CN1561389A

CN1561389A - 糖基神经酰胺作为用于抗传染病和癌症的疫苗的佐剂的用途

Info

Publication number: CN1561389A
Application number: CNA028187466A
Authority: CN
Inventors: 辻守哉; G·冈萨雷斯－阿塞吉诺拉扎; 肥塚靖彦
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd; New York University NYU
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd; New York University NYU
Priority date: 2001-07-25
Filing date: 2002-07-24
Publication date: 2005-01-05
Also published as: AU2002327338A1; US20030157135A1; EP1434859A2; WO2003009812A3; WO2003009812A2; CA2453880A1; JP2005500336A; US7488491B2

Abstract

本发明涉及增强哺乳动物体内抗原的免疫原性的方法和组合物，包括对所述哺乳动物一起施用抗原和包括糖基神经酰胺优选α－半乳糖基神经酰胺(α－GalCer)的佐剂组合物。根据本发明，使用糖基神经酰胺作为佐剂至少部分引起抗原特异性Th1－型应答特别是CD8+T细胞应答的增强和/或延长。本发明的方法和组合物能用于预防和治疗各种传染病和肿瘤。

Description

糖基神经酰胺作为用于抗传染病和癌症的疫苗的佐剂的用途

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求了2001年7月25日提出的美国临时专利申请登记号No.60/308,056的优先权，该专利申请在此全文引作参考。

产生本发明的研究部分受到国家健康协会授权的AI-01682，AI-40656，和AI-47840的支持。因此，美国政府对本发明享有一定权利。

发明领域

本发明涉及糖基神经酰胺作为提高各种传染性的和肿瘤的抗原的免疫原性的佐剂的用途。

发明背景

病原体，肿瘤细胞的成功去除，或者预防性或治疗性免疫之后的自身反应免疫机理很大程度上取决于宿主免疫系统响应免疫而变得被激活并且封固有效应答的能力，优选对健康组织有最小的损伤。

疫苗的合理设计最初涉及鉴定与负责抵抗疾病的保护作用的保护-免疫效应物机理的免疫学相关性，并且接着选择能激发期望的适应性应答的抗原。一旦鉴定了合适的抗原，就基本上将其有效地送递给宿主免疫系统。

在有效疫苗的设计中，免疫佐剂作为决定性成分，促进，延长，和/或增强抗原-特异性免疫应答，以及提供合适类型应答的选择性诱导作用。

用于控制各种肿瘤、自身免疫和感染疾病，包括人免疫缺陷病毒(HIV)和肺结核的新的疫苗现在正处于研发和试验中。与早先的疫苗相比，它们一般以活体减弱病原体或者非复制型灭活病原体为基础，现代疫苗由合成的、重组的、或高度纯化的亚基抗原组成。设计只包括保护免疫作用需要的抗原的亚基疫苗，并且相信比全部灭活或活体-减弱疫苗更安全。但是，亚基抗原的纯度以及不存在与减弱或杀死的疫苗联合的自身辅助免疫调节成分经常导致较弱的免疫原性。

通过同时或者更一般地联合施用带有“佐剂”的抗原能提高相对弱的抗原的免疫原性，当单独施用时通常没有免疫原性的物质仍然能唤起、增强和/或延长响应抗原的免疫应答。不存在佐剂，可能发生减小的免疫应答或者没有免疫应答，或者更糟的是，宿主变得对抗原耐受。

能在一组结构上异质的化合物中找到佐剂(Gupta等，1993，Vaccine，11：293-306)。常规认为佐剂的例子包括油乳状液(例如弗氏佐剂)，皂甙，铝盐或钙盐(例如，明矾)，非离子嵌段聚合物表面活性剂，脂多糖(LPS)，分支杆菌，破伤风类毒素，和很多其他的物质。理论上说，能有利于或扩大免疫作用级联特定情况，最终导致更明显免疫应答的各种分子或物质可以被鉴定为佐剂。

理论上讲，通过在疫苗配方中使用佐剂，人们能(1)指导和优化对于疫苗是合适的并且是所期望的免疫应答；(2)能粘膜送递疫苗，即施用导致疫苗与粘膜表面接触，所述粘膜表面例如口腔或胃或肺上皮和相关的淋巴样组织；(3)促进细胞-介导的免疫应答；(4)提高较弱的免疫原例如高度纯化的或重组抗原的免疫原性；(5)减小提供保护性免疫性需要的抗原的量或免疫次数；和(6)提高免疫应答减小或减弱的个体例如新生儿、老年人和无免疫应答疫苗接受者的疫苗效力。

虽然关于它们的作用方式知之甚少，现在相信佐剂通过下面机理之一增强免疫应答：(1)延长抗原的生物或免疫性半寿期(参见，例如，Lascelles，1989，Vet.Immunol.Immunopathol.，22：15-27；Freund，1956，Adv.Tuber.Res.，7：130-147)；(2)改善对抗原-呈递细胞(APCs)的抗原送递，以及改善APCs对抗原的处理和呈递(参见，例如，Fazekas de St.Groth等，Immunol.Today，19：448-454，1998)，例如，在抗原佐剂复合体被APCs消化之后通过使抗原跨越红细胞浆质膜进入胞质溶胶(Kovacsovics-Bankowski等，Science，1995，267：243-246)；(3)模拟微生物结构，导致位于先天免疫系统的附属细胞上的病原体识别受体(PRRs)对微生物产生的抗原的识别的改善(Janeway，1989，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，54：1-13；Medzhitov，1997，Cell，91：295-298；Rook，1993，Immunol.Today，14：95-96)；(4)模拟来自应激或损伤细胞用来引发免疫应答的诱导危险的信号(参见，例如，Matzinger，1994，Annu.Rev.Immunol.，12：991-209)，(5)诱导免疫调节细胞因子的产生(参见，例如，Nohria，1994，Biotherapy，7：261-269；Iwasaki等，1997，J.Immunol.，158：4591-4601；Maecker等，1997，Vaccine，15：1687-1696)；(6)使免疫应答偏置于特定亚组的免疫系统(例如，产生Th1-或Th2-极化应答[参见下文]，等)(Janssen等，Blood，97：2758-2763，2001；Yamamoto等，Scand.J.Immunol.，53：211-217，2001；Weiner G.J.，J.Leukoc.Biol.，68：455-63，2000；Lucey，Infect.Dis.Clin.North Am.，13：1-9，1999)，和(7)阻断抗原攻击的快速传播(″蓄积效应″)(Hood等，Immunology，Second Ed.，1984，Benjamin/Cummings：Menlo Park，CA；St Clair等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，96：9469-9474，1999；Ahao等，J.Pharm.Sci.，85：1261-1270，1996；Morein等，Vet.Immunol.Immunopathol.，54：373-384，1996)。(也可以参见Schijns的综述文献，Curr.Opin.Immunol.，12：456-463，2000；Vogel，Clin.Infect.Dis.，30[增刊3]：S266-70，2000；Singh和O′Hagan，NatureBiotechnol.，17：1075-81，1999；Cox和Coulter，Vaccine，15：248-256，1997)。

最近的发现强烈提示，内源产生的细胞因子作为传统佐剂激发的基本通讯信号而起作用。细胞因子网络的冗余使得它难以将特定佐剂的活性归因于一种或几种细胞因子。对于免疫原性重要的细胞因子可以包括炎性物质原(1型)：干扰素(IFN)-α/β，肿瘤坏死因子(TNF)-α，白细胞介素(IL)-1，IL-6，IL-12，IL-15和IL-18，它们影响抗原呈递。其他的可以但当更下游克隆扩展和T和B细胞的分化，IL-2，IL-4和IFN-γ作为原型(Brewer等，1996，Eur.J.Immunol.，26：2062-2066；Smith等，1998，Immunology，93：556-562)。通过诱导IFN-γ和延迟型过敏性而增强免疫应答的佐剂也激发IgG亚类的产生，而IgG亚类在补体-介导的溶胞作用和抗体-依赖性-介导的-细胞毒性效应物机理中最具有活性(例如，小鼠中的IgG2a和人中的IgG1)(Allison，Dev.Biol.Stand.，1998，92：311；Unkeless，Annu.Rev.Immunol.，1988，6：251-81；Phillips等，Vaccine，1992，10：151-8)。

毫无疑问，一些佐剂可以发挥一项以上的功能。例如，纯化的微生物成分例如LPS或者鼠弓形体的提取物不只是快速增加抗原-呈递树突细胞(DC)的数目而且它们的迁移还增加IL-12产生(Souza等，1997，J.Exp.Med.，186：1819-1829)。

因为不同的佐剂可以具有不同的作用机理，可以以要应用的给药途径，期望的免疫应答的类型(例如，抗体-介导的，细胞-介导的，粘膜等)，和基本抗原的特别不适性为基础来选择和特定疫苗使用。

一定平衡考虑向疫苗配方中掺入佐剂提高免疫原性的好处和这些试剂会诱导局部和/或全身副作用的风险。局部副反应包括注射部位局部炎症和，罕见的，诱导肉芽留或无菌脓肿形成。对试验动物观察到的对佐剂的全身性反应包括不适，发烧，佐剂关节炎，和先前的葡萄膜炎(Allison等，Mol.Immunol.，1991，28：279-84；Waters等，Infect.Immun.，1986，51：816-25)。这样的反应经常是由佐剂和抗原本身的相互作用引起的，或者可能因为佐剂对特定抗原产生的应答的类型，或者佐剂诱导的细胞因子分布。

因此，很多有效的免疫佐剂，例如弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，是毒性的，因此只用于动物研究目的，而不是对人接种。目前，铝盐和MF59被证明是对人使用的最佳的疫苗佐剂。在评估的新的佐剂中，免疫刺激分子例如脂多糖-衍生的MPL和皂甙衍生的QS-21表现出最有希望，但是对它们对人用安全性有怀疑。特定佐剂，例如MF59微乳液和脂粒免疫刺激复合体(ISCOMs)的临床前研究提示这些分子本身也是体液和细胞免疫应答的有效激发剂，另外，对CpG寡核苷酸的临床前数据表现得令人鼓舞，特别是关于它们选择性操作免疫应答的能力。所有这些佐剂表现预示，开发更有效的新的佐剂可以开发新疫苗，使新的和已经存在的疫苗用作治疗药物和改进的预防性药物。

最近，已经鉴定了新的淋巴样血统，天然杀伤T(NKT)细胞，与主流T细胞，B细胞和NK细胞不同(Arase等，1992，Proc.Natl Acad.Sci.USA，89：6506；Bendelac等，1997，Annu.Rev.Immunol.，15：535)。这些细胞特征在于在小鼠中共同表达Vα14和Jα281基因片段编码的NK细胞受体和半-不变T细胞受体(TCR)和在人体中共同表达Vα24和JαQ基因片段编码的NK细胞受体和半-不变T细胞受体(TCR)。NKT细胞的体内激活迅速诱导一系列导致先天细胞例如天然杀伤(NK)细胞和树突细胞(DC)激活的细胞激活作用，适应细胞例如B细胞和T细胞的激活，共同刺激分子的诱导，和突然释放细胞因子例如白细胞介素-4(IL-4)和干扰素-γ(IFN-γ)(Burdin等，Eur.J.Immunol.29：2014-2025，1999；Carnaud等，J.Immmunol.，163：4647-4650，1999；Kitamura等，J.Exp.Med.，189：1121-1128，1999；Kitamura等，Cell Immunol.，199：37-42，2000；Aderem和Ulevitch，Nature，406：782-787，2000)。另外，激活的NKT细胞本身带来Fas和穿孔素介导的杀伤。NKT TCR的衔接能补充全部激活级联。或者，通过感染的巨噬细胞或DC释放的细胞因子例如白细胞介素-12(IL-12)能选择性触发有效的1型(Th1)辅助细胞功能。有可能相信这些功能与NKT细胞在如自身免疫糖尿病，已经确定的肿瘤的排斥这样的症状中的重要作用或者化学诱导的肿瘤的预防有关(Yoshimoto等，1995，Science，270：1845；Hammond等，J.Exp.Med.，187：1047-1056，1998；Kawano等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：5690；Lehuen等，J.Exp.Med.，188：1831-1839，1998；Wilson等，Nature，391：177-181，1998；Smyth等，J.Exp.Med.，191：661-668，2000)。最后，认为NKT细胞通过它们影响Th1-Th2极化的能力而成为抗菌免疫性的致因(Cui等，J.Exp.Med.，190：783-792，1999；Singh等，J.Immunol.，163：2373-2377，1999；Shinkai和Locksley，J.Exp.Med.，191：907-914，2000)。因此，推断这些细胞是先天免疫应答中的关键效应细胞。但是，NKT细胞在适应性免疫应答的发展中潜在的作用还不清楚。

最近，有人证明α-半乳糖基-神经酰胺(α-GalCer)，一种最初从Okinawan海绵中提取的糖脂(Natori等，Tetrahedron，50：2771-2784，1994)，或者其合成的类似物KRN7000[(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六酰氨基)-1，3，4，-十八烷三醇]能体外和体内激活NKT细胞，KRN7000能从Pharmaceutical ResearchLaboratories，Kirin Brewery(Gumna，日本)获得或者根据先前描述而获得(参见，例如，Kobayashi等，1995，Oncol.Res.，7：529-534；Kawano等，1997，Science，278：1626-9；Burdin等，1998，J.Immunol.，161：3271；Kitamura等，1999，J.Exp.Med.，189：1121；美国专利No.5,936,076)。因此，表明iα-GalCer能刺激NK活性和NKT细胞产生细胞因子，并且表现出体内潜在的抗肿瘤活性(Kawano等，1997，上文；Kawano等，1998，Proc.Natl Acad.Sci.USA，95：5690；Kitamura等，1999，上文)。Kitamura等(1999，上文)证明α-GalCer的免疫刺激效应由CD40-CD40L-介导的NKT-DC相互作用引发。因为在CD1d^-1-和NKT-缺陷小鼠中不存在α-GalCer的免疫调节功能，这表明α-GalCer由MHC I类-样分子CD1d呈现。

CD1是与MHC相关的非多态性基因的保守家族，它看起来涉及向T细胞呈递脂质和糖脂抗原，并且在这个途径中参与抗原识别的先天和适应途径(Park和Bendelac的综述，Nature，406：788-792，2000；还参见Calabi等，Eur.J.Immunol.，19：285-292，1989；Porcelli和Modlin，Annu.Rev.Immunol.，17：297-329，1999)。包括最多5种基因(同位型)，它们以序列同源性为基础能分为两组。第1组，包括CD1a，CD1b，CD1c和CD1e，在人体中呈现但是在小鼠和大鼠身上没有。第2组，包括CD1d，在迄今为止的研究的所有的物种中都发现了，包括人。

抗原呈递细胞例如树突细胞(DCs)，巨噬细胞和B细胞亚型选择性表达CD1同位型，但是除CD1d在肝细胞中表达之外，它们一般不在实体组织中表达(Porcelli等，上文；Bendelac等，Annu.Rev.Immunol.，15：535-562，1997)。表达半-不变体TCR并且发挥有效的效应物和调节功能的小鼠和人CD1d-限制淋巴细胞中的那些以皮摩尔浓度识别α-GalCer(Kawano等，Science，278：1626-1629，1997)。CD1d/α-GalCer复合体接着被小鼠Vα14和人Vα24天然杀伤T(NKT)细胞的抗原受体识别(Bendelac等，Science，268：863-865，1995；Bendelac等，Annu.Rev.Immunol.，15：535-562，1997；Park等，Eur.J.Immunol.，30：620-625，2000)。

与CD1d结合时，证明α-GalCer体内和体外激活鼠NKT细胞(Kawano等，1997，Science，278：1626-1629；Burdin等，1998，J.Immunol.，161：3271-3281)，和体外激活人NKT细胞(Spada等，1998，J.Exp.Med.，188：1529-1534；Brossay等，1998，J.Exp.Med.188：1521-1528)。例如，证明α-GalCer通过激活人NKT细胞而体外展示NKT-介导的抗-肿瘤活性(Kawano等，1999，Cancer Res.，59：5102-5105)。

除了α-GalCer之外，证明具有糖基部分α-异构构象和植物鞘氨醇的3，4-羟基的其他糖基神经酰胺(例如α-葡糖基神经酰胺[α-GlcCer]，Galα1-6Galα1-1′Cer，Galα1-6Glcα1-1′Cer，Galα1-2Galα1-1′Cer，和Galβ1-3Galα1-1′Cer)刺激小鼠Vα14 NKT细胞的增殖，但是效率较低(Kawano等，Science，278：1626-1629，1997)。通过对一组α-GalCer类似物分析与小鼠Vα14 NKT细胞杂交瘤的反应性，Brossay等(J.Immunol.，161：5124-5128，1998)认为α-GalCer酰基链从24至2碳原子几乎完全截断不显著影响小鼠对小鼠CD1或者其人类似物呈递的糖脂的NKT细胞应答。

