KR20090086452A

KR20090086452A - 백신 및 이를 이용한 면역제 치료법

Info

Publication number: KR20090086452A
Application number: KR1020097013558A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 비. 웨이너; 신정임
Original assignee: 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
Priority date: 2000-05-12
Filing date: 2001-05-14
Publication date: 2009-08-12
Also published as: IL152808A0; CN1287850C; US20040223974A1; WO2001087066A1; KR20030016260A; AU6159001A; JP2004515213A; EP1280406A1; BR0110791A; EP1280406A4; CA2408403A1; KR20080067718A; MXPA02011191A; CN1431864A

Abstract

본 발명은 분리된 RANTES 단백질, 및/또는 분리된 IL-8 단백질과 함께 RANTES 단백질을 암호화하는 핵산분자, 및/또는 IL-8 단백질을 암호화하는 핵산분자, 및 선택적으로 면역원, 및/또는 면역원을 암호화하는 핵산분자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 면역원에 대해서 개체내에서 면역반응을 유도하는 방법은 분리된 RANTES 단백질, 및/또는 분리된 IL-8 단백질과 함께 RANTES 단백질을 암호화하는 핵산분자, 및/또는 IL-8 단백질을 암호화하는 핵산분자, 및 부가적으로 표적 단백질, 및/또는 표적 단백질을 암호화하는 핵산분자를 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 분리된 RANTES 단백질, 및/또는 분리된 IL-8 단백질과 함께 RANTES 단백질을 암호화하는 핵산분자, 및/또는 IL-8 단백질을 암호화하는 핵산분자를 개체에 투여하는 개체의 면역시스템을 조절하는 방법도 포함한다. 또한 본 발명은 IL-8을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 RANTES를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합형 백신인, 살아있는 약독성 병원균 및 이를 이용한 면역치료법도 포함한다.

유전 구조물, 백신, RANTES 단백질, IL-8 단백질, 케모킨, 상호주입, 면역반응, 면역 조절, DNA 벡터, 표적 단백질, 헤르페스 심플렉스 바이러스 항원.

Description

백신 및 이를 이용한 면역제 치료법{Vaccines, Immunotherapeutics and Methods for Using the Same}

제1도는 실시예에서 기술된 실험에서 DNA 벡터로 면역된 Balb/c 생쥐의 gD 특이적인 시스템의 레벨을 보여준다. 생쥐의 각 그룹(n=10)은 0과 2주에 gD DNA 백신(생쥐 한 마리당 60μg)에 케모킨 유전자(chemokine gene)(생쥐 한 마리당 40μg)또는 TNF 유전자(생쥐 한 마리당 40μg)을 첨가하여 면역되었다. 생쥐들은 2주째에 두 번째로 면역된 후 피를 뽑고 각 그룹 당 동등하게 모은 혈청은 gD와 반응을 위해 순차적으로 희석되었다. ELISA 역가는 가장 높은 혈청 희석의 역수로 결정된다. 상기의 역가는 자연의 생쥐에서 얻은 혈청과 같은 광학 밀도(optical density)를 보여준다. 흡광도(O.D)는 405nm에서 측정되었다.

제2A도와 제2B도는 실시예의 실험에서 DNA 벡터에 의해 면역된 Balb/c 생쥐에서 IgG 부군(subclass)의 레벨을 보여준다. 제2A도에서, 생쥐(n=10)의 각 그룹은 0주와 2주에 gD DNA 백신(생쥐 한 마리당 60μg)에 케모킨 유전자(chemokine gene)(생쥐 한 마리당 40μg) 또는 TNF 유전자(생쥐 한 마리당 40μg)를 첨가한 것에 의해 면역되었다. 생쥐가 2주에 마지막으로 면역된 후에 피를 뽑고 혈청은 gD와의 반응을 위해 1:100으로 희석되었다. 흡광도(O.D.)는 약 405nm에서 측정되었다. 상대적인 광학 밀도(optical density)는 각 IgG 부군(subclass)/전체 광학밀도의 광학밀도로서 계산되었다. 선 막대(line bar)는 각 생쥐 IgG 부군의 상대적인 광학밀도의 평균(n=10)을 나타낸다. 제2B도는 IgG2a에서 IgG1의 상대적인 비율을 나타낸다. 평균(n=10) IgG2a 레벨은 각 면역집단에서 평균 IgG1 레벨에 의해 나뉘어졌다. *Student's t 테스트를 이용하여 통계학적으로 중요한 P<0.05에서 각 대응하는 gD DNA 백신의 아이소타이프(isotype)만을 비교하였다.

제3A도, 제3B도, 제3C도는 실시예의 실험에서 α케모킨 cDNA(α chemokine cDNA)(제3A도), β케모킨 cDNA(제3B도), TNF 대조구(TNF controls)로 함께 면역시켜준 Balb/c 생쥐에 생체 밖 조건에서 gD 자극을 준 후의 비장세포(splenocyte)의 Th세포 증식 레벨을 보여준다. 각 생쥐(n=2)그룹은 0주와 2주에 gD DNA 백신(생쥐 한 마리당 60μg)에 케모킨 유전자(생쥐 한 마리당 40μg)나 TNF 유전자(생쥐 한 마리당 40μg)를 첨가한 것으로 면역시켜 주었다. 마지막으로 DNA 주입하고 2주 후에, 생쥐 두 마리를 죽여서 증식의 분석을 위해 비장 세포(spleen cells)를 모았다.

양성의 대조구(positive control)로서 비장세포(spleenocyte)는 ml당 1과 5μg의 gD-2 단백질과 ml당 PHA 5μg으로 자극을 주었다. 자극을 준 후 3일 후에, 세포들은 수집되고 cpm이 계산되었다. 샘플은 3개로서 분석이 되었다. 도면들은 비슷한 결과를 보이는 세 개의 각 실험의 결과 중 하나를 나타낸다. PHA 대조 실험 샘플은 40∼50의 자극 지수(stimulation index)를 보였다. *Student's t 테스트를 이용하여 통계학적으로 중요한 P<0.05에서 gD DNA 백신만을 비교하였다.

제4A도, 제4B도, 제4C도는 실시예의 실험에서 gD DNA 백신에 α케모킨 cDNA(제4A도), β케모킨 cDNA (제4B도) 및 TNF 대조구(제4C도)를 첨가한 것으로 면역시킨 Balb/c 생쥐의 생존율을 나타낸다. 각 생쥐 그룹(n=8)은 0주와 2주에 gD DNA 백신(생쥐 한 마리당 60μg)에 케모킨 유전자(chemokine gene)(생쥐 한 마리당 40μg)또는 TNF 유전자(생쥐 한 마리당 40μg)를 첨가한 것으로 면역되었다. 두 번째 면역을 하고 3주 후에, HSV-2 strain 186(7×10⁵ PFU)의 200 LD₅₀과함께 생쥐들의i. vag. 면역성 테스트를 하였다. 생쥐들은 그리고 나서 매일 생존율이 평가되었다. 바이러스 면역성 테스트(viral challenge) 후에 61일 동안 생존한 생쥐들을 세었다. 상기의 과정은 예상된 결과와 함께 한번 반복되었다.

제5도는 실시예의 실험에서 케모킨을 같이 주입하는 것 사이의 보호 율(protection rate)의 차이를 보여준다. 삽입구(parentheses)의 수는 생존 동물의 수/전체 실험 수이다.

발명의 분야

본 발명은 개선된 백신, 면역원에 대해서 개체에 예방적으로 그리고/또는 치료적으로 면역성을 주도록 하는 개선된 방법, 그리고 개선된 면역제 치료 조성물과 개선된 면역요법에 관한 것이다.

발명의 배경

면역요법(immunotherapy)은 바람직한 치료 효과를 주어 사람의 면역 반응을 조절하는 것을 이른다. 면역 치료제(immunotherapeutics)는 개체에 투여하였을 때 개체의 면역 시스템을 충분히 조절하여 바람직하지 않은 면역반응과 관련된 증상을 궁극적으로 감소시키기나 바람직한 면역 반응을 증가시킴으로써 증상을 궁극적으로 감소시키는 합성물을 이른다.

어떤 경우에, 면역요법(immunotherapy)은 개체가 면역반응을 일으키는 면역원에 노출시키는 하는 백신을 개체가 투여받는 백신 프로토콜의 일부분이다. 상기의 경우, 면역치료제는 특정한 조건, 감염 또는 질병을 치료하거나 방지하도록 면역 반응을 증가시키고 또는 선택적으로 세포성지류(cellualr arm)나 체액성 지류(humoral arm)와 같은 면역반응의 일부를 향상시킨다.

어떤 경우에, 면역치료제는 면역원이 없이 실행된다. 상기의 경우, 면역치료제는 면역 반응을 감소시키거나 억제함으로써, 면역반응을 강화시키거나 증가시킴으로써, 면역시스템의 일부를 감소시키거나 억제함으로써 또는 면역 시스템의 일부를 강화시키거나 증가시킴으로써 면역 시스템을 조절하기 위해 제공된다.

어떤 경우에, 면역치료제는 생체 내에서 투여되었을 때 단백질과 결합하여 면역반응의 조절에 관계되는 항체를 포함한다. 면역반응의 조절에 관계된 항체와 단백질 사이의 상호작용 개체 내에서 면역반응의 변경을 초래한다. 예를 들어, 단백질이 자가면역 질병(autoimmune disease)에 관계되면 항체는 반응 또는 질병을 감소시키거나 제거하는 역할을 하여 그 단백질의 활성을 저해할 수 있다.

백신은 알레르겐(allergen), 병원체 항원(pathogen antigen) 또는 인간의 질병에 포함된 세포와 관계된 항원과 같은 표적 항원(target antigen)에 대해 개체를 면역시키는데 유용하다. 인간의 질병에 포함된 세포와 관계된 항원은 암과 관련된 종양 항원(tumor antigen)과 자가면역 질병에 포함된 세포와 관계된 항원을 포함한다.

상기의 백신을 만드는 데 있어서 백신 접종을 받은 개체의 세포에서 표적 항원(target antigen)을 만들어내는 백신이 면역반응의 세포성 지류(cellular arm)를 유도하는데 효과적이라는 점이 알려져 왔다. 구체적으로는, 약독화 생백신(live attenuated vaccine), 독성이 없는 벡터를 이용하는 재조합 백신 그리고 DNA백신은 백신접종을 받은 개체의 세포 내에서 면역시스템의 세포성 지류(cellualr arm)를 유도하는 항원을 만들어 내도록 한다. 반면에 사멸되거나 비활성화된 백신(killed or inactivated vaccine)과 단지 단백질로만 구성된 부단위 백신(sub-unit vaccine)은 체액성 반응(humoral response)을 유도하지만 효과적인 세포성 면역 반응(cellular immune response)을 유도하지 않는다.

세포성 면역반응은 종종 병원체 감염에 대한 보호를 제공하고 병원체 감염, 암 또는 자가면역 질병에 대한 효과적인 면역조절 치료법을 제공한다. 따라서, 약독화 생백신(live attenutated vaccine), 독성이 없는 벡터를 사용하는 재조합 백신(recombinant vaccine) 그리고 DNA 백신과 같이 백신 접종된 개체의 세포내에서 표적 항원을 생산하는 백신은 종종 선호된다.

상기의 백신은 종종 병원체 감염이나 인간 질병에 대해 예방적으로나 치료적으로 개체에 면역성을 부여하는데 효과적인 한편 그에 따라 개선된 백신이 요구된다. 강화된 면역 반응을 만들어내는 조성물과 방법이 요구된다.

마찬가지로, 어떠한 면역치료제는 환자의 면역반응을 조절하는데 유용한 한편, 개선된 합성물과 방법에 대한 요구가 남게 된다.

본 발명의 목적은 개선된 백신, 면역원에 대해서 개체에 주사할 수 있는 개선된 면역제 치료조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명은 개선된 백신, 면역원에 대해서 개체에 예방적으로 치료적으로 면역성을 주도록 하는 개선된 방법, 그리고 개선된 면역요법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합 백신을 개체에게 투여하여 면역원에 대한 개체의 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 개체의 면역 시스템을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기 및 기타 목적들은 하기 설명되는 본 발명에 의하여 모두 달성될 수 있다.

발명의 요약

본 발명은 분리된 RANTES 단백질 및/또는 RANTES 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 분리된 IL-8 단백질과/또는 IL-8 단백질을 코딩하는 핵산분자의 결합에 의해 구성된 혼합물에 관계된 것이다.

