CN1287850C - 疫苗、免疫治疗剂及它们的使用方法 - Google Patents

Abstract

公开了含有分离的RANTES蛋白和/或编码RNATES蛋白的核酸分子以及分离的IL-8蛋白和/或编码IL-8蛋白的核酸分子的组合物，该组合物还任选地含有免疫原和/或编码免疫原的核酸分子。还公开了诱导个体产生针对免疫原的免疫反应的方法，该方法包括向所述个体给予分离的RANTES蛋白和/或编码RNATES蛋白的核酸分子以及分离的IL-8蛋白和/或编码IL-8蛋白的核酸分子，以及附加的靶蛋白质和/或编码靶蛋白质的核酸分子。还公开了调节个体免疫系统的方法，该方法包括向所述个体给予分离的RANTES蛋白和/或编码RNATES蛋白的核酸分子以及分离的IL-8蛋白和/或编码IL-8蛋白的核酸分子。此外，还公开了含有编码IL-8的核酸分子和编码RANTES的核酸分子的重组疫苗——活的减毒病原体以及使用方法。

Description

疫苗、免疫治疗剂及它们的使用方法

发明领域

本发明涉及改善的疫苗、使个体对免疫原产生预防性和/或治疗性免疫的改善方法，以及改善的免疫治疗剂组合物及改善的免疫疗法。

发明背景

免疫治疗指调节人的免疫反应，使其产生需要的治疗效果。免疫治疗剂指当给予个体时，调节该个体的免疫系统，足以最终减少与不利的免疫反应相关的症状或者最终减轻由于增加所需的免疫反应而导致的症状的组合物。

在一些例子中，免疫疗法是接种方案中的一部分，其中，个体接受疫苗，使其暴露于免疫原中，针对这种免疫原，该个体产生了免疫反应。在这些例子中，免疫治疗剂增加了免疫反应和/或选择性地增强了一部分免疫反应(如细胞性的或体液性的)，这部分免疫反应对治疗或预防特殊的病症、感染或疾病是需要的。

在一些例子中，免疫治疗剂以没有免疫原的形式传送。在这些例子中，提供这些免疫治疗剂，用以通过降低或抑制免疫反应、增强或增加免疫反应、降低或抑制部分免疫系统、或者增强或增加部分免疫系统而调节免疫系统。

在一些例子中，免疫治疗剂包括在体内给予时与调节免疫反应所涉及的蛋白质结合的抗体。抗体与调节免疫反应所涉及的蛋白质之间的相互作用导致个体中免疫反应的变化。例如，如果蛋白质在自身免疫疾病中涉及到，则抗体可以抑制该蛋白质的这方面活性，并减少或消除症状或疾病。

可使用疫苗使个体针对靶抗原如变态原、致病抗原或与人的疾病中涉及的细胞相关的抗原产生免疫。与人疾病中涉及的细胞相关的抗原包括癌症相关的肿瘤抗原和自身免疫疾病中涉及的细胞相关的抗原。

在设计这类抗原时，已认识到在接种个体的细胞中产生靶抗原的疫苗能有效诱导免疫系统的细胞武装。具体而言，活的减毒疫苗、使用有毒力的载体的重组疫苗以及DNA疫苗各自导致抗原在接种个体的细胞中生产，其结果诱导了免疫系统的细胞武装。另一方面，虽然死亡的或灭活的疫苗和仅仅含有蛋白质的亚单元疫苗诱导体液反应，但是它们不诱导细胞免疫反应。

常常需要细胞免疫反应提供针对病原体感染的保护，和针对病原体感染、癌症或自身免疫疾病的有效的免疫介导的治疗。因此，在接种个体的细胞中产生靶抗原的疫苗，如活的减毒疫苗、使用有毒力的载体的重组疫苗以及DNA疫苗常常是优选的。

虽然这类疫苗常常使个体有效地产生针对病原体感染或人疾病的预防性或治疗性的免疫，但是仍需要改进的疫苗。需要生产增强的免疫反应的组合物和方法。

同样，虽然一些免疫治疗剂可用于调节患者的免疫反应，但是仍需要改善的组合物和方法。

发明概要

本发明涉及一种组合物，该组合物含有分离的RANTES蛋白和/或编码RANTES的核酸分子以及分离的IL-8蛋白和/或编码该蛋白的核酸分子。

本发明还涉及一种组合物，该组合物含有分离的RANTES蛋白和/或编码RANTES的核酸分子以及分离的IL-8蛋白和/或编码该蛋白的核酸分子，以及靶蛋白质和/或编码该靶蛋白质的核酸分子。

本发明涉及可注射的药物组合物，它含有分离的RANTES蛋白和/或编码此蛋白的核酸分子，以及分离的IL-8蛋白和/或编码该蛋白的核酸分子。

本发明涉及可注射的药物组合物，它含有分离的RANTES蛋白和/或编码RANTES的核酸分子以及分离的IL-8蛋白和/或编码该蛋白的核酸分子，以及靶蛋白质和/或编码该靶蛋白质的核酸分子。

本发明还涉及在个体中诱导针对免疫原的免疫反应的方法，该方法包括向个体给予分离的RANTES蛋白和/或编码RANTES的核酸分子以及分离的IL-8蛋白和/或编码该蛋白的核酸分子，以及靶蛋白质和/或编码该靶蛋白质的核酸分子。

本发明还涉及调节个体的免疫系统的方法，该方法包括向该个体给予分离的RANTES蛋白和/或编码RANTES的核酸分子以及分离的IL-8蛋白和/或编码该蛋白的核酸分子。

本发明还涉及重组疫苗，该疫苗含有操作性连接于调节元件的编码免疫原的核苷酸序列、编码IL-8的核苷酸序列和编码RANTES核苷酸序列，本发明还涉及在个体中诱导针对免疫原的免疫反应的方法，该方法包括向个体给予这样的重组疫苗。

本发明还涉及一种活的减毒病原体，它含有编码IL-8的核苷酸序列和编码RANTES的核苷酸序列，本发明还涉及在个体中诱导针对病原体的免疫反应的方法，该方法包括向个体给予该活的减毒疫苗。

附图的简短描述

图1显示在实施例所述的试验中，经DNA载体免疫的小鼠(Balb/c)中全身性gD-特异性的水平。在第0周和第2周，每组小鼠用gD DAN疫苗(每只小鼠60μg)加趋化因子基因(每只小鼠40μg)或TNF基因(每只小鼠40μg)进行免疫。第二次免疫2周后取小鼠的血样，然后等量集中每组小鼠的血清，逐次稀释，用于与gD反应。测定ELISA效价，以显示与空白对照小鼠的血清相同的光密度的最高血清稀释度的倒数计。在405nm测量吸光度(O.D.)。

图2A和2B显示在实施例所述的试验中，经DNA载体免疫的小鼠(Balb/c)中IgG亚类的水平。在图2A中，在第0周和第2周，每组小鼠用gD DAN疫苗(每只小鼠60μg)加趋化因子基因(每只小鼠40μg)或TNF基因(每只小鼠40μg)进行免疫。在最后一次免疫的2周后，取小鼠的血样，然后将其稀释为1∶100，用于与gD的反应。在405nm测量吸光度。以各IgG亚类的光密度/总的光密度计算相对光密度。直线杆表示各小鼠IgG亚类的相对光密度的平均值(n＝10)。图2B显示IgG2a与IgG1的相对比值。用平均的(n＝10)IgG2a水平除以各免疫组中的平均IgG1水平。^*进行Student t检测，结果与单独的gD DNA疫苗的各相应同种型相比，统计学的显著性为P＜0.05。

图3A、3B和3C显示在实施例所述的试验中，经α趋化因子cDNA(图3A)、β趋化因子cDNA(图3B)和TNF对照(图3C)共免疫的小鼠(Balb/c)，在体外gD刺激后脾细胞的Th细胞增殖水平。在第0周和第2周，每组小鼠用gD DNA疫苗(每只小鼠60μg)加趋化因子基因(每只小鼠40μg)或TNF基因(每只小鼠40μg)进行免疫。进行最后一次DNA注射的2周后，处死两只小鼠，集中它们的脾细胞用于增殖检测。用1μg/ml和5μg/ml的gD-2蛋白刺激脾细胞，并用5μl/ml的PHA作为阳性对照。在刺激3天后，收集细胞，并计算cpm。检测了3份样品。图中显示具有类似的结果的三个分离试验之一的结果。PHA对照样品显示了40-50的刺激指数。进行Student t检测，其结果与单独的gD DNA疫苗相比，统计学显著性为P＜0.05。

图4A、4B和4C显示在实施例所述的试验中，经gD DNA疫苗加α趋化因子cDNA(图4A)、β趋化因子cDNA(图4B)和TNF对照(图4C)免疫的小鼠(Balb/c)的存活比例。在第0周和第2周，每组小鼠用gD DAN疫苗(每只小鼠60μg)加趋化因子基因(每只小鼠40μg)或TNF基因(每只小鼠40μg)进行免疫。第二次免疫后3周，用200LD₅₀的HSV-2186株(7×10⁵PFU)阴道内注射(i.vag.)刺激小鼠。然后每天检查这些小鼠，评估其存活比例。存活的小鼠在61天后用病毒刺激。一旦出现预期的结果就重复这种刺激。

图5显示在实施例所述的试验中，趋化因子共注射间的保护比例的区别。圆括号中的数值是存活的动物/总的测试数量之比的数值。

发明的详细描述

在本文中，术语“免疫调节蛋白”指RANTES蛋白和IL-8蛋白。

术语“靶蛋白质”在本文中指由本发明的基因构建物编码的肽和蛋白质，它们起到免疫反应中的靶蛋白质的作用。术语“靶蛋白质”和“免疫原”交替使用，都指引起免疫反应的蛋白质。靶蛋白质是免疫原性的蛋白质，它具有从病原体或不需的细胞类型如癌细胞或自身免疫疾病中涉及的免疫反应需要的细胞得到的至少一个表位。针对靶蛋白质的免疫反应将保护个体不受到与该靶蛋白质相关的特殊感染或疾病的伤害，和/或治疗该个体的这些感染或疾病。

术语“遗传构建物”在本文中指DNA或RNA分子，这类分子含有编码靶蛋白质或免疫调节蛋白的核苷酸序列。该编码序列包括操作性连接于调节元件的起始和终止信号，包括能指导接受该核酸分子的个体的细胞中的表达的启动子和聚腺苷酸化信号。

