JP5485601B2 - ワクチン、免疫療法剤およびそれらの使用法 - Google Patents
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Description
そのようなワクチンの設計においては、ワクチン接種された個体の細胞中に標的抗原を産生するようなワクチンは免疫系の細胞兵器誘導に有効であることが認められている。特に、弱毒化ワクチン、無発病性ベクターを使用する組換えワクチンおよびDNAワクチンはすべてワクチン接種された個体の細胞に抗原の産生を導き、免疫系の細胞兵器を誘導する。一方、タンパク質および殺したまたは不活性化したワクチンのみから成り、ヒトでの応答を誘導しないサブユニットワクチンは良好な細胞性免疫応答を誘導しない。
免疫調節タンパク質であるケモカインにはMIP−1α、MIP−1β、RANTES、IL−8およびMCP−1が含まれる。
ムチン様分子はセレクチンファミリー構成物のリガンドである。免疫調節タンパク質であるムチン様分子にはCD34、GlyCAM−1およびMadCAM−1が含まれる。
免疫調節タンパク質であるイムノグロブリンスーパーファミリー構成物にはPECAM−1、ICAM類、ICAM−1、ICAM−2、ICAM−3、CD2およびLFA−3が含まれる。
本発明のいくつかの態様によると、免疫調節タンパク質は核酸分子(それは細胞に取り込まれた場合、発現されて免疫調節タンパク質を発現する)を投与することにより送達される。本発明のいくつかの態様では、免疫調節タンパク質はタンパク質それ自身を投与することにより送達される。本発明のいくつかの態様では、免疫調節タンパク質は核酸かまたはタンパク質を投与することにより送達される。本発明のいくつかの態様では、免疫調節タンパク質は核酸およびタンパク質を同時に投与することにより送達される。
ケモカイン: ケモカインまたはケモカインをコードしている核酸分子の投与は細胞によるケモカインの発現を増加させる。
RANTESはTH1ならびにCTL応答を誘導する。
MIP−1β(pCDNA3内へクローン化されpCDNA3−MIP−1βを発生させた構築物として)も使用されるであろう。
接着分子: セレクチンファミリー構成物L−セレクチン P−セレクチン E−セレクチン。
MadCAM−1。
イムノグロブリンスーパーファミリー構成物 PECAM−1 ICAM類 ICAM−1ICAM−2 ICAM−3 CD2 LFA−3。
接着分子は核酸分子として、ワクチン、特に弱毒化生ワクチン、細胞ワクチン、組換え体ワクチン、および核酸/DNAワクチンとともにまたはその一部として投与された場合に最も有用である。
好適な接着分子にはICAM−1、LFA−3およびE−セレクチンが挙げられる。
ICAM−1はCTL増殖には最適である。
サイトカイン: M−CSF G−CSF GSF IL−4IL−18の突然変異形。
共刺激分子: CD40(CD40をコードしているcDNAがpCDNA3内へクローン化され、pCDNA3−CD40を発生させた構築物として使用される)CD40L。
増殖因子: 血管成長因子(血管成長因子をコードしているcDNAがpCDNA3内へクローン化され、pCDNA3−VGFを発生させた構築物として使用される)
IL−7 神経成長因子 血管内皮細胞増殖因子。
レセプター分子: Fas”致死遺伝子”発現産物 TNFレセプター FltApo−1 p55 WSL−1 DR3 TRAMPApo−3 AIR LARD NGRF DR4DR5 KILLER TRAIL−R2 TRICK2 DR6。
その他 カスパーゼ(ICE)。
本発明の実施に有用なプロモーターの例としては(特にヒトに対する遺伝子ワクチンの製造において)、シミアンウイルス40(SV40)、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MMTV)プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)(HIV長い末端反復配列(LTR)プロモーターのような)、モロニーウイルス、ALV、サイトメガロウイルス(CMV)(CMV前初期プロモーター、エプスタインバーウイルス(EBV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)からのプロモーター類、ならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびヒトメタロチオネインのようなヒト遺伝子からのプロモーター類が挙げられるが、これらに制限されるわけではない。
当業者は標準技術および容易に入手可能な材料を用いてMCP−1、MIP−1α、MIP−1β、IL−8またはRANTESに特異的に結合するモノクローナル抗体を製造することができる。モノクローナル抗体を製造するための技術はHarlow,E.およびD.Lane,(1988)ANTIBODIES:ALaboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor NY(本明細書において援用される)に説明されており、ハイブリドーマおよび標的タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体製造のための詳細な手引きが示されている。
組成物はそれをより有効にするための追加の成分を含んでいてもよい。例えば、本発明の組成物は異なったケモカインに特異的な抗体および同一のケモカインの異なったエピトープに特異的な抗体を含む多数の抗ケモカイン抗体を含んでいてもよい。
最初の投与に続いて、個体は再投与により追加免疫されるであろう。いくつかの好適な態様において、多数回投与が実施される。
序
免疫応答におけるケモカインの特異的役割を分子的に詳細に検討するため、α−ケモカインIL−8をコードしているcDNAならびにβ−ケモカインMIP−1α、RANTESおよびMCP−1をコードしているcDNAを個々に発現ベクター内へクローン化し、HIV−1エンベロープまたはgag/polタンパク質をコードしているDNA免疫原と一緒に共免疫感作した。モデル抗原としてこれらのDNAワクチン構築物を用い、そのような免疫感作に続いて誘導された抗原特異的体液性および細胞性免疫応答の分析を通して免疫応答の発生に果たすケモカイン遺伝子発現の特異的役割を検討した。ケモカインは抗原特異的免疫応答の活性化および調節に特異的で同定可能な役割を持っていることが観察された。
DNAワクチン接種によるケモカインの誘導
マウスを50μgのpCDNA3(対照)、pCEnvまたはpCGag/polで免疫した。2週間後、マウスを殺し、それらの脾臓をとり、リンパ球を単離した。これらの細胞は抗原特異的刺激(固定化組換え体ワクシニア感染刺激細胞を用いて)によりインビトロで5日間刺激した。エフェクター細胞からの培養上清液を集め、ケモカインMIP−1α、MIP−1βおよびRANTESの放出を試験した。pCEnvまたはpCGag/polによるDNA免疫感作は対照ベクターと比較してβ−ケモカインMIP−1α、MIP−1βおよびRANTES発現レベルの著しい増加を誘導した。この増加は最初の免疫感作後早くも2週間で存在しており、β−ケモカインがインビボで免疫応答を調節できたことを示唆している。抗原特異的応答に対するケモカインの影響を決定するため、次にDNAワクチンにより誘導される免疫応答に対するそれらの影響を調べた。
ケモカインIL−8、MIP−1α、MCP−1α、MCP−1およびRANTES遺伝子をKim,J.J.,D/B/Weiner(1997)SpringerSem Immunopathol19,174−195;Kim,J.J.,et al.,(1997)Nature Biot.15,641−645;およびKim,J.J.,etal.,(1997)J.Immunol.158,816−826(これらの各々は本明細書において援用される)に説明されている方法を用いてpCDNA3プラスミド発現ベクター内へ個々にクローン化した。これらのケモカイン発現カセットは全挿入物(5’および3’両方の隣接配列を含んで)の配列分析により確認された。加えて、これらのケモカイン構築物はインビトロでRD細胞へトランスフェクトされ、これらの構築物の発現が関連抗体を使用する免疫沈降により、またはケモカインELISAにより確認された。IL−8、MIP−1α、MCP−1およびRANTESのための発現構築物はまたワクチンとしても使用され、マウスを免疫した。材料および方法に説明されているインビボ発現技術により、これらの構築物はインビボでマウス筋肉組織中にそれらがコードしているケモカインを発現したことが決定された。