나아가 본 발명은 분리된 RANTES 단백질 및/또는 RANTES 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 분리된 IL-8 단백질 및/또는 IL-8단백질을 코딩하는 핵산 분자의 결합에 의해 구성되고 더 나아가 표적 단백질 및/또는 표적 단백질을 코딩하는 핵산분자까지도 포함하는 혼합물에 관계된 것이다.

본 발명은 분리된 RANTES 단백질 및/또는 RANTES 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 IL-8 단백질 및/또는 IL-8단백질을 코딩하는 핵산 분자의 결합으로 구성된 주사할 수 있는(injectable) 제약 조성물(pharmaceutical composition)에 관계된 것이다.

본 발명은 분리된 RANTES 단백질 및/또는 RANTES 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 분리된 IL-8 단백질 및/또는 IL-8 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 결합, 더 나아가 표적 단백질 및/또는 표적 단백질을 코딩하는 핵산 분자까지 포함하는 주사할 수 있는 제약 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 나아가 개체의 면역원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관계된 것이다. 상기의 방법은 분리된 RANTES 단백질 및/또는 RANTES 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 분리된 IL-8 단백질 및/또는 IL-8 단백질을 코딩하는 핵산분자 그리고 부가적으로 표적 단백질 및/또는 표적 단백질을 코딩하는 핵산분자의 결합에 의해 구성된 혼합물을 개체에 투여하는 것으로서 구성된다.

본 발명은 나아가 개체의 면역 시스템을 조절하는 방법에 관계된 것이다. 상기의 방법은 분리된 RANTES 단백질 및/또는 RANTES 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 분리된 IL-8 단백질 및/또는 IL-8 단백질을 코딩하는 핵산분자의 결합물을 개체에게 투여하는 것으로서 구성된다.

본 발명은 나아가 조절 인자(regulatory element), IL-8을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(nucleotide sequence) 그리고 RANTES를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 시술가능하도록 연결된 면역원을 코딩하는 재조합 백신 및 상기의 재조합 백신을 개체에게 투여하는 방법으로 구성된 면역원에 대한 개체의 면역 반응을 유도하는 방법에 관계된 것이다.

본 발명은 나아가 IL-8을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 RANTES를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 살아있는 약독성 병원체(live attenuated pathogen) 및 살아있는 약독성 병원체를 개체에게 투여하여 병원체에 대한 개체의 면역 반응을 유도하는 방법에 관계된 것이다.

발명의 상세한 설명

이하에서 이용되는 바와 같이 "면역조절 단백질(immunomodulating protein)"은 RANTES 단백질과 IL-8 단백질을 의미한다.

이하에서 이용된 단어 "표적 단백질(target protein)"은 면역 반응에 표적 단백질로서 작용하는 본 발명의 유전자 구성체에 의해 코딩된 펩티드(peptide)와 단백질을 의미한다. 용어 "표적 단백질"과 "면역원(immunogen)"은 교환 가능하게 이용되었고, 면역 반응이 유도될 수 있게 하는 단백질을 말한다. 표적 단백질은 병원체 또는 암 세포나 면역 반응이 필요한 자가면역 질병에 관계된 세포와 같이 바람직하지 않은 세포 타입으로부터의 단백질과 하나 이상의 에피토프(epitope)를 공유하는 면역성의 단백질이다. 표적 단백질에 대한 면역반응은 표적 단백질이 관련된 특이적인 감염이나 질병에 대해 개체를 보호하거나 개체를 치료할 것이다.

이하에서 이용되는 바와 같이 "유전자 구성물(genetic construct)"이라는 용어는 표적 단백질이나 면역조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티트 서열로 구성되는 DNA 또는 RNA 분자를 말한다. 코딩 서열은 핵산 분자가 투여된 개체의 세포 안에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터와 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 신호를 포함하는 조절 인자(regulatory element)에 시술할 수 있도록(operably) 연결된 개시와 종결 신호(signal)를 포함한다.

이하에서 이용되는 바와 같이, "발현형(expressible form)"이라는 용어는 표적 단백질이나 면역조절 단백질을 코딩하는 코딩 서열에 실시 가능하도록 연결된 필수적인 조절인자를 포함하는 유전자 구성물을 말한다. 상기의 발현형이 개체의 세포 안에 존재할 때 코딩 서열은 발현될 것이다.

이하에서 이용되는 바와 같이, "에피토프를 공유한다(sharing an epiope)"는 용어는 다른 단백질의 에피토프와 같거나 실질적으로 비슷한 에피토프를 적어도 하나 이상 가지는 것을 말한다.

이하에서 이용되는 바와 같이, "실질적으로 비슷한 에피토프(substantially similar epitope)"라는 용어는 단백질의 에피토프와 같지는 않지만 그럼에도 불구하고 상기의 단백질과 교차반응(cross react)하는 세포성 또는 체액성 면역 반응을 불러일으키는 구조를 가진 에피토프를 의미한다.

이하에서 이용되는 바와 같이, "세포내의 병원체(intracellular pathogen)"라는 용어는 적어도 그것의 생활사의 일부가 숙주세포 내에서 존재하고 그 안에서 병원성 단백질을 생산하거나 생산되게 하는 바이러스나 병원성을 가진 생물체를 말한다.

이하에서 이용되는 바와 같이, "과증식성 질병(hyperproliferative disease)이라는 용어는 세포의 과다한 증식에 의해 특징지워지는 질병을 말한다.

이하에서 사용되는 바와 같이, "과증식성 관련 단백질(hyperproliferative-associated protein)"은 과증식성 질병과 관계있는 단백질을 말한다.

본 발명은 IL-8과 RANTES의 결합이 면역반응을 조절한다는 발견으로부터 시작되었다. 따라서, 상기의 단백질 및/또는 상기의 단백질들을 코딩하는 핵산 분자의 합성물은 면역치료제로서 또는 백신과 결합하거나 백신의 구성요소로서 이용될 수 있다. RANTES와 IL-8의 결합물이 백신의 일부로서 투여되었을 때 항원 특이적인 Th1 타입 면역반응을 이끌어내고 방어 면역을 강화시키는 것이 발견되어왔다.

CTL 반응을 유도하고 강화시키는 면역조절 단백질은 세포 내 병원체에 대한 백신의 일부 또는 자가면역 질병이나 암과 관계된 세포에 대한 백신의 일부로 투여되거나 함께 투여되는 때에 특히 유용하다. CTL 반응을 유도하고 강화시키는 면역 조절 단백질은 약독화 생백신(live attenuated vaccine), 세포 백신, 재조합 백신, 핵산/DNA 백신과 함께 투여되었을 때 특히 유용하다. 양자택일적으로, CTL 반응을 유도하고 강화시키는 면역조절 단백질은 암이나 세포 내 감염을 앓고 있는 환자에 투여되는 면역치료제로 유용하다. CTL 반응을 유도하고 강화시키는 면역조절 단백질은 면역력이 저하된(immunocompromised) 환자에 투여되었을 때 유용하다.

T세포 증식 반응을 유도하고 강화시키는 면역조절 단백질은 백신과 결합하거나 백신의 일부로 투여되는 경우 특히 유용하다. 양자택일적으로, T 세포의 증식반응을 유도하고 강화시키는 면역조절 단백질은 면역치료제로서 유용하다. T 세포의 증식반응을 유도하고 강화시키는 면역조절 단백질은 면역력이 저하된(immunocompromised) 환자에 투여되었을 때 유용하다.

RANTES의 뉴클레오티드와 아미노산 서열에 대한 GENBANK 접근 번호(accession number)는 M21121이고 이하에서 참고문헌으로 삽입된다. RANTES는 이하에서 참고문헌으로 삽입된 Schall, T.J., et al, J. Immunol. 141, 1018-1025(1988)에서 기술된다.

*IL-8의 뉴클레오티드와 아미노산 서열에 대한 GENBANK 접근 번호(accession number)는 M28130이고 이하에서 참고문헌으로 삽입된다. IL-8은 이하에서 참고문헌으로 삽입된 Mukaida, N., et al., J. Immunol. 143(4), 1366-1371(1989)에 기술되어 있다.

본 발명의 일부 구체예에 따라, IL-8과 RANTES의 결합이 환자에게 개개체의 면역 시스템의 활성을 조절하도록 투여되었다. IL-8과 RANTES 각각 독립적으로 단 백질의 형태로 직접 투여되고 또는 개체에서 발현되기 위하여 필수적인 조절 요소(regulatory element)에 실시 가능하도록 연결된 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 핵산 분자의 형태로 투여될 수 있다. 핵산 분자가 개체의 세포에 의해 흡수되면, 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 세포 내에서 발현되고 그리하여 단백질은 개체에게 전달된(delivered) 것이다. 본 발명은 IL-8 단백질과/또는 IL-8을 코딩하는 핵산 분자를 RANTES 단백질과/또는 RANTES를 코딩하는 핵산 분자와 결합하여 투여하는 방법과 상기의 투여를 위한 혼합물을 제공한다. 따라서, 본 발명의 일부의 구체예는 RANTES 단백질 및/또는 RANTES를 코딩하는 핵산 분자와 IL-8 단백질 및/또는 IL-8을 코딩하는 핵산 분자로 구성된 결합물과 관계된다. 일부의 구체예에 다르면, 혼합물은 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택된 조합(combination)을 구성한다.: 1) RANTES 단백질과 IL-8 단백질; 2) RANTES 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 IL-8 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 3) RANTES 단백질과 IL-8 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 4) IL-8 단백질과 RANTES 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 5) RANTES 단백질, IL-8 단백질, IL-8 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 6) RANTES 단백질과 IL-8 단백질과 RANTES 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 7) RANTES 단백질과 RANTES 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 IL-8 단백질을 코딩하는 핵산분자; 8) IL-8 단백질과/또는 RANTES 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 IL-8 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 그리고 9) RANTES 단백질과 RANTES 단백질을 코딩하는 핵산분자와 IL-8 단백질과 IL-8 단백질을 코딩하는 핵산 분자

본 발명의 일부 구체예에 따르면, 개체의 면역 시스템의 활성을 조절하기 위 해 개체에게 전달되는 IL-8과 RANTES의 결합물은 백신과 함께 투여된다. 본 발명의 일부에 따르면, 상기의 혼합물과 방법은 예방적으로 그리고/또는 치료학적으로 개체를 병원체 또는 비정상적인 질병관련 세포에 대해 면역시킨다. IL-8과 RANTES는 각각 독립적으로 단백질의 형태로 직접 전달되고 또는 개체에서 발현되는 데에 필수적인 조절 인자에 작동가능하게 연결된 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산 분자의 형태로 투여될 수 있다. 핵산 분자가 개체의 세포에 의해 흡수되면, 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 세포 내에서 발현되고 그것에 의하여 단백질이 개체에게 도달된다. 백신은 예를 들어, 단백질 백신이나 그 서브유니트(subunit), 사멸되거나 비활성화된 백신, 약독화 생백신(live attenuated vaccine), 세포 백신, 재조합 백신 또는 핵산이나 DNA 백신과 같은 어떠한 타입일 수도 있다. 약독화 생백신(live attenuated vaccine), 세포백신, 재조합 백신 또는 핵산이나 DNA 백신의 경우, RANTES 단백질 및/또는 IL-8 단백질은 상기의 백신의 핵산 분자에 의해 코딩될 수 있다. RANTES 단백질 및/또는 RANTES 단백질을 코딩하는 핵산분자와 공동으로 IL-8 단백질 및/또는 IL-8 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 도입에 의해, 특히 세포성 지류(cellualr arm)을 강화시킴으로써 백신에 의해 유도되는 면역반응이 조절될 수 있다. 일부 구체예에 따르면, 혼합물은 단백질 백신 및/또는 사멸된 백신 및/또는 비활성화된 백신 및/또는 약독화 생백신(live attenuated vaccine) 및/또는 재조합 백신 및/또는 DNA 백신이 다음과 같이 구성되는 그룹으로부터 선택된 조합과 공동으로 그리고/또는 그렇지 않으면 포함하여 구성된다.: 1) RANTES 단백질과 IL-8 단백질; 2) RANTES 단백질을 코딩하는 핵산 분 자와 IL-8 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 3) RANTES 단백질과 IL-8 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 4) IL-8 단백질과 RANTES 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 5) RANTES 단백질, IL-8 단백질, IL-8 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 6) RANTES 단백질과 IL-8 단백질과 RANTES 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 7) RANTES 단백질과 RANTES 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 IL-8 단백질을 코딩하는 핵산분자; 8) IL-8 단백질과/또는RANTES 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 IL-8 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 그리고 9) RANTES 단백질과 RANTES 단백질을 코딩하는 핵산분자와 IL-8 단백질과 IL-8 단백질을 코딩하는 핵산 분자.