还证明了体内施用α-GalCer不只引起通过CD1d-限制机理诱导强NK活性和细胞因子产生(例如，IL-4，IL-12和IFN-γ)的NKT细胞的激活作用，而且还诱导获得性免疫性中涉及的免疫调节细胞的激活(Nishimura等，2000，Int.Immunol.，12：987-994)。具体地说，除了巨噬细胞和NKT细胞的激活作用之外，证明体内施用α-GalCer导致早期激活标记物CD69对CD4⁺T细胞，CD8⁺T细胞，和B细胞的诱导(Burdin等，1999，Eur.J.Immunol.29：2014；Singh等，1999，J.Immunol.163：2373；Kitamura等，2000，Cell.Immunol.199：37；Schofield等，1999，Science 283：225；Eberl等，2000，J.Immunol.，165：4305-4311)。这些研究展现了这样的可能性，即α-GalCer在桥接中可以起着同等重要的作用，不仅桥接NKT细胞介导的先天免疫性，而且还桥接B细胞，T辅助(Th)细胞和T细胞毒性(Tc)细胞介导的适应性免疫。

由于鉴定了新的肿瘤特异性抗原并且认识到免疫系统在预防癌症和控制肿瘤生长中起着重要的作用，最近几年，再次恢复了对开发治疗性癌症疫苗的兴趣(例如，减小肿瘤负担和控制转移)。

糖脂配体α-GalCer和NKT细胞快速接触诱导细胞激活级联，这涉及先天和适应性免疫以及产生肿瘤特异性细胞毒性T细胞的共同原理(Nishimura等，2000，上文)，的实证提示，施用α-GalCer一般不只是可以影响速度和强度而且还影响接着的免疫应答的类型，特别是，抗肿瘤细胞的那些。事实上，Kabayashi等(1995，Oncol.Res.，7：529-534)发现合成形式的α-GalCer(KRN 7000)在携带B16的小鼠中比生物反应改性剂例如OK432和香菇多糖和化疗药物丝裂霉素C有更强的抗转移活性。在这些实验中，60％带肿瘤的小鼠用100μg/kgKRN7000治疗得到治愈。KRN7000还表现出在鼠T-淋巴瘤EL-4细胞(Nakagawa等，Oncol.Res.，10：561-568，1998)或结肠26细胞(Nakagawa等，Cancer Res.，58：1202-1207，1998)的肝转移小鼠中诱导显著的肿瘤-特异性免疫性。此外，对小鼠施用α-GalCer抑制原发性黑素瘤发生肝转移(Kawano等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：5690-5693)。

上面得出的数据使得本发明人假设糖基神经酰胺-诱导的NKT细胞应答也可以有助于抗各种炎症中涉及的免疫应答。事实上，本发明人和同事最近发现对小鼠施用α-GalCer快速产生强的抗疟疾活性，抑制啮齿动物疟疾寄生虫约氏疟原虫和P.berghei发育到肝细胞内阶段(Gonzalez-Aseguinolaza等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：8461-8466)。但是单独对没有CD1d或Vα14 NKT细胞的小鼠施用α-GalCer，没有保护它们抗疟疾，表明α-GalCer的抗疟活性需要NKT细胞和CD1d的表达。此外，α-GalCer不能抑制寄生虫在没有IFN-γ或IFN-γ受体的小鼠的肝中发育，表明糖脂的抗疟活性主要由IFN-γ介导。

着眼于α-GalCer的NKT-介导的抗肿瘤和抗寄生虫活性的数据，提出这种糖脂是保护性免疫应答的有效的诱导剂(参见，例如，Park和Bendelac，上文)。本发明人第一次构思和证明重要地祥述这些假设，即α-GalCer和相关的糖基神经酰胺可以不仅作为抗原使用，而且可以用作能增强和/或扩大其他抗原诱导的保护性免疫应答的持续时间的佐剂。这是意想不到的发现，因为α-GalCer-介导的NKT细胞激活导致疟疾感染细胞的完全消除，因此排除了发生适应性免疫应答需要的抗原源。事实上，用照射子孢子免疫之前施用两天α-GalCer几乎完全破坏子孢子-诱导的保护作用。因此，为了使用α-GalCer作为佐剂，与给定抗原相关的施用时间是非常重要的。

因此，本发明第一次提供了用于增强和/或延长哺乳动物特别是人体中抗原的免疫应答时间的方法和组合物，涉及用(i)抗原和(ii)含有糖基神经酰胺，特别是α-GalCer的佐剂，联合对哺乳动物进行免疫。

重要的是，除了它刺激免疫应答的能力之外，已经证明α-GalCer，不依赖其剂量，对啮齿动物和猴子不诱导毒性(Nakagawa等，1998，Cancer Res.，58：1202-1207)。此外，虽然近期研究表明α-GalCer处理小鼠之后立即观察到肝酶活性暂时提高，提示有较小的肝损伤(Osman等，2000，Eur.J.Immunol.，39：1919-1928)，最近使用α-GalCer进行了人体试验治疗癌症患者没有显著并发症(Giaccone等，2000，Abstract.Proc.Amer.Soc.Clin.Oncol.，19：477a)。最后，和很多新研制开发的佐剂不一样(见下文)，α-GalCer和相关的糖基神经酰胺可以以合理的产率和效率合成制备(参见，例如，美国专利No.5,936,076)。所有的这些因素使得糖基神经酰胺，特别是α-GalCer，成为期望的佐剂候选。

与α-GalCer和相关的糖基神经酰胺相反，批准对人使用的常规疫苗送递系统和佐剂，铝盐和MF59(Singh和O′Hagan，Nat.Biotechnol.，17：1075-1081，1999)，在诱导CD8+T细胞应答方面不好。虽然一些新的佐剂，例如纯化的皂甙，免疫刺激复合体，脂质体，CpG DNA基序，和重组减弱病毒(例如，腺病毒，新培斯病毒，流感病毒，和牛痘病毒)，已经被证明与单独的给定的相同抗原诱导的或与标准明矾佐剂联合诱导的那些相比，改善抗原特异性细胞免疫应答(Newman等，J.Immunol.，1992；148：2357-2362；Takahashi等，Nature，1990，344：873-875；Babu等，Vaccine，1995，13：1669-1676；Powers等，J.Infect.Dis.，1995，172：1103-7；White等，Vaccine，1995，13：1111-1122；Krieg等，TrendsMicrobiol.，6：23-27，1998；Rodrigues等，J.Immunol.，158：1268-1274，1997；Tsuji等，J.Virol.，72：6907-6910，1998；Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5214-52188，1993)，目前可得的佐剂中没有一个兼有对人的低毒性，生产的低成本和有效刺激免疫系统的能力。

产生适应性免疫应答是一个多因素现象，其中很多因素参与。就这一点来说，α-GalCer-激活的NKT细胞诱导产生适应性免疫应答中涉及的很多元件的激活，例如抗原呈递细胞(APC)，B细胞，T辅助(Th)细胞和T细胞毒性(Tc)细胞。因此，理论上说，α-GalCer可能是理想的免疫调节剂。另外的好处是能施用α-GalCer并且通过很多不同的途径激活免疫系统，包括适合人使用的口服，皮下和肌内途径。最后，证明α-GalCer对啮齿动物和猴子不诱导毒性(Nakagawa等，Cancer Res.，58：1202-1207，1998)。

因此，本领域强烈需要开发新的佐剂，它能综合低毒性和容易利用，有明显程度增强和/或延长抗原特异性免疫应答的能力。本发明通过提供糖基神经酰胺，一组新的具有卓越性能的佐剂，满足本领域这些和其他需求。这样的佐剂能改善用于治疗各种炎症和癌症的预防性和/或治疗性疫苗。

本发明概述

本发明的一个目的是提供增强哺乳动物体内抗原的免疫原性的方法，包括与含有通式1的糖基神经酰胺的佐剂的组合物联合施用所述抗原：

其中R₁，R₂和R₅代表H或具体单糖；R₃和R₆分别代表H或OH；R₄代表H，OH或具体单糖；X代表1-23的整数；R₇代表下面基团(a)-(g)的任一个：(a)--(CH₂)₁₁--CH₃，(b)--(CH₂)₁₂--CH₃，(c)--(CH₂)₁₃--CH₃，(d)--(CH₂)₉--CH(CH₃)₂，(e)--(CH₂)₁₀--CH(CH₃)₂，(f)--(CH₂)₁₁--CH(CH₃)₂，(g)--(CH₂)₁₁--CH(CH₃)--C₂H₅。

本发明优选的佐剂包括α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)，具体地说，是式2代表的(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六酰基氨基)-1，3，4-十八烷三醇((2S，3S，4R)-1-O-(α-D-ctopyranosyl)-2-(N-hexacosanoylamino)-1，3，4-octadecanetriol)：

根据本发明，糖基神经酰胺用作佐剂导致抗原诱导的保护性免疫性的增强和/或时间的延长，并且至少部分引起抗原特异性Th1-型应答，特别是CD8+T细胞应答的增强和/或时间的延长。

本发明的含有糖基神经酰胺的佐剂可以和任何抗原特别是来自感染物质或肿瘤的抗原联合施用。优选地，同时施用佐剂和抗原，最优选以单位剂量形式。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗哺乳动物疾病的预防性和/或治疗性方法，包括对所述哺乳动物与佐剂组合物一起施用免疫保护性抗原，所述佐剂组合物包括糖基神经酰胺。如这里具体指出的，该方法能用于预防和/或治疗各种炎症或肿瘤疾病。在优选的实施方案中，应用本发明的方法治疗选自病毒感染，细菌感染，寄生虫感染和真菌感染的感染。

因此，在具体的实施方案中，本发明公开了用于对哺乳动物(例如人)赋予抗疟疾的子孢子阶段的免疫性的方法，其中所述方法包括对所述哺乳动物联合施用疟疾特异性抗原和含有α-GalCer的免疫佐剂。在另一个具体的实施方案中，本发明公开了用于增强哺乳动物对HIV感染(和有效预防和/或治疗AIDS)的免疫应答的方法，其中所述方法包括对所述哺乳动物联合施用HIV-特异性抗原和含有α-GalCer的佐剂。这里公开的另外的具体方法不受限制地包括：

(i)通过施用牛分支杆菌(Mycobacterium bovis)杆菌Calmette-Guérin和含有α-GalCer的佐剂，增强对牛分支杆菌(Mycobacterium bovis)杆菌Calmette-Guérin的免疫应答，用于预防结核分支杆菌(M.Tuberculosis)感染；

(ii)通过施用编码人黑素瘤相关抗原，gp100，的质粒cDNA和含有α-GalCer的佐剂，增强对黑素瘤的免疫应答；

(iii)通过施用从免疫决定簇(determinant)抗原65kDa甘露糖蛋白(mannoprotein)(MP65)衍生的肽和含有α-GalCer的佐剂，增强对白色假丝酵母(Candida albicans)的免疫应答。

与本发明的方法结合，还提供了含有免疫原有效量的抗原和免疫原有效量的选自式1的糖基神经酰胺，和，任选的，药学可接受载体或赋形剂的药物和疫苗组合物。在具体的实施方案中，用于本发明的佐剂制剂的糖基神经酰胺是α-GalCer，具体地是[(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六酰氨基)-1，3，4，-十八烷三醇]。

在本发明的组合物中使用的抗原不受限制地包括各种病毒，细菌，真菌，寄生虫-特异性的，和肿瘤特异性的抗原。本发明的病毒抗原的非限制性例子包括HIV抗原，例如gp120，gp160，p18，Tat，Gag，Pol，Env，Nef；来自疱疹病毒的糖蛋白；来自乙肝病毒的表面抗原和核心抗原。本发明的细菌抗原的非限制性例子包括来自疏螺旋体属OspA，OspB和OspC抗原。本发明的真菌和寄生虫抗原的非限制性例子包括分别来自白色假丝酵母(Candida albicans)的MP65和来自疟原虫属(Plasmodium sp.)的CS蛋白质。本发明的肿瘤特异性的非限制性例子包括来自黑素瘤的Melan A和gp100抗原。

在具体的实施方案中，所述抗原是疟疾-特异性的并且包括，例如，照射的疟原虫子孢子或者包括疟原虫环子孢子(CS)蛋白质的T细胞表位，例如CD4+T细胞表位YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK(SEQ ID NO：1)或者约氏疟原虫CS蛋白质的CD8+T细胞表位SYVPSAEQI(SEQ ID NO：2)，或者CD4+T细胞表位(NVDPNANP)_n(SEQ ID NO：3)，或P.falciparum CS蛋白质的CD4+/CD8+T细胞表位EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQID NO：4)的合成肽抗原。在另一个优选的实施方案中，抗原是HIV-特异性的，例如p18蛋白质的CD8+T细胞表位RGPGRAFVTI(SEQ ID NO：5)或者HIV-1 Gag p24CD8+T细胞表位(例如，KAFSPEVIPMF(aa 30-40，SEQ ID NO：6)，KAFSPEVI(aa30-37，SEQ ID NO：7)，TPQDLNM(或T)ML(aa 180-188，SEQ IDNOS：8和9)，DTINEEAAEW(aa 203-212，SEQ ID NO：10)，KRWIILGLNK(aa 263-272，SEQ ID NO：11)，和QATQEVKNW(aa 308-316，SEQ IDNO：12))，或Gag p17 CD8+T细胞表位(例如，RLRPGGKKK(aa 20-29，SEQ ID NO：13)和SLYNTVATL(aa 77-85，SEQ ID NO：14))。

在具体的实施方案中，表达所述抗原的重组病毒呈递所述抗原。优选地，所述病毒选自重组腺病毒，重组痘病毒，和重组新培斯病毒(Sindbis virus)。

本发明还提供了用于含有至少一种抗原和含有糖基神经酰胺佐剂的疫苗组合物的制备方法，所述方法包括混合佐剂和抗原。

在相关的实施方案中，本发明提供了用于制备含有至少一种抗原和含有糖基神经酰胺佐剂的药物或疫苗组合物的试剂盒，所述试剂盒在第一个容器中含有抗原，并且在第二个容器中含有佐剂，以及任选地，包括将抗原和佐剂混合的说明和/或施用组合物的说明；并且其中任选地容器在一个包装中。

附图的简要说明

图1A-D.α-GalCer增强由照射的子孢子和表达疟原虫抗原的重组病毒诱导的保护性抗-疟疾免疫性。A.用不同剂量的(0.5，1，或2微克)或赋形剂(-)对一组BALB/C小鼠腹膜内共同注射，并且一起用约氏疟原虫照射的子孢子(γ-spz)静脉内免疫。两星期之后，用传染性子孢子攻击所有组的小鼠，并且通过实时RT-PCR测定肝中寄生虫rRNA的量。收集来自免疫的和没有免疫的小鼠的血清并且通过IFA测定抗-子孢子抗体的滴度。B.用γ-spz免疫BALB/c(■)或B10.D2(□)小鼠之前两天(-2)，同一天(0)或者两天之后(+2)施用单一剂量的α-GalCer。C.用表达约氏疟原虫CS蛋白质的重组腺病毒，AdPyCS，皮下免疫一组BALB/c小鼠，同时皮下施用α-GalCer(+)或赋形剂(-)。D.用表达约氏疟原虫(P.yoelii)CS蛋白质，SIN(Mal)的CD8+T细胞表位的重组新培斯病毒对一组小鼠皮下免疫，同时皮下施用α-GalCer(+)或赋形剂(-)。星号(*)表示应用未配对t-试验的两个值之间的统计学误差(P＜0.01)。在B-D中，两个星期之后，所有组的小鼠都感染了活体约氏疟原虫子孢子，如A所述测定活体中入侵的寄生虫。结果以五只小鼠的平均值±SD表示。

图2A-C.α-GalCer提高各种疫苗激发的抗原-特异性T细胞免疫应答。A.通过相同途径施用或没有施用α-GalCer，用γ-spz皮下免疫一组BALB/c小鼠，两周或六周之后分离脾淋巴细胞，并且通过ELISPOT分析测定IFN-γ分泌CS-特异性CD8+(■)和CD4+(□)T细胞的数目。B.用表达约氏疟原虫CS蛋白质，AdPyCS，的重组腺病毒皮下免疫一组BALB/c小鼠，并且皮下施用α-GalCer(+)或赋形剂(-)。两个星期之后通过ELISPOT分析测定IFN-γ分泌CS-特异性CD8+(■)和CD4+(□)T细胞的数目。C.用表达约氏疟原虫CS蛋白质，SIN(Mal)，的CD8+T细胞表位的重组新培斯病毒，或者表达HIV的p18蛋白质，SIN(p18)，的CD8+T细胞表位的重组新培斯病毒皮下免疫一组BALB/c小鼠，并且皮下施用α-GalCer(+)或赋形剂(-)。两个星期之后通过ELISPOT分析测定IFN-γ分泌CS-特异性和p18-特异性CD8+T细胞的数目。数据代表相似结果的两个实验中的一个并且表示为三只小鼠的平均值±SD。

