性感染の制御に有意に重要であることを強く支持している。
【0118】
結論として、これらのデータは、ケモカインがTh1及び/又はTh2型に対する免疫応答を抗原依存様式で調節することができることを示している。かかる活性は、以前は、サイトカインとだけ関係付けられてきた。これらのデータは、ケモカインが、抗原特異的免疫の誘導において、サイトカインのような中心的役割を有することを意味している。この発見は、感染性疾患に対する我々の武器を拡大する。その上更に、ケモカインの、癌治療のために免疫応答を調節するための利用も又、考えられる。
【0119】
【表1】
【0120】
【表2】
【0121】
【表3】
【0122】
【表4】
【図面の簡単な説明】
【図1】
実施例に記載した実験においてDNAベクターで免疫化したマウス(Balb/c)における全身性gD特異的のレベルを示す図である。各グループのマウス(n=10)をgD DNAワクチン(60μg/マウス)とケモカイン遺伝子(40μg/マウス)又はTNF遺伝子(40μg/マウス)で、0及び2週目に免疫化した。これらのマウスを、第2回目の免疫化の2週間後に採血してから、グループごとに等しくプールした血清をgDとの反応用に連続希釈した。それらのELISA力価を、ナイーブマウスの血清と同じ光学密度を示す最高血清希釈度の逆として測定した。吸光度(O.D.)を、405nmで測定した。
【図2A】
図2A及び2Bは、実施例に記載した実験においてDNAベクターで免疫化したマウス(Balb/c)におけるIgGサブクラスのレベルを示す図である。図2Aにおいて、各グループのマウス(n=10)を、gD DNAワクチン(60μg/マウス)とケモカイン遺伝子(40μg/マウス)又はTNF遺伝子(40μg/マウス)で、0及び2週目に免疫化した。これらのマウスを、最後の免疫化の2週間後に採血してから、血清をgDとの反応用に1:100に希釈した。吸光度(O.D.)を、405nmで測定した。相対的光学密度を、各IgGサブクラスの光学密度/全光学密度として計算した。直線状のバーは、各マウスIgGサブクラスの相対的光学密度の平均値(n=10)を表している。
【図2B】
図2A及び2Bは、実施例に記載した実験においてDNAベクターで免疫化したマウス(Balb/c)におけるIgGサブクラスのレベルを示す図である。図2Bは、IgG2aのIgG1に対する相対比を示している。平均(n=10)IgG2aレベルは、各免疫化グループにおける平均IgG1レベルにより除した。*gD DNAワクチン単独の各対応イソ型と比較して、スチューデントのt検定を用いて、P<0.05で統計的に有意である。
【図3】
図3A、3B及び3Cは、実施例に記載した実験において、αケモカイン cDNA(図3A)、βケモカイン cDNA(図3B)及びTNF対照(図3C)で免疫化したマウス(Balb/c)における、イン・ビトロgD刺激後の、脾臓細胞のTh細胞増殖レベルを示す図である。各グループのマウス(n=2)を、gD DNAワクチン(60μg/マウス)とケモカイン遺伝子(40μg/ml)又はTNF遺伝子(40μg/マウス)で、0及び2週目に、免疫化した。最後のDNA注入の2週間後に、2匹のマウスを犠牲にして、脾臓細胞を増殖アッセイ用にプールした。脾臓細胞を、1及び5μg/mlのgD−2タンパク質及び5μg/mlのPHA(陽性対照)で刺激した。刺激の3日後に、これらの細胞を収穫してcpmを計数した。試料を、三連でアッセイした。これらの図は、同様の結果を有する3つの別々の実験の1つの結果を示している。PHA対照試料は、40〜50の刺激インデックスを示した。*gD DNAワクチン単独と比較して、スチューデントのt検定を用いて、P<0.05で統計的に有意である。
【図4】
図4A、4B及び4Cは、実施例に記載した実験において、gD DNAワクチンとαケモカインcDNA(図4A)、βケモカインcDNA(図4B)及びTNF対照(図4C)で免疫化したマウス(Balb/c)の生存率を示した図である。各グループのマウス(n=8)を、gD DNAワクチン(60μg/マウス)とケモカイン遺伝子(40μg/マウス)又はTNF遺伝子で、0及び2週目に、免疫化した。第2回目の免疫化の3週間後に、マウスは、LD50200のHSV−2株186(7×105PFU)を用いて、i. vag.で、チャレンジを受けた。その後、マウスを、毎日試験して、生存率を評価した。生存マウスを、ウイルスチャレンジ後、61日間にわたって計数した。これを、予想された結果を伴って、一回反復した。
【図5】
実施例に記載した実験において、ケモカイン同時注入の間での防護率の差異を示した図である。括弧内の数字は、生存動物数/全試験動物数である。
Claims (30)
- 下記を含む組成物:
単離されたRANTESタンパク質及び/又はRANTESタンパク質をコードする核酸分子;及び
単離されたIL−8タンパク質及び/又はIL−8タンパク質をコードする核酸分子。 - 標的タンパク質及び/又は標的タンパク質をコードする核酸分子を更に含む、請求項1に記載の組成物。