ワクチン誘導応答に対する種々のケモカインの影響が個々に分析された。pCEnvおよびpCEnv+IL−8免疫マウスからの抗血清を集め、ELISAによりHIV−1gp120タンパク質に対する特異的抗体応答を分析した。DNA免疫感作後0、2、4および6週に集められた血清からのgp120特異的抗体力価が測定された。1:128希釈において、pCEnv+IL−8で免疫した群からの血清はgp120タンパク質に対する抗体応答を示し、それはpCEnv単独で免疫した群からの応答よりも高かった。同様の結果がpCGag/polで免疫した群で観察された。さらに、IL−8遺伝子の共投与により誘導されたgp120特異的IgGのサブクラスが決定された。IgG1型の生成はTh2型サイトカインにより誘導されるが、IgG2型の生成はTh1型サイトカインにより誘導される。IgG2aに対するIgG1(Th1に対するTh2)の相対比が測定された。pCEnv免疫化群はIgG2aに対するIgG1の比が1.3であった。一方、pCEnv+IL−8の共注射は相対比を0.9に減少させ、Th1型応答への移行を示している。従って、IL−8は抗原特異的応答の質および量の両方に影響を及ぼした。
MIP1−αの共発現は抗原特異的体液性応答の誘導においてIL−8よりも劇的な影響を示した。pCEnv+MIP−1α共免疫感作はエンベロープ特異的抗体応答の劇的な促進を生じた。同様な結果がpCGag/polで免疫した群で観察された。pCEnv+MIP−1αを共投与した後のIgG2aに対するIgG1の相対比が決定された。pCEnv免疫群はIgG2aに対するIgG1の比が1.3であった。一方、pCEnv+MIP−1αの同時注射は相対比を1.7に上昇させ、Th2型応答への移行を示している。HIV−1免疫原(pCEnvまたはpCGag/pol)とMIP−1αの共発現は抗原特異的Tヘルパー細胞増殖応答の促進を生じた。対照的に、MIP−1α免疫感作は抗原特異的CTL応答またはサイトカイン誘導にはほとんど影響しなかった。IL−8の分析で観察されたように、サイトカイン産生に対する影響については、IL−4レベルには再び何の影響も観察されなかった。
次にワクチン誘導免疫応答に対するRANTES共送達の影響が試験された。IL−8およびMIP−1αと異なりpCEnvとRANTESの共発現はHIV−1エンベロープ特異的抗体応答を促進しなかった。加えて、pCEnv+RANTES共免疫感作は、pCEnv単独での免疫化群と比較した場合、IgG1−IgG2a比に対して何の影響も与えなかった。抗体応答とは対照的に、HIV−1免疫原(pCEnvまたはpCGag/pol)とRANTESの共ワクチン接種は抗原特異的Tヘルパー細胞増殖応答の著しい増加を生じた。さらに、pCEnv+RANTESを共投与した群からは2倍高いレベルのTh1サイトカインIFN−γおよびTNF−α発現が観察された。CTL活性には極微の影響しか与えないpCEnv+IL−8またはpCEnv+MIP−1αでの共注射と異なり、HIV−1エンベロープを発現しているワクシニア(vMN462)感染標的の特異的溶解のより劇的な増加がpCEnv+RANTESの共注射後に観察された。50:1のエフェクター:標的(E:T)比でpCEnv+RANTESを共注射後、標的細胞の36%を超える特異的溶解が観察された。同様に、pCGag/pol+RANTESで免疫したマウスではHIV−1gag/polを発現しているワクシニア(vVK1)感染標的の抗原特異的CTL溶解が著しく促進された。RANTES共送達は生じる応答をTh1型表現型に偏らせるが、再び、IL−4に対しては影響を及ぼさなかった。
次にMCP−1 cDNAのアジュバント特性が観察された。MCP−1はpCEnv免疫感作により誘導される特異的抗体結合プロフィールには極微の影響しか及ぼさないようである。さらに、HIV−1免疫原(pCEnvまたはpCGag/pol)とMCP−1の共発現は抗原特異的Tヘルパー細胞増殖応答の促進に対して陽性ではあるが比較的小さな(2倍)促進を示した。pCEnv+MCP−1を共投与した後のIgG2aに対するIgG1の相対比が決定された。pCEnv免疫群はIgG2aに対するIgG1の比が1.3であった。一方、pCEnv+MCP−1の共注射は相対比を1.0に減少させ、Th1型応答への移行を示している。pCEnv+MCP−1の共注射後に特異的溶解のより劇的な増加が観察された。50:1のエフェクター:標的(E:T)比でpCEnv+MCP−1を共注射後、標的細胞の36%を超える特異的溶解が観察された。同様に、pCGag/pol+MCP−1で免疫したマウスではHIV−1gag/polを発現している標的の抗原特異的CTL溶解が著しく促進された。pCEnv+MCP−1免疫マウスによるIFN−γ放出レベルは、pCEnv免疫または対照群よりも著しく高かった。再び、すべての群からのIL−4放出レベルは同様であった。さらに、pCEnv+MCP−1免疫マウス群によるTNF−α放出レベルは、pCEnv免疫または対照群よりも著しく高かった。これらのサイトカイン放出データはCD8+ CDLの活性化におけるMCP−1の役割を明瞭にする我々のCTL結果を支持している。
MCP−1およびRANTESでの共発現によるCTL応答の増加がCD8+T細胞に制限されていたかどうかを決定するため、balb/cマウスでMHCクラスI制限CTLの特異的エピトープであることが示されているHIV−1エンベロープペプチド(RIHIGPGRAFYTTKN)を用いてCTLアッセイが実施された。マウスは50μgの各々のDNA構築物で2週間あけて免疫感作し、第二の免疫感作1週間後に脾臓を採取した。CTLアッセイはインビトロでエンベロープ特異的ペプチドを用いて刺激した後に脾臓細胞に対して実施された。MCP−1およびRANTESでの共注射後の両方において、50:1のE:T比で各々35%および26%特異的溶解でのCTL応答の著しい促進が観察された。補体溶解によりエフェクター細胞集団からCD8+T細胞を除去した後にCTL活性を測定することにより前記の観察を確認した。CD8+T細胞の除去はMCP−1およびRANTESでの共注射後に観察された抗原特異的CTL促進を抑制した。これらの結果は、細胞溶解活性の促進は抗原特異的、クラスI制限およびCD8+T細胞依存的であったことを示している。
これらの特異的ケモカイン抗原増強免疫原のケモカイン産生それ自身に対する影響を決定するのは重要である(もしあれば)。免疫化動物から集められた刺激された細胞によるケモカインMIP−1α、MIP−1β、RANTESおよびMCP−1の発現を調べた。ケモカイン共注射はケモカイン特異的パターンでケモカイン産生を調節した。いくつかの重要な観察が行われた。さらに、ケモカイン遺伝子との共免疫感作により刺激された細胞によるケモカイン発現が増加することが観察された。例えば、MIP−1α発現はpCEnv+MCP−1の共免疫感作により、pCEnv免疫感作単独により発現されたレベルより劇的に促進できたことが観察された。加えて、MIP−1β発現はpCEnv+MCP−1およびpCEnv+RANTES免疫感作(二つの最も顕著なCTL応答の誘導剤)により劇的に促進されたことも観察された。さらに、pCEnv+MIP−1α、pCEnv+MCP−1およびpCEnv+RANTES共免疫感作は刺激された細胞によるRANTES発現を著しく促進させた。最後に、MCP−1の発現はpCEnv+MIP−1αおよびpCEnv+MCP−1共免疫感作で最も高かった。
炎症性反応の免疫の開始は、細胞性接着分子、サイトカインおよびケモカインの厳しく調整された発現を含んだ複雑な過程である。ケモカインは血管から宿主防御の末端部位への白血球やりとりの分子的制御に特に重要である。ケモカインのスーパーファミリーは20を超す関連タンパク質のアレイから成っている。ケモカインは保存されているシステイン残基の存在および位置に基づいて大きく三つのファミリー、C−X−C(α)、C−C(β)およびC(γ)、に分割される。αファミリー構成物においては、最初の二つのシステインが別のアミノ酸により引き離されており、一方βファミリー構成物ではお互いに隣に置かれている。これまでのところ、γファミリーは二つの構成物しか同定されていないが、それらの両方ともそのN末端には二つのシステインの代わりに一つのシステインしか含まれていない。