图3A和3B.α-GalCer延长γ-spz激发的保护性抗疟疾免疫应答的时间。A.用γ-spz和α-GalCer(+)或赋形剂(-)一起免疫BALB/c小鼠，如图2所示，2-4周之后，通过ELISPOT分析测定脾中IFN-γ分泌CS-特异性CD8+T细胞的数目。B.用1×10⁴或1×10⁵γ-spz免疫经α-GalCer(+)或赋形剂(-)处理过的BALB/c小鼠，分别在2或4周之后，用50个活约氏疟原虫子孢子攻击这些和没有接种的小鼠。通过监测攻击之后3-14天稀少的额血涂片中寄生物血症确定血液感染的发生。

图4A和4B.α-GalCer的佐剂活性需要CD1d分子和Vα14 NKT细胞。A.用γ-spz静脉内免疫BALB/c背景CD1d-缺陷(CD1^-1-)，Vα14NKT(Jα281^-1-)缺陷和野生型(WT)小鼠组并且腹膜内施用α-GalCer(+)或赋形剂(-)。两周之后用活子孢子攻击这些和没有接种的小鼠，并且如图1所述测定肝中入侵的寄生虫。B.用γ-spz免疫相同组的A中描述的小鼠，腹膜内注射α-GalCer(+)或赋形剂(-)。两周之后，通过ELISPOT分析测定脾中IFN-γ分泌CS-特异性CD8+T细胞的数目。星号(*)表示应用未配对t-试验的两个值之间的统计学误差(P＜0.01)。结果反映相似结果的两个实验并且表示为五个(A)或三个(B)的平均值±SD。

图5A-C.在IFN-γ受体缺陷小鼠中取消α-GalCer的佐剂活性。A.用γ-spz静脉内免疫B10.D2背景IFN-γ受体缺陷(IFN-γR^-1-)和野生型(WT)小鼠组并且腹膜内施用α-GalCer(+)或赋形剂(-)。两之后获得脾淋巴细胞，并且通过ELISPOT分析测定IFN-γ分泌CS-特异性CD8+(■)和CD4+(□)T细胞的数目。B.从IFN-γR^-1-和WT小鼠获得肝淋巴细胞，并且染有PE-标记的CD1d/α-GalCer四聚体和FITC-标记的抗-CD3抗体，并且通过流式细胞仪分析测定α-GalCer-特异性T细胞百分比。右上角表明的数字代表肝淋巴样细胞群中双阳性细胞百分比。C.从IFN-γR^-1-(■)和WT(□)小鼠获得肝淋巴细胞，并且通过ELISPOT分析测定分泌IFN-γ或IL-4的α-GalCer-特异性细胞的数目，结果表示为五只小鼠的平均值±SD。

本发明的详细描述

定义

术语″佐剂″和″免疫佐剂″在本发明中互换使用，并且指当单独对宿主施用时可以是非免疫原性，但是当与抗原联合施用时增强对另一种抗原的宿主免疫应答的化合物或混合物。

通过本领域公知的任何方法能评价佐剂-介导的免疫应答的增强和/或免疫时间的延长，包括并且不限于下面的一种或几种：

(i)相对相应单独用抗原免疫而产生的那些，提高相应佐剂/抗原联合接种而产生的抗体的数目；(ii)提高识别抗原或佐剂的T细胞的数目；和(iii)提高一种或几种I型细胞因子的水平。

本发明的佐剂包括属于通式1能代表的一类鞘糖脂的化合物，特别是糖基神经酰胺

本发明优选的佐剂包括α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)，具体地说，是式2代表的(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六酰基氨基)-1，3，4-十八烷三醇：

本发明的佐剂中有用的糖基神经酰胺的其他例子包括但不限于：α-葡糖基神经酰胺(α-GlcCer)，具体地说，是式3的(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃葡糖苷)-N-二十六酰基-2-氨基-1，3，4-十八烷三醇：

Galα1-6Galα1-1′Cer，具体地说，是式4的(2S，3S，4R)-2-氨基-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷-(1-6)-α-D-吡喃半乳糖苷)-N-二十六酰基-1，3，4-十八烷三醇：

Galα1-6Glcα1-1′Cer，具体地说，是式5的(2S，3S，4R)-2-氨基-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷-(1-6)-α-D-吡喃葡糖苷)-N-二十六酰基-1，3，4-十八烷三醇：

Galα1-2Glcα1-1′Cer，具体地说，是式6的(2S，3S，4R)-2-氨基-1-O-(α-D-吡喃葡糖苷-(1-2)-α-D-吡喃半乳糖苷)-N-[(R)-2-羟基二十四酰基]-1，3，4-十八烷三醇：

Galβ1-3Galα1-1′Cer，具体地说，是式7的(2S，3S，4R)-2-氨基-1-O-(β-D-呋喃半乳糖苷-(1-4)-α-D-吡喃半乳糖苷)-N-[(R)-2-羟基二十四酰基]-1，3，4-十八烷三醇：

优选地，本发明的佐剂是人用药学可接受的。

本发明的佐剂能作为含有抗原的药物或疫苗组合物的部分或者作为分开的制剂施用，它与含有抗原的第二组合物联合施用。在这些组合物中，糖基神经酰胺能与其他佐剂和/或赋形剂/载体混合。这些其他佐剂包括但不限于，油-乳状液和乳化剂-为基础的佐剂，例如弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，MF59或SAF；矿物凝胶，例如氢氧化铝(明矾)，磷酸铝或磷酸钙；微生物产生的佐剂例如霍乱毒素(CT)，百日咳毒素，大肠杆菌热不稳定毒素(LT)，突变体毒素(例如，LTK63或LTR72)，卡介苗(BCG)，小型棒状杆菌(Corynebacterium parmacm)，DNA CpG基序，胞壁酰二肽，或单磷酸酯A；颗粒佐剂例如免疫刺激复合体(ISCOMs)，脂质体，生物可降解微球，或皂甙(例如，QS-21)；细胞因子例如IFN-γ，IL-2，IL-12或GM-CSF；合成的佐剂例如非离子嵌段共聚物，胞壁酰肽类似物(例如，N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺[thr-MDP]，N-乙酰基-去甲-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺，乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺-L-丙氨酸-2-[1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基]-乙基胺)，聚磷腈(polyphosphazenes)，或合成的多核苷酸，和表面活性物质例如溶血卵磷脂，多聚醇，聚阴离子，肽，烃乳状液，或匙孔血蓝蛋白(KLH)。优选地，这些附加佐剂对于人用也是药学可接受的。

在本发明的定义中，术语″联合施用″用来指在一种组合物中同时施用，或者在不同的组合物中同时，或者依次施用免疫佐剂和抗原。顺序施用认为是″联合″，但是，抗原和佐剂必须以仍然使得佐剂增强对抗原的免疫应答的一定时间间隔分开施用。例如，当抗原是一种多肽时，在同一天施用抗原和佐剂，优选地，彼此间隔1小时，最优选地同时施用。但是，当对受试者送递核酸并且多肽抗原在宿主细胞中表达时，施用核酸24小时之内施用佐剂，优选6小时之内。

如这里使用的，术语″免疫原″意思是抗原能激发体液或细胞免疫应答，优选激发这两者。免疫原整体也是抗原性的。免疫原组合物是当对具有免疫体系的动物施用时激发体液或细胞免疫应答或者这两者的组合物。

术语″抗原″指当导入宿主，动物或人体中时被宿主的免疫系统识别并且能激发免疫应答的任何物质(例如，蛋白质，肽，多糖，糖蛋白，糖脂，核酸，或者它们的组合)。如这里定义的，抗原-诱导的免疫应答可以是体液的或细胞介导的，或两者。当一种物质能特异性与免疫系统的抗原识别分子例如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体(TCR)相互作用时，称为是″抗原性的″。在本发明的定义中，抗原优选是″表面抗原″，即，在病原体的表面，在受感染细胞的表面，或者在肿瘤细胞的表面上天然表达。是抗原性的分子其本身不必须是免疫原性的，即，没有佐剂或载体就能激发免疫应答。

术语″表位″或″抗原决定簇″指B细胞，或T细胞或两者识别的抗原的任何部分。优选地，这样的表位与免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体(TCR)的抗原识别位点相互作用导致诱导抗原-特异性免疫应答。只有当蛋白质裂解成较小的肽并且以位于另一个细胞表面的称之为“主要组织相容性复合体(MHC)”的复合体存在时T细胞才识别蛋白质。有两类MHC复合体-I类和II类，每一类有很多不同的等位基因构成。事实上每个细胞细胞上都发现了I类MHC复合体并且呈递细胞中产生的蛋白质产生的肽。因此，I类MHC复合体用于杀死病毒感染的细胞或者由于致癌基因表达的结果而变成癌的细胞。其表面上有称作CD8的蛋白质的T细胞通过T细胞受体(TCR)特异性结合，I类MHC/肽复合体。这导致溶细胞效应物活性。只是在抗原-呈递细胞(APC)上发现II类MHC复合体，并且用来呈递来自循环病原体的肽，所述循环病原体已经被APC内吞。具有称为CD4的蛋白质的T细胞通过TCR与II类MHC/肽复合体结合。这导致刺激免疫应答的特异细胞因子的合成。为了通过I类MHC呈递而被免疫系统有效地识别，抗原多肽必须包含至少大约8-10个氨基酸的表位，而为了通过II类MHC呈递而被免疫系统有效地识别，抗原多肽必须包含至少大约13-25个氨基酸的表位。参见，例如，Fundamental Immunology，第三版，W.E.Paul编著，1999，Lippincott-RavenPubl。

术语″物种-特异性″抗原指只存在于或者从特定物种产生的抗原。这样，术语″疟疾-衍生的″或″疟疾-特异性″抗原指天然的(例如，照射的子孢子)或合成的(例如，化学合成的多抗原肽[MAP]或重组合成的多肽)抗原，它包括构成疟原虫的任一种蛋白质衍生的至少一种表位(B细胞和/或T细胞)(所述疟原虫是但不限于P.falciparuin，P.vivax，三日疟原虫(P.Malariae)，蛋形疟原虫(P.Ovale)，赖氏(P.Reichenowi)，诺氏疟原虫(P.knowlesi)，巴斯食蟹猴疟原虫(P.cynomolgi)，巴西疟原虫(P.brasilianum)，约氏疟原虫(P.yoelii)，伯氏疟原虫(P.berghei)，或夏氏疟原虫(P.Chabaudi))并且包括至少5-10个氨基酸残基。抗原产生的优选的疟原虫蛋白质是环子孢子(CS)蛋白质，但是，也能使用其他蛋白质，例如，凝血酶致敏蛋白相关附着(Anonymous)蛋白质(TRAP)，也称作子孢子表面蛋白质2(SSP2)，LSAI，hsp70，SALSA，STARP，Hep17，MSA，RAP-1，RAP-2等。

术语″疫苗″指能用来激发受试者保护性免疫性的组合物(例如，蛋白质或载体，例如，腺病毒载体，新培斯病毒载体，或痘病毒载体)。应该指出为了有效，本发明的疫苗能激发一部分接种种群的免疫性，因为一些个体不能发生有力的或保护性免疫应答，或者在一些情况下引起任何免疫应答。这种无能可能源自个体的遗传背景或者因为免疫缺陷条件(或者是后天的或先天的)或者免疫抑制(例如，由于用化学疗法治疗或者使用免疫抑制药物，例如，防止器官排斥或抑制自身免疫症状)。在动物模型中能确定疫苗效力。

术语″DNA疫苗″是本领域非正式术语，在这里指利用重组载体送递的疫苗。或者，这里使用更多的描述术语是″载体疫苗″(因为一些可能的载体，例如逆转录病毒和慢病毒是RNA病毒，并且因为在某些情况下非病毒RNA代替DNA被通过载体送递给细胞)。一般情况下，体内施用载体，但是也包括合适的抗原呈递细胞例如树突细胞(DC)的来自体内的转导，体内施用经转导的细胞。

术语″治疗″在这里用来指减轻或缓解患者的疾病的至少一种症状。在本发明的定义中，术语″治疗″还可以指延长显露前期(prepatency)，即，感染疾病和疾病临床表现之间的时间。优选地，所述疾病或者是感染的疾病(例如，病毒，细菌，寄生虫，或真菌)或者恶性肿瘤(例如，实体或血液肿瘤例如肉瘤，癌，神经胶质瘤，胚细胞瘤，胰腺癌，乳房癌，卵巢癌，前列腺癌，淋巴瘤，白血病，黑素瘤等)。

术语″保护″在这里指预防或治疗，或者两者，如果合适，预防或治疗患者疾病的发展或持续。在本发明的定义中，所述疾病选自感染(例如，病毒，细菌，寄生虫，或真菌)和恶性肿瘤(例如，实体或血液肿瘤例如肉瘤，癌，神经胶质瘤，胚细胞瘤，胰腺癌，乳房癌，卵巢癌，前列腺癌，淋巴瘤，白血病，黑素瘤等)。例如，如这里公开的，预防性施用含有与包括α-GalCer的佐剂混合的来自疟原虫的抗原的抗疟疫苗能保护受试者不冒发生疟疾的危险。类似地，根据本发明，与含有α-GalCer或另一种式1的糖基神经酰胺联合治疗性施用肿瘤-特异性抗原能增强抗-肿瘤免疫应答，导致肿瘤生长转移缓慢，甚至肿瘤消退。

术语″保护性免疫性″指宿主动物的免疫应答(或者是主动的/后天的或被动的/先天的，或者两者)，它导致所述抗原负载的失活和/或减少和产生持续时间长的免疫性(那是获得性的，例如，通过产生抗体)，它预防或延迟重复接触相同的或相关的抗原时发生疾病。″保护性免疫应答″包括体液(抗体)免疫性或细胞免疫性，或者两者，例如有效地消除或减少病原体负载或感染的细胞(或者导致感染的任何其他可测得的减轻)，或者减轻免疫的(接种的)受试者的肿瘤负担。在本发明的定义中，保护性免疫性可以是部分的。

免疫系统分类为两个一般系统，″先天的″或″天然的″免疫系统和″后天的″或″适应性″免疫系统。认为天然免疫系统最初保持控制下的感染，使得适应性免疫系统有时间产生合适的应答。最近的研究提出，先天免疫系统的各种成分触发和增强适应性免疫系统的成分，包括抗原-特异性B和T淋巴细胞(Fearon和Locksley，上文；Kos，1998，Immunol.Res.，17：303；Romagnani，1992，Immunol.Today，13：379；Banchereau和Steinman，1988，Nature，392：245)。

术语″先天免疫性″或″天然免疫性″指先前接触抗原不受影响的先天免疫应答。先天免疫系统的细胞，包括巨噬细胞和树突细胞(DC)，通过模式识别受体吸收外来抗原，这些抗原的肽片段与I类和II类MHC分子结合，并且分别刺激天然CD8⁺和CD4⁺T细胞(Banchereau和Steinman，上文；Holmskov等，1994，Immunol.Today，15：67；Ulevitch和Tobias，1995，Annu.Rev.Immunol.，13：437)。专业抗原-呈递细胞(APC)与这些T细胞联系，导致天然CD4⁺T细胞分化成T-辅助1(Th1)或T-辅助2(Th2)淋巴细胞，它们分别介导细胞和体液免疫性(Trinchieri，1995，Annu.Rev.Immunol.，13：251；Howard和O′Garra，1992，Immunol.Today，13：198；Abbas等，1996，Nature，383：787；Okamura等，1998，Adv.Immunol.，70：281；Mosmann和Sad，1996，Immunol.Today，17：138；O′Garra，1998，Immunity，8：275)。

术语″后天免疫性″或″适应性免疫性″在这里用来指在动物的生命中确立的主动或被动的，体液或细胞的免疫性，它对诱导抗原是特异性的，并且显著的是在反复与所述抗原接触时应答增强。适应性免疫系统T细胞的一个关键特征是它们检测细胞表面上MHC分子呈递的病原体产生的肽的详细浓度。

如这里使用的，术语″增强免疫应答″意指增强免疫应答或者延长免疫应答时间，或者两者。当指一种物质(例如佐剂)的性质时，术语″[能]增强免疫原性″指增强抗原的免疫原性的能力或者延长对抗原的免疫应答时间的能力，或者两者。

短语″增强免疫应答″在本发明的定义中指对给定抗原的免疫反应性的增大的规格和/或效率的性质和过程，所述免疫反应性是体液或细胞免疫性，或者两者。如果抗原-特异性免疫反应性的任何可测量参数(例如，抗体滴度，T细胞产生)提高至少两倍，优选10倍，最优选30倍，则相信免疫应答被增强。

对剂量或量使用的术语″治疗有效的″指对需要的哺乳动物施用时足以导致期望的活性的化合物或药物组合物或疫苗的量。如这里关于含有佐剂或含有抗原的组合物或疫苗所使用的，术语″治疗有效量/剂量″与术语″免疫原有效量/剂量″互换使用，并且指哺乳动物施用时足以产生有效的免疫应答的化合物(例如，抗原和/或含有糖基神经酰胺的佐剂)或药物组合物或疫苗的量/剂量。

短语″药学可接受的″与本发明的组合物联合使用时指当对人施用时是生理耐受的并且一般不产生不期望的反应的这样的组合物的分子整体和其他成分。优选地，如这里使用的，术语″药学可接受的″意思是得到联邦或政府管理部门的批准或者美国药典中列出的或者一般公知的对哺乳动物更特别地对人使用的药典列出的。