다음은 단백질 형태로서 면역 조절 단백질의 준비와 투여에 대한 설명 및 면역조절 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 준비와 투여에 대한 설명이다. 이하에서 서술되는 바와 같이, 본 발명의 혼합물과 방법은 단지 단백질만을 포함하는 혼합물과 방법과 단지 핵산만을 포함하는 혼합물과 방법뿐만 아니라 단백질과 핵산의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 이하의 설명서(description set)는 단백질과 핵산의 조합의 이용을 포함하는 혼합물과 방법을 포함하도록 계획된다.

상기의 설명과 같이, RANTES 단백질과/또는 IL-8 단백질은 면역 반응을 조절하기 위해 면역치료법과/또는 백신 프로토콜의 일부로서 투여될 수 있다. 면역조절 단백질은 재조합 방법론에 의해 표준 단백질 합성 테크닉으로 합성되거나 천연 원료로부터 분리되고 정제되어 준비될 수 있다. 단백질에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)는 분리와 정제 과정에서 발생되고 이용될 수 있다. 상기의 단백질을 코딩하는 cDNA는 분리되고, 서열되고, 숙주세포에 들어가서 단백질을 재조합적으로 발현시키는 발현 벡터를 포함하는 벡터에 삽입되어 왔다.

면역조절 단백질들 중 어느 것을 코딩하는 분리된 cDNA는 면역 조절 단백질을 만들어낼 수 있는 재조합 발현 벡터의 구성에서 개시 물질(starting material)로서 유용하다. cDNA는 숙주세포에 도입되는 발현 벡터를 포함하는 벡터에 삽입되고 단백질을 재조합적으로 발현시킨다. 표준 테크닉과 즉시 이용 가능한 개시 물질을 이용하여 면역조절 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 준비될 수 있다. 핵산분자는 숙주세포로 삽입되는 발현벡터에 삽입될 수 있다. 단백질의 생산을 위한 주지의 재조합 발현 시스템에서 이용되는 숙주세포는 주지되어 있고 즉시 이용이 가능하다. 숙주 세포로는 E.coli와 같은 박테리아 세포, S. cerevisiae와 같은 효모 세포, S. frugiperda와 같은 곤충 세포, 사람이 아닌 포유류 조직 배양 세포 CHO(chinese hamster ovary)세포와 HeLa 세포와 같은 사람 조직 배양세포가 있다.

일부의 구체예에서, 예를 들어, 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 주지의 기술을 이용하여 DNA 분자를 주지의 발현 시스템에 이용되는 상업적으로 이용 가능한 발현 벡터에 삽입한다. 예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 플라스미드 pSE420 (Invitrogen, San Diego, CA)는 E. coli에서 면역조절 단백질의 생산에 이용될 수 있다. 예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 플라스미드 pYES2 (Invitrogen, San Diego, CA)는 효모의 S. cerevisiae 계열(strain)에서의 생산에서 이용될 수 있다. 예를 들어, baculovirus 발현시스템(Invitrogen, San Diego, CA)을 완성하는 상업적으로 이용 가능한 MAXBAC^TM은 곤충 세포에서의 생산을 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 플라스미드 pcDNA I 또는 pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA)는 Chinese Hamster Overy 세포와 같은 포유류 세포에서의 생산에 이용될 수 있다. 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 통상의 기술과 즉시 이용 가능한 개시 물질로 상기의 상업적인 발현 벡터와 시스템이나 면역조절 단백질을 생산하는 다른 것들을 이용할 수 있다.(예를 들어, 이하에서 참고문헌으로 삽입된 Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press(1989)를 참고할 것) 상기와 같이 의도하였던 단백질은 원핵세포(prokaryotic)와 진핵세포(eukaryotic) 시스템 양자 모두에 의해 준비될 수 있고 ,단백질의 형성 과정의 스펙트럼이 결과적으로 생긴다.

기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 다른 상업적으로 이용 가능한 발현 벡터와 시스템을 이용할 수 있거나 즉시 이용 가능한 개시물질과 주지의 방법을 이용해 벡터를 만들어 낼 수 있다. 필수적인 콘트롤 서열(control sequence)를 포함하는 발현 시스템, 예를 들어, 프로모터와 폴리아데닐레이션 신호(polyadenylation signals) 그리고 바람직한 인핸서(enhancer) 등은 즉시 이용가능하고 숙주의 다양성에 따라 기술분야에서 주지되어 있다. 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press(1989)를 참고할 것.

면역 조절 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 발현 벡터(expression vector)는 적합한 호스트를 변형하는 데에 사용되며, 외부 DNA 의 발현이 일어난 조건하에서 배양되고 유지된다. 이렇게 만들어진 본 발명에 따른 단백질은 당해 발 명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려진 방법으로 세포를 용해하거나 배양 매개체를 용해하거나 하여 배양액으로부터 수거된다. 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가지는 자는 상기와 같은 배열 시스템을 이용하여 만들어진 면역 조절 단백질을 분리해 낼 수 있다. 항체(antibody)를 이용하여 자연 공급원으로부터 단백질을 정제하는 방법은 재조합 DNA 방법에 의하여 만들어진 단백질을 정제하는 데에도 동일하게 적용된다.

면역 조절 단백질은 약제 조성물로 만들어질 수 있다. 적절한 약제 운반체(pharmaceutical carriers)로는 당해 발명이 속하는 분야에서 기본적인 텍스트인 Remington's Pharmaceutical Science(A. Osol 저)에 나타나 있으며 이하 본 발명에 참고자료로 사용된다. 본 발명의 약제 조성물은 활성제(active agent)를 표적 세포에 도달하게끔 하여주는 여하한 수단을 이용할 수 있다. 펩티드가 구강을 통하여 주입될 경우에는 소화되기 때문에 흡수를 최대화하기 위하여 비경구적인 주입(parenteral administration), 예를 들어, 정맥(intravenous) 주입, 피하(subcutaneous) 주입, 경피(transdermal) 주입, 근육(intramuscular) 주입 등이 일반적으로 이용된다. 정맥 주입에는 주입 펌프를 이용할 수 있다. 본 발명의 약제 조성물은 에멀젼(emulsion) 형태로 만들어질 수 있다. 또한, 상기 약제 조성물은 비강 주입용 또는 흡입 주입용 에어로졸 약제로 만들어지는 것으로 대체될 수도 있다.

주입량은 약제 동력학(pharmacodynamic)적인 특성; 주입 형태 및 주입 경로; 수령자의 나이, 건강상태 그리고 몸무게; 증후의 성질과 정도; 동시 처방의 종류; 그리고 처방의 빈도 등과 같은 요인에 따라 변화된다. 일반적으로, 단백질 주입량은 몸무게 50 kg 당 약 1∼3,000 mg 정도일 수 있다; 바람직하게는 몸무게 50 kg 당 25∼800 mg을 주입한다. 일반적으로 하루에 8∼800 mg을 1∼6 회로 나누어서 투여하거나 또는 연속적으로 투여하게 되면 효과적으로 원하는 결과를 얻을 수 있게 된다. 국부 주입을 위한 제제는 경피용 패치(transdermal parches), 연고, 로션, 크림, 젤, 물약, 좌약, 스프레이, 액체 그리고 분말 등의 형태를 포함한다. 종래의 약제 운반체, 액체 또는 분말 또는 오일 형태의 기저(base), 농축제 등을 사용하는 것이 필요하거나 바람직하다. 구강 투여를 위한 제제는 분말, 과립, 물 또는 물 이외의 용매 상의 서스펜션 또는 용액, 캡슐, 알약 등의 형태를 포함한다. 농축제, 향제, 희석제, 에멀젼화제(emulsifiers), 분산 촉진제 또는 결합제 등을 사용하는 것이 바람직하다. 비경구용, 정맥용, 포막용 또는 심실용 주입을 위한 조성물은 무균의 수용액을 포함할 수 있는데, 이 수용액은 완충제, 희석제, 또는 다른 적절한 추가제를 포함하고, 바람직하게는 무균 상태이며 발열원이 없는 것이다. 본 발명에 따른 정맥용 투입에 적절한 약제 조성물은 무균 상태이어야 하고 발열원을 포함치 않아야 한다.

비경구용 투여를 위해, 단백질은, 예를 들어, 용액, 서스펜션, 에멀젼 또는 약학적으로 비경구용 전달에 적합한 벡터와 결합되어 있는 건조 분말 등의 형태일 수 있다. 상기 벡터의 예로는 물, 소금, 링거액, 덱스트로스 용액, 그리고 5 %의 인체 세륨 알부민 등이 있다. 리포좀 및 오일과 같은 비수용액상의 벡터 등도 사용될 수 있다. 벡터 또는 건조 분말은 염화나트륨이나 만니톨(mannitol)과 같은 등장 성(isotonicity)을 유지시켜주는 추가적인 제제 또는 완충제와 유지제 같은 화학적 안정성을 유지시켜주는 추가적인 제제를 포함할 수 있다. 제제는 통상적인 기술로 살균될 수 있다. 예를 들어, 주사에 의한 주입에 적절한 비경구용 조성물은 0.9 % 염화나트륨 수용액에 1.5 중량%의 활성제제를 녹여 만들 수 있다.

본 발명에 따른 약제 조성물은 활성제(active agent)를 포유류 몸체 내에서 활성제의 활성 부위에 도달하게끔 하여주는 여하한 수단을 이용할 수 있다. 본 발명에 따른 약제 조성물은 국부적인 또는 전체 구조적인 처방이 요구되는 지에 따라서 그리고 처방이 요구되는 부위에 따라서 수많은 방법들이 사용될 수 있다. 주입은 국부적(눈, 질, 직장, 비강, 피부를 포함)이거나, 구강을 통하거나 또는 비경구에 의해 이루어질 수 있다. 비경구용 주입에는 정맥 주입, 피하 주입, 복막 또는 근육 주입, 흡입을 통한 폐 주입, 포막 또는 심실 주입 등을 포함한다.

본 발명의 일부 구체예에서, IL-8 그리고/또는 RANTES 단백질은 핵산 분자를 주입함으로써 전달되는데, 이러한 핵산 분자는 상기 핵산 분자가 세포에 투입되었을 때에 단백질을 형성하도록 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스로 이루어진다. IL-8 그리고 RANTES 단백질 각각이 단백질 그 자체를 주입함으로써 전달되는 본 발명의 구체예에 따라, 일부 구체예는 단백질 그 자체를 전달하는 대신에 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 전달하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 두 단백질 모두를 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스들은 단일 핵산 분자 위에 형성될 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물들은 두 개의 핵산 분자로 이루어지는데, 한 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스들은 한 핵산 분자 위에 형성되고, 다른 단 백질을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스들은 다른 핵산 분자 위에 형성된다. 일부 구체예에서, 조성물들은 두 개의 핵산 분자로 이루어지는데, 한 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스들은 한 핵산 분자 위에 형성되고, 두 단백질 모두를 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스들은 다른 핵산 분자 위에 형성된다.

본 발명은 나아가 면역 조절 단백질을 전달하기 위한 조성물 및 그 이용방법과 관련된다. 본 발명은 조절인자들에 작동되도록 연결되는 IL-8을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스 그리고/또는 조절인자들에 작동되도록 연결되는 RANTES를 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스로 이루어지는 핵산 분자와 관련된다. 본 발명은 나아가 상기의 핵산 분자들을 구성하는 주입 가능한 약제 조성물과 관련된다.

조절인자들에 작동되도록 연결되는 IL-8을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스 그리고/또는 조절인자들에 작동되도록 연결되는 RANTES를 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스로 이루어지는 핵산 분자는 DNA 주입(DNA 백신 접종으로 알려짐), 재조합형 아데노바이러스(adenovirus)라고 알려진 재조합형 벡터, 바이러스와 재조합형 우두(vaccinia)를 결합시킨 재조합형 아데노바이러스 등의 몇 가지 잘 알려진 기술 중 어느 것을 이용하여 주입될 수 있다.