IL−8をコードしているヌクレオチド配列がワクチンまたは免疫療法剤の一部としてある種の細胞へ送達された場合、完全長形では不活性であり成熟形にプロセッシングされた場合にのみ活性になるのであまり有効ではない。図1Aに示したように、IL−8の最初の35アミノ酸はカスパーゼ−1(ICE)により切断される。突然変異体IL−18ヌクレオチド配列が構築され、それは図1Bに示した突然変異体IL−18へ翻訳される。このIL−18の突然変異体形は本発明による有効な免疫調節タンパク質として働く。免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされた突然変異体IL−18をコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーT細胞応答が促進される。突然変異体形をコードしているヌクレオチド配列はpCDNA3内へ挿入されるであろう。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたCD40をコードしているヌクレオチド配列の送達によりCTL応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたCD40Lをコードしているヌクレオチド配列の送達によりCTL応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたICAM−1をコードしているヌクレオチド配列の送達によりCTL応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたLFA−3をコードしているヌクレオチド配列の送達によりCTL応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたVCAM−1をコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーT細胞応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたE−セレクチンをコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーT細胞応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたG−CSFをコードしているヌクレオチド配列の送達によりCTL応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたG−CSFをコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーT細胞応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたE−セレクチンをコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーT細胞応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたNGFをコードしているヌクレオチド配列の送達によりCTL応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたIL−7をコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーT細胞応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたVEGFをコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーT細胞応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたRANTESをコードしているヌクレオチド配列の送達によりCTL応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたRANTESをコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーT細胞応答が促進される。
免疫原をコードしているヌクレオチド配列と組み合わされたIL−8をコードしているヌクレオチド配列の送達によりヘルパーT細胞応答が促進される。
MCP−1またはRANTESの任意の一つの送達によりTNF−α産生が促進される。
実施例4
M−CSF(マクロファージ−コロニー刺激因子)、G−CSF(顆粒球−CSF)およびGM−CSF(顆粒球/単球−CSF)のための遺伝子発現カセットならびにHIV−1DNA免疫原構築物の共送達後の抗原特異的免疫応答に対する影響を試験した。これらのサイトカインのための遺伝子は個々にサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター制御下の発現ベクター内へクローン化した。遺伝子プラスミド発現カセットは次にHIV−1免疫原のためのDNAワクチンカセットとともにマウスに注射された。抗原特異的免疫応答の方向性および程度に対するこれらの遺伝子アジュバントカセットでの共注射の免疫学的効果を分析した;これらの結果は原型Th1およびTh2型サイトカイン(各々IL−12およびIL−4)遺伝子の共送達で観察された結果と比較された。モデル抗原としてこれらのDNAワクチン構築物を用い、CSFがインビボで抗原特異的免疫応答を劇的におよび明白に制御でき、およびワクチン特異的様式でβ−ケモカイン産生を駆動していることが観察された。
HIV−1エンベロープタンパク質(pCEnv)およびgag/polタンパク質(pCGag/Pol)を発現しているDNAワクチンはBoyer,J.D.,etal.(1997)Nature Med.3,526−532(本明細書において援用される)に説明されているように製造された。ヒトG−CSFおよびM−CSFならびにマウスGM−CSFのための遺伝子はKim,J.J.,etal.(1998)Eur.J.Immunol.28,1089−1103およびKim,J.J.,etal.(1998)J.Clin.Invest.102,1112−1124(本明細書において援用される)に説明されているようにpCDNA3発現ベクター(Invitrogen,Inc.,SanDiego,CA)内へクローン化された。ヒトG−CSFおよびM−CSFはマウス細胞中で活性であることが報告されている。きれいなプラスミドは細菌中で製造され、QiagenMaxi Prepキット(Qiagen,SantaClara,CA)を用いて精製された。
マウス肥満細胞腫P815細胞株はATCC(Rockville,MD)から入手した。HIV−1エンベロープ(vMN462)、gag/pol(vVK1)およびβ−ガラクトシダーゼ(vSC8)を発現している組換え体ワクチンはNIHAIDS Research and Reference ReagentProgramから入手した。組換え体gp120またはp24タンパク質はImmunoDiagnostics,Inc.(Bedford,MA)から入手した。
6から8週齢のメスBALB/cマウス(Harlan Sprague Dawley,Inc.,Indianapolis,IN)の大腿4頭筋にリン酸緩衝液(PBS)および0.25%ブピバカイン−HCl(Sigma,St.Louis,MO)に処方した問題とする各々のDNA構築物50μgを注射した。種々の遺伝子発現カセットの投与は、注射前に選択されたプラスミドを混合することにより行った。対照マウスは50μgのpCDNA3ベクターで免疫した。各々の研究の組は3度実施され、代表的な組の結果が示されている。マウスには2回の免疫感作(各々50mg)を2週間の間隔で行った。追加注射1週間後、マウスを殺し、脾臓を採取してリンパ球を単離し、細胞応答を試験した(ThまたはCTL)。すべての動物は温度制御し、明暗を反復させたペンシルバニア大学の施設で飼い、それらの世話は米国国立保健研究所およびペンシルバニア大学のガイドラインに沿っていた。
0.1M炭酸塩−重炭酸塩緩衝液(pH9.5)で2mg/ml濃度に希釈した15μgのp24またはgp120タンパク質を4℃で一夜、マイクロタイターウェルに吸着させた。プレートはPBS−0.05%トウィーン−20で洗浄し、37℃で1時間3%BSAのPBS−0.05%トウィーン−20溶液でブロックした。マウス抗血清は0.05%トウィーン−20で希釈し、37℃で1時間インキュベートし、次にHRP−結合ヤギ抗マウスIgG(Sigma,St.Louis,MO)とインキュベートした。プレートを洗浄し、3’3’5’5’TMB(Sigma)緩衝溶液で発色させた。gp120特異的IgGサブクラスの相対レベルの決定には、抗マウスIgG−HRPを抗マウスIgG1およびIgG2a結合HRP(Zyrned,SanFrancisco,CA)に置換した。続いてABTS基質溶液(Chemicon,Temecula,CA)が添加された。各々の工程において、プレートは洗浄緩衝液(PBS+0.05%トウィーン−X)で3回洗浄された。プレートはDynatechMR5000プレートリーダー上、450nmの光学密度が読みとられた。
リンパ球は脾臓から採取され、赤血球を除去することによりおよび新鮮な培地で数回洗浄することによりエフェクター細胞として調製された。単離された細胞懸濁液は5x106細胞/mlの濃度で再懸濁した。5x105細胞を含んでいる100μlをすぐに96ウェルマイクロタイター平底プレートの各々へ加えた。5μg/mlおよび1μg/mlの最終濃度で組換え体p24またはgp120タンパク質をウェルに3重に加えた。細胞は5%CO2中、37℃で3日間インキュベートした。各々のウェルに1mCiのトリチウム化チミジンを加え、細胞は37℃で12から18時間インキュベートした。プレートをとり、取り込まれたトリチウム化チミジンの量をBetaPlateリーダー(Wallac,Turku,Finland)で測定した。刺激指数は式:刺激指数(SI)=(実験的カウント/自発的カウント)から決定された。自発的カウントウェルは不適切タンパク質対照として働く10%ウシ胎児血清を含んでいる。