对本发明的药物或疫苗组合物使用的术语″载体″指和化合物(例如，抗原和/或包括糖基神经酰胺的佐剂)一起施用的稀释剂，赋形剂或载体。这样的药学载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油，动物，植物或合成来源的那些，例如花生油，豆油，矿物油，芝麻油和类似的。水或含水溶液，盐水溶液，和葡萄糖水溶液和甘油溶液优选用作载体，特别用于注射液。合适的药物载体是E.W.Martin，″Remington′s Pharmaceutical Sciences″，18版中描述的那些。

术语″天然抗体″或″免疫球蛋白″指通常的大约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)构成。每一条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而不同的免疫球蛋白同位型的重链之间的二硫键数目不同。每条重链和轻链还有有规律间隔的链间二硫桥。每条重链一端具有一个可变区(VH)接着是几个恒定区。每条轻链一端具有一个可变区(VL)，另一端有一个恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区排列，轻链可变区与重链的可变区排列。相信特定氨基酸残基形成轻链和重链可变区之间的界面(Clothia等，J Mol.Biol.，186：651-663，1985；Novotny和Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：4592-4596，1985)。

术语″抗体″或″Ab″以最广义使用并且具体不只是覆盖天然抗体而且还包括单链单克隆抗体(包括激动剂和拮抗剂抗体)，具有多表位特异性的抗体组合物，以及抗体片段(例如，Fab，F(ab′)2，scFv和Fv)，只要它们表现出期望的生物活性。

″细胞因子″是对另一个细胞种群作用作为细胞间调节剂的一个细胞种群释放的一组蛋白质的一般术语。这样的细胞因子的例子是淋巴因子单核因子和传统的多肽激素。细胞因子包括干扰素(IFN，特别是IFN-γ)，白细胞介素(IL，特别是IL-1，IL-2，IL-4，IL10，IL-12)，集落刺激因子(CSF)，血小板生成素(TPO)，红细胞生成素(EPO)，白血病抑制因子(LIF)，试剂盒-配体，生长激素(GH)，胰岛素-样生长因子(IGF)，甲状旁腺素，甲状腺素，胰岛素，松弛素，滤泡刺激激素(FSH)，甲状腺刺激激素(TSH)，leutinizing hormone(LH)，造血生长因子，肝生长因子，成纤维细胞生长因子(FGF)，催乳激素，胎盘催乳激素，肿瘤坏死因子(TNF)，mullerian-抑制物质，小鼠促性腺素-相关肽，抑制素，活化素，血管内皮生长因子(VEGF)，整联蛋白，神经生长因子(NGF)，血小板生长因子，转化生长因子(TGF)，骨诱导因子等。

术语″受试者″在这里指具有免疫系统的动物，优选哺乳动物(例如，啮齿类动物例如小鼠)。特别地，该术语指人。

术语″大约″或″大概″通常意指给定值或范围的20％之内，更优选10％之内，最优选5％之内。或者，特别是在生物系统中(例如，当测定免疫应答时)，术语″大约″意指优选在给定两个值系数之内的大约对数之内(即，数量级)。

术语″载体″，″克隆载体″，和″表达载体″意指通过它能将DNA或RNA序列(例如，外来基因)导入宿主细胞，从而转化宿主并且促进导入的序列的表达(例如，转录和/或翻译)的载体。载体包括质粒，噬菌体，病毒等。

根据本发明，可以应用本领域技术人员公知的常规分子生物学，微生物学，和重组DNA技术。这样的技术是公知的并且在文献中有详细解释。参见，例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)，Cold Spring Harbor拉Laboratory Press，冷泉港，纽约(这里是″Sambrook等，1989″)；DNACloning：A Practical Approach Volumes I and II(D.N.Glover编著1985)；Oligoizucleotide Synthesis(M.J.Gait编著1984)；Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames & S.J.Higgins编著(1985)]；Transcription And Translation[B.D.Hames & S.J.Higgins，编著(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney，编著(1986)]；Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等(编著)Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。

″核酸分子″(或者″核酸″)指核糖核苷的磷酸酯聚合物形式(腺苷，鸟苷，尿苷，或胞苷：″RNA分子″)或者脱氧核糖核苷(脱氧腺苷，脱氧鸟苷，脱氧尿苷，或脱氧胞苷：″DNA分子″)，或者它们的任何磷酯类似物，例如硫代磷酸酯或硫酯，或者是单链形式，或者是双链螺旋。定义的术语中包括寡核苷酸(具有少于100个核苷酸的构成单元)或多核苷酸，还有双链DNA-DNA，DNA-RNA，和RNA-RNA螺旋。该术语例如包括特别是在线性(例如，限制性片段)或环状DNA分子，质粒，和染色体中发现的双链DNA。在讨论特定双链DNA分子的结构中，可以根据只以5′至3′方向沿着没有转录的DNA链(即，具有与mRNA的序列同源性的链)给出的序列的常规标准描述序列。″重组DNA分子″是经历分子生物学操作的DNA分子。

如这里使用的，术语″多肽″指以氨基酸为基础的聚合物，它可以由核酸编码或者合成制备。多肽可以是蛋白质，蛋白质片段，嵌合蛋白等。一般来说，术语″蛋白质″指细胞内源表达的多肽。一般来说，编码特定蛋白质或酶的DNA序列被″转录″成相应的mRNA序列。mRNA序列接着″翻译″成形成蛋白质的氨基酸序列。″氨基酸序列″是两个或多个氨基酸的链。术语″肽″通常用于具有少于100个氨基酸构成单元的以氨基酸为基础的聚合物，而术语″多肽″指具有至少100个这样的单元的聚合物。但是，在这里，″多肽″是一般术语。

含有糖基神经酰胺的佐剂的应用

一方面，本发明提供增强哺乳动物抗原的免疫原性的方法，包括与含有式1的糖基神经酰胺优选半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)的佐剂组合物联合施用所述抗原。根据本发明，糖基神经酰胺用作佐剂导致抗原诱导的保护性免疫性的增强和/或时间的延长。例如，如这里公开的，联合施用糖基神经酰胺和相应于肿瘤或病毒抗原的T细胞或B细胞表位的肽，或者表达这些抗原的DNA构建体，增强抗原-特异性免疫应答。

本发明的含有糖基神经酰胺的佐剂可以与任何抗原联合施用，特别地，与来自感染的物质或肿瘤的抗原。

如背景技术部分讨论的，小鼠和人体中糖基神经酰胺的免疫刺激作用取决于CD1d分子的表达并且由NKT细胞介导。事实上，本发明证明α-GalCer佐剂活性至少部分归因于它增强和/或延长NKT-介导的抗原特异性Th1-型T细胞应答和CD8+T细胞(或Tc)应答的能力。

从免疫治疗的角度看，NKT细胞系统的糖基神经酰胺-介导的激活作用表现出比其他机理显著优越，在于下面几个原因：(a)激活的NKT细胞的细胞毒性水平非常高并且有效抗很多种肿瘤细胞或感染细胞；(b)糖基神经酰胺对NKT细胞的激活作用完全依赖于CD1d分子，它在个体中是单态性的(Porcelli，Adv.Immunol.，59：1-98，1995)，表明含有糖基神经酰胺的佐剂能被所有的患者利用，不管MHC单元型；(c)在免疫治疗之前通过使用Vα14 NKT细胞状态作为指示剂对小鼠体内测试，能评价人患者的DC的抗原呈递功能和NKT激活作用。

根据本发明，含有式1的糖基神经酰胺的佐剂和抗原可以作为两个分开的配方施用或者作为相同组合物的部分施用。如果分开施用，可以顺序或同时施用佐剂和抗原。如这里公开的，同时施用糖基神经酰胺佐剂和抗原是优选的，并且一般使得实现最有效免疫刺激。

因为本发明的糖基神经酰胺佐剂与大多数不同的抗原结合表现出它的免疫刺激活性，因此它用于保护性和治疗性应用。因此，在另一方面，本发明提供处理哺乳动物疾病的预防性和/或治疗性方法，包括对所述哺乳动物联合施用抗原和含有式1的糖基神经酰胺的佐剂。该方法能用于，例如，保护性抗和/或治疗各种炎症以及用于治疗各种肿瘤疾病。

能应用增强本发明方法的免疫原性克服感染，包括但不限于，寄生虫感染(例如疟原虫引起的那些等)，病毒感染(例如流感病毒，白血病病毒，免疫缺陷病毒例如HIV，乳头状瘤病毒，疱疹病毒，肝炎病毒，风疹病毒，痘病毒，流行性腮腺炎病毒，巨细胞病毒[CMV]，埃-巴病毒等引起的那些)，细菌感染(例如葡萄球菌属，链球菌属，肺炎球菌属，淋病奈瑟氏球菌属，疏螺旋体属，甲单胞菌属，等引起的那些)，和真菌感染(例如念珠菌属，发癣菌属，ptyrosporum，等引起的那些)。

本发明的方法还用于治疗各种癌症，包括但不限于纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肉瘤，软骨肉瘤，成骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴肉瘤，淋巴内皮肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，Ewing′s肿瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，胰腺癌，乳房癌，卵巢癌，前列腺癌，淋巴瘤，白血病，鳞状细胞癌，基础细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺肉瘤，骨髓癌，支气管原癌，肾细胞癌，肝癌，胆管癌，绒膜癌，精原细胞瘤，胚胎癌，Wilms′肿瘤，子宫颈癌，睾丸癌，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神经胶质瘤，星形细胞瘤，成神经管细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜细胞瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听觉神经瘤，少突神经胶质瘤，脑膜瘤，黑素瘤，神经母细胞瘤，和成视网膜细胞瘤。

如这里另外公开的，当同时施用抗原和糖基神经酰胺佐剂时获得增强本发明方法的免疫原性的最大效率。

在一个具体的实施方案中，本发明公开了预防和/或治疗哺乳动物(例如人)疟疾的方法，其中所述方法包括对所述动物联合施用疟疾-特异性抗原和含有式1的糖基神经酰胺，优选α-GalCer的佐剂。如下面实施例1中公开的，用最适度以下剂量的照射的疟疾寄生虫对小鼠接种，联合施用α-GalCer，大大增强保护性抗-疟疾免疫性。联合施用α-GalCer不仅仅提高保护作用的水平，而且还延长保护性抗疟疾免疫性时间。此外，这里公开了对小鼠共同施用α-GalCer和照射的寄生虫或肽(相应于疟疾CS蛋白质的CD4+或CD8+表位)，导致抗原-特异性T细胞数目的增加。

在另一个具体的实施方案中，本发明公开了提高哺乳动物相应HIV感染(和有效地预防和/或治疗AIDS)的免疫应答的方法，其中所述方法包括对所述哺乳动物联合施用HIV-特异性抗原和α-GalCer佐剂。如下面实施例2中公开的，对用HIV的p18(V3环)的CD8+T细胞表位(RGPGRAFVTI[SEQ ID NO：5])免疫的小鼠联合施用α-GalCer，与没有用α-GalCer处理免疫的小鼠中诱导的相比，HIV-特异性CD8+T细胞应答几乎提高3倍。

本发明的方法能和其他治疗方法结合使用。例如，能与化疗和/或放疗和/或IL-12治疗结合应用使用肿瘤-特异性抗原和含有糖基神经酰胺的本发明佐剂的抗癌治疗。能与IFN-α治疗结合应用包括含有α-糖基-神经酰胺的佐剂的抗-病毒疫苗。

除了它的治疗应用之外，本发明的糖基神经酰胺佐剂还可以用作研究基础免疫学诸多方面的研究工具。例如，能用它研究免疫机理，例如NKT细胞的功能，DC的抗原呈，和细胞因子和它们的受体对免疫应答的调节。还可以在疫苗设计研究中使用糖基神经酰胺佐剂，这有助于鉴定保护性免疫性的要求，因为对于相同的抗原，不同的佐剂可以产生强度和/或时间长短不同的免疫应答。

含有糖基神经酰胺的药物和疫苗组合物

结合本发明的方法，还提供了含有免疫原有效量的抗原和免疫原有效量的包括糖基神经酰胺的佐剂，和，任选的，另外一种免疫刺激物，载体或赋形剂的药物(优选全部是药学可接受的)的药物和疫苗组合物。所述抗原和佐剂可以配制成单一组合物或者为两种分开的组合物，它们可以同时或顺序施用。

本发明的佐剂包括属于通式1能代表的鞘糖脂类的化合物，特别是糖基神经酰胺：

本发明优选的佐剂包括α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)，具体地说，是式2代表的(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六酸基氨基)-1，3，4-十八烷三醇：

α-GalCer佐剂成分可以从Okinawan海绵中分离(例如，根据Natori等，Tetrahedron，50：2771-2784，1994所述)或者合成制备(参见，例如，美国专利Nos.5,936,076；5,780,441；5,849,716,和6,071,884；PCT公开Nos.WO 98/29534，和WO98/44928；Kobayashi等，1995，Oncol.Res.，7：529534)。类似地，本发明的其他糖基神经酰胺佐剂能从天然来源分离(例如，从海绵)或者合成制备(例如如美国专利Nos.5,936,076；5,780,441；5,849,716,和6,071,884；PCT公开Nos.WO 98/29534和WO 98/44928；Morita等，J.Med.Chem.，38：2176-2187，1995；Teriyuki等，J.Med.Chem.，42：1836-1841，1999所述)。

本发明的免疫原(例如疫苗)组合物中使用的抗原可以来自真核细胞(例如，肿瘤，寄生虫，真菌)，细菌细胞，病毒颗粒，或者其任何部分。在物质对其所针对的免疫应答有不好的抗原性的作用中，应用标准共价结合技术，例如使用几种商售试剂盒中的一种，可以常规地将它与载体分子例如白蛋白或半抗原偶联。

本发明优选的抗原的例子包括(i)疟疾特异性抗原，例如照射的疟原虫子孢子或者包括至少一个疟疾环子孢子(CS)蛋白质(参见下文)的T细胞和/或B细胞表位的合成的肽抗原；(ii)病毒蛋白或肽抗原，例如从下面的病毒产生的那些：流感病毒(例如，表面糖蛋白血凝素(HA)和唾液酸苷酶(NA)[例如禽流感HA或鸟流感A/Jalisco/95H5 HA)；免疫缺陷病毒(例如，猫科免疫缺陷病毒(FIV)抗原，猿免疫缺陷病毒(SIV)抗原，或人免疫缺陷病毒抗原(HIV)例如gp120，gp160，p18抗原[下文实施例2中所述])，Gagp 17/p24，Tat，Pol，Nef，和Env；疱疹病毒(例如，糖蛋白，例如，来自猫科疱疹病毒，马疱疹病毒，牛疱疹病毒，假狂犬病病毒，犬疱疹病毒，单纯性疱疹病毒(HSV，例如，HSV tk，gB，gD)，Marek′s病病毒，火鸡疱疹病毒(HVT)，或巨细胞病毒(CMV)，或埃-巴病毒)；肝炎病毒 (例如，乙肝表面抗原(HBsAg))；乳头状瘤病毒；牛白血病病毒(例如，gp51，30膜抗原)；猫科白血病病毒(FeLV)(例如，FeLV膜蛋白，Newcastle病病毒(NDV)抗原，例如，HNorF)；劳斯相关病毒(例如RAV-1 env)；传染性支气管炎病毒(例如，基质和/或preplomer)；黄病毒(例如，日本大脑炎病毒(JEV)抗原，黄色发热病毒，或登革热病毒抗原)；麻疹病毒(例如，犬科温热病毒抗原，麻疹抗原，或牛疫抗原例如HA或F)；狂犬病(例如，狂犬病糖蛋白G)；细小病毒(例如，犬科细小病毒抗原)；痘病毒(例如，先天性缺肢畸形抗原，金丝雀痘病毒抗原，或家禽痘病毒抗原)；或鸡痘病毒(水痘带状疱疹病毒抗原)；传染性粘液囊病病毒(例如，VP2，VP3，或VP4)；Hantaan病毒；流行性腮腺炎病毒；(iii)细菌抗原，例如从格兰氏阴性细菌细胞壁分离的脂多糖，和葡萄球菌-特异性的，链球菌-特异性的，肺炎球菌-特异性的(例如，PspA[参见PCT公开No.WO 92/14488])，淋病奈瑟氏菌-特异性的，疏螺旋体-特异性的(例如，Lyme疾病相关的疏螺旋体的OspA，OspB，OspC抗原，例如Borrelia burgdorferi，Borrelia afzelli，和Borreliagarinii[参见，例如，美国专利No.5,523,089；PCT公开Nos.WO90/04411，WO91/09870，WO93/04175，WO96/06165，WO93/08306；PCT/US92/08697；Bergstrom等，Mol.Microbiol.，3：479-486，1989；Johnson等，Infect.and Immun.60：1845-1853，1992；Johnson等，Vaccine 13：1086-1094，1995；The SixthInternational Conference on Lyme Borreliosis：Progress on theDevelopment of Lyme Disease Vaccine，Vaccine 13：133-135，1995])，和假单胞菌-特异性的蛋白质或肽；(iv)真菌抗原，例如从念珠菌属，毛癣菌属，或ptyrosporum分离的那些，和(v)肿瘤-特异性蛋白质，例如ErbB受体，Melan A[MART1]，gap100，酪氨酸酶，TRP-1/gp 75，和TRP-2(在黑色素瘤中)；MAGE-1和MAGE-3(在膀胱癌，头颈癌，和非小细胞癌中)；HPV EG和E7蛋白质(在脑癌中)；粘蛋白[MUC-1](在乳房癌，胰腺癌，结肠癌和前列腺癌中)；前列腺-特异性抗原[PSA](在前列腺癌中)；胚胎癌抗原[CEA](在结肠癌，乳房癌，和肠胃癌中)和这样的共有肿瘤-特异性抗原例如MAGE-2，MAGE-4，MAGE-6，MAGE-10，MAGE12，BAGE-1，CAGE-1，2，8，CAGE-3 to 7，LAGE-1，NY-ESO-1/LAGE-2，NA-88，GnTV，和TRP2-INT2。