术语“可表达形式”在本文中指基因构建物，它含有操作性连接于编码靶蛋白质或免疫调节蛋白的编码序列的必需的调节元件，这样当存在于个体的细胞中时此编码序列可被表达。

术语“共享一个表位”在文中指含有至少一个与另一蛋白质的表位相同或基本上类似的表位的蛋白质。

术语“基本上类似的表位”在本文中指其结构与蛋白质的表位不同，但引起与该蛋白质相互作用的细胞或体液免疫反应的的表位。

在本文中，术语“细胞内病原体”指一种病毒或致病的生物体，它们至少有部分生殖期或生活周期存在于宿主细胞中，并且在那生产致病的蛋白质或引起这类蛋白质的生产。

在本文中，术语“过度增殖性疾病”指其特征为细胞的过度增殖的那些疾病和病症。

在本文中，术语“过度增殖性疾病相关的蛋白质”指与过度增殖性疾病相关的蛋白质。

本发明以使用IL-8和RENTES的组合调节免疫反应的发现为基础。因此，这些蛋白质的组合和/或编码这些蛋白质的核酸分子可作为免疫治疗剂而传送，或者与疫苗一起传送，或者作为疫苗的成分。已发现RANTES和IL-8的组合可驱动抗原特异性的Th1型免疫反应，并在作为疫苗的一部分给予时增强保护性免疫性。

诱导并增强CTL应答的免疫调节蛋白质，在与针对细胞内病原体或者自身免疫疾病或癌症相关细胞的疫苗一起给予，或者作为它们的一部分给予时特别有用。诱导并增强CTL应答的免疫调节蛋白质，在与活的减毒疫苗、细胞疫苗、重组疫苗和核酸/DNA疫苗一起给予时特别有用。或者，诱导并增强CTL应答的免疫调节蛋白可用作免疫治疗剂，可将这类治疗剂给予癌症或细胞内传染的患者。诱导并增强CTL应答的免疫调节蛋白质可用于给予免疫妥协的患者。

诱导并增强T细胞增殖反应的免疫调节蛋白在与疫苗一起给予或作为其一部分给予时特别有用。或者，诱导并增强T细胞增殖反应的免疫调节蛋白可用作免疫治疗剂。诱导并增强T细胞增殖反应的免疫调节蛋白可用于给予免疫妥协的患者。

RANTES的核苷酸和氨基酸序列的GENBANK登记号是M21121，本文将其纳入作为参考。Schall，T.J.等〔J.Immunol.，141，1018-1025(1988)〕描述了RANTES，本文将其纳入作为参考。

IL-8的核苷酸和氨基酸序列的GENBANK登记号是M28130，本文将其纳入作为参考。Mukaida，N.等〔J.Immunol.，143(4)，1366-1371(1989)〕描述了IL-8，本文将其纳入作为参考。

根据本发明的一些实施例，将IL-8和RANTES的组合传送给个体，以调节该个体免疫系统的活性。可将IL-8和RANTES各自独立地直接以蛋白质形式传送，和/或以含有操作性连接于在该个体中表达所需的调节元件的编码该蛋白质的核苷酸序列的核酸分子形式传送。当这些核酸分子被个体的细胞摄取时，编码该蛋白质的核苷酸序列在细胞中表达，从而将该蛋白质传送给该个体。本发明提供传送IL-8蛋白和/或编码该蛋白的核酸分子以及RANTES蛋白和/或编码该蛋白的核酸分子，以及传送它们的组合物。因此，本发明的一些实施例涉及含有RANTES蛋白和/或编码该蛋白的核酸分子与IL-8蛋白和/或编码该蛋白的核酸分子的组合。根据一些实施例，这些组合物含有选自以下的组合：1)RANTES蛋白和IL-8蛋白；2)编码RANTES蛋白的核酸分子和编码IL-8蛋白的核酸分子；3)RANTES蛋白和编码IL-8蛋白的核酸分子；4)IL-8蛋白和编码RANTES的核酸分子；5)RNATES蛋白、IL-8蛋白和编码IL-8蛋白的核酸分子；6)RANTES蛋白和IL-8蛋白以及编码RANTES蛋白的核酸分子；7)RANTES蛋白和编码RANTES蛋白的核酸分子以及编码IL-8蛋白的核酸分子；8)IL-8蛋白和/或编码RANTES蛋白的核酸分子以及编码IL-8的核酸分子；和9)RANTES蛋白和编码RANTES蛋白的核酸分子以及IL-8蛋白和编码IL-8蛋白的核酸分子。

根据本发明的一些实施例，传送给个体以调节该个体免疫系统的活性的IL-8和RANTES的组合可与疫苗一起给予。根据本发明的一些方面，提供了使个体产生针对病原体或异常的疾病相关的细胞的预防性和/或治疗性免疫的组合物和方法。IL-8和RANTES可各自独立地直接以蛋白质形式传送，和/或以含有操作性连接于在该个体中表达所需的调节元件的编码该蛋白质的核苷酸序列的核酸分子形式传送。当这些核酸分子被个体的细胞摄取时，编码该蛋白质的核苷酸序列在细胞中表达，从而将该蛋白质传送给该个体。疫苗可以是任何类型的疫苗，如亚单元或蛋白质疫苗、死亡的或灭活的疫苗、活的减毒疫苗、细胞疫苗、重组疫苗或核酸或DNA疫苗。在活的减毒疫苗、细胞疫苗、重组疫苗或核酸或DNA疫苗的例子中，RANTES蛋白和/或IL-8蛋白可由这些疫苗的核酸分子编码。通过传送IL-8蛋白和/或编码IL-8的核酸分子以及RANTES蛋白和/或编码该蛋白的核酸分子，可调节由疫苗诱导的免疫反应，具体是通过增强细胞武装来进行调节。根据一些实施例，这些组合物含有诸如蛋白质疫苗和/或死亡的疫苗和/或灭活的疫苗和/或活的减毒疫苗和/或重组疫苗和/或DNA疫苗之类的疫苗，以及和/或另外包括以下组合：1)RANTES蛋白和IL-8蛋白；2)编码RANTES蛋白的核酸分子和编码IL-8蛋白的核酸分子；3)RANTES蛋白和编码IL-8蛋白的核酸分子；4)IL-8蛋白和编码RANTES的核酸分子；5)RNATES蛋白、IL-8蛋白和编码IL-8蛋白的核酸分子；6)RANTES蛋白和IL-8蛋白以及编码RANTES蛋白的核酸分子；7)RANTES蛋白和编码RANTES蛋白的核酸分子以及编码IL-8蛋白的核酸分子；8)IL-8蛋白和/或编码RANTES蛋白的核酸分子以及编码IL-8的核酸分子；和9)RANTES蛋白和编码RANTES蛋白的核酸分子以及IL-8蛋白和编码IL-8蛋白的核酸分子。

下面是制备和给予蛋白质形式的免疫调节蛋白的描述，和编码这些免疫调节蛋白的核酸分子的制备和给予的描述。如文中所述，本发明的组合物和方法可包括蛋白质和核酸的组合，以及仅仅含有蛋白质的组合物和方法，和仅含有核酸的组合物和方法。因此，下面的描述包括将蛋白质和核酸的组合的用途包括在内的组合物和方法。

如上所述，为了调节免疫反应，可将RANTES蛋白和/或IL-8蛋白以免疫治疗和/或疫苗方案的一部分给予。可采用重组方法制备免疫调节蛋白，采用标准的蛋白质合成技术合成，或从天然的来源中分离和纯化。可产生生产与该蛋白质结合的抗体的杂交瘤，并在分离和纯化方法中使用。已分离出编码这种蛋白质的cDNA，并对其进行测序，将其掺入包括引入宿主细胞中然后重组表达蛋白质的表达载体在内的载体中。

编码任一免疫调节蛋白的分离的cDNA可用作构建可生产该免疫调节蛋白的重组表达载体中的起始材料。将该cDNA掺入载体中，包括被引入宿主细胞中然后重组表达蛋白质的表达载体。

采用标准的技术和易于获得的起始原料，可制备编码免疫调节蛋白的核酸分子。可将该核酸分子掺入表达载体中，然后将该表达载体引入宿主细胞。用在已知的用于蛋白质的生产重组表达系统中的宿主细胞是已知的，并且易于获得。宿主细胞的例子包括细菌细胞如大肠杆菌(E.coli)、酵母细胞如酿酒酵母(S.cerevisiae)、昆虫细胞如草地贪夜蛾(S.frugiperda)、非人哺乳动物组织培养细胞中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和人组织培养细胞如HeLa细胞。

在一些实施例中，例如，本领域普通的技术人员可采用已知的技术将DNA分子插入市售获得的用于已知的表达系统的表达载体中。例如，市售获得的质粒pSE420(Invitrogen，San Diego，CA)可用于在大肠杆菌中生产免疫调节蛋白。市售获得的质粒pYES2(Invitrogen，San Diego，CA)可用于如在酵母的酿酒酵母中进行蛋白质的生产。市售获得的MAXBAC^TM完全杆状病毒表达系统(Invitrogen，San Diego，CA)用于如在昆虫细胞中进行蛋白质的生产。市售获得的质粒pcDNA I或pcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)可用于如在哺乳动物的细胞如中国仓鼠卵巢细胞中进行蛋白质的生产。本领域普通的技术人员可使用这些市售获得的表达载体和系统或其他载体和系统，采用常规的技术进而易于获得的起始材料来生产免疫调节蛋白。〔例如参见Sambrook等，《分子克隆实验手册》，第二版，ColdSpring Harbor出版社(1989)，本文将其纳入作为参考)。因此，可在原核系统和真核系统中制备所需的蛋白质，得到加工形式的蛋白质的谱带。

本领域普通的技术人员可使用其他的市售表达载体和系统，或者采用已知的方法和易于获得的起始材料生产载体。易于获得含有必需的控制序列如启动子和聚腺苷酸化信号以及优选的增强子的表达系统，且在本领域中在各种宿主中都是已知的。例如参见Sambrook等，《分子克隆实验手册》，第二版，Cold Spring Harbor出版社(1989)。

将包括编码免疫调节蛋白的DNA的表达载体用于转化匹配的宿主，然后在使该外源DNA表达的条件下培养和维持该宿主。采用适当的以及本领域熟练的技术人员已知的技术，通过裂解细胞或者采用从培养基中回收的技术，从培养基中回收由此获得的本发明蛋白质。本领域普通的技术人员可采用已知的技术分离出使用这类表达系统产生的免疫调节蛋白。使用抗体从自然来源中纯化蛋白质的方法同样可用于纯化重组DNA方法产生的蛋白质。