- 調節エレメントに操作可能に結合されたIL−8をコードするヌクレオチド配列と、調節エレメントに操作可能に結合されたRANTESをコードするヌクレオチドを含むプラスミドを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記のプラスミドが、調節配列に操作可能に結合された免疫原をコードするヌクレオチド配列を更に含む、請求項3に記載の組成物。
- 前記の免疫原が、病原性抗原、癌関連抗原又は自己免疫疾患と関連する細胞に結合した抗原である、請求項4に記載の組成物。
- 前記の免疫原が、病原性抗原である、請求項4に記載の組成物。
- 前記の免疫原が、単純ヘルペス抗原である、請求項4に記載の組成物。
- 前記の単純ヘルペス抗原が、HSV2gDである、請求項7に記載の組成物。
- 請求項1〜8の組成物を含む、注射用医薬組成物。
- 免疫原に対する免疫応答を個体において誘導する方法であって、該個体に下記を投与することを含む当該方法:
単離されたRANTESタンパク質及び/又はRANTESタンパク質をコードする核酸分子;
単離されたIL−8タンパク質及び/又はIL−8タンパク質をコードする核酸分子;及び
標的タンパク質及び/又は標的タンパク質をコードする核酸分子。 - 前記の個体に下記を投与することを含む、請求項10に記載の方法
RANTESタンパク質をコードする核酸分子;
IL−8タンパク質をコードする核酸分子;及び
標的タンパク質をコードする核酸分子。 - 前記の個体に、RANTESタンパク質をコードするヌクレオチド配列、IL−8タンパク質をコードするヌクレオチド配列及び標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドを投与することを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記の個体に、2以上の異なるプラスミドを投与することを含む、請求項11に記載の方法であって、該2以上の異なるプラスミドが、集合的に、RANTESタンパク質をコードするヌクレオチド配列、IL−8タンパク質をコードするヌクレオチド配列及び標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む当該方法。
- 前記の個体に、RANTESタンパク質及び/又はIL−8タンパク質及び/又は標的タンパク質を投与することを含む、請求項11〜13の何れか一つに記載の方法。
- 請求項10〜14に記載の方法であって、前記の標的タンパク質が、病原性抗原、癌関連抗原又は自己免疫疾患と関連する細胞に結合した抗原である当該方法。
- 請求項10〜15に記載の方法であって、前記の免疫原が、病原性抗原である当該方法。
- 請求項10〜16の何れか一つに記載の方法であって、前記の標的タンパク質が、単純ヘルペスウイルス抗原である当該方法。
- 請求項10〜17の何れか一つに記載の方法であって、前記の標的タンパク質が、単純ヘルペスウイルス抗原HSV2gDである当該方法。
- 個体の免疫系を調節する方法であって、該個体に下記を投与することを含む当該方法
単離されたRANTESタンパク質及び/又はRANTESタンパク質をコードする核酸分子;及び
単離されたIL−8タンパク質及び/又はIL−8タンパク質をコードする核酸分子。 - 前記の個体に下記を投与することを含む、請求項19に記載の方法
RANTESタンパク質をコードする核酸分子;
IL−8タンパク質をコードする核酸分子。 - 前記の個体に、RANTESタンパク質をコードするヌクレオチド配列及びIL−8タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドを投与することを含む、請求項20に記載の方法。
- 前記の個体に、2以上のプラスミドを投与することを含む、請求項20に記載の方法であって、該2以上の異なるプラスミドが、集合的に、RANTESタンパク質をコードするヌクレオチド配列及びIL−8タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む当該方法。
- 前記の個体に、RANTESタンパク質及び/又はIL−8タンパク質を投与することを含む、請求項19〜22の何れか一つに記載の方法。
- 調節エレメントに操作可能に結合された免疫原をコードするヌクレオチド配列、IL−8をコードするヌクレオチド配列及びRANTESをコードするヌクレオチド配列を含む組換えワクチン。
- 前記の免疫原が、病原性抗原、癌関連抗原又は自己免疫疾患と関連する細胞に結合した抗原である、請求項24に記載の組換えワクチン。
- 前記の免疫原が、病原性抗原である、請求項24に記載の組換えワクチン。
- 免疫原に対する免疫応答を個体において誘導する方法であって、該個体に請求項24に記載の組換えワクチンを投与することを含む当該方法。
- 前記の組換えワクチンが、組換えワクシニアワクチンである、請求項24に記載の組換えワクチン。
- IL−8をコードするヌクレオチド配列及びRANTESをコードするヌクレオチド配列を含む生弱毒化病原体。
- 病原体に対して個体を免疫化する方法であって、該個体に請求項29に記載の生弱毒化病原体を投与することを含む当該方法。
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