ワクシニア感染標的を使用して5時間の51Cr放出CTLアッセイが実施された。アッセイはインビトロでのエフェクター刺激で実施され、エフェクターは適切なワクシニア感染細胞(エンベロープに対してはvMN462およびgag/polに対してはvVK1)で刺激され、それは5日間、CTL培養培地中5x106細胞/mlで、0.1%グルタルアルデヒドを用いて固定された。エフェクターはRPMI1640(Gibco−BRL,GrandIsland,NY)、10%ウシ胎児血清(Gibco−BRL)およびCon Aを含まない10%RAT−T−STIM(Becton Dickinson Labware,Bedford,MA)から成るCTL培養培地で2日間、非特異的に刺激された。ワクシニア感染標的は37℃で5から12時間、10−20の感染多重度(MOI)で3x106のP815細胞を感染させることにより調製された。標準クロム放出アッセイが実施され、そこで標的細胞は100mCi/mlNa2 51CrO2で60から120分間標識され、刺激エフェクター脾臓細胞と37℃で6時間インキュベートされた。CTL溶解は50:1から12.5:1の範囲のエフェクター:標的(E:T)比で決定された。上清を採取し、LKBCliniGammaガンマ−カウンターで計数された。パーセント特異的溶解は式:
100x実験的放出−自発的放出/最大放出−自発的放出
から決定された。最大放出は1%トリトンX−100含有培地中の標的細胞の溶解により決定された。”自発的放出”のカウントが”最大放出”の20%を超えたならば、アッセイは正当とは考えられなかった。
CD8+T細胞はα−CD8モノクローナル抗体(Pharmingen,SanDiego,CA)による処理により脾臓細胞から取り出され、続いてウサギ補体(Sigma)と37℃で45分間インキュベートした。
CTLアッセイのために刺激されたエフェクターからの上清が6日目に集められ、IFN−γおよびIL−4(Biosource International,Inc.,Camarillo,CA)およびMIP−1α(R&D Systems,Minneapolis,MN)、MIP−lβおよびRANTES(Intergen,Pace,NY)のためのELISAキットを使用してサイトカインおよびケモカインプロフィールが試験された。
サイトカイン遺伝子は個々にpCDNA3プラスミド発現ベクター内へクローン化された。サイトカイン構築物がそれらの適切なタンパク質を発現しているかどうかを試験するため、それらをRD筋肉細胞株内へトランスフェクトし、これらの構築物の発現をサイトカインELISAにより分析した。結果は各々の発現カセットが特異的サイトカインを産生していることを示している(G−CSF〜40−60pg/ml;GM−CSF >70pg/ml;M−CSF 〜60−70pg/ml)。
G−CSFはマクロファージ、線維芽細胞、内皮細胞および骨髄間質細胞により産生される増殖因子である。G−CSFは好中球、内皮細胞および血小板を活性化するが、抗原提示細胞には直接的な影響をほとんど及ぼさないと考えられている。抗原特異的抗体応答に対するG−CSF共発現の影響が試験された。pCEnvおよびpCEnv+G−CSF免疫マウスからの抗血清を集め、ELISAによりHIV−1gp120タンパク質に対する特異的抗体応答を分析した。DNA免疫感作6週間後に集められた血清からのgp120特異的抗体力価が測定された。G−CSF共免疫感作はgp120特異的抗体応答レベルには有意な影響を与えなかった。同様な結果がpCGag/polで免疫した群で観察された。さらに、G−CSF遺伝子の共投与により誘導されたgp120特異的IgGのサブクラスが決定された。IgG1型の産生はTh2型サイトカインにより誘導され、一方、IgG2a型の産生はTh1型サイトカインにより誘導されることが報告されている。IgG1(Th2)に対するIgG2a(Th1)の相対比が測定された。pCEnv免疫群は0.8のIgG1に対するIgG2aの比を持っていた。一方、原型Th1サイトカインIL−12遺伝子の共免疫感作は比を1.28に増加させ、Th2サイトカインIL−4遺伝子は比を0.68に減少させた。G−CSFの共投与は比を1.1に増加させ、Th1型応答への移行を示している。
GC−CSFは顆粒球細胞を活性化および分化させ、内皮細胞、赤血球系細胞、巨核球およびTヘルパー細胞の増殖因子として働くことができる。GM−CSFがキラーT細胞に影響を及ぼすことができるかどうかは明確ではない。G−CSF共発現と対照的に、GM−CSF共発現は抗原特異的体液性応答の誘導において著しい促進効果(すべての群で最も高い)を持っていた。IL−4共注射と同様に、GM−CSF共免疫感作は最も高いレベルのエンベロープ特異的抗体応答を生じさせた。同様な結果がpCGag/polで免疫した群で観察された。一方、pCEnv+GM−CSF共免疫感作はpCEnv単独で免疫した群と比較した場合、IgG2a/IgG1比には何の影響も及ぼさなかった。さらに、IL−12共免疫感作とともに、HIV−1免疫原(pCEnvまたはpCGag/pol)とのGM−CSF共発現は最も高いレベルの抗原特異的Tヘルパー細胞増殖応答を生じた。GM−CSF発現はIFN−γレベルを増加させるが(2倍)、IL−4産生には影響しないことも観察された。対照的に、GM−CSF共免疫感作は抗原特異的CTL応答にはわずかな影響しか及ぼさなかった。
M−CSFはマクロファージならびにマクロファージ前駆細胞の強力な活性化剤である。M−CSFレセプターは制限された発現パターンを持っており、再びマクロファージに限られている。そういうものであるので、このAPC集団に対するM−CSF共送達の直接効果が評価できる。GM−CSFと異なり、pCEnvとのM−CSFの共発現はHIV−1エンベロープ特異的抗体応答に対して陽性の促進効果を持っていた(しかしIL−4またはGM−CSFよりは小さい)。pCEnv+M−CSFでの共投与後のIgG1に対するIgG2aの相対比が決定された。pCEnv免疫群は0.8のIgG1に対するIgG2aの比を持っていた。一方、pCEnv+M−CSFの共注射は比を1.2に増加させ、Th1型応答への強い移行を示している。さらに、HIV−1免疫原(pCEnvまたはpCGag/pol)とのM−CSF共発現は抗原特異的Tヘルパー細胞増殖応答の著しい増加を生じた。CTL活性にほとんど影響を及ぼさないpCEnv+G−CSFまたはpCEnv+GM−CSF共注射と異なり、pCEnv+M−CSF共注射後に、HIV−1エンベロープを発現しているワクシニア感染標的(vMN462)の特異的溶解における、より劇的な増加が生じた。50:1のエフェクター:標的(E:T)比でのpCEnv+M−CSF共注射後に、標的細胞のほとんど40%の特異的溶解が観察された。同様に、pCGag/pol+M−CSFで免疫したマウスでは、HIV−1gag/polを発現しているワクシニア感染標的(vVK1)の抗原特異的CTL溶解の著しい促進が生じた。pCEnv+M−CSFで免疫したマウスによるIFN−γ放出レベルは、pCEnv免疫または対照群よりも著しく高かった。一方、これらの群のIL−4レベルは類似していた。
M−CSF共発現を経るCTL応答の増加がCD8+T細胞に制限されているかどうかを決定するため、balb/cマウスでMHCクラスI制限CTLの特異的エピトープであることが示されているHIV−1エンベロープペプチド(RIHIGPGRAFYTTKN)を用いてCTLアッセイが実施された。マウスは50μgの各々のDNA構築物で2週間あけて免疫感作し、第二の免疫感作1週間後に脾臓を採取した。CTLアッセイは前記のようにインビトロでエンベロープ特異的ペプチドを用いて刺激した後に単離脾臓細胞に対して実施された。M−CSF両方の共注射後、50:1のE:T比で40%の特異的溶解を示すCTL応答の著しい促進が観察された。補体溶解によりエフェクター細胞集団からCD8+T細胞を除去した後にCTL活性を測定することによりこの観察を確認した。CD8+T細胞の除去はM−CSFの共注射後に観察された抗原特異的CTL促進を抑制した。これらの結果は、細胞溶解活性の促進は抗原特異的、クラスI制限およびCD8+T細胞依存的であったことを示している。
刺激されたT細胞からのβ−ケモカイン(MIP−1α、MIP−βおよびRANRES)発現プロフィールが試験された。これらのβ−ケモカインはマクロファージ指向性(しかしT細胞指向性ではない)ウイルスに対してCD8+T細胞により産生される主HIV抑制因子である。さらに、これらのCD8+T細胞産生ケモカインは末梢における細胞性免疫展開に決定的な役割を果たしていることが示されている。特に、我々はpCEnvによるDNA免疫感作はβ−ケモカインMIP−1α、MIP−βおよびRANRESを誘導することを観察した。さらに、造血サイトカイン遺伝子による共免疫感作は、刺激されたT細胞によるケモカインの発現を増加させることが観察された。例えば、MIP−α発現はpCEnv+G−CSFによる共免疫感作により、pCEnv単独の免疫感作により発現されるレベルよりも劇的に促進できることが観察された。加えて、MIP−β発現はpCEnv+M−CSF共免疫感作により劇的に促進されることが観察された。一方、pCEnv+M−CSF、pCEnv+G−CSFおよびpCEnv+GM−CSF共免疫感作は、刺激されたエフェクター細胞によるRANTES発現の促進を、DNAワクチンカセット単独により誘導されるレベルよりも著しく高めなかった。しかしながら、興味あることに、M−CSFは遺伝子免疫感作それ自身により誘導されるよりも低いレベルにMIP−1αを下方調節するようである。このデータはMIP−1αはCTL応答の駆動に直接的に関与しているのではなく、実際にはその誘導を妨害しているのであろう。