可将免疫调节蛋白配制成药物组合物。适当的药物载体在本领域的一个标准参考文本Remington′s Pharmaceutical Science，A.Osol中描述，本文将其纳入作为参考。可采用使活性制剂到达靶细胞的任何方法给予本发明的药物组合物。因为当口服给予的肽会被消化，所以，通常采用肠道外给药，即静脉内、皮下、经皮、肌肉内给药来使吸收到达最佳程度。静脉内给药可在灌注泵的帮助下得以实现。本发明的药物组合物可以配制成乳化液。或者，可将它们配制成气溶胶药剂，用于鼻内或吸入给药。在一些例子中，可能需要局部给药。

给药的剂量根据如下因素而变：药物动力学特征；给药的方式和途径；接受者的年龄、健康和体重；症状的性质和程度；同时进行治疗的种类；以及治疗的频率。通常，蛋白质的剂量可以约为每50千克体重1-3000毫克蛋白质，较佳是每50千克体重10-1000毫克蛋白质，更佳是每50千克体重25-800毫克蛋白质。通常每天向个体给予8-800毫克，以分开的剂量给予，一天1-6次，或者以持续的方式给予，以有效获得所需的效果。用于局部给药的制剂可包括经皮补片、油膏、洗剂、霜、凝胶、滴剂、栓剂、喷剂、液体和粉末。常规的药学载体、水溶液、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必需的或需要的。口服的组合物包括粉末或粒剂、悬浮液或水溶液或者非水介质中的溶液、胶囊、小袋或片剂。可能需要增稠剂、增香剂、稀释剂、乳化剂、分散剂或结合剂。用于肠道外、静脉内、鞘内或者心室内给药的组合物包括无菌的水溶液，该水溶液还可含有缓冲液、稀释剂和其他合适的添加剂，优选是无菌的和无热原质的水溶液。适用于静脉内给药的本发明药物组合物无菌且无热原质。

对于肠道外给药，蛋白质可以如被配制成与药学上可接受的肠道外载体组合的溶液、悬浮液、乳化液或冻干粉末。这类载体的例子是水、盐水、林格溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可使用脂质体和非水载体。载体或冻干粉末可含有维持等渗性(如氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(如缓冲液和防腐剂)用的添加剂。可采用常规的技术给制剂灭菌。例如，通过将1.5重量％的活性成分溶解在0.9％的氯化钠溶液中而制得适合用于注射给药的肠道外组合物。

可采用使活性成分到达其在哺乳动物体内的作用位点的任何方法给予本发明的药物组合物。根据所需的是局部还是全身性的治疗以及要治疗的区域，可以各种方法给予本发明的药物组合物。给药可以是局部的(包括眼、阴道、直肠、鼻内、经皮)、口腔或肠道外的给药。肠道外给药包括静脉滴注；皮下、腹膜内或肌肉内注射；肺部给药，如采用吸入法或吹入法；或者鞘内或心室内给药。

在一些实施例中，通过给予含有编码IL-8和/或RANTES蛋白的核苷酸序列的核酸分子，使其在被细胞摄取后表达产生这两种蛋白质，从而实现它们的传送。除了本发明直接给予IL-8和RANTES蛋白的实施例以外，一些实施例还包括同时传送编码这些蛋白质的核酸分子，和/或用这类核酸分子替换它们所编码的蛋白质。在一些实施例中，编码这两种蛋白质的核苷酸序列在单个核酸分子上。在一些实施例中，组合物含有两个核酸分子，编码一种蛋白质的核苷酸序列在一个核酸分子上，编码另一蛋白质的核苷酸序列在另一核酸分子上。在一些实施例中，组合物含有两个核酸分子，编码一个蛋白质的核苷酸序列在一个核酸分子上，编码两个蛋白质的核苷酸序列在另一核酸分子上。

本发明还涉及用于传送免疫调节蛋白的组合物和使用这类组合物的方法。本发明涉及含有操作性连接于调节元件的编码IL-8的核苷酸序列和/或操作性连接于调节元件的编码RANTES的核苷酸序列的核酸分子。本发明还涉及可注射的药物组合物，该组合物含有这类核酸分子。

可采用任何几种本领域已知的技术，包括DNA注射(还称为DNA接种)、重组载体如重组腺病毒、重组腺病毒相关的病毒和重组疫苗，传送含有操作性连接于调节元件的编码IL-8的核苷酸序列和/或操作性连接于调节元件的编码RANTES的核苷酸序列的核酸分子。

美国专利第5593972、5739118、5817637、5830876、5962428、5981505、5580859、5703055、5676594号以及本文所引用的优先权申请描述了DNA疫苗，本文将它们纳入作为参考。除了这些申请中描述的传送方案外，在美国专利第4945050号和第5036006号中还描述了传送DNA的替换方法，本文将它们纳入作为参考。

给药途径包括，但不局限于，肌内、鼻内、腹膜内、真皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和口服，以及局部、透皮、通过吸入或栓剂或至粘膜组织，例如灌洗阴道、直肠、尿道、口腔颊部和舌下组织。较佳的给药途径包括粘膜组织、肌内、腹膜内、真皮内和皮下注射给药。遗传构建物的给药手段包括但不局限于，传统的注射器、无针注射装置或“微粒轰击基因枪”。

当遗传构建物被细胞摄取时，它们可留在细胞内作为功能性的染色体外分子，和/或整合到细胞的染色体DNA中。可以将DNA以质粒形式作为分离的遗传物质引入细胞。或者，可将能够与染色体整合的线性DNA引入细胞。在将DNA引入细胞后，可以加入促进DNA整合到染色体中的试剂。也可以在DNA分子内包含促进整合的DNA序列。或者，可以将RNA引入细胞。也可以考虑提供一种线性小染色体形式的遗传构建物，它具有着丝粒、端粒和复制起点。基因构建物可以作为部分遗传物质留在生活于细胞内的减毒活微生物或重组微生物载体内。基因构建物可以是重组病毒疫苗的基因组部分，此时，遗传物质或者整合到细胞染色体内，或者留存在染色体外。

遗传构建物包括核酸分子基因表达所需的调控元件。这些元件包括：启动子、起始密码子、终止密码子和聚腺苷酸化信号。此外，为了编码靶蛋白或免疫调节蛋白的序列的基因表达，常需要增强子。这些元件必须与编码所需蛋白的序列操作性相连，而且这些调控元件必须在所给予的个体内可操作。

起始密码子和终止密码子一般认为是编码所需蛋白的核苷酸序列的一部分。但是，这些元件在给予基因构建物的个体内必须是有功能的。起始密码子和终止密码子必须与编码序列在同一读码框内。

所使用的启动子和聚腺苷酸化信号必须在个体的细胞中起作用。

用于实施本发明，尤其是在人用遗传疫苗的生产中使用的启动子的例子，包括但不限于猿病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)的启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)的启动子如HIV长末端重复序列(LTR)的启动子、Moloney病毒启动子、ALV启动子、巨细胞病毒(CMV)的启动子例如CMV立即早期启动子、EB病毒的启动子、Rous肉瘤病毒(RSV)的启动子，以及例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌酸、人金属硫蛋白等人基因的启动子。

用于实施本发明，尤其是用于生产人用基因疫苗的聚腺苷酸化信号的例子包括但不限于SV40聚腺苷酸化信号和LTR聚腺苷酸化信号。特别是，本发明使用的是位于pCEP4质粒(Invitrogen，San Diego CA)内的SV40聚腺苷酸化信号，文中称为SV40聚腺苷酸化信号。

除了DNA表达必需的调控元件外，DNA分子内还可以包含其它元件。这些附加的元件包括增强子。增强子可以选自但不限于：人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌酸和诸如CMV、RSV和EBV等病毒的增强子。

为了使构建物保留在染色体外并在细胞内产生构建物的多个拷贝，可以提供具有哺乳动物复制起点的遗传构建物。Invitrogen(San Diego CA)的质粒pCEP4和pREP4含有EB病毒复制起点和产生高拷贝游离复制产物而不整合的核抗原EBNA-1编码区域。

在有关免疫接种应用的一些较佳实施方案中，输送的核酸分子包括编码靶蛋白、免疫调节蛋白和进一步加强针对这些靶蛋白的免疫应答的蛋白的基因的核苷酸序列。这些基因的例子是编码其它细胞因子和淋巴因子的基因，例如编码α干扰素、γ干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNF、上皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和IL-12的基因。在一些实施方案中，用于免疫接种组合物的遗传构建物中宜包含GM-CSF的基因。

如果出于某种原因需要消除接受该遗传构建物的细胞，可以加入作为细胞自毁靶子的其它元件。可以在遗传构建物中加入可表达形式的疱疹胸苷激酶(tk)基因。可以给予个体药物甘克洛福(gangcyclovir)，该药将选择性地杀灭所有产生tk的细胞，从而提供了选择性破坏具有该遗传构建物的细胞的方法。

如果出于任何原因，需要消除接受了遗传构建物的细胞，则可加入一种附加的元件，将其作为破坏细胞的靶标。可在该遗传构建物中包含可表达形式的疱疹胸苷激酶(tk)基因。可向个体给予药物9-〔1，3-二羟-2-丙氧甲基〕鸟嘌呤(gangcyclovir)，该药物将选择杀死生产tk的任何细胞，从而提供选择破坏具有该遗传构建物的细胞的方法。

为了尽可能扩大蛋白的生产，可以选择调控序列使得它们很好地适合于在给予构建物的细胞内表达基因。而且，可以选择在细胞内最有效转录的密码子。本领域普通技术人员能够制造在细胞内具有功能的DNA构建物。