DNA 백신은 미국특허 제5,593,972호, 제5,739,118호, 제5,817,637호, 제5,830,876호, 제5,962,428호, 제5,981,505호, 제5,580,859호, 제5,703,055호, 제5,676,594호에 개시되어 있으며, 상기 각 문헌의 우선권 인용 문헌들 또한 개시되어 있고, 상기 문헌들은 모두 이하 본 발명의 참고자료로 활용된다. 상기 문헌들에 나타난 이송 실험계획에 덧붙여서, DNA 이송을 위한 다른 방법이 미국특허 제 4,945,050호 그리고 제5,036,006호에 개시되어 있으며, 이하 본 발명의 참고자료로서 활용된다.

주입 경로는 근육, 비강, 복막, 경피, 피하, 정맥, 동맥, 안구(intraocularlly) 그리고 구강 등을 포함하며, 또한, 흡입, 좌약, 또는 질, 직장, 요도, 구강, 설하 조직(sublingual tissue) 등과 같은 점막으로의 국부적인 피하 주입 등도 포함되나 이에 한정되지 아니한다. 바람직한 주입 경로는 점막 조직, 근육, 심실, 경피 그리고 피하 주입을 포함한다. 유전자 구조는 종래의 주사기, 바늘 없는 주사 장치, 또는 "마이크로 유전자 발사총" 등의 방법으로 이루어지나 이에 한정되지는 아니한다.

IL-8 그리고/또는 RANTES 단백질은 핵산 분자를 주입함으로써 전달되는데, 이러한 핵산 분자는 상기 핵산 분자가 세포에 투입되었을 때에 단백질을 형성하도록 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스로 이루어진다. IL-8 그리고 RANTES 단백질 각각이 단백질 그 자체를 주입함으로써 전달되는 본 발명의 구체예에 따라, 일부 구체예는 단백질 그 자체를 전달하는 대신에 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 전달하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 두 단백질 모두를 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스들은 단일 핵산 분자 위에 형성될 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물들은 두 개의 핵산 분자로 이루어지는데, 한 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스들은 한 핵산 분자 위에 형성되고, 다른 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스들은 다른 핵산 분자 위에 형성된다. 일부 구체예에서, 조성물들은 두 개의 핵산 분자로 이루어지는데, 한 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스들은 한 핵산 분자 위에 형성되고, 두 단백질 모두를 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스들은 다른 핵산 분자 위에 형성된다.

유전자 구조는 핵산 분자의 유전자 발현에 필요한 조절인자를 포함한다. 상기 인자는 프로모터, 개시 코돈, 정지 코돈, 폴리아데닐레이션 신호로 이루어진다. 덧붙여서, 표적 단백질 또는 면역 조절 단백질을 암호화하는 시퀀스의 유전자 배열에 필요한 인핸서(enhancer)가 종종 요구된다. 상기와 같은 인자들은 원하는 단백질을 암호화하는 시퀀스에 결합되어 작동되도록 연결되는 것이 필요하며, 조절인자들은 그들이 결합된 대상 내에서 작동되도록 하는 것이 필요하다.

개시 코돈과 정지 코돈들은 일반적으로 원하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스의 일부분으로 간주되어진다. 그러나, 이러한 인자들은 유전자 구조가 이루어진 대상 내에서 작동되도록 하는 것이 필요하다. 개시 및 정지 코돈은 반드시 코딩 시퀀스와 구조가 일치하여야 한다.

프로모터와 폴리아데닐레이션 신호는 각각의 세포 내에서 작동되어야 한다.

본 발명의 실시에 적합한, 특히, 인간을 위한 유전자 백신을 제조하는 데에 적합한 프로모터의 예로는 Simian Virus 40(SV40), Mouse Mammary Tumor Virus(MMTV) 프로모터, HIV Long Terminal Repeat(LTR) 프로모터와 같은 Human Immunodeficiency Virus(HIV), Moloney virus, ALV, CMV immediate early 프로모터와 같은 Cytomegalovirus(CMV), Epstein Barr Virus(EBV), Rous Sarcoma Virus(RSV) 등을 포함하며, 인체의 액틴(actin), 마이오신(Myosin), 헤모글로빈, 근육 크레아틴 그리고 메탈로티오닌(metalothionein) 등과 같은 인간 유전자로부터 얻어지는 프로모터도 포함하나 이에 한정되지는 아니한다.

본 발명의 실시에 적합한, 특히, 인간을 위한 유전자 백신을 제조하는 데에 적합한 폴리아데닐레이션 신호의 예로는 SV40 폴리아데닐레이션 신호와 LTR 폴리아데닐레이션 신호를 포함하나 이에 제한되지는 아니한다. 특히, pCEP4 플라스미드(CA, 샌디에고, 인비트로젠) 내에 들어있는 SV40 폴리아데닐레이션 신호가 사용된다.

DNA 배열에 필요한 조절인자에 덧붙여서, 다른 인자들도 DNA 분자에 포함될 수 있다. 이러한 추가적인 인자들은 인핸서를 포함한다. 인핸서는

인체의 액틴(actin), 마이오신(Myosin), 헤모글로빈, 근육 크레아틴, CMV, RSV 그리고 EBV로부터 얻어지는 바이러스성 강화제로 이루어지는 군으로부터 선택되어지며, 이에 제한되지는 아니한다.

여하한 이유에서건 유전자 구조를 수용하는 세포를 제거하는 것이 바람직한 경우에 세포 파괴를 위한 표적으로 이용되는 추가적인 인자가 투입될 수 있다. 배열 가능한 형태의 헙스 티미딘 키나아제(herpse thymidine kinase, tk) 유전자가 유전자 구조에 포함될 수 있다. gangcyclovir 약물을 각 개체에 투여할 수 있고, 이 약물은 tk를 만드는 즉, 유전자 구조와 선택적인 세포 파괴를 위한 수단을 제공하는 모든 세포를 선택적으로 파괴할 것이다.

단백질 생성을 극대화하기 위해서, 인자 시퀀스는 유전자 구조가 주입된 세포 내의 유전자 배열에 가장 적합하도록 선택되어져야 한다. 더욱이, 코돈들은 세포 내에서 가장 효율적으로 전환될 수 있는 것으로 선택되어져야 한다. 당해 발명 이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가지는 자는 세포 내에서 기능할 수 있는 DNA 구조를 만들어낼 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 근육, 비강, 복막, 경피, 피하, 정맥, 동맥, 안구(intraocularlly) 그리고 구강을 통하여, 또한, 흡입, 좌약, 또는 질, 직장, 요도, 구강, 설하 조직(sublingual tissue) 등과 같은 점막으로의 국부적인 피하를 통하여 핵산 분자를 주입하는 단계로 이루어진다.

비경구용 투여를 위해, 단백질은, 예를 들어, 용액, 서스펜션, 에멀젼 또는 약학적으로 비경구용 전달에 적합한 벡터와 결합되어 있는 건조 분말 등의 형태일 수 있다. 상기 벡터의 예로는 물, 소금, 링거액, 덱스트로스 용액, 그리고 5 %의 인체 세륨 알부민 등이 있다. 리포좀 및 오일과 같은 비수용액상의 벡터 등도 사용될 수 있다. 벡터 또는 건조 분말은 염화나트륨이나 매니톨(mannitol)과 같은 등장성(isotonicity)을 유지시켜주는 추가적인 제제 또는 완충제와 유지제 같은 화학적 안정성을 유지시켜주는 추가적인 제제를 포함할 수 있다. 제제는 통상적인 기술로 살균될 수 있다. 예를 들어, 주사에 의한 주입에 적절한 비경구용 조성물은 0.9 % 염화나트륨 수용액에 1.5 중량%의 활성제제를 녹여 만들 수 있다.

본 발명에 따른 약제 조성물은 활성제(active agent)를 포유류 몸체 내에서 활성제의 활성 영역에 도달하게끔 하여주는 여하한 수단을 이용할 수 있다. 본 발명에 따른 약제 조성물은 국부적인 또는 전체 구조적인 처방이 요구되는 지에 따라서 그리고 처방이 요구되는 부위에 따라서 수많은 방법들이 사용될 수 있다. 주입은 국부적(눈, 질, 직장, 비강, 피부를 포함)이거나, 구강을 통하거나 또는 비경구 에 의해 이루어질 수 있다. 비경구용 주입에는 정맥 주입, 피하 주입, 복막 또는 근육 주입, 흡입을 통한 폐 주입, 포막 또는 심실 주입 등을 포함한다.

핵산 분자들은 재조합형 벡터의 핵산 분자인 플라스미드 DNA 또는 묽은 백신이나 세포 백신 내에 존재하는 유전적 재료의 일부로서 제공된다. 일부 구체예에서는, 표적 단백질 그리고/또는 면역 조절 단백질은 이들을 암호화하는 핵산 분자에 부가하여 또는 이들을 암호화하는 핵산 분자를 대신하여 전달될 수 있다.

유전자 구조는 표적 단백질 또는 유전자 배열에 필요한 조절인자에 결합되어 작동되도록 연결되는 면역 조절 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스로 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어서, 표적 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스의 배열 가능한 형태로 이루어지는 구조와 면역 조절 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스의 배열 가능한 형태로 이루어지는 구조를 포함하는 유전자 구조의 조합들이 제공된다. 유전자 구조의 조합을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 살아있는 세포에 결합함으로써 DNA 또는 RNA의 배열을 얻을 수 있고, 표적 단백질 및 면역 조절 단백질을 만들어낼 수 있다.

본 발명은 바이러스, 원핵 병원 세포, 단위세포 병원 유기체와 다세포 기생 충과 같은 진핵 병원 세포 등과 같은 모든 병원체로부터 각 개체를 면역하는 데에 사용될 수 있다. 본 발명은 특히 세포를 감염시키고 바이러스와 같이 캡슐화되지 아니하는 병원체 그리고 임질, 리스테리아 균, 시겔라 균 등과 같은 원핵생물에 대하여 각 개체를 면역하는 데에 유용하다. 단백질 생성을 극대화하기 위해서, 인자 시퀀스는 유전자 구조가 주입된 세포 내의 유전자 배열에 가장 적합하도록 선택되어져야 한다. 더욱이, DNA 배열들은 세포 내에서 가장 효율적으로 전환될 수 있는 것으로 선택되어져야 한다. 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가지는 자는 세포 내에서 작동할 수 있는 DNA 구조를 만들어낼 수 있다.

병원체의 감염으로부터 방어할 수 있는 유전자 백신을 만들어내기 위해서는, 면역 유전자 단백질을 암호화하는 유전자 물질이 표적에 대한 암호화 시퀀스로서 유전자 구조 내에 반드시 포함되어야 한다. 병원체가 세포 내로 감염되든지(이 경우에 본 발명이 특히 유용하게 적용된다), 또는 세포 외부를 통하여 감염되든지 간에 모든 병원체의 항원이 적절한 대응을 도출해내지는 못하는 것 같다. DNA와 RNA는 그 크기가 작고 쉽게 만들어질 수 있기 때문에 본 발명은 복합적인 병원체 항원을 제공하는 백신을 얻을 수 있다는 부가적인 이점을 얻을 수 있다. 유전자 백신에 사용되는 유전자 구조는 많은 병원체 항원을 암호화하는 유전자 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 몇 개의 바이러스 유전자들이 단일 구조에 포함될 수 있고, 그리하여 복합적인 표적을 제공할 수 있게 된다.

표 1과 표2는 병원체의 시료 및 유기체들의 리스트를 포함하고 있는데, 유전자 백신은 상기 병원체들로부터 각 개체가 감염되는 것을 방지하기 위하여 제조될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 병원체에 대항하여 각 개체를 면역하는 방법은 HIV, HTLV 또는 HBV에 대하여 직접적으로 나타나 있다.

본 발명의 다른 면에서 고증식 질병의 특징인 세포의 고증식에 대하여 폭 넓은 방어적인 면역 대응을 제공하는 방법 및 고증식 질병으로부터 고통받는 각 개인을 치료하는 방법이 제공된다. 고증식 질병의 예로는 모든 형태의 암과 건선을 포함한다.

단백질을 각 개체의 세포에 결합시키는 면역 유전적인 고증식 세포를 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스를 사용함으로써 각 개체의 백신 처리된 세포 내에서 상기와 같은 단백질이 생성되는 결과가 발견되었다. 고증식 질병으로부터 면역하기 위하여 과증식성 질병과 관련되는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 유전자 구조가 각 개체에 주입된다.