局所免疫環境(注入部位または筋肉中の局所リンパ節の末梢)の処置は免疫応答の程度および方向性の両方に影響されるであろう。DNAワクチンのための分子アジュバントとしてG−CSF、GM−CSFおよびM−CSF遺伝子共送達により引き出される免疫効果が試験された。
ケモカインにより密接に制御されている三つの特異的接着分子の免疫調節効果が試験された。インビボでの免疫活性化におけるICAM−1、LFA−3およびVCAM−1の役割を探査するためにDNAワクチン技術を利用した。特定的に、ICAM−1、LFA−3およびVCAM−1の遺伝子を個々にサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの制御下にある発現ベクター内へクローン化した。これらの構築物は次にHIV−1エンベロープまたはgag/pol抗原をコードしているDNA免疫原とともに共免疫感作された。抗原特異的免疫応答レベルに対するこれらの接着分子カセット共注射の免疫学的影響が分析された。
HIV−1エンベロープタンパク質(pCEnv)およびgag/polタンパク質(pCGag/Pol)を発現しているDNAワクチンはKim,J.J.,etal.Nature Biot.15,641−645(本明細書において援用される)に説明されているように製造された。ICAM−1、LFA−3およびVCAM−1の遺伝子はpCDNA3発現ベクター(Invitrogen,Inc.,SanDiego,CA)内へクローン化され、きれいなプラスミドDNAはKim,J.J.,etal.(1998)Eur.J.Immunol.28,1089−1103に説明されているように製造された。
ヒト横紋筋肉腫(RD)およびマウス肥満細胞腫P815細胞株はATCC(Rockville,MD)から入手した。HIV−1エンベロープ(vMN462)、gag/pol(vVK1)およびβ−ガラクトシダーゼ(vSC8)を発現している組換え体ワクチンはNIHAIDS Research and Reference ReagentProgramから入手した。組換え体gp120またはp24タンパク質はImmunoDiagnostics,Inc.(Bedford,MA)から入手した。
ICAM−1、LFA−3、およびVCAM−1構築物の発現はそれらをRD細胞へトランスフェクトすることにより分析された。細胞はトランスフェクション72時間後に採取し、ICAM−1、LFA−3およびVCAM−1のためのフルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合モノクローナル抗体(Pharmingen,SanDiego,CA)で分析された。
6から8週齢のメスBALB/cマウス(Harlan Sprague Dawley,Inc.,Indianapolis,IN)の大腿4頭筋にリン酸緩衝液(PBS)および0.25%ブピバカイン−HCl(Sigma,St.Louis,MO)に処方した問題とする各々のDNA構築物50μgを注射した。種々の遺伝子発現カセットの投与は、注射前に選択されたプラスミドを混合することにより行った。対照マウスは50μgのpCDNA3ベクターで免疫した。各々の研究の組は3度実施され、代表的な組の結果が示されている。マウスには2回の免疫感作(各々50mg)を2週間の間隔で行った。追加注射1週間後、マウスを殺し、脾臓を採取してリンパ球を単離し、細胞応答を試験した(ThまたはCTL(細胞障害性Tリンパ球))。
0.1M炭酸塩−重炭酸塩緩衝液(pH9.5)で2mg/ml濃度に希釈した15μgのp24またはgp120タンパク質を4℃で一夜、マイクロタイターウェルに吸着させた。プレートはPBS−0.05%トウィーン−20で洗浄し、37℃で1時間3%BSAのPBS−0.05%トウィーン−20溶液でブロックした。マウス抗血清は0.05%トウィーン−20で希釈し、37℃で1時間インキュベートし、次にHRP−結合ヤギ抗マウスIgG(Sigma,St.Louis,MO)とインキュベートした。プレートを洗浄し、3’3’5’5’TMB(Sigma)緩衝溶液で発色させた。プレートはDynatechMR5000プレートリーダー上、450nmの光学密度が読みとられた。
リンパ球を脾臓から採取し、赤血球を除去することによりおよび新鮮な培地で数回洗浄することによりエフェクター細胞として調製された。単離された細胞懸濁液は5x106細胞/mlの濃度で再懸濁した。5x105細胞を含んでいる100μlをすぐに96ウェルマイクロタイター平底プレートの各々へ加えた。5μg/mlおよび1μg/mlの最終濃度で組換え体p24またはgp120タンパク質をウェルに3重に加えた。細胞は5%CO2中、37℃で3日間インキュベートした。各々のウェルに1mCiのトリチウム化チミジンを加え、細胞は37℃で12から18時間インキュベートした。プレートを採取し、取り込まれたトリチウム化チミジンの量をBetaPlateリーダー(Wallac,Turku,Finland)で測定した。刺激指数は式:刺激指数(SI)=(実験的カウント/自発的カウント)から決定された。自発的カウントウェルは不適切タンパク質対照として働く10%ウシ胎児血清を含んでいる。加えて、pCEnvまたは対照免疫動物は決まりきってPr55タンパク質に対して1のSIを持っている。同様に、pCGag/polまたは対照は決まりきってgp120タンパク質に対して1のSIを持っている。細胞が健康であるのを確かめるため、PHAまたはconA(Sigma)がポリクローナル刺激物質陽性対照として使用された。PHAまたはconA対照試料は20−40のSIを持っていた。
ワクシニア感染標的を使用して5時間の51Cr放出CTLアッセイが実施された。アッセイはインビトロでのエフェクター刺激で実施され、エフェクターは適切なワクシニア感染細胞(エンベロープに対してはvMN462およびgag/polに対してはvVK1)で刺激され、CTL培養培地中(5x106細胞/ml)で、0.1%グルタルアルデヒドを用いて5日間固定された。エフェクターはRPMI1640(Gibco−BRL,GrandIsland,NY)、10%ウシ胎児血清(Gibco−BRL)およびCon Aを含まない10%RAT−T−STIM(Becton Dickinson Labware,Bedford,MA)から成るCTL培養培地で2日間、非特異的に刺激された。ワクシニア感染標的は37℃で5から12時間、10−20の感染多重度(MOI)で3x106のP815細胞を感染させることにより調製された。標準クロム放出アッセイが実施され、そこで標的細胞は100mCi/mlNa2 51CrO2で60から120分間標識され、刺激エフェクター脾臓細胞と37℃で6時間インキュベートされた。CTL溶解は50:1から12.5:1の範囲のエフェクター:標的(E:T)比で決定された。上清を採取し、LKBCliniGammaガンマ−カウンターで計数された。パーセント特異的溶解は式:
100x実験的放出−自発的放出/最大放出−自発的放出
から決定された。最大放出は1%トリトンX−100含有培地中の標的細胞の溶解により決定された。”自発的放出”のカウントが”最大放出”の20%を超えたならば、アッセイは正当とは考えられなかった。
CD8+T細胞はα−CD8モノクローナル抗体(Pharmingen,SanDiego,CA)による処理により脾臓細胞から取り出され、続いてウサギ補体(Sigma)と37℃で45分間インキュベートした。
CTLアッセイのために刺激されたエフェクターからの上清が6日目に集められ、IFN−γおよびIL−4、およびMIP−1α、MIP−lβおよびRANTESのためのELISAキットを使用して発現が試験された(Biosource,Camarillo,CA;R&DSystems,Minneapolis,MN;Intergen,Purchase,NY)。
ICAM−1、LFA−3およびVCAM−1はトランスフェクトされた細胞により発現できる
ICAM−1(pCICAM−1)、LFA−3(pCLFA−3)およびVCAM−l(pCVCAM−1)遺伝子は個々にpCDNA3発現ベクター(図2)内へクローン化された。ICAM−1、LFA−3およびVCAM−1構築物がそれらの適切なタンパク質を発現できるかどうかを試験するため、それらをヒト横紋筋肉腫(RD)細胞株内へトランスフェクトした。FACS分析を使用し、ICAM−1、LFA−3およびVCAM−1発現カセットのトランスフェクションが、各々ICAM−1、LFA−3およびVCAM−1の特異的発現を生じさせたことが観察された。また、二つのDNA発現カセットの筋肉内共免疫感作により、同じ筋肉細胞内で両方のコードされたタンパク質が共発現していることもインビボで観察した。