上面列出的抗原只是为了举例，因为感兴趣的抗原可以来自任何动物或人病原体或肿瘤。关于感兴趣的病原体产生的抗原的编码DNA，注意参考，例如，美国专利Nos.4,722,848；5,174,993；5,338,683；5,494,807；5,503,834；5,505,941；5,514,375；5,529,780；U.K.专利No.GB 2 269 820 B；和PCT公开Nos.WO92/22641；WO93/03145；WO94/16716；WO96/3941；PCT/US94/06652。关于从肿瘤病毒得到的抗原，还可以参见Molecular Biology of TumorViruses，RNA Tumor Viruses，第二版，Weiss等编著，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1982。对于本发明组合物中有用的附加的抗原的名单还可以参见Stedman′s Medical Dictionary(24版，1982)。

在具体的实施方案中，本发明的组合物提供抗疟疾的保护性免疫性，特别是抗约氏疟原虫和主要人疟原虫物种P.Falciparum和P.vivax。这些组合物含有下面成分的一种或多种：(i)至少一种包括优选能对不同遗传背景的哺乳动物激发抗-疟疾T-细胞应答的T细胞表位的疟疾-特异性肽(例如，YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK[SEQ ID NO：1]或SYVPSAEQI[SEQ ID NO：2]约氏疟原虫CS蛋白质的T细胞表位[Renia等，J.Immunol.，22：157-160，1993；Rodrigues等，Int.Immunol.，3：579-585，1991]或(NVDPNANP)_n[SEQ ID NO：3]或EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT[SEQ ID NO：4]P.falciparum CS蛋白质的T细胞表位[Nardin等，Science 246：1603，1989；Moreno等，Int.Immunol.3：997，1991；Moreno等，J.Immunol.151：489，1993])；(ii)至少一种包括能刺激抗-疟疾(即，中和)抗体(例如，定向抗疟疾微生物子孢子期)的B细胞表位的疟疾-特异性肽(例如，(NANP)3[SEQ ID NO：15]位于P.falciparum CS蛋白质的重复区中的B细胞表位[Nardin等，J.Exp.Med.156：20，1982；Nardin等，Ann.Rev.Immunol.11：687，1993])。优选地，本发明的免疫组合物包括至少一种B细胞表位和至少一种T细胞表位。B细胞表位优选激发特异性识别并且结合疟疾环子孢子(CS)蛋白质的抗体的产生。或者或另外，本发明的组合物可以包括来自其他疟疾成分或者与其他疟疾成分反应的B细胞和/或T细胞表位，例如，P.vivax红细胞分泌蛋白-1或-2(PvESP-1或PvESP-2)(参见，例如，美国专利No.5,874,527)，P.falciparum子孢子表面蛋白，指定为凝血酶致敏蛋白相关附着(Anonymous)蛋白(TRAP)，也称作子孢子表面蛋白2(SSP2)，LSAI，hsp70，SALSA，STARP，Hep17，MSA，RAP-1，和RAP-2。在一个实施方案中，B细胞表位和T细胞表位成分掺入导多抗原肽(MAPs)中，形成包含高密度表位的合成的大分子多肽。MAP合成的方法是本领域公知的(参见，例如，Tam，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5409，1988；Tam，Meth.Enzymol.，168：7，1989)。

本发明还涉及从其他疟原虫物种产生的B细胞表位和T细胞表位，包括但不限于，三日疟原虫(P.Malariae)，蛋形疟原虫(P.Ovale)，赖氏(P.Reichenowi)，诺氏疟原虫(P.knowlesi)，巴斯食蟹猴疟原虫(P.cynomolgi)，巴西疟原虫(P.brasilianum)，约氏疟原虫，伯氏疟原虫(P.berghei)，或夏氏疟原虫(P.Chabaudi)。这些表位一般包括从疟原虫蛋白质衍生的包括8-18个氨基酸残基。

在另一个具体的实施方案中，本发明优选的抗原是HIV特异性的(例如p18蛋白质的T细胞表位RGPGRAFVTI[SEQ ID NO：5]，参见下面的实施例2)。根据本文公开的，含有这样的HIV-特异性抗原和包括式1的糖基神经酰胺优选α-GalCer的佐剂的药物组合物能增强易感哺乳动物宿主对HIV抗原的T细胞应答。

在另一个具体的实施方案中，本发明的抗原是流感A病毒-特异性的。根据这里公开的，共同施用α-GalCer和最适度以下剂量的(10⁵p.f.u.)表达流感A病毒的核蛋白(NP)的CD8+T细胞表位TYQRTRALV(SEQ ID NO：16)的重组新培斯病毒显著增强易感哺乳动物宿主的CD8+T细胞抗-流感应答。

为了提供在本发明的组合物中使用的另外的抗原-衍生的B和T细胞表位，通过本领域公知的几种方法中的一种或者组合可以鉴定这些表位，例如，通过(i)使用蛋白水解酶将感兴趣的抗原水解为重叠的肽，接着测定各种肽与全长抗原激发的抗体结合的能力或者诱导T细胞或B细胞激活的能力(参见，例如，Janis Kuby，Immunology，pp.79-80，W.H.Freeman，1992)；(ii)制备合成的肽，其序列是给定抗原的片段或类似物(参见，例如，Alexander等，1994，Immunity，1：751-61；Hammer等，1994，J.Exp.Med.，180：23538)，或者易这些片段为基础的构建体，或者与载体或异源抗原连接或融合的类似物，并且测定这样的合成的肽激发抗原-特异性抗体或T细胞激活的能力(例如，测定它们体外和体内与II类MHC分子相互作用的能力[参见，例如，O′Sullivan等，1991，J.Immunol.，147：2663-9；Hill等，1991，J.Immunol.，147：189-197])；为了测定T细胞表位，肽应该至少8-10个氨基酸长，占据I类MHC分子的凹槽，和至少13-25个氨基酸长，占据II类MHC分子的凹槽，优选地，肽应该更长；这些肽应该还包含合适的固定基序，能使得它们与产生免疫应答的足够高的亲和性和特异性结合各种I类或II类MHC分子(参见Bocchia等，Blood85：2680-2684，1995；Englehard，Ann.Rev.Immunol.12：181，1994)；(iii)对与纯MHC分子结合的肽测序(参见，例如，Nelson等，1997，PNAS，94：628-33)；(iv)对肽展示文库筛选与II类MHC分子结合的高亲和性，TCR，抗全长抗原的抗体，等(参见，例如，Hammer等，1992，J.Exp.Med.，176：1007-13)；(v)计算机分析不同的蛋白质序列，鉴定，例如，亲水性的一段(亲水性氨基酸残基经常位于蛋白质的表面，因此易接近抗体)和/或高亲和性TCR或II类MHC等位基因-特异性基元，例如，通过比较感兴趣的蛋白质的序列和公开的与MHC分子结合的肽的结构(Mallios，Bioinformatics，15：432-439，1999；Milik等，Nat.Biotechnol.，16：753-756，1998；Brusic等，Nuc.Acids Res，26：368-371，1998；Feller和de 1a Cruz，Nature，349：720-721，1991)；(vi)对天然抗原-抗体复合体进行X-射线结晶学分析(Janis Kuby，Immunology，p.80，W.H.Freeman，1992)，和(vii)对感兴趣的抗原的不同部分制备单克隆抗体，然后确定那些抗体体外或体内是否减弱从中得到抗原的病原体或肿瘤的生长(参见美国专利No.5,019,384和这里引述的文献)。

在具体的实施方案中，表达所述抗原的重组病毒可以呈递本发明的抗原。优选地，所述病毒选自重组腺病毒，重组痘病毒，和重组新培斯病毒。

在公开的组合物中，抗原和糖基神经酰胺都以免疫原有效量存在。对于各种特异抗原，应该试验测定最佳免疫原有效量(考虑到给定患者的具体特征和/或治疗类型)。一般情况下，这种量在每公斤体重0.1微克至100毫克抗原的范围内。对于本发明的糖基神经酰胺佐剂，最佳免疫原有效量优选在每公斤体重10-100微克佐剂的范围内。

本发明还提供了含有至少一种抗原和包括式1的糖基神经酰胺优选α-GalCer的佐剂的疫苗组合物的制备方法，优选地，所述方法包括混合佐剂和抗原，和任选地一种或几种生理可接受载体和/或赋形剂和/或辅助物质。

配方和给药

本发明提供了含有本发明的治疗物质的药物和疫苗配方(抗原和糖基神经酰胺佐剂或者是单一组合物或者作为两个分开的组合物，它们可以同时施用或顺序施用)，该配方适合给药以激发抗原-特异性保护性免疫应答，用于治疗和预防上述传染或肿瘤病。以任何常规方法使用一种或几种生理可接受载体或赋形剂能配制本发明的组合物。这样，可以将抗原和/或含有式1的糖基神经酰胺优选α-GalCer的佐剂配制，以通过经皮送递，或者经粘膜施用，包括但不限于，口服，口，鼻内，眼，阴道，直肠，脑内，皮内肌内，腹膜内，静脉内，皮下途径，通过划痕(通过皮肤上层划痕，例如，使用分叉针头)，通过吸入(肺)或者吹入法(通过口或鼻)，或者通过施给来自体内的细胞呈递抗原，接着将细胞施给受试者，或者通过任何免疫的标准途径。

优选地，本发明的免疫原配方能肠胃外送递，即，通过静脉内(i.v.)，皮下(s.c.)，腹膜内(i.p.)，肌内(i.m.)，皮下(s.d.)，或者皮内(i.d.)给药，通过直接注射，通过，例如，大丸剂注射，连续输注，或者基因枪(例如，对受试者施用载体疫苗，例如裸DNA或RNA)。用于注射的配方可以以单一剂量形式存在，例如，在安瓿或多剂量容器中，有加入的防腐剂。组合物可以采用赋形剂，混悬剂，溶液或在油性赋形剂或含水赋形剂的乳状液这样的形式，并且可以含有配制试剂，例如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是在使用之前用合适的赋形剂例如无菌无热源水重新兑制的粉末剂形式。

本发明还涉及各种粘膜接种策略。局部送递疫苗可以定向于粘膜，可以应用各种策略将免疫原组合物送递给粘膜。例如，在一个具体的实施方案中，可以在和与霍乱毒素例如霍乱毒素B或霍乱毒素A/B嵌合物的结合物或嵌合融合蛋白的混合物或者作为与霍乱毒素例如霍乱毒素B或霍乱毒素A/B嵌合物的结合物或嵌合融合蛋白施用免疫原性多肽或载体疫苗(参见，例如，Hajishengallis，J Immunol.，154：4322-32，1995；Jobling和Holmes，Infect Immun.，60：4915-24，1992；Lebens和Holmgren，Dev Biol Stand 82：215-27，1994)。在另一个实施方案中，对于粘膜接种可以制备与热不稳定肠毒素(LT)的混合物。其他粘膜接种策略包括将免疫原制成微胶囊(参见，例如，美国专利Nos.5,075,109；5,820,883,和5,853,763)并且使用免疫有效膜载体(参见，例如，PCT申请No.WO 98/0558)。通过使用红细胞(rbc)或rbc空细胞(参见，例如，美国专利No.5,643,577)，或者通过使用蓝舌病毒抗原(参见，例如，美国专利No.5,690,938)能增强口服施用的免疫原的免疫原性。全身施用定向的免疫原也能产生粘膜免疫(参见，美国专利No.5,518,725)。也可以应用各种策略送递基因用于在粘膜组织中表达，例如使用嵌合鼻病毒(参见，例如，美国专利No.5,714,374)，腺病毒，牛痘病毒，或者特异定向核酸(参见，例如，PCT申请No.WO 97/05267)。

对于口服给药，本发明的制剂可以是例如通过常规方法使用药学可接受赋形剂制备的片剂或胶囊，所述赋形剂是例如粘合剂(例如，预先明胶化的玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如，乳糖，微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁，滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)；或湿润剂(例如，月桂基硫酸钠)。通过本领域公知的技术可以将片剂包衣。本发明的组合物还可以装入微球中或为胶囊中，例如，用聚乙醇酸/乳酸制备(PGLA)(参见，美国专利Nos.5,814,344；5,100,669和4,849,222；PCT公开Nos.WO95/11010和WO93/07861)。用于口服的液体制剂可以是例如溶液，糖浆，乳状液或混悬液形式，或者它们可以制备成在使用之前用水或其他合适的赋形剂重新兑制的干燥产品。通过常规方法使用药学可接受添加剂能制备这样的液体制剂，所述添加剂是例如悬浮剂(例如，山梨糖醇浆，纤维素衍生物或氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；没有水的赋形剂(例如，杏仁油，油酯，乙醇或分级分离的植物油)；和防腐剂(例如羟基苯甲酸或山梨酸甲酯或丙酯)。如果合适，制剂还可以含有缓冲盐，矫味剂，着色剂和甜味剂。可以将用于口服的制剂合适地配制成控制释放的活性化合物制剂。

对于吸入给药，根据本发明的治疗物质能方便地以气溶胶喷雾形式从加压包装或喷雾器送递，使用合适的抛射剂，例如，二氯二氟甲烷，三氯氟代甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或者其他合适的气体。在加压气雾剂情况下，通过提供一个阀门送出计量的量来确定单位剂量。可以配制含有化合物和合适的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物的在吸入器或吹入器中使用的例如明胶的胶囊或药筒。

本发明的组合物还可以配制成直肠组合物，例如栓剂或滞留灌肠剂，例如，含有常规栓剂基质，例如椰子油或其他甘油酯。

除了前面描述的制剂之外，组合物还可以配制成贮存制剂。这样的长时作用的制剂可以通过植入法给药(例如，皮下或肌内)或者通过肌内注射。这样，例如，用合适的聚合物或疏水性材料(例如，作为可接受油中的乳状液)或离子交换树脂，或者作为少量可溶衍生物，例如，作为少量可溶性盐，能配制所述化合物。

如这里公开的，抗原和/或糖基神经酰胺佐剂可以与药学可接受的并且与活性成分相匹配的赋形剂混合。合适的赋形剂是，例如，水，盐水，缓冲盐，葡萄糖，甘油，乙醇，无菌等张含水缓冲液或类似的，和它们的混合物。另外，如果期望，制剂还可以包括少量的辅助物质，例如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂，和/或免疫刺激物(例如，除了糖基神经酰胺的佐剂)，其增强药物组合物或疫苗的效力。可以增强本发明的组合物的效力的另外的免疫刺激物的非限制性例子包括免疫刺激，免疫加强，或炎性细胞因子原淋巴因子，或趋化因子或编码它们的核酸(具体的例子包括白细胞介素(IL)-1，IL-2，IL-3，IL-4，L-12，IL-13，巨细胞-巨噬细胞(GM)-集落刺激因子(CSF)和其他集落刺激因子，巨噬细胞炎性因子，Flt3配体，参见“定义”章节中免疫刺激细胞因子的一般例子。这些传统的免疫刺激分子能作为蛋白质全身或局部送递或者通过编码分子的表达的载体的表达。上面描述的用于送递抗原和糖基神经酰胺的技术也可以用于送递传统的免疫刺激分子。

本发明还提供了包括一个或多个容器的包装或试剂盒，容器中装有一种或几种本发明的免疫原配方的成分。在相关的实施方案中，本发明提供用于制备包括至少一种抗原和含有糖基神经酰胺的佐剂的药物或疫苗组合物的试剂盒(kit)，所述试剂盒第一个容器中装有抗原，第二个容器中装有佐剂，和任选地，混合抗原和佐剂的说明和/或施用组合物的说明。试剂盒的每一个容器还可以任选地包括一种或几种生理可接受载体和/或赋形剂和/或辅助物质。和这样的容器一起可以有政府机关调节操作的规定形式的说明，药物或生物制品的使用或出售说明，这些说明反映机构批准对人制造，使用或出售。