과증식 단백질을 효과적인 면역 유전적 표적으로 만들기 위해서는 보통의 세포들에 비하여 과증식 세포 내에서 단백질이 아주 높은 비율로 만들어져야 한다. 표적 항원은 상기와 같은 단백질 및 그 조각, 그리고 상기 단백질에서 발견되는 적어도 하나의 항원결정체를 포함하는 펩타이드를 포함한다. 어떤 경우에는, 과증식성 관련(hyperproliferative-associated) 단백질은 다른 단백질을 코드화하는 유전자의 변형이다. 정상 단백질 상에서는 발견되지 않는 에피토프(epitope)가 되는 약간 다른 아미노산 서열을 갖는 경우는 제외하고는 상기 변형된 유전자는 정상 단백질과 거의 동일하다. 그러한 표적(target) 단백질은 myb, myc, fyn와 같은 종양 유전자(oncogene), 및 전위 유전자 bcr/abl, ras, src, P53, neu, 및 EGRF에 의하여 코드화된 단백질을 포함한다. 종양 유전자에 더하여 표적 항원, 항암치료 및 보호적 처방을 위한 표적 단백질과 같은 생성물은, 몇몇 구체예에서는 자기면역 질명을 위한 표적 항원으로도 사용되는 T 세포 임파종(lymphomas)의 T 세포 수용체(receptor)의 변이 부위, 및 B 세포 임파종에 의하여 만들어진 항체의 변이 부위를 포함한다. 다른 종양성(tumor-associated) 단백질은 모노클로날(monoclonal) 항체 17-1A에 의하여 인식되는 단백질 및 엽산 결합(folate binding) 단백질을 포함하는 종양 세포의 높은 수준에서 발견되는 단백질들과 같은 표적 단백질로서 사용될 수 있다.

본 발명은 하나 이상의 심각한 형태의 암으로부터 개체를 면역시키기 위하여 사용될 수 있으며, 특히 특별한 암에 걸리기 쉬운 사람 또는 암이 도지기 쉬운 사람을 예방 차원에서 면역시키는데 유용하다. 전염병학 뿐만 아니라 유전학 및 기술의 발전에 말미암아, 개체에 있어서 암의 발전 여부에 대한 가능성 및 위험 평가를 결정할 수 있게 되었다. 유전 심사 및 가족 병력을 통하여, 특정 개체가 어느 심각한 형태의 암이 발생할지 여부에 대한 가능성을 예견할 수 있다.

마찬가지로, 이미 암이 발생하여 이러한 암을 제거하기 위한 치료를 받았거나 또는 완화된 사람은 특히 도지거나 재발의 가능성이 높다. 치료 계획의 일부로서, 그러한 사람은 재발과 싸우기 위하여 했던 것과 같이 진단된 그 암에 대하여 면역될 수 있다. 그래서, 어떤 사람이 어떤 형태의 암에 걸려 재발의 위험이 있음이 알려지면, 미래에 다시 발생한 바로 그 암과 싸울 면역 시스템을 준비하기 위하여 면역될 수 있다.

본 발명은 과증식성 질병으로부터 고통받는 사람들을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 그러한 방법들에 있어서, 유전 구조의 도입은 표적 단백질을 생산하는 과증식성 세포와 싸우기 위하여 개체의 면역 시스템의 방향을 정하고 증진시키는 면역치료법으로 작용한다.

본 발명은 세포 수용체 및 자기 방향성(self-directed) 항원을 생성하는 세포를 포함하는 자기 면역과 관련된 표적들에 대한 광범위한 보호적 면역 반응을 줌으로써 자기면역성 질병으로 고통받는 사람을 치료하는 방법을 제공한다.

T 세포 관여 자기면역성 질병은 류마티스성 관절염(RA), 복합 경화증(MS), Sjogren 증후군, 유육종증(sarcoidosis), 인슐린 의존 당뇨병(IDDM), 자기면역성 갑상선염, 반응성 관절염, 강직성 척추염, 피부경화증. polymyositis, dermatomyosiyis, 건선, 맥관염, Wegener 육아종증, Crohn 병, 및 궤양성 대장염을 포함한다. 이러한 질병 각각은 내생적 항원에 결합하여 자기면역성 질병과 관련된 일련의 염증 반응을 일으키는 T 세포 수용체에 의해 특징 지워진다. 상기 T 세포의 변이 부위에 대한 백신접종은 그러한 T 세포들을 제거하기 위하여 CTLs를 포함하는 면역반응을 유도한다.

RA의 경우, 그러한 질병에 관련된 T 세포 수용체(TCRs)의 몇몇 특정 변이 부위가 특징이 된다. 이런 TCRs는 Vβ-3, Vβ-14, Vβ-17 및 Vα-17을 포함한다. 그래서, 적어도 하나의 이러한 단백질을 코드화하는 DNA 구조로 백신접종은 RA 관련 T 세포를 목표로 하게 될 면역 반응을 유도한다. Howell, M.D., et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci.USA 88:10921-10925; Paliard, X., 333을 참조할 것이며, 그 각각은 본 발명에 따른 참조문헌으로 포함된다.

MS의 경우, 그러한 질병에 관련된 TCRs의 몇몇 특정 변이 부위가 특징이 된다. 이러한 TCRs는 Vβ-7 및 Vα-10을 포함한다. 그래서, 적어도 하나의 이러한 단백질을 코드화하는 DNA 구조로 백신접종은 MS 관련 T 세포를 목표로 하게 될 면역 반응을 유도할 것이다. Wucherpfennig,J.R. et al., 1990 Nature 345:344-2346을 참조할 것이며, 그 각각은 본 발명에 따른 참조문헌으로 포함된다.

피부경화증의 경우, 그러한 질병에 관련된 TCRs의 몇몇 특정 견이 부위가 특징이 된다. 이러한 TCRs는 Vβ-6, Vβ-8, Vβ-14, 및 Vα-16, Vα-3C, Vα-7, Vα-14, Vα-15, Vα-16, Vα-28, 및 Vα-12를 포함한다. 그래서, 적어도 하나의 이러한 단백질을 코드화하는 DNA 구조로 백신접종은 피부경화증 관련 T 세포를 목표로 하게 될 면역 반응을 유도할 것이다.

T 세포 중개 자기면역성 질병, 특히 TCR의 변이 부위가 아직 특징 지워지지 않은 질병으로 고통받는 환자를 치료하기 위하여, 활액검사가 실시될 수 있다. 현재의 T 세포의 샘플을 채취할 수 있으며, 그러한 TCRs의 변이 부위는 표준 기술을 이용하여 찾아낼 수 있다. 이러한 정보를 바탕으로 유전 백신을 준비할 수 있다.

B 세포 중개 자기면역성 질병은 피부결핵(SLE), Grave 병, 근무력증, 자기면역성 용혈 빈혈증, 자기면역성 혈소판 감소증, 제1 담 경화증, 및 악성 빈혈증을 포함한다. 각각의 이러한 질병은 내생적 항원에 결합하여 자기면역성 질병과 관련된 일련의 염증 반응을 일으키는 T 세포 수용체에 의해 특징 지워진다. 상기 T 세포의 변이 부위에 대한 백신접종은 항체를 생성하는 B 세포들을 제거하기 위하여 CTLs를 포함하는 면역반응을 유도한다.

B 세포 중개 자기면역성 질병으로부터 고통받는 환자들을 치료하기 위하여, 자기면역 활동과 관련된 항체의 변이 부위가 밝혀져야 한다. 생체검사가 실시되고 염증을 일으키는 부위에 존재하는 상기 항체의 샘플이 채취될 수 있다. 그러한 항체의 변이 부위는 표준 기술을 통하여 찾아질 수 있다. 이러한 정보를 바탕으로 유전 백신이 준비될 수 있다.

SLE의 경우, 한 항원은 DNA라고 믿어지고 있다. 그래서, SLE에 대해 면역화 되는 환자에 있어서, 그들의 혈청이 항-DNA 항체를 위하여 가려낼 수 있으며, 상기 혈청에서 찾아진 그러한 항-DNA 항체의 변이 부위를 코드화하는 DNA 구조를 포함하는 백신을 준비할 수 있다.

TCRs와 항체의 변이 부위들 간의 통상적인 구조는 잘 알려져 있다. 특정 TCR 또는 항체를 코드화하는 DNA 서열은 Kbat, et al. 1987 Sequence of Proteins of Immunokogical Interest U.S Department of Health and H uman Services, Bethesda MD(이 내용은 본 발명에 따른 참조 문헌으로 포함된다)에 기재된 내용과 같은 하기의 잘 알려진 방법을 통하여 일반적으로 찾아진다. 게다가, 항체들로부터 기능적 변이 부위를 클로닝(cloning)하기 위한 일반적인 방법은 Chaudhary, V.K, et al., 2990 Proc. Acad. Sci. USA 87:1066에 나타나 있으며, 이러한 내용은 본 발명에 따른 참조 문헌으로 포함된다.

유전 백신을 증진하기 위하여 면역조절 단백질(immunomodulating protein) 코드 서열의 표현 가능한 형태를 사용하는 것에 더하여, 본 발명은 독소를 약화시 킨 살아있는 개선된 백신 및 항원을 코드화하는 외부 유전자를 이송하는 재조합 벡터를 사용하는 개선된 백신과 관련된다. 약독화 생백신 및 외부 항원을 이송하는 재조합 벡터의 이용의 예는 미국특허 제,722,848호, 제5,017,487호, 제5,077,044호, 제5,110,587호, 제5,112,749호, 제5,174,994호, 제5,223,424호, 제 5,225,336호, 제5,240,703호, 제5,242,829호, 제5,294,441호, 제5,294,548호, 제5,310,668호, 제5,387,774호, 제5,389,368호, 제5,424,065호, 제5,451,499호, 제5,454,364호, 제5,462,734호, 제5,479,734호, 및 제5,482,713호에 기재되어 있으며, 그 각각은 본 발명에 따른 참조 문헌으로 포함된다. 면역조절 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구조는 형질을 발현하기 위하여 백신 접종자에 작용할 수 있는 규정 서열에 동작상 링크되어 있다. 상기 유전자 구조는 본 발명에 따른 개선된 백신을 생산하기 위하여 약독화 생백신 및 재조합 백신에 포함된다.

본 발명은 사람을 면역시키는 개선된 방법을 제공하는 것으로서, DNA 백신, 약독화 생백신, 및 재조합 백신을 포함하는 백신 합성물의 부분으로서 사람의 세포들에 유전자 구조를 이송하는 단계를 포함한다. 상기 유전자 구조는 면역조절 단백질을 코드화하고 형질을 발현하기 위하여 백신 접종자에게 작용할 수 있는 규정 서열에 동작상 링크되어 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

예 : 케모킨(chemokines) IL-8을 코드화하는 DNA 백신, 및 RANTES 구동 항원 특정 Th1 타입의 면역 반응, 및 생체내에 있어서 헤르페스 심플렉스 바이러스-2에 대한 강화된 보호 면역성

도입

면역반응 또는 염증 반응의 시작은 costimulatory 분자, 응집 분자, 시토킨(cytokines), 및 케모킨(chemokines)의 조화로운 합성을 수반하는 복잡한 과정이다. 특히, 케모킨은 주된 방어지의 주변에 면역 세포들을 배치하는 분자 조절에 있어서 중요하다. 케모킨 상과(superfamily)는 두 시스타인(cysteine) 잔재를 분할하는 단일 아미노산 서열의 존재(α과) 및 부존재(β과)에 기초한 두 아과(subfamily)로 이루어진다. α 및 β 케모킨은 neutrophils, 호산 백혈구(eosinophils), 호염기성 세포(basophils), 모노사이트(monocytes)를 포함하는 다양한 면역 세포 형태의 직접적인 이주를 유도한다고 알려져 있다. α 케모킨과(CXC 타입), 인터류킨(IL)-8 및 인터페론-γ 유도 가능 단백질(IP)-10, 및 β 케모킨과(CC 타입), RANTES(regulated on activation, normal T cell expressed and secreted), 모노사이트 주화성 단백질(MCP-1), 및 macrophage 염증성 단백질(MIP)-1α는 T 림프구를 화학적으로 유인하는 것으로 알려져 있다. 특히, IL-8 및 IP-10은 neutrophils를 화학적으로 유인하며, 혈류를 떠나서 주변 조직으로 이주하도록 유도한다. 이와 유사하게, RANTES는 모노사이트, 비활성 CD4+/CD45개+ T 기억 세포, 및 활성 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 화학적으로 유인한다. MIP-1α는 호산 백혈구를 화학적으로 유인하고 알갱이를 떼어내는 것으로 알려져 있다. MIP-1α는 또한 호염기성 백혈구 및 비만세포로부터 히스타민(histamine) 분리를 유도하고, 호염기 성 세포 및 B 세포를 화학적으로 유인한다. MCP-1은 만성 염증성 질병에 있어서 중요한 케모킨이다. MCP-1은 혈류로부터 모노사이트를 이주하도록 유도하고 조직 macrophages가 되도록 한다. MCP-1은 또한 활성 기억 서브셋(subset)의 T 임파구를 화학적으로 유인한다. 최근의 연구에 따르면, 케모킨 수용체는 T 세포 서브셋을 표시하고 그리고 케모킨은 항원 특정 면역 반응의 생성에 관여할 수도 있다고 한다.