次に、抗原特異的免疫応答の誘導に対する接着分子共発現の影響を調べた。すべての実験において、50μgの各々のDNA発現構築物が、週0および2にBALB/cマウスの筋肉内へ注射された。調べられた第一の免疫パラメーターは抗原特異的体液性応答であった。週0、2および6に免疫マウスからの抗血清が集められ、ELISAによりHIV−1gp120タンパク質に対する特異的抗体応答が分析された。ICAM−1、LFA−3およびVCAM−1の共発現はpCEnv免疫感作により誘導された特異的抗体結合プロフィールに極微の影響しか及ぼさなかったようである。同様の結果がpCGag/polで共免疫した群で観察された。
細胞性免疫応答の程度に対する接着分子共発現の影響もまた調べられた。CD4+Tヘルパー細胞増殖性応答の誘導は、Th細胞がB細胞を経る体液性免疫応答およびCD8+T細胞を経るCTL応答の両方に決定的な役割を果たしているので重要である。pCGag/polで免疫したマウスのTh増殖性応答およびICAM−1、LFA−3およびVCAM−1で共免疫した該応答が測定された。組換え体gp120HIV−1エンベロープタンパク質(5μg/mlおよび1μg/ml)がT細胞増殖の特異的刺激のために各々のウェルに加えられた。また、無関係なタンパク質を用いてT細胞の非特異的刺激をこれらの群で分析し、非特異的抗原はインビトロでT細胞増殖性応答を誘導しないことを観察した。バックグラウンドレベルの増殖が対照ベクターで免疫した対照群で観察され、中レベルの増殖がpCEnv単独で免疫した群で観察された。対照的に、pCICAM−1またはpCLFA−3で共免疫した群は著しく高いレベルの増殖性応答を持っていた。一方、VCAM−1遺伝子で共免疫した群は抗原特異的Th応答の促進を示さなかった。同様の結果がpCGag/polで共免疫した群で観察された。どちらか一方の免疫原を使用した反復実験で、pCICAM−1またはpCLFA−3の共送達は抗原特異的増殖性応答の3から4倍の増加を生じた。
細胞免疫性の促進をさらに調べるため、pCEnvおよびpCGag/polで共免疫したマウスの脾臓細胞を使用してCTLアッセイを実施した。特異的および非特異的ワクシニア感染またはペプチド処理標的からのクロム放出測定に先立ってエフェクター脾臓細胞のインビトロ刺激が実施された。標的の特異的溶解を計算するため、特異的標的のパーセント溶解から無関係標的のパーセント溶解が差し引かれた。バックグラウンドレベルの特異的溶解がpCDNA3、pCICAM−1、pCLFA−3またはpCVCAM−1で免疫感作した対照動物で観察され、pCEnvで免疫感作した動物は低レベルのCTL応答を示した。一方、pCEnv+pCICAM−1による共免疫感作はCTL活性の劇的な増加を生じた。HIV−1エンベロープワクシニア(vMN462)感染標的の40%を超える特異的溶解が、50:1のエフェクター:標的(E:T)比でのpCEnv+pCICAM−1による共免疫感作後に観察された。CTL活性は12.5:1のE:T比では20%特異的溶解に減少した。対照的に、pCEnv+pCLFA−3による共免疫感作はCTL活性のより穏やかな増加を生じた。同様のCTLの結果がpCGag/pol+pCICAM−1およびpCGag/pol+pCLFA−3による共免疫感作後に観察された。
免疫化動物における刺激CTLによるサイトカイン産生の分析は観察されたCTLの結果を支持している。サイトカインは免疫応答発生の間、免疫細胞の方向付けおよび標的化に鍵となる役割を果たしている、例えば、IFN−γはT細胞仲介細胞障害性免疫応答の制御に複雑に関与しており、一方、IL−4はB細胞仲介免疫応答において支配的な役割を果たしている。CTLアッセイのためにインビトロで刺激されたエフェクター細胞からの上清液を分析し、サイトカインIFN−γおよびIL−4の放出を試験した。pCICAM−1の共注射はIFN−γレベルを著しく増加させることが観察された。pCLFA−3の共注射ではIFN−γ産生の増加はより穏やかなものであった。一方、すべての群から放出されたIL−4のレベルは同様であった。
最近、我々は感染末梢部位での特定のケモカイン産生を通してインビボでのCD8+エフェクターT細胞が抗原特異的応答を拡大させることを報告した。従って、刺激CTLによるβ−ケモカインの産生を分析した。CTLのためにインビトロで刺激されたエフェクター細胞からの上清を分析し、β−ケモカインMIP−1α、MIP−βおよびRANTESの放出が試験された。前に観察されたように、pCEnvでのDNA免疫感作は、対照ベクターよりも著しく高いMIP−1α、MIP−βおよびRANTES発現レベルを誘導した。さらに、pCEnv+pCLFA−3の共注射は、pCEnv免疫群よりもβ−ケモカイン産生レベルを増加させた。なおさらに著しいことに、pCEnv+pCICAM−1による共免疫感作ではpCEnv免疫群よりもβ−ケモカイン産生の劇的な促進が生じた。対照的に、pCICAM−1による共投与はケモカイン発現を促進しなかった。これらの結果は、ICAM−1およびLFA−3は直接的T細胞共刺激を提供するということを支持している。
B7(CD80およびCD86)経路はT細胞応答を開始および拡大するための決定的な第二のシグナル送達のための主共刺激経路であると考えられている。これらの分子はDNAワクチン関連では調節因子として試験されてきた。この関連において、CD86分子はワクチンアジュバントとして送達された場合、CD8+細胞障害性Tリンパ球の抗原特異的誘導に突出した役割を果たしているようである。DNA免疫原とともにCD86cDNAを共投与すると抗原特異的CD8+CTL応答が劇的に増加した。ICAM−1およびLFA−3の効果はB7−CD28シグナル依存的であるかもしれないし、またはインビボでCTL誘導を駆動するための別の相乗的経路を代表しているかもしれない。従って、ICAM−1およびLFA−3分子がCD86分子と共発現された場合、CTL誘導レベルを相乗的に促進することができるかどうかをさらに探査した。ICAM−1およびCD86分子の共発現は抗原特異的CTL応答を相乗的に促進できることが観察された。一方、LFA−3およびCD86分子の共発現はCTL応答レベルを改良しなかった。これらの結果は、ICAM−1/LFA−3経路はCD86/CD28経路と独立したT細胞共刺激シグナルを提供することを示しており、インビボではそれらはT細胞応答を拡大するために相乗的に働いているのであろう。
免疫または炎症性反応の間、抗原がふれた部位へリンパ球が運ばれる。リンパ球および内皮細胞の接着分子が、直接の細胞接触および白血球の移動の方向付けに重要な役割を果たしている。加えて、接着分子はAPCへのTリンパ球の結合に重要な役割を果たしている。ICAM−1(CD54)は90−114kDの分子であり、内皮細胞、マクロファージおよび樹状細胞上に発現され、LFA−1およびMac−1に結合する。Tリンパ球を含むほとんどすべての白血球はLFA−1を発現するが、Mac−1発現は単球、マクロファージおよび顆粒球に制限されている。LFA−3(CD58)はAPCを含む種々の細胞型により発現される55−70kDの表面分子である(Springer,T.A.,etal.1987,Ann.Rev.Immunol.5:223−252、本明細書において援用される)。血管細胞接着分子−1(VCAM−1)は活性化内皮細胞および平滑筋細胞上に発現される110kDの表面分子である(Osbom,L.,etal.1989.Cell.59:1203−1211、本明細書において援用される)。VCAM−1は、好酸球、リンパ球、単球および好塩基球を含むほとんどの単核白血球で構成的に発現される最後期抗原−4(VLA−4)を認識し結合するが、好中球には存在しない(Elices,M.J.,etal.1990 Cell.60:577−584、本明細書において援用される)。VCAM−1/VLA−4相互作用は白血球移動および血管外遊出に重要な役割を果たしている。
T細胞上のCD40リガンドおよび白血球機能関連タンパク質(LFA)は各々APC上のCD40および細胞間接着分子(ICAM)と相互作用する。共刺激分子CD40およびCD40リガンド、および接着分子LFA−3およびICAM−1を共免疫感作し、gDプラスミドワクチンおよびHSV−2による致死的感染に対する保護についての免疫調節効果を分析した。全身的gD特異的IgG産生がCD40、CD40リガンドおよびICAM−1の共注射により著しく促進されたことが観察された。しかしながら、IgG産生の変化はCD40、CD40リガンドおよびICAM−1の共注射によってもほとんど観察されなかった。さらに、Th1型細胞性応答がCD40リガンドにより起こり、これに対し、Th1およびTh2型免疫応答の両方がLFA−3により起こされた。CD40リガンドおよびLFA−3の共送達はまた、致死的HSV−2感染での生存率を高めた。これらの研究は共刺激および接着分子は異なった共刺激経路を持っており、それらは保護的抗原特異的免疫性の発生に重要な役割を果たすことを示している。
マウス