本发明的一个方法包括以肌内、鼻内、腹膜内、皮下、经皮或局部或者灌洗选自吸入、阴道、直肠、尿道、口腔和舌下的粘膜组织的方式给予核酸分子。

在有些实施方案中，将核酸分子与多核苷酸功能增强剂或遗传疫苗促进剂一起输送给细胞。多核苷酸功能增强剂在1993年1月26日提交的美国专利申请08/008,342，1993年3月11日提交的美国专利申请08/029,336，1993年9月21日提交的美国专利申请08/125,012以及1994年1月26日提交的国际专利申请PCT/US94/00899中有所描述，以上申请均被纳入本文作为参考。遗传疫苗促进剂在1994年4月1日提交的美国专利申请08/221,579中有所描述，该文也被纳入本文作参考。与核酸分子联合给予的辅助剂可以与核酸分子混合给予，或者在给予核酸分子的同时、之前或之后分开给予。此外，具有转染剂和/或复制剂和/或促炎剂功能并能和GVF一同给予的其它物质包括生长因子、细胞因子和淋巴因子，例如α干扰素、γ干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNF、上皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12以及成纤维细胞生长因子，表面活性剂(如免疫刺激性复合物(ISCOMS))，弗氏不完全佐剂，LPS类似物〔包括单磷酸脂A(MPL)〕，胞壁酰肽，醌类似物和诸如角鲨烯和角鲨烯之类的泡囊，和透明质酸，它们可以和遗传构建物联合给予。在一些实施方案中，免疫调节蛋白可用作GVF。

本发明的药物组合物含有大约1毫微克至2000微克DNA。在一些较佳的实施方案中，本发明的药物组合物含有大约5毫微克至1000微克DNA。在一些较佳的实施方案中，该药物组合物含有大约10毫微克至800微克DNA。在一些较佳的实施方案中，该药物组合物含有大约0.1至500微克DNA。在一些较佳的实施方案中，该药物组合物含有大约1至350微克DNA。在一些较佳的实施方案中，该药物组合物含有大约25至250微克DNA。在一些较佳的实施方案中，该药物组合物含有大约100至200微克DNA。

本发明的药物组合物可根据所用的给药方式来配制。当药物组合物是可注射的药物组合物时，它们是无菌、无热原和无颗粒的。宜采用等渗的制剂。通常，等渗性添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖、山梨糖和乳糖。在一些情况下，等渗溶液如磷酸缓冲盐溶液是较佳的。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，在制剂中加入血管收缩剂。

根据本发明的一些实施方案，提供了诱导针对免疫原的免疫反应的方法，该方法包括向个体传送免疫原IL-8和RANTES的组合。根据本发明的一些实施方案，传送以蛋白质形式或其编码核酸分子的IL-8和RANTES的制剂以疫苗组合物的成分或者作为其补充物一起给予。该疫苗可以是亚单位疫苗、杀死的疫苗、活的减毒疫苗、细胞疫苗、重组疫苗或核酸或DNA疫苗。在活的减毒疫苗、细胞疫苗、重组疫苗或核酸或DNA疫苗的例子中，IL-8和RANTES可由这些疫苗的核酸分子编码。或者或此外，IL-8和/或RANTES蛋白可用作佐剂。

根据一些实施方案，免疫原IL-8和RANTES可各自独立地以蛋白质形式直接传送，和/或以含有操作性连接于在个体中表达所需的调节元件的编码该蛋白质的核苷酸序列的核酸分子的形式传送。当这些核酸分子被个体的细胞摄取时，编码所述蛋白质的这些核苷酸序列在细胞中表达，从而将所述蛋白质传送给该个体。

如下面所述，可通过传送分别编码免疫原IL-8和RANTES的基因构建物而实施传送免疫原IL-8和RANTES的方法。如下面所讨论，可将免疫原称为靶蛋白质。在不包括给予免疫原的实施方案中，可在不提供或传送编码靶蛋白质的基因构建物的情况下实施下面的描述。

本发明用于引起针对靶蛋白质，即特异性地与病原体、变态原或个体自身的“异常”细胞相关的蛋白质的大范围的免疫反应。本发明用于使个体产生针对致病因子和生物体的免疫，这样针对致病蛋白质的免疫反应将提供针对该病原体的保护性免疫性。本发明用于抵抗过度增殖性疾病和症状如癌症，通过引起针对与该高增殖性细胞特异性相关的靶蛋白质的免疫反应而实现这种抵抗。本发明用于通过引起针对与自身免疫疾病中涉及的细胞特异性相关的靶蛋白质的免疫反应而抵抗自身负疫疾病和症状。

根据本发明的一些方面，将编码靶蛋白质和免疫调节蛋白的DNA或RNA引入它们所表达的个体组织的细胞中，从而产生编码的蛋白质。编码靶蛋白质和一个或两个免疫调节蛋白的DNA或RNA序列与在该个体的细胞中表达所需的调节元件连接。DNA表达用的调节元件包括启动子和聚腺苷酸化信号。此外，其他元件如Kozak区域也可包含在遗传构建物中。

在一些实施方案中，编码靶蛋白质的可表达形式的序列和编码这两种免疫调节蛋白的可表达形式序列在传送给个体的同一核酸分子上。在一些实施方案中，编码靶蛋白质的可表达形式序列出现在与含有编码一个或这两个免疫调节蛋白的可表达形式序列的核酸分子分离的核酸分子上。在一些实施例中，编码靶蛋白质的可表达形式序列和编码一种免疫调节蛋白的可表达形式序列出现在与含有编码另两种免疫调节蛋白的可表达形式序列的核酸分子分离的核酸分子上。在这些例子中，两种分子都被传送给个体。在一些实施方案中，编码靶蛋白质的可表达形式序列出现在与含有编码两种免疫调节蛋白的可表达形式序列的核酸分子分离的核酸分子上。在这些例子中，两种分子都被传送到个体中。在一些实施方案中，编码靶蛋白质的可表达形式序列出现在与含有编码两种免疫调节蛋白中的一种的可表达形式序列的核酸分子分离的核酸分子上，所述编码两种免疫调节蛋白中的一种的可表达形式序列出现在与含有编码另两种免疫调节蛋白的可表达形式序列的核酸分子分离的核酸分子上。在这些例子中，所有三种分子都被传送给个体。此外，可传送编码一种、两种或三种蛋白质的一种、两种或三种DNA分子的任何组合，以产生大量的具有大量不同分子的组合。重要的是，靶蛋白质RANTES和IL-8的编码序列的拷贝在至少一个核酸分子中提供。

可以质粒DNA、重组载体的核酸分子或者减毒疫苗或细胞疫苗中提供的遗传物质的形式提供这些核酸分子。或者，在一些实施方案中，除了编码它们的核酸分子之外，还可以蛋白质的形式传送靶蛋白质和/或任一或两种免疫调节蛋白，或者用这些蛋白质取代编码它们的核酸分子。

遗传构建物可含有操作性连接于表达所需的调节元件的编码靶蛋白质或免疫调节蛋白的核苷酸序列。根据本发明，提供了基因构建物的组合，该基因构建物包括含有编码靶蛋白质的可表达形式的核苷酸序列的构建物和含有编码免疫调节蛋白的可表达形式的核苷酸序列的构建物。将含有基因构建物的组合的DNA或RNA分子掺入活细胞中，将导致该DNA或RNA的表达，和靶蛋白质和免疫调节蛋白的生产。结果将获得针对该靶蛋白质的增强的免疫反应。

本发明可用于使个体针对所有的病原体如病毒、原核和致病的真核生物体如单细胞致病生物体或多细胞寄生虫产生免疫。本发明特别可用于使个体针对感染细胞和不被包囊的那些病原体(如病毒)和原核生物(如淋病、李斯特菌属和志贺氏菌属)的那些病原体产生免疫。此外，本发明还用于使个体针对原生动物病原体产生免疫，该病原体在其生活周期中包括一个在细胞内致病的阶段。表1提供一些病毒家族和种属的清单，本发明的疫苗据此制备。含有编码含至少一个与致病抗原上具有的表位相同或基本上类似的表位的肽的DNA序列的DNA构建物可用在疫苗中，所述致病抗原如表中所列出的抗原。此外，本发明还可用于使个体针对其他病原体产生免疫，所述病原体包括原核的和真核的原生动物病原体以及多细胞寄生虫，如表2所列出的。

为了生产提供抗病原感染保护作用的基因疫苗，必需在基因构建物中包括编码免疫原性蛋白的基因编码序列作为靶蛋白的编码序列，所述免疫原性蛋白能够引起针对它的保护性免疫应答。不论病原体是胞内感染(对此，本发明尤其适用)还是胞外感染，不可能所有的致病抗原都引发保护性应答。因为DNA和RNA都较小，而且较容易生产，本发明还提供了多价致病抗原免疫接种的额外优点。用于基因疫苗的基因构建物可以包括编码多种致病抗原的基因物质。例如，可将数个病毒基因包括在一个构建物中，由此提供了多种靶标。

表1和表2列出了一些致病因子和生物的名单，可以制备针对它们的基因疫苗以保护个体避免受它们感染。在一些优选的实施方案中，免疫个体抵抗病原体的方法所针对的是HIV、HTLV或HBV。

本发明的另一方面提供了一种给予基础广泛的保护性免疫应答来抵抗以过度增殖性疾病为特征的过度增殖性细胞的方法，还涉及治疗过度增殖性疾病患者的方法。本文所用的术语“过度增殖性疾病”指以细胞的过度增殖为特征的疾病或紊乱。过度增殖性疾病的例子包括所有形式的癌症和牛皮癣。

已经发现，将包含编码免疫原性“过度增殖细胞”相关蛋白的核苷酸序列的基因构建物引入个体细胞，导致在个体的接种细胞内产生了这些蛋白。本文所用的术语“过度增殖性相关蛋白”指与过度增殖性疾病相关的蛋白。为了免疫接种以抵抗过度增殖性疾病，需给予个体包含编码过度增殖性疾病相关蛋白的核苷酸序列的基因构建物。

为了使过度增殖相关蛋白成为有效的免疫原性靶标，该蛋白必需只在过度增殖细胞内产生，或在过度增殖细胞内的产生水平高于正常细胞。靶抗原包括这样的蛋白、其片段和肽，它们至少包含上述蛋白中的一个表位。有时，过度增殖相关蛋白是编码某蛋白的基团发生突变的产物。突变基因编码的蛋白与正常蛋白几乎相同，仅因细微的氨基酸序列差异产生了一个正常蛋白上没有的不同表位。这样的靶蛋白包括由诸如myb，myc，fyn之类的致癌基因和转位基因bcr/abl，ras，src，P53，neu，trk编码的蛋白和EGRF。除了作为靶抗原的致癌基因产物之外，用于抗癌治疗和保护性治疗的靶蛋白还包括B细胞淋巴瘤产生的抗体的可变区和T细胞淋巴瘤的T细胞受体的可变区，在一些实施方案中，它们也可用作自身免疫疾病的靶抗原。还可以用其它肿瘤相关蛋白作为靶蛋白，例如在肿瘤细胞内含量较高的蛋白，包括单克隆抗体17-1A识别的蛋白和叶酸结合蛋白。