如果期望，组合物可以存在于包装或配药装置中，包装或配药装置可以包含装有活性成分的一个或多个单位剂量形式(即，抗原和/或含有糖基神经酰胺的佐剂)。包装可以，例如，包括金属或塑料箔，例如发泡包装。包装或配药装置可以带有给药说明。在相匹配药物载体中配制的本发明的组合物也可以在合适的容器中制备，放置，并且标明治疗指定的症状。

有效剂量和安全性评

根据本发明的方法，以免疫原有效量，优选地，最小毒性，对患者施用这里描述的药物和疫苗组合物。如在标题是“定义”的章节中陈述的，公开的配方的″免疫原有效剂量″或″治疗有效剂量″指足以使受治疗的受试者产生有效免疫应答因此足以对所述受试者带来健康利益的抗原和/或糖基神经酰胺的量。

根据本领域已经确定的方法(参见，例如，the Center forBiological Evaluation和Food and Drug Administration和theNational Institute of Allergy and Infectious Diseases之间的合作努力对含有新的佐剂的几种疫苗配方的评价报告[Goldenthal等，National Cooperative Vaccine Development Working Group.AIDS Res.Hum.Retroviruses，1993，9：545-9])，利用小动物模型(例如小鼠)临床前研究第一次测定了本发明的化合物和组合物的有效剂量和毒性，其中发现抗原和含有糖基神经酰胺的佐剂是免疫原性的并且通过对人临床试验提出的相同的途径能重复免疫。具体地说，对于本发明的方法中使用的任何药物组合物或疫苗，最初从动物模型能估计实现循环血浆浓度范围的治疗有效剂量，包括IC₅₀(即，实现症状的半最大抑制作用的试验化合物的浓度)。然后使用动物系统产生的剂量-应答曲线测定对人的最初临床试验的试验剂量。在对各种组合物的安全性测定中，免疫的剂量和次数应该符合或超过临床试验中使用所预期的那些。

如这里公开的，确定本发明的组合物中糖基神经酰胺，抗原和其他成分的剂量，以保证连续或间断施用的剂量不超过考虑实验动物的结果和患者各自状况的一定量。根据配药规程，患者或受试动物状况，例如年龄，体重，性别，敏感性，进食，用药时间，联合使用的药物，疾病的严重程度，具体剂量自然不同。根据上述指征通过试验能确定一定条件下的合适的剂量和给药时间，并且应该根据医师和各个患者环境根据标准临床技术的判断来决定。与此相关，抗原的剂量一般在每千克体重0.1微克至100毫克范围内，增强对抗原的免疫应答需要的糖基神经酰胺佐剂的剂量一般在每千克体重10-100微克范围内。

通过对实验动物的标准药学程序能确定本发明的含有糖基神经酰胺的免疫原组合物的毒性和治疗功效，例如通过测定LD₅₀(50％致死剂量)和ED₅₀(50％治疗有效的剂量)。毒性和治疗作用之间的剂量之比是治疗指数，并且可以表示为LD₅₀/ED₅₀。优选具有大的治疗指数的组合物。虽然能使用具有毒副作用的治疗物质(例如，当治疗严重的癌症或威胁生命的传染)，但是为了将对其他组织和器官的可能的损伤最小化，应该小心设计送递系统，将这样的免疫原组合物定向送给特定位点(例如，介导免疫应答的淋巴样组织，支持传染物质复制的肿瘤或器官)，从而减小副作用。如这里公开的(也可以参见背景部分和实施例)，本发明的糖基神经酰胺不只是在相对低剂量(例如，每千克体重10-100微克佐剂)下有高免疫刺激性，而且还具有低毒性并且产生显著的副作用。

如上面具体说明的，在配制对人使用的剂量范围中能使用从动物研究获得的数据。对人使用的本发明的含有糖基神经酰胺的治疗有效剂量优选在包括极小或没有毒性的ED₅₀的循环浓度的范围内。根据使用的剂量形式和使用的给药途径，剂量可以在这个范围内变化。理想地，应该使用单一剂量。

实施例

下面的实施例详细描述本发明而不限制其范围。

实施例1：天然杀伤T细胞α-半乳糖基神经酰胺增强疟疾疫苗诱导的保护性免疫性并且延长其时间

方法

寄生物和它们用于免疫和攻击的用途

根据描述(Rodrigues等，Int.Immunol.，3：579-585，1991；Gonzalez-Aseguinolaza等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：8461-8466，2000)，通过解剖蚊子唾液腺而获得约氏疟原虫(17X NL株)子孢子。对于免疫，通过将它们暴露于12,000rad而将子孢子照射-减弱，然后静脉内注射给小鼠的尾静脉或者皮下注射给小鼠的尾根。使用1×10⁴和1×10⁵γ-spz免疫小鼠分别用于保护试验和ELISPOT试验。通过显微镜观察吉姆萨氏染色的薄血液涂片确定寄生物血症，薄血液涂片在子孢子接种之后第3天至第14天每天获得。完全保护定义为在整个时期内没有寄生物血症。

用重组病毒免疫

使用最适度以下剂量(1×10⁷p.f.u.)的表达全约氏疟原虫CS蛋白质，AdPyCS的重组腺病毒(Rodrigues等，J.Immunol.，158：1268-1274，1997)免疫小鼠。根据描述(Tsuji等，J.Virol.，72：6907-6910，1998；Villacres等，Virology，270：54-64，2000)构建表达约氏疟原虫CS蛋白质，SIN(Mal)，的CD8+T细胞表位(SYVPSAEQI[SEQ ID NO：2])的重组新培斯病毒，和表达HIV p18蛋白质，SIN(p18)，的CD8+T细胞表位(RGPGRAFVTI[SEQ ID NO：5])的重组新培斯病毒，并且皮下接种作为最适度以下剂量的1×10⁵p.f.u.的病毒。

小鼠.

从Jackson Laboratory(BarHarbor，ME)购得BALB/c和B10.D2小鼠，并且保持在Animal Facility标准条件下。通过应用同源重组和聚集嵌合体技术特异性缺失Jα281基因片段构建Vα14NKT-缺陷小鼠(Jα281^-1-)(Cui等，Science，278：1623-1626，1997；Gonzalez-Aseguinolaza等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：8461-8466，2000)，并且在与BALB/c小鼠3-4次回交之后使用。从129源的胚胎肝细胞产生CD1d-缺陷小鼠(CD1d^-1-)，并且在与BALB/c小鼠7-8次回交之后使用(Mendiratta等，Immunity，6：469477，1997；Gonzalez-Aseguinolaza等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：8461-8466，2000)。从Swiss Institute for ExperimentalCancer Research(Epalinges，瑞士)获得IFN-γ受体-缺陷小鼠(IFN-γR^-1-)，在与B10.D2小鼠3次回交之后使用(Rodrigues等，Parasite Immunol.，22：157-160，2000)。在6-8周使用两种性别的小鼠。

α-GalCer.

应用公开的方法(Morita等，J.Med.Chem.，38：2176-2187，1995；Teriyuki等，J.Med.Chem.，42：1836-1841，1999)由Kirin Brewery(Gunma，日本)合成α-GalCer，[(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六酰氨基)-1，3，4，-十八烷三醇]。起始产物溶解于0.5％聚山梨酯-20(Nikko Chemical，东京)的0.9％NaCl溶液并且在使用之前用PBS稀释。

肽免疫和α-GalCer处理

用相应于约氏疟原虫CS蛋白质的CD4+T细胞表位(YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK[SEQ ID NO：1])的肽(Renia等，J.Immunol.，22：157-160，1993)或者CD8+T细胞表位(SYVPSAEQI[SEQID NO：2])的肽(Rodrigues等，Int.Immunol.，3：579-585，1991)免疫小鼠。代表CS蛋白质的CD8+表位的肽在弗氏不完全佐剂(IFA)中乳化，而包含CS-特异性CD4+表位的肽在弗氏完全佐剂(CFA)中乳化。用10mg肽对小鼠皮下接种。用α-GalCer对-些免疫的小鼠腹膜内注射，其他小鼠单独注射赋形剂作为对照。施用的剂量和时间在下文中指出。

通过ELISPOT试验定量测定表位-特异性CD4+和CD8+T细胞

进行ELISPOT试验测定产生IFN-γ或IL-4的CS-特异性CD4+和CD8+T细胞的数目(Miyahira等，J.Immunol.Methods，181：45-54，1995)。简要地说，用抗小鼠IFN-γ单克隆抗体(mAb)，或抗小鼠IL-4mAb包被96孔硝基纤维素板(Millipore，Bedford，MA)。室温下温育过夜之后，反复冲洗孔并且在37℃下用培养基封闭1小时。MHC-相容靶细胞，表达I和II类MHC H-2^d分子的A20.2J B细胞淋巴瘤在37℃下与代表约氏疟原虫CS蛋白质的CD4+T细胞表位(YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK[SEQ ID NO：1])或CD8+T细胞表位(SYVPSAEQI[SEQ ID NO：2])，或者HIV p18蛋白质的CD8+T细胞表位(RGPGRAFVTI[SEQ ID NO：5])的合成肽温育1小时。照射肽攻击的靶细胞之后，将细胞加给ELISPOT孔。没有处理的靶细胞用作副对照物。使从免疫小鼠的脾或淋巴结分离的系列稀释的淋巴细胞在ELISPOT孔中与1.5×10⁵个靶细胞共同培养。将板在37℃和5％CO₂温育24小时之后用于IFN-γ检测或者温育48小时之后用于IL-4检测，如先前所述处理板(Rodrigues等，J.Immunol.，158：1268-1274，1997)，并且测定相应于IFN-γ和IL-4分泌细胞的点的数目。

通过实时PCR定量测定接种子孢子小鼠的肝中约氏疟原虫rRNA

根据描述(Bruna-Romero等，Int.J.Parasitol.31：1499-1502，2001)进行约氏疟原虫rRNA的定量测定。简要地说，通过Chomczynski和Sacchi的方法(Chomczynski和Sacchi，Anal.Biochem.，162：156-159，1987)，从注射1×10⁴约氏疟原虫子孢子42小时之后解剖的小鼠肝中分离全部RNA。提取的RNA的逆转录之后，产生cDNA并且通过即时PCR，使用ABI Prism 5700 Sequence Detection system(PE Biosystems，Foster City，CA；Bruna-Romero等，Int.J.Parasitol.，31：1499-1502，2001)分析它的量。利用约氏疟原虫(17XNL)18S rRNA序列(Bruna-Romero等Int.J.Parasitol.，31：1499-1502，2001)，应用ABI Prism primer Express软件(PEBiosystems，Foster City，CA)，常规设计具有下面序列的引物和荧光探针。从Operon Technologies Inc.(Alameda，CA)获得引物，5′-GGGGATTGGT TTTGACGTTTTTGCG-3′(正引物；SEQ ID NO：17)，和5′-AAGCATTAAATAAAG CGAATACATCCTTAT-3′(逆引物；SEQ ID NO：18)。从PE Applied biosystems(Foster City，CA)获得特异荧光探针，PyNYU，5′-FAM-CAATTGGTTTACCTTTTGCTCTTT-TAMRA-3′(SEQID NO：19)，并且使用5-丙炔-2′-去氧尿苷(turbo Taqman探针)产生，实现合适的Tm。反应混合物含有5微升的10x Taqman缓冲液A(PEBiosystems，Foster City，CA)，3.5mMMgCl₂，200μM dNTP，0.3μM正引物，0.3μM逆引物，50nM turbo Taqman探针PyNYU，1.25UAmpliTaq Gold DNA聚合酶，和最多50微升最终反应体积的水。温度曲线包括95℃10分钟和95℃变性15秒和60℃淬火/延伸1分钟35个循环。在用0.5mg/ml溴化乙锭染色的2％琼脂糖-1×TAE(50mMTris-乙酸盐，pH8.0，1mM EDTA)凝胶中观察PCR产物。使用Gel Doc2000凝胶文件编辑系统(BioRad，Hercules，CA)获得凝胶的数字成象，并且使用Quantity One software(BioRad，Hercules，CA)通过显微测密术分析。利用从两个肝样品和从用已知量的质粒18ScDNA产生的标准曲线获得的CT值进行线性回归分析测定在该项分析中检测的寄生物产生的18ScDNA分子的精确量。

通过ELISPOT分析定量测定α-GalCer-特异性细胞

利用ELISPOT分析测定产生α-GalCer-特异性淋巴细胞的IFN-γ和/或IL-4的相对数目。根据描述(Rodrigues等，J.Immunol.，158：1268-1274，1997)从野生型和IFN-γR-缺陷小鼠的肝分离淋巴细胞。以10⁷细胞/毫升的细胞密度与100ng/ml的α-GalCer或赋形剂温育12小时之后，将从每孔1×10⁶个细胞开始系列稀释的淋巴细胞放置于用相应的抗-细胞因子抗体包被的ELISPOT孔中。在37℃和5％CO₂下将板温育24小时之后，根据描述(Rodrigues等，J.Immunol.，158：1268-1274，1997)进行平板培养。

使用CDI d/α-GalCer四聚体进行流式细胞仪分析

根据描述(Matsuda等，J.Exp.Med.，192：741-754，2000)，使用由CDI d分子和α-GalCer组成的CDI d/α-GalCer四聚体复合体鉴定α-GalCer-特异性淋巴细胞。新鲜分离的肝淋巴细胞首先与藻红蛋白(PE)-标记的四聚体复合体温育，接着与FITC-标记的抗-CD3单克隆抗体第二次温育。然后通过FACScalibur仪器(BectonDickinson，San Jose，CA)使用CELLQUEST软件(Becton Dickinson)分析细胞。

间接免疫荧光分析(IFA).

仅在用子孢子攻击之前获得免疫小鼠的血清，在间接免疫荧光分析(IFA)中使用约氏疟原虫子孢子测定它们的Ab滴度。简要地说，约氏疟原虫子孢子放在多点样载玻片上，空气风干。与血清温育1小时之后，在含有1％BSA的PBS中稀释，用PBS冲洗载玻片，并且与FITC-标记的亲和性纯化的山羊抗-小鼠Ab(Kirkegaard & PerryLaboratories，Gaithersburg，MD)温育1小时。然后冲洗载玻片并且固定在含有50％(v/v)甘油和1％(w/v)伊凡斯蓝的PBS中减少漂白。认为产生子孢子荧光的最高血清稀释度被认为是IFA滴度。

通过ELISA测定同种型水平

在用子孢子对它们攻击之前获得免疫小鼠的血清，并且使用Mouse Hybridoma Subtyping试剂盒(Boehringer Mannheim，Mannheim，德国)测定CS-特异性IgM，IgG1，IgG2a，和IgE同种型的水平。简要地说，用10mg/ml的约氏疟原虫CS蛋白质的B细胞表位(QGPGAP)₂(Charoenvit等，J.Immunol.，146：1020-1025，1991)包被平板，用含有1％BSA的PBS封闭，并且与来自免疫的和没有免疫的小鼠的血清的1∶5稀释物温育1小时。然后冲洗板并且加入与过氧化物酶偶联的抗-小鼠IgM，IgGla，IgG2a(Boehringer Mannheim)和IgE(Southern Biotechnology Associates，Inc.，Birmingham，AL)，接着根据供应商的说明与底物2，2-吖嗪-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐(6)]温育。

统计学分析

对所有的比较使用学生试验。只有P值低于0.01才认为有统计学意义。数据以平均±SD给出。

结论

α-GalCer增强保护性抗-疟疾免疫性

为了评价α-GalCer增强通过最适度以下剂量照射的子孢子免疫诱导的保护性抗-疟疾免疫应答的能力，用最适度以下剂量(1×10⁴)照射的子孢子(γ-spz)和不同剂量的γ-GalCer(0.5，1.2微克)对BALB/c小鼠静脉内免疫接种。两个星期之后，用1×10⁴1活约氏疟原虫子孢子攻击不同组的小鼠，通过应用高灵敏性即时PCR分析(Bruna Romero等，Int.J.Parasitol.31：1499 1502，2001)通过测定肝中寄生物-特异性rRNA的量来测定保护性抗-疟疾免疫性的水平。施用α-GalCer以剂量依赖方式显著增强γ-spz免疫激发的保护性免疫性的水平(肝发育阶段抑制作用百分比％)(图1A)。事实上，与单独用γ-spz免疫的小鼠的肝中的相比，施用2微克α-GalCer的γ-spz免疫的小鼠的肝中负载的寄生物少10倍。

本发明人还使用风干的约氏疟原虫子孢子的免疫荧光分析(IFA)测定了抗-子孢子抗体的滴度，以及抗环子孢子(CS)蛋白质的滴度，使用ELISA测定了子孢子的主要表面抗原。不管是否接受了α-GalCer，γ-spz免疫的小鼠组之间抗体滴度相同(图1A)。当测定抗-CS抗体的免疫球蛋白同种型时，在α-GalCer处理的和没有处理的小鼠之间没有检测到抗-CS抗体IgE，IgG₁，IgG_2a或IgM同种型分布的显著差异。这些结果标明抗-疟疾体液应答不受α-GalCer处理的影响。