이상에서 발표된 바와 같이, DNA 백신 모델은 케모킨이 면역반응을 조절할 수 있을 것인지 그리고 한정된 쥐 모델 시스템에서 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)-2 의 공격으로부터의 보호에 영향을 줄 수 있을 것인지 여부에 대한 연구에 유용하였다. 면역 반응 및 보호적 면역성 조절에 대한 연구를 위하여, HSV-2 단백질을 코드화하는 DNA 단백질 합성 구조는 케모킨(IL-8, IP-10, RANTES, MCP-1, MCP-1α)에 대한 유전자 플라스미드 코드화와 함께 인도되었다. 항원 특정 면역 유도 및 공격으로부터의 보호에 있어서 조절효과는 그 다음에 분석되었다. 반면에, IP-10, MCP-1, MIP-1α와의 함께 주입한 경우는 보호 상태에 대해 전적으로 해로운 효과를 가져 왔다. 이러한 연구에 의해 시토킨을 회상시키는 방식으로 케모킨이 중요한 면역 반응 및 질병 진화에 영향을 주고 조절할 수 있다는 것이 뒷받침된다. 중요한 면역 조절은 같이 인도된 케모킨 cDNAs의 사용을 통하여, 면역 반응뿐만 아니라 질병 보호에 영향을 끼치면서 획득될 수 있다. 게다가, 케모킨 유전자 인도 보조약의 사용은, 특히 IL-8 및 RANTES에 있어서 훨씬 능률적인 백신을 생산하거나 또는 HSV에 대한 면역치료에 있어서 중요하다.

방법

쥐

Harlan Spague-Dawley(Indianapolis, Ind)로부터 4내지 6주된 암컷 BALB/c 쥐들을 구입하였다. 그들은 National Institutes of Health(Bethesda, Md) 및 University of Pennsylvania IACUC(Philadelphia, PA)의 가이드라인 하에서 보살펴졌다.

시약

HSV-2 strain 186(University of Pennsylvania, Philadelphia, Rockville, Md의 P. Schaffer로부터의 고마운 선물임)이 Vero cell line(American Type Culture Collection, Rockville, Md)으로 증식되었다. DNA 백신, HSV-2 gD 단백질을 코드화하는 pAPL-gD2(pgD)는 이전에 Pachuk, C.J. et al., "Humoral and cellular immune response to herpes simplex virus-2 glycoprotein D generated by facilitated DNA immunization of mice" Current topics Microbiol. Immunol. 1998 226:79-89에 기재되어 있으며, 이 내용은 본 발명에 따른 참조 문헌으로 포함된다. 상기 단백질 합성 벡터, pCDNA3-IL-8, pCDNA3-RANTES, pCDNA3MCP-1, pCDNA3-MIP-1α, pCDNA3-TNF-α, 및 pCDNA3-TNE-β는 Kim,J.J. et al., "CD8 positive T-cells influence antigen-specific immune response through the expression of chemokines" J. Clin. Invest. 1998 102:1112-1124 및 Kim, J.J. et al., "Modulation of amplitude and direction of in vivo immune responses by co- administration of cytokine hene expression cassettes with DNA immunogens" Eur. J. Immunl. 1998 28:1089-1103에 기재된 바와 같이, 이전에 구성되었으며, 이러한 내용은 본 발명에 따른 참조 문헌으로 포함된다. 플라스미드 DNA는 박테리아에서 생산되었으며 이중으로 밴드가 감겨진 CsCL 플레파라트에서 정제되었다. 재조합형 HSV-2 gD 단백질은 G.H. Cohen 및 R.J. Eisenberg, University od Pennsylvania, Philadelphia, Pa로부터 증여 받아서 이러한 연구에 재조합형 항원으로 사용되었다.

쥐들에 DNA 접종

BALB/c 쥐들의 대퇴 사두근에 28-게이지 바늘(Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.)을 사용하여 인산 완화 염수 100㎕ 및 0.025％ bupivacaine-HCL(Sigma, St. Louis, Mo)에 처방된 gD DNA 구성체를 주사하였다.

효소 결합 면역 흡착제 분석

효소 결합 면역 흡착제 분석(ELISA)은 Sin, J.I. et al. "Invivo modulation of vaccine-induced immune response toward a Th1 phenotype increase potency and vaccine effectiveness in a herpes simplex virus type 2 mouse model" J. Virol. 1999 73:501-509 및 Sin, J.I. et al. "Enhancement of protective humoral (Th2) and cell-mediated (Th1) immune responses against herpes simplex virus-2 through co-delivery of granulocyte macrophage-colony stimulating factor expression cassettes" Eur. J. Immunol. 1998 28:3530-3540에 이미 기재된 바와 같이 실시하였으며, 이러한 내용은 본 발명에 따른 참조 문헌으로 포함된다. 특히, hD 특정 IgG 아강(subclass)의 상대적인 레벨을 결정하기 위하여, HRP(Zymed, San Francisco, CA)와 접합한 반-쥐과 IgG1, IgG2a, IgG2b, 또는 IgG3로서 반-쥐과 IgG-HRP를 대체하였다. 상기 ELISA의 적정 농도는 투약하지 않은 쥐의 혈청과 같은 광학상의 농도를 보이는 최고 혈청 희석값의 역으로 결정된다.

T 협력자(Th) 세포 증식 분석

Th 세포 증식 분석은 Sin, J.I. et al. J Virol. 1999 supra 및 Sin, J.I. et al. Eur. J. Immunol. 1998 supra에 이미 기재된 바와 같이 실시되었으며, 이러한 내용은 본 발명에 따른 참조 문헌으로 포함된다. 고립된 세포 부유물은 1×10⁵cells/ml의 농도까지 재부유시켰다. 100㎕ 약수를 포함하는 1×10⁵ 세포가 96 마이크로타이터(microtiter) 평판 플레이트를 갖는 각각의 용기에 가해졌다. 최종농도가 1㎍/ml 및 5㎍/ml에서 HSV-2 gD 단백질이 삼중으로 용기들에 가해졌다. 상기 세포들은 5％ CO₂안에서 3일 동안 37℃에서 배양되었다. tritiated thymidinedm 일 μCi가 각각의 세포들에 가해졌으며, 상기 세포들은 37℃에서 12 내지 18시간동안 배양되었다. 상기 플레이트를 채취한 결과, 결합된 tritiated thymidinedm의 양은 Beta Plate reader(Wallac, Turki. Finland)로 측정되었다. 자극 지수는 다음 식으로 결정되었다.

자극 지수(SI) = (실험에 의한 집계-자연 상태의 집계)/자연 상태의 집계

자연상태의 용기는 비관련 단백질로 작용하는10％ fetal calf 혈청을 포함한다. 세포들이 건강하다는 것을 알기 위하여, 5㎍/ml PHA(Sigma)가 polyclonal 자극제 염기성 통제수단으로 사용되었다.

Th1 및 Th2 타입의 시토킨 및 케모킨

1 ml 약수를 포함하는 6×10⁶ splenocytes가 24 플레이트를 갖는 용기들에 가해졌다. 그리고 HSV-2 gD 단백질/ml 1 ㎍이 각각으 용기에 첨가되었다. 37℃에서 5％ CO₂ 상태로 2일간의 배양 후에, 세포 상청액을 획득하여 IL-2, IL-10, IFN-_γ,RANTES, MCP-1. 및 MIP-1α의 레벨을 파악하는데 사용하였다. 이 때, 세포 밖의 용액을 시토킨 또는 케모킨 특정 ELISA 플레이트에 첨가함으로써 상업적인 시토킨 및 케모킨 키트(Biosource, Intl., Camarilo, Ca. and R&D Systems, Minneapolis, Md.)를 사용하였다.

Intravanginal HSV-2 공격

쥐들은 Millgan, G.N. et al. " Analysis of herpes simplex virus-specific T cells in the murine female genital tract following genital infection with herpes simplex virus type 2" Virol. 1995 212:481-489 및 McDermott, et al. "Immnity in the female genital tract after intravanginal vaccination of mice with an attenuated strain of herpes simplex virus type 2" J. Virol. 1984 51:747-753에 기재된 것과 약간 변경된 상태로 공격을 받았으며, 상기 문헌은 본 발명에 따른 참조문헌으로 포함된다. 상기 바이러스를 접종하기 이전에, 상기 intravahinal 영역은 끝부분에 면을 붙인 주걱(Hardwood Products Company, Guiford, ME)을 0.1M NaOH 용액에 담근 것과 말린 면 주걱으로 닦아내었다. 병리 상황 및 생존 비율을 평가하기 위하여 쥐들을 매일 검사하였다.

통계적 분석

paired Student's test를 이용하여 통계적 분석을 하였다. 다른 면역 그룹들간의 값들이 비교되었다. 0.05보다 작은 p 값들은 심각한 것으로 간주되었다.

결과

케모킨 플라스미드의 상호 관리는 조직적 IgG 생산물에 영향을 미친다

항원 특정 항체 반응의 유도 상의 선택된 케모킨의 생체내 효과가 먼저 고찰되었다. 통제 동물이 gD 백신 및 2 proinflammatory 시토킨 및 TNF과 유전자(TNF-α, TNF-β)에 의하여 면역되었다. 이러한 proinflammatory 시토킨은 초기 면역 반응에 유사하게 관련되는 것으로 생각되고, 이전에 생성된 데이터에 기초하여 양의 통제수단으로 작용한다고 연구되었다. 도 1에 도시된 바와 같이, 제2차 면역접종 2주 후에 수집된 동일하게 울혈된 혈청에 대한 ELISA 타이터(titer)는 12,800(IL-8), 6,400(IP-10), 6,400(RANTES), 6,400(MCP-1), 12,800(MIP-1α), TNF-α(25,600), TNF-β(6,400), 및 6,400(gD DNA 백신 만에 대해)로 결정되었다. 이러한 사실은 IL-8 및 MIP-1α의 상호 주입은 중간의, 그러나 심각하지 않은 gD 특정 IgG 항체의 고양으로 귀결된다는 것을 보여준다. 반대로, IP-10, RANTES 또는 MCP-1은 pgD 백신만을 사용한 경우의 그것과 유사한 항체반응을 보였다. TNF-α cDNA 통제를 통해서는 이전에 관찰된 바와 정확G 똑같이, gD DNA 백신만을 사용한 경우의 그것보다 더 높은 조직 IgG 레벨로 귀결되었다.

케모킨 플라스미드와의 상호접종은 IgG 아강을 Th1 또는 Th2 아이소타이프로 이동시킨다

*IgG 아강은 유도된 면역 반응의 Th1 vs Th2 성질을 알려준다. 상기 상호 주입에 의해 유도된 IgG 아강이 분석되었다. 각각의 면역접종 그룹에 의해 유도된 IgG 아이소타이프(isotypes)는 도 2A에 도시되어 있으며, IgG2a 대 IgG1의 상대적 비율(Th1 대 Th2)은 도 2B에 도시되어 있다. 상기 pgD 면역 접종 그룹의 IgG2a 대 IgG1의 비율은 0,62이다. IL-8, RANTES 또는 TNF-α 유전자의 상호 주입은 gD 특정 IgG2a 대 IgG1의 상대적 비율을 0.8로 상승시켰다. 반면에 MCP-1 또는 TNF-β 유전자의 상호 면역접종은 pgD 백신접종만을 한 경우와 비슷한 IgG 아유형 패턴으로 귀 결되었다. 이러한 분석을 통하여, IL-8 및 RANTES는 면역반응을 γ-IFN 타입 시토킨과 비슷한 형태로 Th1 표현형(phenotype) in vivo 방향으로 이끈다는 사실이 지지된다.