虽然本发明可用于免疫个体以抵抗一种或多种形式的癌症，但本发明尤其适用于对个体进行预防性免疫接种，所述个体具有发生某种癌症的倾向或曾经患有癌症因而易复发。遗传学和基因技术以及流行病学的发展使得确定个体发生癌症的可能性和进行这方面的风险评估成为可能。用遗传筛选和/或家族健康史，有可能预测特定个体发生数种癌症中任何一种的可能性。

类似地，那些已经患癌症的个体和已接受治疗去除癌症的或处于缓解期的个体尤其易复发。作为治疗方法的一部分，为了战胜复发，可以针对已确诊的癌症对个体进行免疫接种。这样，一旦得知某个体曾患有某种癌症并有复发的危险，就可对他们进行免疫接种，使其免疫系统作好准备以抵抗任何将出现的癌症。

本发明提供了一种治疗过度增殖性疾病患者的方法。在这些方法中，引入的基因构建物起免疫治疗剂的作用，引导和促进个体的免疫系统战胜产生靶蛋白的过度增殖细胞。

本发明提供了治疗患自身免疫疾病和紊乱的个体的方法，方法是赋予基础广泛的保护性免疫应答以抵抗与自身免疫相关的靶抗原，包括细胞受体和产生针对“自身”的抗体的细胞。

T细胞介导的自身免疫疾病包括类风湿关节炎(RA)，多发性硬化(MS)，Sjogren综合征，肉样瘤病，胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)，自身免疫甲状腺炎，反应性关节炎，僵硬性脊椎炎，硬皮病，多肌炎，皮肌炎，牛皮癣，脉管炎，韦格纳氏肉芽肿病，Crohn疾病和溃疡性结肠炎。上述疾病的特征均在于T细胞受体结合内源性抗原，由此引发与自身免疫疾病有关的炎性级联反应。针对T细胞可变区的疫苗接种将引发包括CTL在内的免疫应答，以消除那些T细胞。

在RA中，已经特征性地描述了参与该疾病的T细胞受体(TCR)的数个特异性可变区。这些TCR包括Vβ-3，Vβ-14，Vβ-17和Vα-17。这样，用编码这些蛋白至少之一的DNA构建物作疫苗接种，将引发针对参与RA的T细胞的免疫应答。参见：Howell，M.D.等，1991 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10921-10925；Paliard，X.等，1991 Science 253，325-329；Williams.W.V.等1992.J.Clin.Invest.90：326-333；以上均被纳入本文作参考。

在MS中，已经特征性地描述了参与该疾病的TCR的数种特异性可变区。这些TCR包括Vβ-7和Vα-10。这样，用编码这些蛋白至少之一的DNA构建物作疫苗接种，将引发针对参与MS的T细胞的免疫应答。参见：Wucherpfennig，K.W.等，1990 Science 248：1016-1019；Oksenberg，J.R.等，1990 Nature 345：344-346；以上均被纳入本文作参考。

在硬皮病中，已经特征性地描述了参与该疾病的TCR的数种特异性可变区。这些TCR包括Vβ-6，Vβ-8，Vβ-14和Vα-16，Vα-3C，Vα-7，Vα-14，Vα-15，Vα-16，Vα-28和Vα-12。这样，用编码这些蛋白至少之一的DNA构建物接种，将引发针对参与硬皮病的T细胞的免疫应答。

为了治疗T细胞介导的自身免疫疾病患者，尤其是TCR可变区尚待特性分析的疾病患者，可以进行滑液活检。可以提取含有T细胞的样品，用标准技术鉴定那些TCR的可变区。利用以上信息就可以制备基因疫苗。

B细胞介导的自身免疫疾病包括狼疮(SLE)，格雷夫斯病，重症肌无力，自身免疫溶血性贫血，自身免疫血小板减少症，哮喘，冷球蛋白血症、原发性胆管硬化和恶性贫血。这些疾病的特征均在于抗体结合内源抗原，并引发与自身免疫疾病相关的炎性级联反应。用针对这些抗体可变区的疫苗接种，将引发包括CTL在内的免疫应答，从而消灭产生这些抗体的B细胞。

为了治疗B细胞介导的自身免疫疾病患者，必须鉴定出参与自身免疫活动的那些抗体的可变区。可以进行活检，取炎症部位的抗体样品。用标准技术鉴定那些抗体的可变区。利用这一信息就可以制备出基因疫苗。

在SLE情况下，一个抗原被认为是DNA。这样，可以在待接受抗SLE免疫的患者中筛选其血清抗DAN抗体，然后制备出包括编码血清中抗DNA抗体可变区的DNA构建物的疫苗。

TCR和抗体的可变区的共同结构特征是众所周知的。通常可用下列熟知的方法来找到编码特定TCR或抗体的DNA序列，这些方法例如在Kabat等，1987，“免疫学感兴趣的蛋白的序列”U.S.Department of Health and Human Services，Bethesda MD中有所描述，本文将其纳入作为参考。此外，克隆功能性可变区的常用方法可在Chaudhary，V.K.等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1066中找到，本文将其纳为参考。

除了用可表达形式的免疫调节蛋白编码序列来改进基因疫苗外，本发明还涉及改进的减毒活疫苗和利用重组载体输送编码抗原的外源基因的改良疫苗。减毒活疫苗和利用重组载体输送外源抗原的疫苗的实例可参见美国专利：4,722,848；5,017,487；5,077,044；5,110,587；5,112,749；5,174,993；5,223,424；5,225,336；5,240,703；5,242,829；5,294,441；5,294,548；5,310,668；5,387,744；5,389,368；5,424,065；5,451,499；5,453,364；5,462,734；5,470,734和5,482,713，以上这些专利均纳入本文作参考。本发明提供的基因构建物包括编码免疫调节蛋白的核苷酸序列，该序列与可在受接种者体内有效实现表达功能的调控序列操作性相连。将基因构建物掺入减毒活疫苗和重组疫苗中，产生本发明的改良疫苗。

本发明提供了一种免疫接种个体的改进方法，它包括将基因构建物作为疫苗组合物的一部分输送给个体细胞的步骤，该疫苗组合物包括DNA疫苗，减毒活疫苗和重组疫苗。基因构建物包括编码免疫调节蛋白的核苷酸序列，该序列与能在受免疫者体内有效实现表达功能的调控序列操作性相连。此改良疫苗可产生加强的细胞免疫应答。

实施例：编码趋化因子IL-8和RANTES的DNA疫苗驱动抗原特异性Th1型免疫反应并在体内增强针对单纯疱疹病毒-2的保护性免疫

                            引言

免疫反应或炎症反应的激发是个复杂的过程，涉及共刺激分子、附着分子、细胞因子和趋化因子的协同表达。尤其是，趋化因子在分子调节免疫细胞到达宿主防御的外周位点的交通中具有重要性。以隔开两个半胱氨酸残基的单一氨基酸序列的存在(α族)或缺乏(β族)为标准，趋化因子超家族由两个亚族组成。α和β趋化因子已显示出能诱导各种免疫细胞类型的直接迁移，这些细胞类型包括嗜中性白细胞、嗜曙红性白细胞、嗜碱性白细胞和单核细胞。α趋化因子家族(CXC型)、白介素(IL)-8和γ-干扰素诱导的蛋白(IP)-10、和β趋化因子家族(CC型)、RANTES(调节激活、正常的T细胞表达和分泌)、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)和巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1α已显示出对T淋巴细胞具有趋化性。尤其是，已知IL-8和IP-10对嗜中性白细胞具有趋化性，诱导它们离开血流，迁移到周围组织中。类似地，RANTES对单核细胞产生趋化性，没有刺激CD4+/CD45RO+记忆T细胞而刺激了CD4+和CD8+T细胞。MIP-1α已知对嗜曙红性白细胞具有趋化性，并使其脱粒。MIP-1α还诱导组胺从嗜碱性白细胞和肥大细胞中释放，并对嗜碱性白细胞和B细胞产生趋化性。MCP-1在慢性炎症中是重要的趋化因子。MCP-1诱导单核细胞迁移出血流，使其成为组织巨噬细胞。MCP-1还对激活的记忆T淋病细胞的亚类产生趋化性。最近的研究支持了趋化因子受体标记T细胞亚类，并且趋化因子可能在抗原特异性免疫反应的产生中涉及。

如本文所述，将DNA疫苗模型用于研究趋化因子是否能调节免疫反应，并之后使定义的小鼠模型系统产生对单纯疱疹病毒(HSV)-2刺激的保护。为了研究免疫反应和保护性免疫性的调节，将编码HSV-2蛋白的DNA表达构建物与编码趋化因子(IL-8、IP-10、RANTES、MCP-1、MIP-1α)的基因质粒一起传送。然后分析针对刺激所产生的抗原特异性免疫诱导和保护的调节效果。观察到与IL-8和RANTES的共注射增强了针对HSV刺激的抗原特异性免疫反应和保护。另一方面，与IP-10、MCP-1、MIP-1α的共注射对保护的状态具有完全有害的效果。这些研究支持趋化因子可在重要的免疫反应和疾病发展中以细胞因子回忆的方式起作用并能对其进行调节。通过使用共传送趋化因子cDNA可实现明显的免疫调节，结果不仅产生免疫反应，还产生疾病保护。此外，使用趋化因子基因的传送佐剂(具体是IL-8和RANTES)，在制备更有效的疫苗或者在针对HSV的免疫治疗中是重要的。

                           方法

小鼠

从Harlan-Sprague-Dawley(Indianapolis，Ind.)购得雌性4周龄和6周龄小鼠。在国家健康研究会(Bethesda，Md.)和宾夕法尼亚州立大学IACUC(Philadelphia，PA)的指南下饲养这些小鼠。