然后通过在用1×10⁴γ-spz静脉内接种的同一天，之前两天或者之后两天对BALB/c小鼠施用2微克的糖脂来检测α-GalCer展示的佐剂活性的动力学。当和γ-spz同一天施用α-GalCer时，激发最大水平的保护性抗-疟疾免疫性(图1B)。γ-spz免疫之后两天施用α-GalCer不显著增强单独子孢子诱导的保护性免疫性的水平。令人感兴趣的是，当在γ-spz免疫之前两天施用α-GalCer时，保护性免疫性完全被取消。早两天施用α-GalCer可能在它们被抗原呈递细胞加工和呈递之前消除了子孢子是可能的，从而防止诱导疟疾-特异性免疫应答。如本发明人先前研究所证明的(Gonzalez-Aseguinolaza等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：8461-8466，2000)，在用活子孢子攻击之前两天施用α-GalCer以取决于NKT细胞和IFN-γ的方式从活体中完全消除了寄生物。对B10.D2小鼠发现了α-GalCer佐剂活性的类似动力学(图1B)。

共同施用α-GalCer和疟疾抗原增强疟疾-特异性T细胞应答，特别是CD8+T细胞的那些

为了测定α-GalCer-介导的抗疟疾的保护性免疫应答的增强是否是与γ-spz免疫相关的特定现象，或者是不依赖施用的免疫原的更一般的现象，在用最适度以下剂量的表达全CS蛋白质，AdPyCS(Rodrigues等，J.Immunol.，158：1268-1274，1997)的重组腺病毒，或者表达CS蛋白质，SIN(Mal)(Tsuji等，J.Virol.72：6907-6910，1998)的CD8+T细胞表位的重组新培斯病毒皮下接种的同一天对BALB/c小鼠施用α-GalCer。如图1C和1D所示，α-GalCer显著增强用最适度以下剂量的两种不同的重组病毒接种诱导的保护性免疫应答。在AdPyCS情况下，在SIN(Mal)情况下，保护作用的增强是对照物的几乎10倍，与α-GalCer共同施用之后保护作用增强3倍。

为了进一步评价α-GalCer与疫苗共同施用的佐剂活性，通过血液薄涂片的显微镜检查每天监测寄生物血症(即，血液中存在寄生物)。简要地说，用1×10⁴γ-spz静脉内或者用1×10⁷p.f.u.的AdPyCS皮下对BALB/c小鼠免疫，该剂量另外不能带来抗疟疾的保护作用，有或没有α-GalCer处理。两个星期之后，用50活约氏疟原虫子孢子攻击所有的小鼠，并且通过检测寄生物血症测定血液感染发生率。30只α-GalCer处理的，γ-spz免疫的小鼠中有28只受到保护，而大多数没有用α-GalCer处理的，γ-spz免疫的小鼠发生疟疾感染(表I)。类似地，α-GalCer与AdPyCS一起施用强烈增强最适度以下剂量病毒诱导的保护作用效果。另一方面，单独施用α-GalCer没有保护受到攻击的小鼠。总之，这些结果确认肝阶段数据(图1)，并且一起表明施用α-GalCer提高最适度以下免疫剂量的γ-spz和重组病毒的效力，表明出色的佐剂效果。

表I.α-GalCer增强疟疾免疫原诱导的保护性免疫性

免疫原	受保护小鼠的数目/受攻击数目	％保护作用(没有寄生物血症)
免疫原	受保护小鼠的数目/受攻击数目	％保护作用(没有寄生物血症)	γ-spz^*	6/30	20
γ-spz+α-GalCer	28/30	93	γ-spz^*	6/30	20
γ-spz+α-GalCer	28/30	93	AdPyCS^*	2/30	7
AdPyCS+α-GalCer	24/30	80	AdPyCS^*	2/30	7
AdPyCS+α-GalCer	24/30	80	α-GalCer	0/30	0
没有	0/30	0	α-GalCer	0/30	0

*用1×10⁴γ-spz静脉内或者用1×10⁷p.f.u.的AdPyCS皮下对BALB/c小鼠免疫。

α-GalCer增强各种疫苗激发的T细胞应答

为了测定共同注射α-GalCer和γ-spz增强疟疾-特异性T细胞应答的哪种成分(即，CD4+和/或CD8+T细胞应答)，对用或没有用α-GalCer处理的γ-spz免疫小鼠比较这些免疫参数。对于这个目的，或者与赋形剂(0.5％聚山梨酯-20，Nikko Chemical，东京)或α-GalCer一起用1×10⁵γ-spz免疫BALB/c小鼠。2或6周之后，分离脾淋巴细胞，并且通过ELISPOT分析测定CS-特异性，IFN-γ和IL-4-分泌CD8+和CD4+T细胞的数目(Rodrigues等，J.Immunol.，158：1268-1274，1997)。如图2A所示，免疫之后两周，α-GalCer处理显著增强γ-spz激发的CS-特异T细胞应答的水平。特别地，与γ-spz单独免疫诱导的相比，α-GalCer将IFN-γ-分泌CS-特异CD8+T细胞的数目提高了大约7倍(图2A)。此外，IFN-γ-分泌CS-特异CD4+T细胞的数目也显著增加，虽然程度较小(图2A)。更重要的，施用α-GalCer不仅提高CS-特异CD8+T细胞应答水平而且还延长应答时间(图2A；见下文)。当在γ-spz免疫之前两天或者之后两天施用α-GalCer时没有观察到这样的α-GalCer处理对T细胞应答强的增强。分泌IL-4的CS-特异CD4+或CD8+T细胞的数目没有发现显著差异，表明α-GalCer处理主要增强本发明实验体系周抗原-特异性Th1-型应答。因为对BALB/c和B10.D2小鼠发现相似结果，可以得出结论，即这些小鼠的不同遗传背景不影响α-GalCer的佐剂作用。

因为发现施用α-GalCer大大增强子孢子免疫小鼠的CS-特异性T细胞应答，本发明人决定测定肽免疫时以及重组病毒免疫时α-GalCer是否也能增强CS-特异性T细胞应答。用(i)10mg相应于CS蛋白质的CD8+T细胞表位或CD4+T细胞表位的合成肽或者(ii)最适度以下剂量的AdPyCS皮下免疫的同时对BALB/c小鼠施用α-GalCer。十天之后，从这些组的小鼠获得淋巴结细胞(对于肽免疫)和脾细胞(对于病毒免疫)，并且通过ELISPOT分析测定分泌IFN-γ或IL-4的CS-特异性T细胞的数目。α-GalCer处理的肽免疫的小鼠体内激发的分泌IFN-γ的CS-特异性CD4+和CD8+T细胞的数目显著高于没有α-GalCer处理的肽免疫的小鼠体内这样的T细胞的数目。肽免疫之前两天和之后两天施用α-GalCer也能显著增强CS-特异性T细胞应答，尽管程度比同时施用α-GalCer和肽增强的应答的程度小。α-GalCer处理的AdPyCS-免疫的小鼠体内激发的分泌IFN-γ的CS-特异性CD4+和CD8+T细胞的数目比只用病毒免疫的小鼠组的T细胞的数目高10-倍(图2B)。当使用SIN(Mal)时，发现α-GalCer处理也提高分泌IFN-γ的CS-特异性CD8+T细胞的数目(图2C)。

本发明人还检查了α-GalCer佐剂活性是否是与CS的H-2Kd-限制CD8+T细胞表位特异相关的现象，或者是否能应用于非疟疾表位。为了这个目的，用表达p18蛋白质HIV的(V3环)(Villacres等，Virology，270：54-64，2000)的H-2Dd-限制CD8+T细胞表位(RGPGRAFVTI[SEQ ID NO：5])的重组新培斯病毒免疫BALB/c小鼠。共同施用α-GalCer将SIN(p18)免疫诱导的p18-特异IFN-γ-分泌CD8+T细胞的数目提高4-倍(图2C)。这些结果表明(i)α-GalCer处理增强小鼠对HIV抗原的CD8+T细胞应答，和(2)α-GalCer处理增强表达外源表位的重组新培斯病毒，即，抗原呈递的另一种形式，诱导的CD8+T细胞应答。更一般地，这里给出的数据证明，α-GalCer处理对细胞免疫应答的增强不依赖抗原送递体系(减弱病原体，肽或重组病毒)和表位。

α-GalCer延长子孢子接种激发的疟疾-特异性T细胞应答和抗疟疾保护作用的时间

接着，在α-GalCer处理的，子孢子免疫的小鼠，和子孢子免疫的并且没有α-GalCer处理的小鼠之间比较CS-特异性CD8+T细胞应答的时间。用1×10⁵γ-spz免疫BALB/c小鼠，有或没有α-GalCer处理，2或4周之后，从这些小鼠获得脾细胞，并且通过ELISPOT分析，测定分泌IFN-γ的CS-特异性CD8+T细胞数目。施用α-GalCer不仅提高CS-特异性CD8+T细胞应答的水平，而且还延长该应答的时间(图3A)。

为了测定α-GalCer的佐剂作用对抗疟疾的保护时间的影响，通过在两个分开的实验中显微镜检查血液薄涂片每天监测寄生物血症(即，血液中存在寄生物)。在实验1中，两组小鼠，一组用α-GalCer处理而另一组不用，用1×10⁴γ-spz免疫，该剂量在免疫之后2周不能带来抗疟疾保护作用。两周之后，用50活约氏疟原虫子孢子攻击所有的小鼠，并且通过监测寄生物血症测定血液感染的发生率。在实验2中，两组小鼠，一组用α-GalCer处理而另一组不用，用1×10⁵γ-spz免疫，该剂量在免疫之后2周诱导完全保护作用，但是在之后4周则不能。四周之后，用50活约氏疟原虫子孢子攻击这些免疫的小鼠和天然对照物，并且如上所述测定感染过程。发现在两个实验中十只α-GalCer处理的子孢子免疫的小鼠中有九只受到保护，而大多数没有接受α-GalCer处理的子孢子免疫的小鼠发生疟疾感染(图3B)。这些结果证实通过RT-PCR测定肝中寄生物入侵的研究中获得的数据，并且进一步证明施用α-GalCer延长保护性免疫应答的时间并且提高最适度以下免疫剂量的照射的子孢子的效力，表明佐剂效果。

α-GalCer的佐剂活性需要CD1d分子，Vα14 NKT细胞和IFN-γ

因为已经证明CD1d分子存在下α-GalCer激活NKT细胞(参见背景部分的参考文献，例如，Kawano等，Science，278：1626-1629，1997)，使用缺失CD1d分子的小鼠和表达典型NKT细胞受体的T细胞缺陷小鼠研究α-GalCer佐剂活性的细胞机理。简要地，这些敲除的小鼠以及野生型对照物，都用最适度以下剂量的γ-spz(1×10⁴)免疫，有或没有α-GalCer处理。两个星期之后，用活子孢子攻击这些免疫的小鼠和没有免疫的小鼠对照物，并且测定保护性抗-疟疾免疫性的水平。如图4A所示，施用α-GalCer，提高野生型小鼠γ-spz诱导的保护性免疫性的水平，不能增强CD1d-缺陷小鼠，和没有Vα14 NKT细胞的Jα281-缺陷小鼠的保护性免疫性。这些结果表明α-GalCer的佐剂活性依赖CD1d分子和Vα14 NKT细胞。

为了进一步证明CD1d分子和Vα14 NKT细胞对α-GalCer的佐剂活性生物重要性，对γ-spz免疫的，α-GalCer处理的或没有处理的小鼠，缺失CD1d分子或Vα14 NKT细胞，测定CS-特异性CD8+T细胞的数目。如图4B所示，与没有处理的小鼠相比，α-GalCer处理不能增加CD1d-缺陷小鼠γ-spz免疫诱导的CS-特异性CD8+T细胞的数目，表明α-GalCer需要CD1d增强CS-特异性CD8+T细胞应答。令人感兴趣的是，在γ-spz免疫的并且α-GalCer处理的，Jα281-缺陷小鼠中，与没有处理的小鼠相比，CS-特异性CD8+T细胞的数目显著增加(图4B)。但是，这种增加没有达到α-GalCer处理的γ-spz免疫的野生型小鼠的水平(图4B)并且不增强保护性抗-疟疾免疫性的水平(图4A)。因此，这些发现证明Vα14 NKT细胞在介导α-GalCer的佐剂作用中的重要性。

最后，为了洞察α-GalCer佐剂活性的分子机理，用γ-spz免疫没有IFN-γ受体(IFN-γR^-1-)的小鼠，有或没有α-GalCer共同处理，十天之后，通过ELISPOT测定分析CS-特异性IFN-γ-分泌CD8+和CD4+T细胞的数目。共同施用α-GalCer不能增加γ-spz免疫的敲除小鼠的CS-特异性IFN-γ-分泌CD8+和CD4+T细胞的数目(图5A)。有人报道过不同分子缺陷的小鼠，例如缺失GM-CSF受体β-链(Sato等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：7439-7444，1999)和Fas(Mieza等，J.Immunol.，156：4035-4040，1996)也部分缺失NKT细胞。为了排除IFN-γ受体不存在导致NKT细胞数目减少和/或功能缺陷的可能性，通过CD1d/α-GalCer四聚体染色和ELISPOT测定分析这些IFN-γR^-1-小鼠NKT细胞的存在和功能。使用CD1d/α-GalCer四聚体的流式细胞仪分析表明IFN-γR^-1-小鼠肝淋巴细胞中α-GalCer-特异性NKT细胞的百分比类似于野生型小鼠(图5B)。另外，野生型和FN-γR^-1-小鼠的肝(图5C)和脾中分泌IFN-γ的α-GalCer-特异细胞的数目相似，排除了由于NKT细胞群缺陷而没有佐剂活性的可能性。总之，这些结果表明α-GalCer佐剂活性依赖IFN-γ产生。

讨论

该实施例说明NKT细胞配体α-GalCer作为调节疟疾-特异抗原诱导的获得性抗-疟疾免疫性的佐剂的能力。如这里公开的，对用最适度以下剂量的(i)照射的约氏疟原虫子孢子，(ii)相应于CS蛋白质的CD8+T细胞表位或CD4+T细胞表位的合成肽或者(iii)表达全CS蛋白质或CS蛋白质的CD8+T细胞表位的重组病毒免疫的小鼠施用α-GalCer，大大增强保护性抗-疟疾免疫性。另外，这里发现α-GalCer处理即使在子孢子免疫之后4周也激发较高水平的保护作用，表明联合施用α-GalCer能激发持续较长时间的保护性免疫性。

表明施用α-GalCer影响的主要免疫成分是分泌IFN-γ的疟疾-特异性CD8+和CD4+T细胞。在本项研究中，α-GalCer处理没有改变体液应答和Th2-型应答的水平。相反，施用α-GalCer分别将γ-spz免疫诱导的增加IFN-γ-分泌CS-特异性CD4+和CD8+T细胞的数目提高5-倍和7-倍。此外，与没有处理的小鼠相比，α-GalCer处理的小鼠γ-spz免疫之后6周CS-特异性T细胞应答的水平保持高得多。因为抗疟疾的肝阶段的保护性免疫性主要由CD8+T细胞和CD4+T细胞介导，并且要求产生IFN-γ(Schofield等，Nature330：664-666，1987；Weiss等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：573-576，1988；Doolan和Hoffinan.J.Immunol.，165：1453-1462，2000)，则通过α-GalCer处理提高抗-疟疾保护作用并且延长该保护作用是意料之中的。

当用相应于CD4+和CD8+表位的合成肽或者用表达约氏疟原虫CS蛋白质或这种蛋白质的H-2Kd-限制CD8+T细胞表位的重组病毒对α-GalCer处理的小鼠免疫接种时，也发现α-GalCer的佐剂作用。这些结果证明并且扩充通过γ-spz免疫获得的数据，表明不管使用的免疫原的类型(全寄生物，或肽，或重组病毒)，施用α-GalCer增强疟疾-特异性CD8+和CD4+T细胞应答。这里还证明施用α-GalCer对CD8+T细胞应答的增强不依赖使用的CD8+T细胞表位，因为表达HIV的H-2Dd-限制T细胞表位的重组新培斯病毒诱导的免疫应答也得到增强。

α-GalCer增强γ-spz免疫诱导的保护性抗-疟疾免疫性的水平的能力需要CD1d分子和Vα14 NKT细胞。没有这些成分，α-GalCer不能增强最适剂量以下免疫原激发的保护作用。虽然α-GalCer增强保护性抗-疟疾免疫性的能力需要CD1d分子和Vα14 NKT细胞，在α-GalCer处理之后Jα281-缺陷小鼠体内检测到CS-特异性CD 8+T细胞数目的显著增加。这可能由于这些小鼠的高度遗传异质性，它影响T细胞应答并且引起这种适度的增加。或者，CD1d-反应性，非-Vα14NKT细胞也可以存在于Jα281-缺陷小鼠体内。