メス4−6週齢BALB/cマウスはHarlan Sprague−Dawley(Indianapolis,Ind.)から購入された。それらは米国国立保健研究所(Bethesda,Md.)およびペンシルバニア大学IACUC(Philadelphia,Pa.)のガイドラインに沿って世話された。
HSV−2株186(P.Schaffer、ペンシルバニア大学、Philadelphia,Pa.、から親切にも寄贈された)はベロ細胞株(AmericanType Culture Collection,Rockville,Md.)中で繁殖させた。組換え体HSV−2gDタンパク質が本研究で組換え体抗原として使用された。ヒト横紋筋肉腫(RD)細胞株はATCC(Rockville,Md.)から入手した。
DNAワクチン、HSV−2gDタンパク質をコードしているpAPL−gD2はPachuk,etal.1998 Current topics Microbiol.Immunol.226,79(本明細書において援用される)に記載されているように調製された。pCDNA3−CD40、pCDNA3−CD40リガンド、pCDNA3−LFAおよびpCDNA3−ICAM−1を作製するためにCD40、CD40リガンド、LFA−3およびICAM−1のcDNAの各々が発現ベクターpCDNA3内へクローン化された。プラスミドDNAは細菌中で産生され、二重バンドCsCl処方により精製された。
CD40、CD40リガンド、LFA−3およびICAM−1構築物の発現はそれらをRD細胞内へトランスフェクトすることにより分析された。細胞はトランスフェクション72時間後に採取し、LFA−3、ICAM−1、CD40およびCD40リガンドのためのフルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合モノクローナル抗体(Pharmingen,SanDiego,CA)によるFACS分析を使用して発現が試験された。
BALB/cマウスの大腿4頭筋に100μlのリン酸緩衝液および0.25%ブピバカイン−HCl(Sigma,St.Louis,Mo.)に処方したgDDNA構築物を28ゲージ注射針(Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)を通して注射した。種々のケモカインおよびサイトカイン遺伝子発現カセット試料は注射前にpgDプラスミド溶液と混合させた。
gD特異的IgGサブクラスの相対レベルを決定するため、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)がHRPと結合された抗マウスIgG1およびIgD2a(Zyrned,SanFrancisco,CA)を使用して実施された。ELISA力価は天然マウス血清と同一の光学密度を示している最も高い血清希釈を基準にして決定された。
6x106脾臓細胞を含んでいる1mlを24ウェルプレートに加えた。次に、各々のウェルに1μgのHSV−2gDを加えた。5%CO2中、37℃で2日間インキュベートした後、細胞上清液を確保し、細胞外液体をサイトカインまたはケモカイン特異的ELISAプレートに加えることにより市販のサイトカインキット(Biosource,Intl.,Camarillo,Ca.およびR&DSystems,Minneapolis,Md.)を使用してIL−2、IL−10、IFN−γ、RANTES、MCP−lおよびMIP−1αのレベルを検出するために使用した。
ウイルスを接種する前に。膣内領域を0.1MNaOH溶液に浸した綿付き塗布具(HardwoodProducts Company,Guiford,ME)でふきとり、乾燥綿付き塗布具で清浄した。マウスは生存率を評価するため毎日検査された。
統計分析は対応のあるスチューデントt検定およびANOVAを用いて行われた。異なった免疫感作群間の値が比較された。p値<0.05が有意であると考えられた。
CD40、CD40リガンド、LFA−3およびICAM−1はトランスフェクトされた細胞により発現できる
CD40、CD40リガンド、LFA−3およびICAM−1は個々にpCDNA3発現ベクター内へクローン化された。CD40、CD40リガンド、LFA−3およびICAM−1構築物がそれらの適切なタンパク質を発現することができるかどうかを試験するため、それらをインビトロでヒトRD細胞内へトランスフェクトした。FACS分析を用い、CD40、CD40リガンド、LFA−3およびICAM−1発現カセットが各々CD40、CD40リガンド、LFA−3およびICAM−1の特異的発現を生じていることが観察された。RD細胞はpCDNA3(対照)またはCD40、CD40リガンド、LFA−3およびICAM−1を発現しているpCDNA3でトランスフェクトされた。トランスフェクションして3日後、細胞をプレートから除き、トランスフェクトされた遺伝子産物の発現を検出するため、α−CD40、α−CD40リガンド、α−LFA−3およびα−ICAM−1抗体を用いるFACS分析により分析した。
CD40、CD40リガンド、LFA−3およびICAM−1発現ベクターとgD遺伝子ワクチンの共注射がgDに対する全身的IgG応答に影響するかどうかを決定するため、DNA接種後の血清の100倍希釈液がELISAで試験された。マウスの各々の群(n=8)を共刺激分子遺伝子(40μg)を加えたgD DNAワクチン(60μg)で2回免疫した。2回目のDNA注射から2週間後にマウスから採血し、血清をgDとの反応のために1:100に希釈した。CD40またはCD40リガンドプラスミドDNA(マウス当たり40μg)を加えたgD DNAワクチン(マウス当たり60μg)の共注射は全体のIgGレベルにはほとんど影響しなかった。群当たり等しくプールした血清はELISA力価を決定するために連続的に希釈した。均等にプールされた第二の免疫感作2週間後のELISA力価もまた6,400(CD40)、6,400(CD40リガンド)および6,400(gDDNAワクチン単独)であることが決定された。これらの共刺激分子(マウス当たり40μg)を加えたgD DNAワクチン(マウス当たり10μg)で1回共注射して1ヶ月後に得られた血清を試験した場合にも同様の結果が得られた。
IgGサブクラスは誘導された免疫応答のTh1対Th2特性の指標を与える。CD40、CD40リガンド、LFA−3およびICAM−1での共注射により誘導されたIgGサブクラスを分析した。DNAベクターで免疫されたマウスにおけるgD特異的IgGアイソタイプレベルが測定された。マウスの各々の群(n=8)を共刺激分子遺伝子(40μg)かまたは接着分子遺伝子(40μg)を加えたgD DNAワクチン(60μg)で2回免疫した。2回目のDNA注射から2週間後にマウスから採血し、群当たり均等にプールした血清をgDとの反応のために1:100に希釈した。光学密度は405nmで測定された。CD40リガンド遺伝子での共注射はIgG1に対するgD特異的IgG2aの相対的産生を増加させたが、CD40遺伝子での共注射はgDDNAワクチン単独と類似のIgGアイソタイプパターンを示した。IgG産生におけるこの移行は、より高いTh1型応答はCD40リガンドDNAでの共注射でのみ誘導されることを示している。しかしながら、LFA−3の共注射は、gDDNAワクチン単独またはICAM−1共注射よりもIgG1およびIgG2aアイソタイプ両方を著しく高く増加させた。この増加はLFA−3cDNAでの共注射によりTh1およびTh2型応答の両方が誘導されたことを示している。
Tヘルパー細胞はAg刺激B細胞の増殖およびCD8+T細胞の増殖を経る各々体液性および細胞性免疫応答の惹起に重要な役割を果たしている。CD4活性化の特異的指標としてT細胞増殖が試験された。インビトロにおいて特異的抗原で刺激された場合、サイトカイン遺伝子による共免疫感作後に得られるT細胞の増殖レベルを測定することが重要である。gD−2タンパク質(1および5μg/ml)がT細胞の抗原特異的刺激に使用された。陽性対照として、5μg/ml PHAがポリクローナル刺激剤として使用された。陰性対照では低いバックグラウンドレベルのTh細胞増殖が観察された。しかしながら、gDDNAワクチン接種は陰性対照よりも高いTh細胞増殖応答を誘導した。CD40リガンドおよびLFA−3cDNAで共注射した場合、Th細胞増殖レベルはさらに後押しされた。しかしながら、CD40およびICAM−1が共注射された動物ではTh細胞応答の増加はほとんど検出されなかった。この傾向は試験された二つの異なった抗原濃度で観察され、この効果はCD40リガンドおよびLFA−3仲介であることを反映している。gDプラスミドワクチン接種は、Balb/cマウスにおけるCTLエピトープの欠損のためCTL応答を生じなかった。しかしながら、細胞性効果をより詳細に評価するため、サイトカイン産生プロフィールを次に試験した。