试剂

在Vero细胞系(美国典型培养物保藏中心，Rockville，Md.)中繁殖HSV-2株186(P.Schaffer的友好礼物，宾夕法尼亚州立大学，Philadelphia，Pa.)。编码HSV-2gD蛋白的DNA疫苗pAPL-gD2(pgD)是Pachuk，C.J.等〔《通过促进小鼠的DNA免疫而产生的针对单纯疱疹病毒-2糖蛋白D体液和细胞免疫反应》(Humoral andcellular immune response ti herpes simplex virus-2 glycoprotein D generated byfacilitated DNA immunization of mice)，Current topics Microbiol.Immunol.，1998，226：79-89〕先前所述的，本文将其纳入作为参考。表达载体pCDNA3-IL-8、pCDNA3-IP-10、pCDNA3-RANTES、pCDNA3-MCP-1、pCDNA3-MIP-1α、pCDNA3-TNF-α和pCDNA3-TNF-β是如Kim，J.J.等〔《CD8阳性T细胞通过趋化因子的表达影响抗原特异性免疫反应》(CD8 positive T cell influence antigen-specificimmune responses through the expression of chemokines)，J.Clin.Invest.，1998，102：1112-1114〕和Kim，J.J.等〔《通过共给予具有DNA免疫原的细胞因子基因表达盒调节体内免疫反应的幅度和方向》(Modulation of amplitude and direction of in vivoimmune responses by co-administration of cytokine gene expression cassettes withDNA immunogens)，Eur.J.Immunol.，1998，28：1089-1103〕所述构建得到，本文将它们纳入作为参考。在细菌中制备质粒DNA，并采用双带CsCl制品纯化。使用G.H.Cohen和R.J.Eisenberg(宾夕法尼亚州立大学，Philadelphia，Pa.)的慷慨礼物——重组HSV-2gD蛋白作为这些研究中的重组抗原。

小鼠的DNA接种

使用28口径的针(Becton Dickinson，Franklin Lakes，N.J.)在BALB/c小鼠的四头肌注射配制在100μl磷酸缓冲盐溶液和0.25％盐酸布比卡因(Sigma，St.Louis，Mo.)中的gD DNA构建物。在注射前先使各种趋化因子和细胞因子基因表达盒的样品与gpD质粒溶液混合。

ELISA

如Sin，J.I.等〔《针对Th1表型的疫苗诱导的免疫反应的体内调节增加了单纯疱疹病毒2型小鼠模型中的潜力和疫苗效力》(In vivo modulation of vaccine-induced immune responses toward a Th1 phenotype increases potency and vaccineeffectiveness in a herpes simplex virus type 2 mouse model)，J.Virol.，1999，73：501-509〕和Sin，J.I.等〔《通过共传送粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子表达盒而产生的针对单纯疱疹病毒-2的保护性体液(Th2)和细胞介导的(Th1)免疫反应的增强》(Enhancement of protective humoral(Th2)and cell-mediated(Th1)immune responsesagainst herpes simplex virus-2 through co-delivery of granulocyte macrophage-colonystimulating factor expression cassettes)，Eur.J.Immunol.，1998，28：3530-3540〕所述进行酶联免疫吸附检测(ELISA)，本文将它们纳入作为参考。具体而言，为了测定gD特异性IgG亚类的相对水平，用与HRP(Zymed，San Francisco，CA)偶联的抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3替换抗鼠IgG-HRP。测定ELISA效价，以显示与空白对照小鼠的血清相同的光密度的最高血清稀释度的倒数计。T辅助(Th)细胞增殖试验

如Sin，J.I.等(J.Virol.，1999，同上)和Sin，J.I.等(Eur.J.Immunol.，1998，同上)先前所述进行细胞增殖试验。将分离得到的细胞悬浮液再悬浮至浓度为106个细胞/ml。然后立即将含有1×10⁵个细胞的100μl等分试样加到96孔微滴定平底平板的每个孔中。将最终浓度为1μg/ml和5μg/ml的HSV-2gD蛋白加到各个孔中，进行三组试验。在37℃、5％CO₂的条件下培育细胞3天。将1μCi的氚化胸苷加到各孔中，然后在37℃培育细胞12-18小时。收集平板，在Beta Plate读数器(Wallac，Turki，Finland)中测量掺入的氚化胸苷的量。由下式计算刺激指数：

         刺激指数(SI)＝(试验计数-自发计数)/自发计数自发计数孔包括作为不相关的蛋白对照的10％胎牛血清。为了确保细胞是健康的，使用5μg/ml的PHA(Sigma)作为多克隆刺激物阳性对照。

Th1和Th2型细胞因子和趋化因子

将含有6×10⁶脾细胞的1ml等分试样加到24孔平板的孔中。然后，将1μgHSV-2gD蛋白/ml加到各孔中。在37℃、5％CO₂中培育2天后，保证细胞上清液的安全，然后使用市售的细胞因子和趋化因子试剂盒(Biosource，Intl.，Camarillo，Ca.和R&D Systems，Minneapolis，Md.)，将细胞内的液体加到细胞因子或趋化因子特异性ELISA平板上检测它们的IL-2、IL-10、IFN-γ、RANTES、MCP-1和MIP-1α的水平。

阴道内HSV-2刺激

如Milligan，G.N.等〔《感染单纯疱疹2型病毒的雌鼠生殖道中单纯疱疹病毒特异性T细胞的分析》(Analysis of herpes simplex virus-specific T cells in themurine female genital tract following genital infection with herpes simplex virus type2)，Virol.，1995，212：481-489〕和McDermott等〔《经单纯疱疹2型病毒的减毒株的阴道内接种的小鼠其雌性生殖道中的免疫性》(Immunity in the female genitaltract after intravaginal vaccination of mice with an attenuated strain of herpes simplexvirus type 2)，J.Virol.，1984，51：747-753〕〕先前所述刺激小鼠，其中有一些修改，本文将它们纳入作为参考。在接种病毒之前，先使用浸了0.1M NaOH溶液的棉团施用器(cotton tipped applicator，Hardwood Products Company，Guiford，ME)擦洗阴道内区域，然后用干燥的棉球清洁。然后每天检测小鼠，以评估致病症状和生存比例。

统计学分析

使用成对Student t检验进行统计学分析。不同免疫组之间的值是可比的。p值小于0.05被认为是显著的。

                                 结果

共给予趋化因子质粒影响了全身的IgG生产

首先研究所选择的趋化因子对诱导抗原特异性抗体反应的体内效果。对照动物用gD疫苗和TNF家族的2种促炎细胞因子(TNF-α和TNF-β)免疫。对这些促炎细胞因子进行研究，因为它们被认为同样地在早期的免疫反应中涉及，并且在先前所获得的数据的基础上，它们应作为阳性对照。如图1所示，第二次免疫的2周后等量汇集的血清的ELISA效价分别为12800(IL-8)、6400(IP-10)、6400(RANTES)、6400(MCP-1)、12800(MIP-1α)、25600(TNF-α)、6400(TNF-β)和6400(对于单独的gD DNA)。这显示与IL-8和MIP-1α中任一种共注射产生适度但不显著的gD-特异性IgG抗体的增加。相反，IP-10、RANTES或MCP-1显示出与单独进行pgD接种所获得的类似的抗体反应水平。TNF-αcDNA对照产生了明显高于先前所确切观察到的单独使用gD DNA疫苗所产生的全身性IgG水平。使用趋化因子质粒进行的共免疫将IgG亚类转变成Th1或Th2同种型

IgG亚类给出了关于所诱导的免疫反应的Th1和Th2性质的指示。分析了由共注射诱导产生的IgG亚类。各免疫组诱导产生的IgG同种型显示在图2A中，IgG2a与IgG1(Th1与Th2)的相对比值显示在图2B中。pgD免疫组的IgG2a与IgG1比为0.62。与IL-8、RANTES或TNF-α基因共注射将gD特异性IgG2a与IgG1的相对比值增加到0.8。另一方面，与IP-10或MIP-1α之一共注射降低了IgG2与IgG1的相对比值(0.3和0.4)，而与MCP-1或TNF-β基因共免疫则产生类似于单独进行pgD免疫所获得的IgG亚型模式。这个分析结果支持了IL-8和RANTES以与γ-IFN型细胞因子类似的方式在体内驱动免疫反应向Th1表型发展的结论。

IL-8和RANTES共注射增强Th细胞的增殖性反应

细胞增殖是用于评估细胞介导的免疫的标准参数。使用gD蛋白在体外刺激免疫动物的脾细胞，从而测量使用细胞因子基因进行的共免疫后产生的Th细胞增殖性反应。如图3A-3C所示，单独的pgD DNA接种产生gD特异性Th细胞增殖性反应。与IL-8、RANTES或TNF-αcDNA之一进行共注射，观察到超过单独使用gD DNA疫苗的显著增加的Th细胞增殖性反应。在与TNF-β基因的共注射中观察到增殖有轻微的增加。与此相反，与IP-10、MCP-1或MIP-1α基因之一的共免疫则出现对Th细胞增殖性反应产生最小的影响。但是，共注射显示对PHA-诱导的非特异性Th细胞增殖性反应没有影响(S.I.范围为40-50)。由于在Balb/c背景中缺乏CTL表位的缘故，gD质粒接种没有产生CTL反应。但是，为了更详细地评估细胞影响，检测了细胞因子生产的特征。

趋化因子共注射影响了Th1和Th2细胞因子的生产

Th1细胞因子(IL-2和IFN-γ)和Th2细胞因子(IL-4、IL-5和IL-10)是理解免疫反应极化的主要支持。Th1免疫反应被认为是驱动了细胞免疫的诱导，而Th2免疫反应则优先驱动体液免疫。基于IgG表型的结果，通过直接分析细胞因子释放进一步评估Th1和Th2问题。如表3所示，通过与IK-8cDNA共注射，IL-2生产急剧增加了几乎7倍。也可以通过与TNF-αcDNA共注射以及通过与MIP-1α盒共注射诱导IL-2。具体而言，通过RANTES共传送，IFN-γ的生产最显著地增加了20倍，与IL-8共传送，该生产增加了6倍，这进一步支持同种型结果(isotypingresults)，并证明了IL-8和RANTES以抗原依赖性的方式介导Th1型细胞免疫反应。RANTES、IL-8、TNF-α和TNF-β的共注射各自还增强IL-10的生产，这种生产显著地高于单独使用pgD疫苗所获得的生产。这阐明了在IL-8和RANTES驱动的T细胞中Th1优于Th2。