虽然α-GalCer的佐剂作用的精确的分子机理还不完全清楚，本发明发现α-GalCer的这些活性在缺失IFN-γ受体的小鼠中消失，表明IFN-γ在介导α-GalCer的佐剂作用中是重要的。有可能NKT和/或NK细胞分泌的IFN-γ通过上调I类MHC处理机构，例如TAP，蛋白酶亚基和I类重链，而对抗原呈递细胞起作用。或者，IFN-γ可以通过对抗原-特异性CD8+T细胞直接作用而增强获得性细胞-介导的免疫应答。

本发明动力学研究证明，只有当与抗原(例如照射的疟原虫子孢子[γ-spz]，或者疟疾-特异性肽表位[例如，重组病毒代表的])共同施用糖脂并且在用这些免疫原接种之前两天或之后两天导致佐剂活性丧失时施用α-GalCer，α-GalCer才起着最大佐剂作用。最近使用CD1d/α-GalCer四聚体在施用α-GalCer之后的NKT细胞体内动力学的研究表明，鼠NKT细胞，特别是构成淋巴细胞群20-30％的肝中的那些，迅速被激活，分泌大量IFN-γ和IL-4，并且在刺激之后5小时容易消失(Matsuda等，J.Exp.Med.，192：741-754，2000)。令人感兴趣地，α-GalCer激活的NKT细胞的迅速消失也通过用α-GalCer处理的癌症患者的外周血的表型分析得以证实。

如先前各研究人员证明的，NKT细胞激活不只是引起NK细胞的激活，而且还引起记忆CD4+和CD8+T细胞的增殖 (Eberl等，J.Immunol.，165：4305-4311，2000)或者T细胞和B细胞表面上早期激活标记CD69的诱导(Nishimura等，Int.Immunol.12：987-994，2000)，提出在引发T细胞和B细胞应答中激活的NKT细胞的作用。还有，不同研究人员的近期研究表明α-GalCer处理之后NKT和NK细胞都分泌IFN-γ(Nishimura等，Int.Immunol.12：987-994，2000；Carnaud等，J.Immunol.，163：4647-4650，1999；Eberl和MacDonald，Eur.J.Immunol.，30：985-992，2000)。在这些研究的一项中证明，对用T细胞淋巴瘤免疫的小鼠施用α-GalCer增强肿瘤特异性细胞毒性T细胞的产生(Nishimura等，Int.Immunol.12：987-994，2000)。但是，关于α-GalCer激活的NKT细胞是否能贡献于抗病原体或肿瘤的保护性免疫性的诱导还没有阐明。就这一点来说，本发明的研究第一次指出α-GalCer激活的NKT细胞在诱导保护性免疫性中起着作用，其中特异CD8+T细胞是主要效应细胞。

结论是，该项研究证明α-GalCer作为佐剂增强和/或延长保护性抗原特异性免疫应答的时间。具体地说，如这里公开的，这种α-GalCer介导的免疫刺激作用至少部分归因于α-GalCer激活的NKT细胞。虽然还没有鉴定α-GalCer的内源哺乳动物配对部分，但是相信它也是在病理和炎症条件范围下被诱导激活NKT细胞(Mieza等，J.Immunol.，156：4035-4040，1996；Sumida等，J.Exp.Med.，182：1163-1168，1995)。因此，这里公开的研究可以代表NKT细胞在桥接先天和后天免疫性中的作用的证据。

本发明对于α-GalCer的佐剂活性的发现清楚地不仅只适用于疟疾，而且还适合各种其他胞内微生物病原体，以及适合其他传染病和肿瘤。最后，因为已经证明α-GalCer不仅能刺激鼠类，而且还刺激人NKT细胞(Brossay等，J.Exp.Med.188：1521-1528，1998；Spada等，J.Exp.Med.，188：1529-1534，1998)，本发明的发现可以直接应用于对人NKT细胞的作用的理解，和新的更有效人疫苗的设计。

本发明不局限于这里描述的具体实施方案的范围。事实上，除了这里描述的之外，从上面的描述和附图，本发明的各种修饰对于本领域技术人员变得显而易见了。这样的修饰意在落在后面的权利要求书的范围内。

所有的专利，申请，公开物，试验方法，文献，和其他材料在此引作参考。

序列表

<110> New York University

Tsuji，Moriya

Gonzalez-Aseguinolaza，Gloria

Nussenzweig，Ruth S.

Koezuka，Yasuhiko

<120>糖基神经酰胺作为用于抗传染病和癌症的疫苗的佐剂的用途

<130>5986/2H958WO0

<140>Not Yet Assigned

<141>2002-07-24

<150>60/308,056

<151>2001-07-25

<160>19

<170>FastSEQ for Windows Version 3.0

<210>1

<211>21

<212>PRT

<213>P.yoelii

<400>1

Tyr Asn Arg Asn Ile Val Asn Arg Leu Leu Gly Asp Ala Leu Asn Gly

1 5 10 15

Lys Pro Glu Glu Lys

20

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>P.yoelii

<400>2

Ser Tyr Val Pro Ser Ala Glu Gln Ile

1 5

<210>3

<211>8

<212>PRT

<213>p.falciparum

<400>3

Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro

1 5

<210>4

<211>20

<212>PRT

<213>P.falciparum

<400>4

Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro

1 5 10 15

Cys Ser Val Thr

20

<210>5

<211>10

<212>PRT

<213>HIV-1

<400>5

Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile

1 5 10

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<211>11

<212>PRT

<213>HIV-1

<400>6

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1 5 10

<210>7

<211>8

<212>PRT

<213>HIV-1

<400>7

Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile

1 5

<210>8

<211>9

<212>PRT

<213>HIV-1

<400>8

Thr Pro Gln Asp Leu Asn MetMet Leu

1 5

<210>9

<211>9

<212>PRT

<213>HIV-1

<400>9

Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu

1 5

<210>10

<211>10

<212>PRT

<213>HIV-1

<400>10

Asp Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp

1 5 10

<210>11

<211>10

<212>PRT

<213>HIV-1

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Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys

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<212>PRT

<213>HIV-1

<400>12

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1 5

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<212>PRT

<213>HIV-1

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Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys

1 5

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<211>9

<212>PRT

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<400>14

Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu

1 5

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<211>12

<212>PRT

<213>P.falciparum

<400>15

Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro

1 5 10

<210>16

<211>9

<212>PRT

<213>流感A病毒

<400>16

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1 5

<210>17

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于RT-PCR的正向引物

<400>17

ggggattggt tttgacgttt ttgcg 25

<210>18

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于RT-PCR的逆向引物

<400>18

aagcattaaa taaagcgaat acatccttat 30

<210>19

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>荧光探针，PyNYU

<400>19

caattggttt accttttgct cttt 24

Claims

1.用于增强哺乳动物抗原的免疫原性的方法，包括用所述抗原并且联合施用包括通式1的糖基神经酰胺的佐剂对哺乳动物进行免疫：

2.权利要求1的方法，其中所述糖基神经酰胺选自α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)，α-葡糖基神经酰胺(α-GlcCer)，Galα1-6Galα1-1′Cer，Galα1-6Glcα1-1′Cer，Galα1-2Galα1-1′Cer，和Galβ1-3Galα1-1′Cer。

3.权利要求2的方法，其中所述α-GalCer是(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六酰基氨基)-1，3，4-十八烷三醇。

4.权利要求1的方法，其中同时施用所述抗原和所述佐剂。

5.权利要求1的方法，其中所述抗原是疟疾-特异性的。

6.权利要求5的方法，其中所述疟疾-特异性抗原包括照射的疟原虫子孢子。

7.权利要求5的方法，其中所述疟疾-特异性抗原包括疟疾环子孢子(CS)蛋白质的T细胞表位。

8.权利要求1的方法，其中所述抗原是HIV-特异性的。

9.权利要求1的方法，其中所述抗原由表达所述抗原的重组病毒呈递。

10.权利要求9的方法，其中所述病毒选自重组腺病毒，重组痘病毒，和重组新培斯病毒。

11.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是人。

12.用于增强或延长哺乳动物抗原-特异性Th1-型免疫应答时间的方法，包括对所述哺乳动物联合施用(i)抗原和(ii)包括通式1的糖基神经酰胺的佐剂：

13.权利要求12的方法，其中所述Th1-型免疫应答是CD8+T细胞应答。

14.用于治疗哺乳动物疾病的方法，包括对所述哺乳动物联合施用抗原和包括通式1的糖基神经酰胺的佐剂：

15.权利要求14的方法，其中所述糖基神经酰胺选自α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)，α-葡糖基神经酰胺(α-GlcCer)，Galα1-6Galα1-1′Cer，Galα1-6Glcα1-1′Cer，Galα1-2Galα1-1′Cer，和Galβ1-3Galα1-1′Cer。

16.权利要求15的方法，其中所述α-GalCer是(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六酰基氨基)-1，3，4-十八烷三醇。

17.权利要求14的方法，其中所述疾病选自传染病和癌症。

18.权利要求17的方法，其中所述传染选自病毒传染，细菌传染，寄生物传染，和真菌传染。

19.权利要求14的方法，其中所述疾病是疟疾。

20.权利要求14的方法，其中所述疾病是HIV感染。

21.权利要求14的方法，其中所述哺乳动物是人。

22.含有免疫原有效量的具有通式1的糖基神经酰胺的佐剂的药物组合物：

23.权利要求22的药物组合物，其中所述糖基神经酰胺选自α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)，α-葡糖基神经酰胺(α-GlcCer)，Galα1-6Galα1-1′Cer，Galα1-6Glcα1-1′Cer，Galα1-2Galα1-1′Cer，和Galβ1-3Galα1-1′Cer。

24.权利要求23的药物组合物，其中所述α-GalCer是(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六酰基氨基)-1，3，4-十八烷三醇。

25.权利要求22的药物组合物，进一步包括药学可接受载体或赋形剂。

26.权利要求22的药物组合物，进一步包括免疫原有效量的抗原。

27.用于对哺乳动物增强抗原诱导的保护性免疫性的方法，包括对所述哺乳动物施用权利要求22的药物组合物。

28.用于治疗哺乳动物疾病的方法，包括对所述哺乳动物施用权利要求22的药物组合物。

29.权利要求28的方法，其中所述疾病选自传染病和癌症。

30.权利要求29的方法，其中所述传染选自病毒传染，细菌传染，寄生物传染，和真菌传染。

31.权利要求28的方法，其中所述疾病是疟疾。

32.权利要求28的方法，其中所述疾病是HIV感染。

33.含有免疫原有效量的抗原和免疫原有效量的具有通式1的糖基神经酰胺的佐剂的疫苗组合物：

34.权利要求33的疫苗组合物，其中所述糖基神经酰胺选自α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)，α-葡糖基神经酰胺(α-GlcCer)，Galα1-6Galα1-1′Cer，Galα1-6Glcα1-1′Cer，Galα1-2Galα1-1′Cer，和Galβ1-3Galα1-1′Cer。

35.权利要求34的疫苗组合物，其中所述α-GalCer是(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六酰基氨基)-1，3，4-十八烷三醇。

36.权利要求33的疫苗组合物，进一步包括药学可接受载体或赋形剂。

37.用于给易感哺乳动物宿主带来抗疟疾子孢子阶段的免疫性的方法，包括对所述宿主联合施用

(i)第一量的至少一种选自子孢子表面抗原的疟疾-特异性抗原，和

(ii)第二量的作为免疫佐剂的α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)；

所述第一和第二量是与不联合施用所述佐剂下施用所述第一量的所述抗原时宿主的免疫应答相比，有效联合增强或延长宿主对所述抗原的免疫应答的量。

38.权利要求37的方法，其中所述α-GalCer是(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六酰基氨基)-1，3，4-十八烷三醇。

39.权利要求37的方法，其中所述抗原和所述佐剂同时施用。

40.权利要求37的方法，其中所述疟疾-特异性抗原包括疟原虫环子孢子(CS)蛋白质的T细胞表位。

41.权利要求40的方法，其中所述T细胞表位具有选自YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK(SEQ ID NO：1)，SYVPSAEQI(SEQ ID NO：2)，(NVDPNANP)_n(SEQ ID NO：3)，和EYLNKIQNSLSTEWSPC SVT(SEQ IDNO：4)的氨基酸序列。

42.权利要求37的方法，其中所述疟疾-特异性抗原包括疟原虫环子孢子(CS)蛋白质的B细胞表位。

43.权利要求42的方法，其中所述B细胞表位具有氨基酸序列(NANP)₃(SEQ ID NO：15)。

44.权利要求37的方法，其中所述疟疾-特异性抗原由表达所述抗原的重组病毒呈递。

45.权利要求44的方法，其中所述病毒选自重组腺病毒，重组痘病毒，和重组新培斯病毒。

46.权利要求37的方法，其中所述哺乳动物是人。

47.权利要求37的方法，其中所述免疫应答的增强或延长是通过抗原特异性CD8+T细胞应答的增强和时间的延长实现的。

48.权利要求37的方法，其中所述第一量是每千克体重0.1微克至100毫克范围内。

49.权利要求37的方法，其中所述第二量是每千克体重10-100微克范围内。

50.用于对易感哺乳动物宿主增强对HIV抗原的T细胞应答的方法，包括对所述宿主联合施用：

(i)第一量的至少一种选自Gag，Tat，Pol，Env，Nef，gp 160，p18，和gp 120的HIV-特异性抗原，和

(ii)第二量的作为免疫佐剂的α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)；

所述第一和第二量是与不联合施用所述佐剂下施用所述第一量的所述抗原时宿主的免疫应答相比，有效联合增强宿主对所述抗原的T细胞应答的量。

51.权利要求50的方法，其中所述α-GalCer是(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六酰基氨基)-1，3，4-十八烷三醇。

52.权利要求50的方法，其中所述HIV-特异性抗原和所述佐剂同时施用。

53.权利要求50的方法，其中在所述抗原之前1小时施用所述佐剂。

54.权利要求50的方法，其中所述HIV-特异性抗原包括Gag，Tat，Env，Pol，Nef，gp160，p18，或gp120的T细胞表位。

55.权利要求54的方法，其中所述T细胞表位具有选自RGPGRAFVTI(SEQ ID NO：5)，KAFSPEVIPMF(SEQ ID NO：6)，KAFSPEVI(SEQ ID NO：7)，TPQDLNMML(SEQ ID NO：8)，TPQDLNTML(SEQ ID NO：9)，DTINEEAAEW(SEQ ID NO：10)，KRWIILGLNK(SEQ ID NO：11)，和QATQEVKNW(SEQ ID NO：12)，RLRPGGKKK(SEQ ID NO：13)，和SLYNTVATL(SEQ ID NO：14)的氨基酸序列。

56.权利要求50的方法，其中所述HIV-特异性抗原由表达所述抗原的重组病毒呈递。

57.权利要求50的方法，其中所述病毒选自重组腺病毒，重组痘病毒，和重组新培斯病毒。

58.权利要求50的方法，其中所述哺乳动物是人。

59.权利要求50的方法，其中所述第一量是每千克体重0.1微克至100毫克范围内。

60.权利要求50的方法，其中所述第二量是每千克体重10-100微克范围内。

61.含有至少一种抗原和包括通式1的糖基神经酰胺的佐剂的疫苗组合物的制备方法：

其中R₁，R₂和R₅代表H或具体单糖；R₃和R₆分别代表H或OH；R₄代表H，OH或具体单糖；X代表1-23的整数；R₇代表下面基团(a)-(g)的任一个：(a)--(CH₂)₁₁--CH₃，(b)--(CH₂)₁₂--CH₃，(c)--(CH₂)₁₃--CH₃，(d)--(CH₂)₉--CH(CH₃)₂，(e)--(CH₂)₁₀--CH(CH₃)₂，(f)--(CH₂)₁₁--CH(CH₃)₂，(g)--(CH₂)₁₁--CH(CH₃)--C₂H₅，所述方法包括混合佐剂和抗原。

62.用于制备含有至少一种抗原和佐剂的药物或疫苗组合物的试剂盒，其中所述佐剂包括通式1的糖基神经酰胺：

其中R₁，R₂和R₅代表H或具体单糖；R₃和R₆分别代表H或OH；R₄代表H，OH或具体单糖；X代表1-23的整数；R₇代表下面基团(a)-(g)的任一个：(a)--(CH₂)₁₁--CH₃，(b)--(CH₂)₁₂--CH₃，(c)--(CH₂)₁₃--CH₃，(d)--(CH₂)₉--CH(CH₃)₂，(e)--(CH₂)₁₀--CH(CH₃)₂，(f)--(CH₂)₁₁--CH(CH₃)₂，(g)--(CH₂)₁₁--CH(CH₃)--C₂H₅，所述试剂盒包括第一容器中的抗原，第二容器中的佐剂，和任选地用于混合抗原和佐剂的说明和/或组合物给药说明；并且任选地，容器置于包装中。

63.权利要求62的试剂盒，其中所述佐剂选自选自α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)，α-葡糖基神经酰胺(α-GlcCer)，Galα1-6Galα1-1′Cer，Galα1-6Glcα1-1′Cer，Galα1-2Galα1-1′Cer，和Galβ1-3Galα1-1′Cer。

64.权利要求63的试剂盒，其中所述α-GalCer是(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六酰基氨基)-1，3，4-十八烷三醇。