IL-8 및 RANTES 상호 접종은 Th 세포 증식반응을 고양시킨다

세포증식은 세포 매개 면역을 평가하는데 사용되는 표준 파라메터이다. 시토킨 유전자와의 상호 접종에 따른 Th 세포 증식 반응이 gD 단백질로서 in vitro 면역된 동물로부터 splenocytes를 자극함으로써 측정되었다. 도 3A-3C에 도시된 바와 같이, pgD DNA 백신접종만으로는 gD 특정 Th 세포 증식 반응에 귀결된다. IL-8, RANTES 또는 TNF-α cDNAs와의 상호 주입으로서 gD DNA 백신만의 경우를 뛰어 넘는 Th 세포 증식 반응이 심각하게 고양되는 것이 관찰되었다. TNF-β와의 상호 주입에 의해서는 증식에 있어서 약간 고양되는 것이 관찰되었다. 반대로, IP-10, MCP-1 또는 MIP-1α 유전자와의 상호 면역접종은 Th 세포의 증식 반응 레벨에 미미한 영향을 미치는 것으로 보였다. 그러나, PHA 유도 비특정 Th 세포 증식반응에는 상호접종이 전혀 영향을 미치지 않는 것으로 보인다(S.I. 범위가 40에서 50임). Balb/c 환경에서 CTL 에피토프(epitope)가 부족함에 기인하여 상기 gD 플라스미드 백신접종은 CTL 반응에 귀결되지는 않는다. 그러나, 세포적 효과를 자세히 평가하기 위하여 시토킨 생산물 프로파일을 검사하였다.

케모킨 상호 주입은 Th1 및 Th2 시토킨의 생산에 영향을 미친다

Th1 시토킨(IL-2 및 IFN-γ) 및 Th2(IL-4, IL-5 및 IL-10)는 면역반응의 양극화 현상을 이해하는 중심이 된다. Th1 면역반응은 세포성 면역을 유도한다고 생각되어지며, 반면에 Th2 면역반응은 바람직한 체액성 면역을 구동한다고 생각된다. IgG 표현형 결과에 기초하여, 시토킨 방출을 직접적으로 분석함으로써 상기 Th1 및 Th2 유출물을 좀 더 평가하였다. 표3에 나타난 바와 같이, IL-8 cDNA를 상호 주입함에 따라 IL-2 생산이 거의 7배로 급격하게 상승되었다. IL-2는 또한 TNF-α cDNA와의 상호 주입, 및 MIP-1α에 의해 유도되었다. 특히, IFN-γ의 생산은 RANTESDML 상호 이송에 의해 20배, IL-8에 의해 6배 고양되었으며, 이는 아이소타이프 결과를 더욱 지지하며, 아울러 IL-8과 RANTES는 Th1 타입 세포성 면역 반응을 항원 종속형으로 매개함을 입증하고 있다. RANRES, IL-8, TNF-α, 및 TNF-β 상호주입 각각은 IL-10 생산을 pgD 백신만을 사용한 경우보다 심각하게 상승시킨다. 이러한 사실은 IL-8 및 RANTES가 Th1의 T 세포들을 Th2 타입으로 현저하게 이동시키는 것을 설명한다.

케모킨 상호주입은 β케모킨의 생산에 영향을 미친다

케모킨 상호주입이 항원 종속형 방식으로 β케모킨 생산을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위하여, 동물들이 상호 면역접종 되었고, 재조합형 gD 항원 또는 통제 항원으로 in vitro 자극한 후에 스플레노사이트(splenocytes)의 β케모킨 방출 레벨을 분석하였다. 표 4에 나타난 바와 같이, IL-8 cDNA로서 상호 주입함으로써 MCP-1 생산이 급격하게 증가되었으며, 그러나 RANTES 및 MIP-1α 카셋트로써 상 호 주입함으로써 감소되었다. RANTES의 경우, IL-8 및 RANTES 상호주입은 pgD 백신만의 경우보다 더 높은 RANTES 생산을 불렀다. 이러한 사실은 RANTES가 HSV 모델의 IL-8과는 다른 항원 특정 면역반응을 조절한다는 것을 의미한다. 이것은 또한 케모킨이 그 자신의 생산을 조절함을 지지하고 있다.

IL-8 및 RANTES 케모킨 상호주입은 인트라베지날(intravaginal) HSV-2 공격으로부터 보호를 강화한다

항원 특정 면역 조절이 병원체의 복제에 영향을 준다는 것은 중요하다. 케모킨 상호주입의 보호적 효능이 쥐과의 헤르페스 공격 모델에 있어서 분석되었다. 쥐들은 0 내지 2주동안 DNA 벡터와 i.m. 상호 면역 접종되었고, 그 후 2차 면역접종 후 3주 째에 HSV-2에 의하여 공격을 받았다. 인트라배지날 공격 루트는 HSV-2가 점액질로 감염됨에 따라 선택되었다. 도4A 및 4B에 도시된 바와 같이, gD DNA 백신(쥐 한 마리당 60㎍)만으로의 면역은 HSV-2의 200 LD₅₀으로써 인트라베지날 공격으로부터 쥐로 하여금 63％의 생존율을 보여주었다. IL-8 및 RANTES cDNA와의 상호주입은 생존율을 88％로 증가시켜, 보호 비율을 거의 30％ 증가시켰다. 반면에 MCP-1 및 IP-10 40㎍으로 상호 주입한 경우는 생존율이 25％로 감소시켰고, 이는 전체 보호 비율을 약 40％ 감소시킨 것이다. 유사하게, NIP-1α 상호주입은 또한 생존율을 감소시켰다. 이러한 사실은 케모킨 IL-8 및 RANTES는 항원 특정 면역 조절을 통하여 HSV-2 감염으로부터의 보호기능을 고양한다는 결론을 지지한다.

TNF과 상호주입은 인트라베지날 HSV-2 공격으로부터의 보호를 약화시킨다

TNF과의 상호주입의 보호 효능이 헤르페스 공격 모델과 비교되었다. TNF-α 및 TNF-βcDNA는 생존율을 25％로 감소시켜, 보호 비율(도 4C)을 40％ 감소시켰다. 이러한 데이터는 몇몇 면역조절 cDNA의 상호주입은 백신 효과를 감소시킨다는 것을 지지하며, 아울러 반응의 질이 특히 중요하다는 점을 지지한다.

토론

HSV는 감기 염증, 안구 감염, 뇌염, 및 유전 감염 등과 같은 다양한 인간 질병의 원인 매개체이다. HSV는 바이러스성 잠재능력을 형성하여 숙주에 재발을 일으킨다. 바이러스성 감염동안, 항체를 중화하는 것은 바이러스 입자를 무력화시키나, 세포내 HSV 감염을 조절할 수 없게 된다. 차라리, 세포 매개 면역이 HSV 감염 세포를 죽이는 주요 작동자이다. 제1 HSV 감염을 통제하기 위한 B 세포 억제 쥐들의 능력 또는 부수적인 바이러스성 감염을 방지하기 위한 채택적 이송 T 세포의 능력은 세포 매개 면역 이 바이러스성 감염 및 그 확산에 방지와 직접적으로 관련되어 있음을 제시한다. CD4+ 및 CD8+ T 세포는 HSV 감염의 방지와 관련되어 있음이 잘 알려져 있다. 더욱이, Th1 타입 CD4+ T 세포는 HSV-2의 공격으로부터의 보호에 훨씬 결정적인 역할을 한다는 몇몇 리포터가 있다. CD4+ T 세포가 생체내 방혈되었을 때, HSV에 대한 보호 면역이 상실된다. 게다가, Th1 타입의 CD4+ 세포는 많은 양의 IFN-γ를 생산한다. IFN-γ는 세포독성 CD4+ T 세포와 CD8+ CTL에 의하여 더 잘 인 식할 수 있도록 하기 위하여 HSV 감염 세포 위에 클래스 Ⅰ 및 클래스 Ⅱ 합성을 조절하며, 직접적인 안티-HSV(anti-HSV) 효과를 갖는다. Th1 타입의 시토킨 cDNA와의 상호이송은 질병 상태를 악화시킨다. 유사하게, 프로토타이픽(prototypic) Th1 타입 시토킨 IL-2 cDNA에 의하여 강화된 보호는, HSV 감염에 대한 Th1 타입 T 세포 매개 보호 면역의 중요성을 강조하면서, HSV 공격 모델에 있어서 Th1 타입 CD4+ T 세포와 매개된다.

동물 모델에 있어서, 몇몇 HSV 당단백질 또는 DNA 구조 합성 특정 바이러스성 구성요소의 면역화는 바이러스성 공격에 대하여 완벽한 또는 부분적인 보호를 제공한다. 몇몇 HSV 바이러스성 단백질은 잠재적인 면역 표적으로 분석되어 왔다. gC, ICP27, 또는 gD 단백질을 코드화하는 cDNA로 면역접종은 항원 특정 면역 반응 및 동물에 있어서 HSV로 말미암은 생체내 공격에 대한 보호를 유도하다는 것이 보여졌다. 최근에, 아단위 백신의 임상적 시도가 재발하는 HSN 감염으로부터 보호하는 것이 실패하였고, 이는 이러한 병원체에 대하여 더 효과적인 접근을 디자인하기 위하여 추가적인 관찰이 필요하다는 것을 지지한다. HSV-2 감염에 대한 보호적 면역의 유도에 대한 선택된 케모킨의 그러한 생체내 효과는 gD DNA 백신 구조와 더불어 플라스미드로서 그들을 상호주입함으로써 연구되었다. IL-8 및 MIP-1α 케모킨 유전자로서 상호면역된 그룹은, 보조약으로서 TNF-α를 사용한 경우와 유사한 방식으로, gD 면역 그룹보다 약간 높은 IgG 반응을 보였다. 게다가, 항원 특정 IgG 이소타이프 반응은 케모킨을 분자 보조약으로 사용함으로써 획득되었다. IL-8 및 RANTES는, gD DNA 백신만을 사용한 경우 또는 MCP-1 또는 TNF-β로서 상호주입한 경우와 비교하여, IgG2a 대 IgG1의 상대적인 비율이 심각하게 상승되었다. 그러나, IP-10 및 MIP-1α 유전자와의 상호주입은, IgG2a와 비교하여, 더 긍정적인 IgG1의 생산을 유도하였다. 그래서, 이러한 결과는 체액성 면역 반응에 있어서 Th1 또는 Th2로의 이동은 케모킨에 의해서 조절될 수 있다는 HIV 모델에 있어서의 기존의 발견을 확장하며, 케모킨은 생체내 시토킨 생산을 조절할 수 있다는 것을 다시 제시한다.

Th 세포 증식 및 C시 반응과 같은 in vitro 면역 패러메터는 세포 매개 면역의 잠재성을 평가하는데 사용되어 왔다. IL-8 및 RANTES와의 프라스미드 상호주입만이 단지 TNF-α 통제와 유사한 방식으로 좀 더 높은 Th 세포 증식을 유도하였다. il-8 상호주입은 gD DNA 백신만의 경우보다 매우 높은 IL-2 및 INF-γ 생산을 유도하는 것으로 귀결되었고, 더욱이 이는 상기 아이소타이프 결과를 지지하고 IL-8이 Th1 타입 세포성 면역 반응을 항원 종속형 방식으로 매개함을 입증한다. IL-8 상호주입은 또한 MCP-1, MIP-1, 및 RANTES 생산을 고양하며, 이는 IL-8이 생체내에서 β케모킨 생산을 증가시키게 된다는 것을 의미한다. RANTES 상호주입은 IFN-γ, IL-10, MIP-1α, 및 RANTES의 생산을 증대하나, IL-2 및 MCP-1의 생산을 감소시킨다. 이는 RANTES가 항원 특정 면역 반응을 HSV 모델에 있어서 IL-8과는 달리 매개한다는 것을 지적한다.