趋化因子共注射影响β趋化因子的生产

为了测定趋化因子共注射是否能诱导β趋化因子以抗原依赖性的方式生产，对动物进行共免疫，并在体外使用重组gD抗原或对照抗原刺激后分析其脾细胞的β趋化因子的释放水平。如表4所示，通过与IL-8cDNA共注射，MCP-1生产急剧增加，但是与RANTES和MIP-1α盒共注射则下降。通过与RANTES和IL-8的共传送最明显地增加了MIP-1α的生产。在RANTES的例子中，共注射IL-8和RANTES增加了RANTES的生产，其生产高于单独注射pgD疫苗所获得的结果。这表明RANTES以与IL-8不同的HSV模式调节抗原特异性免疫反应。这还支持趋化因子调节它们自己的生产。

IL-8和RANTES趋化因子共注射增强免受阴道内HSV-2刺激的保护作用

重要的是抗原特异性免疫调节影响了病原体的复制。在鼠疱疹刺激模型中分析趋化因子共注射的保护效率。在第0周和第2周用DNA载体i.m.免疫小鼠，然后在第二次免疫的3周后用HSV-2刺激。在粘膜皮肤下用HSV-2进行阴道内刺激。如图4A和4B所示，单独使用gD DNA疫苗(每只小鼠60μg)免疫，结果是经200LD₅₀的HSV-2阴道内刺激的小鼠有63％的存活。与IL-8和RANTES cDNA共注射将存活比例增加到88％，保护比例增加了将近30％，而与40μg的MCP-1和IP-10共注射则使存活比降到25％，下降的幅度大约占总的保护比例的40％。类似地，MIP-1α共注射还导致存活比例的下降。这支持了趋化因子IL-8和RANTES通过抗原特异性免疫调节增强免受HSV-2传染的保护作用的结论。

TNF家族共注射使免受阴道内HSV-2刺激的保护作用变糟

在疱疹刺激模型中比较TNF家族共注射的保护效率。与TNF-α和TNF-βcDNA的共注射导致存活下降至25％，保护比例下降40％(图4C)。这个数据进一步支持一些免疫调节cDNA的共注射将降低免疫效果，也支持了反应的质量是特别重要。

                             讨论

HSV是导致人的许多疾病如冻疮、眼睛传染病、脑炎和生殖道传染病的病因。HSV可在宿主中建立频繁再现的病毒潜伏期。在病毒感染期间，中和抗体使病毒粒子灭活，但不能控制细胞内的HSV感染。相反，细胞介导的免疫是杀死感染了HSV的细胞的主要效应功能。B细胞抑制的小鼠控制主要的HSV感染的能力或使T细胞适应性地转移以预防接着的病毒感染的能力进一步表明，细胞介导的免疫可能直接涉及到病毒感染及其传播的抑制。文献中已记载，CD4+和CD8+T细胞在预防HSV感染中都涉及到。此外，有几个报道提出Th1型CD4+T细胞在免受HSV-2刺激的保护作用中起到了更关键的作用。当CD4+T细胞在体内被去除时，针对HSV的保护性免疫力丧失。而且，Th1型CD4+T细胞产生大量的IFN-γ。IFN-γ使HSV感染的细胞的I类和II类表达上调，以使细胞毒性CD4+T细胞和CD8+CTL产生更好的识别，并具有直接的抗-HSV作用。与Th1型细胞因子cDNA共传送使得疾病状态恶化。类似地，通过与原型Th1型细胞因子IL-12cDNA共传送而增强的保护作用是由HSV刺激模型中的Th1型CD4+T细胞介导，这说明了Th1型T细胞介导的针对HSV感染的保护性免疫力的重要性。

在动物模型中，一些糖蛋白或表达特殊的病毒成分的DNA构建物的免疫提供了针对病毒刺激的完整或部分的保护作用。已将几种HSV病毒蛋白质作为潜在的免疫靶标对它们进行了分析。与编码gC、ICP27或gD蛋白的cDNA的免疫显示出可诱导抗原特异性免疫反应和针对动物的体内HSV刺激的保护作用。最近，使用亚单位疫苗进行的临床试验在保护再发生的HSV感染方面失败，这表明在设计针对此病原体方面的更有效方法方面需要额外的见识。

通过将它们作为质粒盒与gD cDNA疫苗构建物共注射，对所选择的趋化因子针对HSV-2感染的保护性免疫力的诱导的体内效果进行了研究。共免疫了IL-8和MIP-1α趋化因子基因的组，其IgG反应以类似于TNF-α作为疫苗佐剂的方式稍微高于gD免疫组。此外，使用趋化因子作为分子佐剂获得了抗原特异性IgG同种型反应的调节。与单独使用gD DNA疫苗或与MCP-1共注射或者与TNF-β对照相比，IL-8和RANTES显著增加了gD特异性IgG2a对IgG1的相对比例。但是，与IgG2a相比，IP-10和MIP-1α基因的共注射诱导了IgG1更有利的生产。因此，这些结果扩展了现有的在HIV模型中关于体液免疫应答向Th1或Th2的转变可由趋化因子调节的发现，表明趋化因子可在体内调节细胞因子的生产。

已使用体外免疫参数如Th细胞增殖和CTL反应来评估细胞介导的免疫的潜力。仅有与IL-8和RANTES共注射的质粒以类似于TNF-α对照的方式诱导较高的Th细胞增殖。IL-8共免疫还导致IL-2和INF-γ的生产明显高于单独使用gD DNA免疫获得的结果，这进一步支持同种型结果，并证明了IL-8以抗原依赖性方式介导Th1型细胞免疫反应。IL-8共注射还增强了MCP-1、MIP-1和REANTES的生产。表明IL-8可调节β趋化因子的体内生产。RANTES共注射导致INF-γ、IL-10、MIP-1α和RANTES的生产增加，但减少了IL-2和MCP-1的生产。这表明在HSV模型中，RANTES以不同于IL-8的方式调节抗原特异性免疫反应。

在HSV刺激研究中，在用200LD₅₀的HSV-2刺激接种时，单独的gD接种显示63％的存活比例。通过共注射趋化因子IL-8和RANTES cDNA，可获得更好的存活比例(88％)和较不严重的疱疹性病灶形成。相反，共传送趋化因子基因(IP-10和MCP-1)将受刺激小鼠的存活比例减少到25％，这比仅接受gD疫苗的小鼠的总存活减少了50％以上。类似地，MIP-1α共注射还对接种动物的存活比例产生负面影响。如果考虑到每个趋化因子组中测试的动物的总数，则这些观察是令人惊讶的(仅使用gD的存活比例为72％，13/18；注射IL-8的存活比例为94％，17/18，注射IP-10的存活比例为39％，7/18；注射MIP-1α的存活比例为56％，10/18)(图5)。这表明与IL-8和RANTES趋化因子基因共注射增强了免受致死HSV刺激的保护，而与IP-10和MCP-1的共注射和较少程度的MIP-1α则使动物更易于受到病毒的感染，尽管诱导了免疫反应。与Th1型细胞因子基因共注射增强了免受致死HSV刺激的保护比例，而与Th2型细胞因子共注射则使动物对病毒感染的易感性增加。在病理学研究中，已报道了Th-1的重要性，如致病感染的细胞因子抗性反应。因此，看起来有可能Th1和/或Th2型免疫反应由这些趋化因子驱动，导致在免疫反应质量的基础之上所产生的免受HSV感染刺激的保护作用。

在TNF家族的例子中，与TNF-α和TNF-β基因的共注射还将受刺激的小鼠的存活比例减少到25％，这比仅接受gD疫苗的小鼠的总存活减少了50％以上。虽然共注射了TNF-α基因的小鼠的gD特异性抗体和Th细胞增殖水平以及细胞因子生产水平(IL-2、INF-γ、IL-10)比仅仅接种了gD DNA的小鼠的高得多，但是TNF细胞因子介导的对HSV-2感染的易感性也在这些动物中观察到。并不清楚观察到这种结果的原因，但是这种观察结果强烈支持了反应的质量对于控制致病感染具有明显的重要性。

总之，这些数据证明趋化因子可以抗原依赖性的方式调节Th1和/或Th2型的免疫反应。这些活性先前仅仅与细胞因子相关。这些数据暗示，趋化因子在抗原特异性免疫的诱导中具有与细胞因子一样重要的作用。这个发现拓宽了我们的抗传染病的武器范围。此外，还应考虑使用趋化因子调节用于癌症治疗的免疫反应。

                            表1

小RNA病毒科

属：            鼻病毒属：(医用)造成50％普通感冒病例。

                肠道病毒(Etheroviruses)：(医用)包括脊髓灰质炎病毒，柯

                萨奇病毒，艾可病毒，人肠道病毒例如甲肝病毒。

                口疮病毒：(兽医用)这些是足口腔疾病病毒。

靶抗原：VP1，VP2，VP3，VP4，VPG

杯状病毒科

属：            诺沃尔克组病毒属：(医用)这些病毒是流行性胃肠炎的重

                要病原体。

披膜病毒科

属：            α病毒属：(医用和兽医用)例子包括Senilis病毒、罗斯河病

                毒和东方和西方马脑炎病毒。

                呼肠孤病毒属：(医用)风疹病毒。

黄病毒科

                例子包括：(医用)登革热病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、

                圣路易斯脑膜炎病毒和虱传脑炎病毒。

丙肝病毒：(医用)这些病毒不属于任何科，但被认为或者是披膜病毒或者是黄病毒。大部分类似于披膜病毒科。

冠状病毒科：(医用和兽医用)

                传染性支气管炎病毒(禽)

                猪可传递性胃肠炎病毒(猪)

                猪血凝脑脊髓炎病毒(猪)

                猫传染性腹膜炎病毒(猫)

                猫小肠冠状病毒(猫)

                狗冠状病毒(狗)

                人呼吸道冠状病毒引起约40例普通感冒。EX.224E，0C43。

            注意-冠状病毒可能引起非甲型、非乙型和非丙型的肝炎。

靶抗原：

            E1-又称M蛋白或基质蛋白

            E2-又称S蛋白或刺突蛋白

            E3-又称HE或血凝素-elterose糖蛋白(并不存在于所有的

            冠状病毒中)

            N-核衣壳

弹状病毒科

属：        Vesiliovirus

            狂犬病病毒：(医用和兽医用)狂犬病

靶抗原：    G蛋白

            N蛋白

线状病毒科：(医用)

            出血热病毒，例如马堡病毒和埃博拉病毒

副粘病毒科：

属：        副粘病毒属：(医用和兽医用)

            腮腺炎病毒，新城疫病病毒(重要的鸡致病原)

            麻疹病毒属：(医用和兽医用)

            麻疹病毒、狗瘟热

            肺病毒：(医用或兽医用)