Th1サイトカイン(IL−2およびIFN−γ)およびTh2サイトカイン(IL−4、IL−5およびIL−10)は免疫応答偏向についての我々の理解における主な支えであってきた。Th1免疫応答は細胞免疫性の誘導を駆動すると考えられ、一方、Th2免疫応答は優先的に体液性免疫を駆動する。従って、共刺激分子とのまたはそれなしでのgDDNAワクチン接種がTh1またはTh2免疫応答を誘導するかどうかを試験した。共刺激分子または接着分子で共免疫されたマウスの脾臓細胞からのIL−2、IL−10、IFN−γ、RANTES、MIP−1αおよびMCP−1の産生レベルが測定された。マウスの各々の群(n=2)を共刺激分子遺伝子かまたは接着分子遺伝子(40μg)を加えたgD DNAワクチン(60μg)で0および2週目に免疫した。最後にDNA注射して2週間後、2匹のマウスを殺し、脾臓細胞をプールした。脾臓細胞は1μg/mlのgD−2タンパク質で2日間刺激した。IL−2およびIFN−γ産生はCD40リガンドcDNAの共注射により著しく促進されたが、IL−10産生はこの共注射で減少した。しかしながら、CD40にgD遺伝子を加えたものの共注射はこのアッセイにおいてIFN−γをわずかに増加させた。しかしながら、IL−2、IL−10およびIFN−γ産生がLFA−3 cDNAの共注射により、gDDNAワクチンよりも著しく高くすべて促進されたが、ICAM−1にgD遺伝子を加えた共注射はこのアッセイにおいてわずかな増強効果しか持っていなかった。このことはCD40リガンドはTh1表現型に対して免疫応答を駆動するが、LFA−3はインビボにおいてTh1およびTh2の両方に影響することを支持している。
RANTES(活性化が制御されている、正常T細胞から発現および分泌値される)、MIPマクロファージ炎症性タンパク質)−1αおよびMCP(単球走化性タンパク質)−1を含むベータケモカイン(CC型)は特に単球性食細胞を化学誘引し、T細胞、好塩基球、好酸球および単核食細胞ならびに他の可溶性免疫調節物質を活性化する。MCP−1と比較して、RANTESおよびMIP−1αはまた主HIV抑制因子であると報告されている。これらの分子は炎症性免疫応答の調節に重要であると考えられている。しかしながら、感染性疾患におけるそれらの直接的役割は研究中である。インビボにおけるケモカイン産生に対して、CD40、CD40リガンド、LFA−3およびICAM−1分子のワクチンアジュバントとしての関係は知られていない。CD40、CD40リガンド、LFA−3およびICAM−1cDNAを加えたgD DNAワクチンの共注射により誘導されるケモカイン(RANTES、MCP−1およびMIP−1α)のレベルが調べられた。gD DNAワクチン単独でRANTES、MCP−1およびMIP−1αの産生を抗原特異的様式で促進した。さらに、CD40リガンド cDNAの共注射はRANTESおよびMIP−1α産生をgD DNAワクチン単独よりも著しく高く促進した。対照的に、CD40分子の共注射はβ−ケモカイン産生に対してわずかな増強効果しか示さなかった。LFA−3cDNAの共注射はRANTESおよびMIP−1α産生をgD DNAワクチン単独よりも著しく高く促進したデータが得られた。同様に、RANTESおよびMIP−1αの産生はICAM−1共注射により促進された。対照的に、MCP−1産生はICAM−1共注射により阻害された。この調節は共刺激および接着分子はβケモカインファミリーの個々の構成物の産生に特異的効果を持つことができることを支持している。
HSV−2(186)の致死量(LD50)は以前に測定されている。gD DNAワクチンに分子アジュバントとしてCD40、CD40リガンド、LFA−3およびICAM−1 cDNAを使用するとHSV−2感染の保護に影響できるかどうかを決定するため、マウスをDNAワクチンおよび個々の共刺激および接着分子cDNAの両方で免疫し、続いて4LD50のHSV−2でi.vag.感染させた。膣内感染経路は、HSV−2が粘膜を通して感染し、泌尿性器感染を起こすので選択された。共刺激および接着分子遺伝子を加えたgDDNAワクチンを2倍量にして免疫したマウスの生存率が測定された。マウスの各々の群(n=10)を共刺激または接着分子遺伝子(40μg)を加えたgD DNAワクチン(10μg)で1回免疫した。DNA免疫感作4週間後、マウスを4LD50のHSV−2株186(1.4x104pfu)でi.vag.感染させた。マウスをgD DNAワクチンで免疫した場合、60%の生存が記録されたが、すべての天然のマウスはウイルス感染後13日以内に死亡した。CD40リガンドの共注射は生存率を100%に上げたが(保護率の40%の上昇)、CD40cDNAの共注射はgDDNAワクチン単独と比較して極微の保護効果しか示さなかった。さらに、LFA−3cDNAの共注射は生存率を90%に上げた。しかしながら、ICAM−1cDNAの共注射はHSV−2感染にわずかに良好な効果を示しただけであった。
抗原提示の間、APCの共刺激分子はT細胞応答の開始および分化に重要である。特に、CD40L−CD40相互作用はAPCからのB7およびIL−12発現を誘導する。IL−12はまたT細胞からのCD40リガンド発現を促進させるが、一方、IFN−γはCD40リガンド発現を阻害し、それらはT細胞上のCD40リガンド誘導の自己制御機構であるらしいことを示している。さらに、サイトカインIL−2およびIL−4もまた抗CD3刺激T細胞上のCD40リガンド発現を促進し、インビボでの免疫応答の仲介における共刺激分子およびサイトカイン間の協調制御が存在することを示している。さらに、CD40−CD40リガンド相互作用はTh細胞依存性抗体応答、前炎症性サイトカイン産生を増加させ、マクロファージの殺腫瘍性および殺微生物活性に必要とされる。特に、CD40リガンドは休止T細胞では発現されないが、CD3−TCRが引き金を引く過程により誘導される。CD40(45−50kD糖タンパク質)はTNFレセプタースーパーファミリーの構成物であり、B細胞、単球および樹状細胞上に発現される。しかしながら、そのリガンド、CD40リガンド(gp39)はTNF−αと配列相同性を持つタイプII膜内外タンパク質であり、活性化T細胞上に過渡的に発現される。接着分子の相互作用、T細胞上のLFA−3とAPC上のICAM−1、はICAM−1に高い親和性および結合活性を持つLFA−3のコンホメーション変化により高度に制御されている。CD3モノクローナル抗体またはクラスIIと抗原に関係したLFA−3の共刺激はT細胞増殖およびT細胞からの種々のサイトカインのより高い産生を生じることが知られている。さらに、LFA−3とICAM−1の相互作用はシグナル経路の引き金を引く。共刺激性CD40/CD40リガンド分子と比較して、これらの接着分子および抗CD3または抗TCR抗体の表面上での共局在化がT細胞への適切なシグナリングに必要とされる。
免疫表現型およびHSV−2による致死的感染に対する保護についてのケモカイン(IL−8、IP−10、RANTES、MCP−1およびMIP−1α)の調節効果が分析された。IL−8およびRANTES共注射は抗原特異的免疫応答および致死的HSV−2感染からの保護を劇的に促進した。しかしながら、IL−8およびIP−10による共注射は感染マウスの死亡率を増加させた。これらの研究は、保護的抗原特異的免疫性の発生に重要な役割を果たしているサイトカインをより思い出させる様式で、ケモカインが免疫応答を支配および駆動できることを示している。
Claims (12)
- 制御要素に作動可能なように連結された免疫原をコードしているヌクレオチド配列および制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含むプラスミドであって、免疫調節タンパク質がICAM−1であり、そして免疫原がHIV−1抗原または単純ヘルペス抗原である、プラスミド。
- 免疫原がHIV−1 ENV またはHIV−1 GAG/POL抗原である、請求項1に記載のプラスミド。
- 免疫原がHSV2gDである、請求項1に記載のプラスミド。
- 請求項1のプラスミドを含んでいる注射可能な医薬組成物。
- 免疫原に対して個体の免疫応答を誘導するために使用される、請求項1に記載のプラスミド。
- 単純ヘルペスウイルスまたはHIVの感染に対して個体を免疫するために使用される、請求項1に記載のプラスミド。
- 二つのプラスミドを含む組成物であって、
制御要素に作動可能なように連結された免疫原をコードしているヌクレオチド配列を含む第一のプラスミド;および
制御要素に作動可能なように連結された免疫調節タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む第二のプラスミドであって、免疫調節タンパク質がICAM−1であり、そして免疫原がHIV−1抗原または単純ヘルペス抗原である、前記第二のプラスミド
を含む、前記組成物。 - 免疫原がHIV−1 ENV またはHIV−1 GAG/POL抗原である、請求項7に記載の組成物。
- 免疫原がHSV2gDである、請求項7に記載の組成物。
- 請求項7に記載の組成物を含んでいる注射可能な医薬組成物。
- 免疫原に対して個体の免疫応答を誘導するために使用される、請求項7に記載の組成物。
- 単純ヘルペスウイルスまたはHIVの感染に対して個体を免疫するために使用される、請求項7に記載の組成物。
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