HSV 공격 연구에 있어서, gD 백신접종만으로는 HSV-2의 200LD50의 공격 접종원에서 63％의 생존율을 보였다. 케모킨 IL-8 및 RANTES cDNA를 상호 주입함으로써, 더 향상된 생존율(88％) 및 덜 심각한 헤르페스 손상이 얻어졌다. 반대로, 케 모킨 유전자(IP-10 및 MCP-1)의 상호 이송을 통하여, 공격받은 쥐들의 생존율이 25％로 낮아졌고, 이는 gD 백신만을 사용한 경우보다 전체적으로 50％이상 감소한 거이다. 유사하게, MIP-1α 상호주입은 또한 백신접종된 동물의 생존에 부정적인 영향을 미쳤다. 이러한 관찰은, 각각의 케모킨 그룹에서 테스트된 전체 동물 수를 고려할 때, 놀랄만하다(gD 단독 생존율, 13/18 [72％]; IL-8의 생존율. 17/18 [92％]; IP-10의 생존율, 7/18 [39％]; MIP-1α의 생존율, 10/18 [56％])(도 5). 이것은 IL-8 및 RANTES 케모킨 유전자는 치명적인 HSV 공격으로부터 보호 기능을 강화하고, 반면에 IP-10 및 MCP-1 및 좀 더 낮은 정도의 MIP-1α는 면역반응의 유도에도 불구하고 동물로 하여금 바이러스성 질병에 훨씬 걸리기 쉽게 한다. Th1 타입 시토킨 유전자는 치명적인 HSV 공격으로부터 보호 비율을 향상하고, 반면에 Th2 타입 시토킨 상호주입은 동물이 바이러스성 감염에 걸리기 쉽게 한다. 병원균적인 연구에 있어서, 병원체 감염으로부터 저항하기 위하여 시토킨 반응과 같은 Th1의 중요성은 알려져 왔다. 그래서, Th1 및/또는 Th2 면역 반응은 이러한 케모킨에 의해 구동되고 있으며, 면역반응의 질에 기초한 HSV 감염 공격으로부터의 보호에 영향을 미치게 된다.

TNF과의 경우, TNF-α 및 TNF-β 유전자 모두의 상호 주입은 공격받은 쥐들의 생존율을 25％ 감소시켰고, 이는 gD 백신만의 경우보다 전체적으로 50％이상 감소한 결과이다. 비록 TNF-α 유전자를 상호주입한 쥐들의 시토킨 생산 레벨(IL-2, IFN-γ, IL-10) 뿐만 아니라 gD 특정 항체 및 Th 세포 증식 수준도 gD DNA 백신만을 사용한 경우에 비하여 훨씬 더 높아졌으나, HSV-2 감염에 대한 TNF 시토킨 매개 가능성이 높음이 그러한 동물들에게서 관찰되었다. 이러한 관찰의 이유는 불명확하나, 반응의 질이 병원체 감염을 통제하기 위하여 심각하게 중요하다는 사실을 강력하게 지지하였다.

결론적으로, 상기 데이터는 케모킨은 Th1 및/또는 Th2 타입에 대한 면역반응을 항원 종속형 방식으로 조절할 수 있다. 그러한 활동은 이전에는 단지 시토킨과 관련되었다. 이러한 데이터는 항원 특정 면역의 유도에 있어서 케모킨은 시토킨과 같은 중심적 역할을 한다는 것을 암시한다. 이러한 사실은 감염성 질병에 대한 우리의 대처무기를 넓힌다. 게다가 암 치료를 위한 면역 반응을 조절하기 위하여 케모킨을 활용함은 또한 고려되어야 한다.

표 1

피코마바이러스 과(科)

속(屬): 리노바이러스: (의학) 보통 감기의 50%정도 신뢰.

에테로바이러스: (의학) 폴리오바이러스, 콕사키바이러스

에코바이러스, 및 A형 간염 바이러스와 같은 인간

엔테로바이러스 포함.

아프토바이러스: (수의학) 이는 구족병 바이러스임.

표적 항원: VP1, VP2, VP3, VP4, VPG

칼시바이러스 과

속: 노르워크 군(群)의 바이러스: (의학) 이들 바이러스는

유행성 위장염의 중요한 원인제임.

토가바이러스 과

속: 알파바이러스: (의학 및 수의학) 세닐리스 바이러스,

로스리버 바이러스, 및 동양 및 서양 말 뇌염을 포함.

레오바이러스: (의학) 루벨라 바이러스.

플라리비리듀 과

(의학) 뎅그열(dengue), 황열병, 일본뇌염, 세인트 루이스

뇌염, 및 틱본(tick borne) 뇌염 바이러스 포함.

C형 간염 바이러스: (의학) 이들 바이러스는 하나의 과(科)에 존재하지 않지만 토가바이러스 또는 플라비바이러스에 해당하는 것으로 판단. 토가바이러스 과와 상당한 유사성이 있음.

코로나바이러스 과: (의학 및 수의학)

전염성 기관지염 바이러스(양계)

불결 전염성 위장염 바이러스(돼지)

불결 헤마글루티네이팅 엔세팔로미엘리티스 바이러스(돼지)

고양이 전염성 복막염 바이러스(고양이)

고양이 장티푸스 코로나바이러스(고양이)

개 코로나바이러스(개)

보통 감기의 약 40% 의 원인이 되는 인간

호흡기 코로나바이러스: 예 224E, 0C43

주) 코로나바이러스는 Non-A, B 또는 C 형 간염을 유발시

킬 수도 있음.

표적 항원:

E1-M 또는 매트릭스 단백질이라고도 함

E2-S 또는 스파이크(spike) 단백질이라고도 함

E3-HE 또는 헤마글루틴-엘테로제 글리코프로테인이라고함 (모든 코로나바이러스에 존재하지 않음)

N-뉴클레오캅시드

라브도바이러스 과

속: 베실리오바이러스

리싸바이러스: (의학 및 수의학)

광견병

표적항원: G 단백질

N 단백질

필로비리듀 과: (의학)

마르버그(Marburg) 및 에볼라 바이러스와 같은

출혈열 바이러스

파라믹소바이러스 과:

속: 파라믹소바이러스: (의학 및 수의학)

이하선염 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스(닭의 중요한 병원체)

모빌리바이러스: (의학 및 수의학)

홍역, 개의 디스템퍼

뉴민바이러스: (의학 및 수의학)

호흡기 신시셜(syncytial) 바이러스

오로토믹소바이러스 과(의학)

독감 바이러스

분가바이러스 과

속: 분가바이러스: (의학) 캘리포니아 뇌염, LA 크로쎄

플레보바이러스: (의학) 리프트 밸리 열병

한타바이러스: 푸레말라는 헤마하긴 열병 바이러스임.

나이르바이러스(수의학): 나이로비 양 질병

기타 많은 분가바이러스

아레나바일스 과(의학)

LCM, 라싸 열병 바이러스

레오바이러스 과

속: 레오바이러스: 가능한 인간 병원체

로타바이러스: 어린이 급성 위장염

오르비바이러스: (의학 및 수의학)

콜로라도 틱(Tick) 열병, 레봄보(인간) 말 뇌염,

혀의 청색태

레트로바이러스 과

서브-과(Sub-Family) :

온코리비리날: (수의학)(의학) 고양이 백혈병 바이러스,

HTLVⅠ 및 HTLVⅡ

렌티비리날: (의학 및 수의학) HIV, 고양이 면역결필

바이러스, 말 전염병, 빈혈증 바이러스

스푸마비리날

파포바바이러스 과

서브-과:

폴리오마바이러스: (의학) BKU 및 JCU 바이러스

서브-과:

파필로마바이러스: (의학) 암 또는 악성 전이 유두종과

Claims

분리된 RANTES 단백질, RANTES 단백질을 암호화하는 핵산 분자 또는 이들의 조합 ; 및

분리된 IL-8 단백질, IL-8 단백질을 암호화하는 핵산분자 또는 이들의 조합;을 포함하는 것을 특징으로 하는;

병원체와 연관된 단백질, 암세포와 연관된 단백질, 자가면역 질병에 걸린 세포와 연관된 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나의 면역원에 대한 예방접종(vaccination)을 위한 조성물.
제1항에 있어서, 표적 단백질, 표적 단백질을 암호화하는 핵산분자 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 조절인자에 작동할 수 있도록 연결된 IL-8을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 조절인자에 작동할 수 있도록 연결된 RANTES를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서, 상기 플라스미드가 조절 인자에 작동할 수 있도록 연결된 면역원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서, 상기 면역원이 자가 면역 질병과 관련있는 세포에 연결된 항원, 병원체 항원 또는 암 관련 항원인 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서, 상기 면역원이 병원체 항원인 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서, 상기 면역원이 헤르페스 심플렉스 항원인 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서, 상기 헤르페스 심플렉스 항원이 HSV2gD인 것을 특징으로 하는 조성물.
상기 제1항 내지 제8항의 어느 한 항의 조성물을 포함하는;

병원체와 연관된 단백질, 암세포와 연관된 단백질, 자가면역 질병에 걸린 세포와 연관된 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나의 면역원에 대한 예방접종(vaccination)을 위한 주사용 의약 조성물.
분리된 RANTES 단백질, RANTES 단백질을 암호화하는 핵산분자 또는 이들의 조합;

분리된 IL-8 단백질, IL-8 단백질을 암호화하는 핵산분자 또는 이들의 조합; 및

표적 단백질, 표적 단백질을 암호화하는 핵산분자 또는 이들의 조합;

을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것으로 병원체와 연관된 단백질, 암세포와 연관된 단백질, 자가면역 질병에 걸린 세포와 연관된 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나의 면역원에 대한 예방접종(vaccination)을 위해 상기 인간을 제외한 개체의 면역반응을 유도하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 인간을 제외한 개체에 RANTES 단백질을 암호화하는 핵산분자, IL-8 단백질을 암호화하는 핵산분자, 및 표적 단백질을 암호화하는 핵산분자를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 인간을 제외한 개체에 RANTES 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, IL-8 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 표적 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 인간을 제외한 개체에 둘 이상의 다른 플라스미드를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 둘 이상의 다른 플라스미드는 RANTES 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, IL-8 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 표적 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 집합적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
상기 제11항 내지 제13항의 어느 한 항에 있어서, 상기 인간을 제외한 개체에 RANTES 단백질, IL-8 단백질, 표적 단백질 또는 이들의 조합을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 표적 단백질이 자가 면역질병과 관련있는 세포에 연결된 항원, 병원체 항원 또는 암 관련 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 면역원이 병원체 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 단백질이 헤르페스 심플렉스 바이러스 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 표적 단백질이 헤르페스 심플렉스 바이러스 항원 HSV2gD인 것을 특징으로 하는 방법.
분리된 RANTES 단백질, RANTES 단백질을 암호화하는 핵산 분자 또는 이들의 조합; 및

분리된 IL-8 단백질, IL-8 단백질을 암호화하는 핵산분자 또는 이들의 조합;

을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계로 포함하는 것을 특징으로 하는 것으로 병원체와 연관된 단백질, 암세포와 연관된 단백질, 자가면역 질병에 걸린 세 포와 연관된 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나의 면역원에 대한 예방접종(vaccination)을 위한 인간을 제외한 개체 면역 시스템을 조절하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 인간을 제외한 개체에 RANTES 단백질을 암호화하는 핵산분자와 IL-8 단백질을 암호화하는 핵산분자를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 인간을 제외한 개체에 RANTES 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 IL-8 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 인간을 제외한 개체에 둘 이상의 다른 플라스미드를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 둘 이상의 다른 플라스미드는 RANTES 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 IL-8 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 집합적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제19항 내지 제22항의 어느 한 항에 있어서, 상기 인간을 제외한 개체에 RANTES 단백질,IL-8 단백질 또는 이들의 조합을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
조절 인자에 작동할 수 있도록 연결된 면역원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, IL-8을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 RANTES를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합형 백신.
제24항에 있어서, 상기 면역원이 자가 면역질병과 관련있는 세포에 연결된 항원, 병원체 항원 또는 암 관련 항원인 것을 특징으로 하는 재조합형 백신.
제24항에 있어서, 상기 면역원이 병원체 항원인 것을 특징으로 하는 재조합형 백신.
제24항의 재조합형 백신을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원에 대하여 인간을 제외한 개체 내의 면역반응을 유도하기 위한 방법.
제24항에 있어서, 상기 재조합형 백신이 재조합형 바씨니아 백신인 것을 특징으로 하는 재조합형 백신.
IL-8을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 RANTES를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 살아있는 약독성 병원체.
제29항의 살아있는 약독성 병원체를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는;

병원체에 대한 예방접종(vaccination)을 위해 인간을 제외한 개체를 면역시키기 위한 방법.