            呼吸道合胞病毒

正粘液病毒科(医用)

            流感病毒

布尼亚病毒科(Bungavirus)

属：        布尼亚病毒属：(医用)加利福尼亚脑炎，LA Crosse

            白蛉热病毒属：(医用)里夫特山谷热病

            汉坦病毒属：Puremala是一种hemahagin热病毒

            内罗毕病毒属：(兽医用)内罗毕绵羊病

            还有许多未归类的布尼亚病毒属

沙粒病毒科(医用)

            LCM，拉沙热病毒

呼肠孤病毒科

属：        呼肠孤病毒属：可能是一种人病原

            轮状病毒：儿童急性胃肠道炎

            环状病毒属：(医用和兽医用)

            科罗拉多虱传热病毒、Lebombo(人)马脑炎病毒、蓝舌病毒

逆转录病毒科

亚科：

            致癌病毒亚科：(兽医用和医用)猫白血病病毒、

            HTLVI和HTLVII

            慢病毒亚科：(医用和兽医用)HIV，猫免疫缺陷病毒、马传

            染病病毒、贫血病毒

            泡沫病毒亚科

乳多空病毒科

亚科：

            多瘤病毒亚科：(医用)BKU和JCU病毒

亚科：

            乳头瘤病毒亚科：(医用)与癌症或乳头瘤的恶性发展有关

            的许多种病毒

腺病毒(医用)

            EX AD7，ARD.，O.B.-引起呼吸道疾病-一些腺病毒，

            例如275，引起肠炎

细小病毒科(兽医用)

            猫细小病毒：引起猫肠炎

            猫瘟病毒

            狗细小病毒

            猪细小病毒

疱疹病毒科

亚科：      α疱疹病毒亚科

属：        单纯疱疹病毒属：(医用)

            HSVI，HSVII

            水痘病毒属：(医用和兽医用)假狂犬病-水痘-带状疱疹病毒

亚科-       β疱疹病毒亚科

属：        巨细胞病毒属：(医用)

            HCMV

            鼠巨细胞病毒(Muromegalovirus)

亚科：      γ疱疹病毒亚科

属：        淋巴隐病毒属(医用)

            EBV-(Burkitts淋巴细胞)

            Rhadino病毒

痘病毒科

亚科：      带状痘病毒亚科(医用-兽医用)

属：        天花病毒属(天花病毒)

            牛痘属(牛痘病毒)

            副痘病毒属-兽医用

            Auipoxvirus-兽医用

            山羊痘病毒属

            兔痘病毒属

            猪痘病毒属

亚科：      Entemopoxviridue亚科

肝DNA病毒科

            乙型肝炎病毒

未分类的

            δ肝炎病毒

                    表2

细菌病原

革兰阳性病原球菌包括：肺炎球菌；葡萄球菌；和链球菌。革兰阴性病原球菌包括：脑膜炎球菌和淋球菌。

病原性革兰阴性肠道杆菌包括：肠杆菌、假单胞菌、不动细菌和艾肯氏菌、类鼻疽、沙门氏菌、志贺氏菌、嗜血杆菌、软性下疳、布鲁氏菌、土拉菌、耶尔森(巴斯德)菌、念珠状链杆菌和螺菌、单核细胞增生李斯特菌、猪红斑丹毒丝菌、白喉杆菌、霍乱杆菌、炭疽杆菌、杜诺万氏菌(性病性肉芽肿)和巴尔通氏体。

病原性厌氧菌包括：破伤风杆菌；肉毒菌和其它羧菌；结核菌；麻风杆菌和其它分枝杆菌。病原性螺旋体病包括：梅毒；密螺旋体病；热带肉芽肿；品它病和地方流行性梅毒；和钩端螺旋体病。

由较高级病原菌和病原性真菌引起的其它感染包括：放线菌病；诺卡菌病；隐球菌病，酵母病，组织胞浆菌病和球孢子菌病；念珠菌病，曲霉病，和毛霉菌病；孢子丝菌病，巴西芽生菌病，霉样真菌病(petriellidosis)，球拟酵母菌病，足分枝菌病和着色芽生菌病；和皮肤真菌病。

立克次体感染包括立克次体的和立克次体病。

支原体和衣原体感染的病例包括：支原体肺炎；性病性淋巴肉芽肿；鹦鹉热；和产期衣原体感染。

真核细胞病原

由病原性原虫和蠕虫引起的感染包括：阿米巴病；疟疾；利什曼病；锥虫病；弓形体病；肺炎肺囊虫病；巴贝虫病；贾第鞭毛虫病；旋毛虫病；丝虫病；血吸虫病；线虫病；吸虫病；和绦虫感染。

表3：体外进行gD刺激^a后脾细胞的IL-2、IL-10和IFN-γ的生产水平

免疫组	IL-2(pg/ml)	IFN-γ(pg/ml)	IL-10(pg/ml)
				空白对照pgD+pCDNA3pgD+IL8pgD+IP-10pgD+RANTESpgD+MCP-1pgD+MIP-1αpgD+TNF-αpgD+TNF-β	16.7±0.8134.7±3.5756.4±5.4143.5±3.959.9±1.193.6±4.7345.4±18403±13.3288±5.6	10.5±0.722.4±2.4138.5±4.731.5±2.5520±1317.9±0.555.4±1.877±6.320.8±1.5	17.1±6.1257.1±4.4128±1369.9±1.9360±46.549.7±2.322±2.186.8±6.278.3±3.6

a在第0周和第2周，用gD DNA疫苗(每只小鼠60μg)加趋化因子基因(每只小鼠40μg)或TNF cNDA(每只小鼠40μg)免疫各组小鼠(n＝2)。最后一次DNA注射2周后，处死两只小鼠，集中它们的脾细胞。用1μg gD蛋白/ml刺激这些脾细胞2天。进行三个试验检测样品，所得的值代表释放的细胞因子浓度的平均值±标准偏差。这代表显示出类似结果的三个分离试验中的一个。

表4：体外gD刺激^a后脾细胞的MCP-1、MIP-1α和RANTES的生产水平

免疫组	MCP-1(pg/ml)	MIP-1α(pg/ml)	RANTES(pg/ml)
				空白对照pgD+pCDNA3pgD+IL-8pgD+IP-10pgD+RANTESgD+MCP-1pgD+MIP-lα	153.8±5.7234±5.3322±24246.3±2.7189.7±0209.2±6.4142.7±3.3	247±11747±391,411±113l,407±4592,267±219725±501787±94	769±7917±551,234±5383l±521,077±32646±45690±39

a在第0周和第2周，用gD DNA疫苗(每只小鼠60μg)加趋化因子基因(每只小鼠40μg)免疫各组小鼠(n＝2)。最后一次DNA注射2周后，处死两只小鼠，集中它们的脾细胞。用1μg gD蛋白/ml刺激这些脾细胞2天。进行三个试验检测样品，所得的值代表释放的趋化因子浓度的平均值±标准偏差。这表示显示出类似结果的三个分离试验中的一个。

Claims (24)

1.一种组合物，它含有：

分离的RANTES蛋白和/或编码RANTES蛋白的核酸分子；和

分离的IL-8蛋白和/或编码IL-8蛋白的核酸分子。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有靶蛋白质和/或编码靶蛋白质的核酸分子。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有一个质粒，该质粒含有操作性连接于调节元件的、编码IL-8的核苷酸序列，和操作性连接于调节元件的、编码RANTES的核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述质粒还含有操作性连接于调节元件的编码免疫原的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述免疫原是单纯疱疹抗原。

6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述单纯疱疹抗原是HSV2gD。

7.一种可注射的药物组合物，它含有权利要求1-6中任一项所述的组合物。

8.一种物质在制备在个体中诱导针对免疫原的免疫应答的药剂中的用途，所述物质包含：

(A)分离的RANTES蛋白和/或编码RANTES蛋白的核苷酸序列；

(B)分离的IL-8蛋白和/或编码IL-8蛋白的核苷酸序列，和

(C)靶蛋白质和/或编码靶蛋白质的核苷酸序列，

上述核苷酸序列在一个或多个核酸分子上。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述药剂包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子合起来编码RANTES蛋白、IL-8蛋白、和靶蛋白质。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述药剂包含含有编码RANTES蛋白的核苷酸序列、编码IL-8蛋白的核苷酸序列和编码靶蛋白质的核苷酸序列的质粒。

11.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述药剂包含两种或多种不同的质粒，所述质粒合起来编码RANTES蛋白、IL-8蛋白和靶蛋白质。

12.如权利要求9-11中任一项所述的用途，其特征在于，所述药剂包含RANTES蛋白和/或IL-8蛋白和/或靶蛋白质。

13.如权利要求9-11中任一项所述的用途，其特征在于，所述靶蛋白质是单纯疱疹病毒抗原。

14.如权利要求9-11中任一项所述的用途，其特征在于，所述靶蛋白质是单纯疱疹病毒抗原HSV2gD。

15.一种物质在制备调节个体免疫系统的药剂中的用途，所述物质包含：

(A)分离的RANTES蛋白和/或编码RANTES蛋白的核苷酸序列，和

(B)分离的IL-8蛋白和/或编码IL-8蛋白的核苷酸序列，

上述核苷酸序列在一个或多个核酸分子上。

16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述药剂包含：

编码RANTES蛋白的核酸分子；

编码IL-8蛋白的核酸分子。

17.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述药剂包含含有编码RANTES蛋白的核苷酸序列和编码IL-8蛋白的核苷酸序列的质粒。

18.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述药剂包含两种或多种不同的质粒，所述质粒合起来编码RANTES蛋白和IL-8蛋白。

19.如权利要求15-18中任一项所述的用途，其特征在于，所述药剂包含RANTES蛋白和/或IL-8蛋白。

20.一种重组疫苗，它含有操作性连接于调节元件的编码免疫原的核苷酸序列、编码IL-8的核苷酸序列和编码RANTES的核苷酸序列。

21.如权利要求20所述的重组疫苗，其特征在于，所述重组疫苗是重组的牛痘疫苗。

22.权利要求20所述的重组疫苗在制备在个体中诱导针对免疫原的免疫反应的药剂中的用途。

23.一种活的减毒病原体，它含有编码IL-8的核苷酸序列和编码RANTES的核苷酸序列。

24.权利要求23所述的活的减毒病原体在制备使个体产生针对病原体的免疫的药剂中的用途。

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