CN1604792A - 增强免疫应答的试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫原性组合物以及制造和使用所述组合物的方法。所述免疫原性组合物包含。所述兴奋剂和引导分子在化学上是不同的。所述兴奋剂和免疫原以相关的量存在而导致免疫应答的增强，这是和免疫原和引导分子或兴奋剂之一导致的结果是相关的。

Description

增强免疫应答的试剂
                         发明背景
发明领域
这项发明涉及免疫学领域，尤其涉及不同类型佐剂的组合以辅助宿主产生对于病原体、哺乳动物抗原和其它临床有意义的目标增强了的体内抗体反应。
相关技术的描述
75年前，Ramon证明通过施用含有引起发热细菌的疫苗提高对于白喉和破伤风的抗毒素反应是可能的。从那时开始，就存在临床医师和免疫学家在努力通过佐剂增强免疫应答，同时尝试使经常存在的阻碍它们在人类中应用的毒性副反应最小化。
通常，抗原通过抗原呈递细胞“呈递”给免疫系统，它包括APC表面的主要组织相容性复合分子(MHC)存在下的B-细胞、树突状细胞和的巨噬细胞。通常，认为作为免疫原的合成和自然抗原是被APC摄取和部分消化的，使得较小片的原始完整的抗原可在细胞表面表达。
现在已经明白，T-淋巴细胞对B-淋巴细胞，相对来说是不能与可溶性抗原作用的。典型的，T-淋巴细胞需要将抗原处理，然后表达在有上面提及的MHC分子存在时的APC细胞表面。T-细胞和特异性的T-细胞受体辨认双分子配体形式的抗原，这种配体包括所处理的抗原以及一个或多个MHC分子。已经认为在T-细胞有效起动之前，所述APC分子必须被激活表达共-刺激分子。
树突状细胞(DC)被认为是最有效的抗原呈递细胞，显然是唯一能在初次免疫应答中活化天然(以前未被激活)T细胞的细胞(Banchereau和Steinman 1998 Nature392：245-252)。如果一种疫苗为了产生全T细胞免疫和最佳的抗体反应，激活天然T细胞是必须的。不幸的是，树突状细胞很少。它们在次级淋巴器官中每400个细胞中仅有1个，每500个白细胞中有1个，在大多数非淋巴组织中每1000个细胞中有1个。伴随所述缺乏的是天然T细胞对于任何单个表位或MHC肽复合物的低频率反应，估计低至1/10,000(Mason 1998 Immunol.Today 19：395-404)，简而言之，产生最好的免疫应答接下来就是所述抗原到达一种稀少细胞，它必须接下来和另外一种稀少免疫细胞相作用。
天然T细胞通过血流连续的再循环通过淋巴结(Gretz等1996 J Immunol 157：495-499)，然而不成熟的树突状细胞是非淋巴器官相对稳定的居住者(Cowing和Gilmore 1992 J Immumol.148：1072-1079)。不成熟的树突状细胞表达低水平的表面MHC和共-刺激分子，如仅是T细胞的弱激活剂。然而，这些细胞是胞饮作用形成的并且吞噬细胞的，使得它们能够经常探测环境而发现潜在病原体的存在。当暴露于合适的“刺激”(刺激性佐剂)时，不成熟的树突状细胞被动员，脱离局部组织并通过不同的淋巴系统迁移到淋巴结(Banchereau和Steinman 1998 Nature392：245-252)。在它们迁移至淋巴结过程中，DC成熟并成为有效的T细胞激活剂。朗格罕氏细胞可能是研究最多的DC细胞。它们寄居在皮肤表皮层和黏膜，它们在其中出现的频率要比在其它非淋巴器官中发现的不成熟树突状细胞高。能够使佐剂适合每一种类型的免疫细胞，特别是朗格罕氏类型的DC会有很大的收效。
由于以上给出的原因，许多免疫原以及部分表位，包括外源和内源的，经常不被辨认，或仅被免疫系统微弱的辨认。很难，在一些例子中不可能诱导针对这样目标的抗体产生。当处理小的半抗原或发展包含小的非免疫原肽亚单位疫苗时，这个问题经常遇到。配制这样疫苗的传统方法是通过和蛋白质载体结合以大分子呈递这些抗原，所述蛋白质载体更具有免疫原性并且是疫苗的目标(联合疫苗)。但是经常是所述轭合物仍不能诱导对于较少量免疫原性材料的细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)反应的产生。在这些例子中，一种佐剂是需要的。不幸的是，现在许多佐剂(被证明的和在试验中的)可增强免疫应答的一些方面，但所有的都通常不能诱导产生CTL反应、血清反应的必须水平，和/或表现出一些类型的毒性。现在对于病毒感染的看法，主张保护最好是同时通过体液和细胞介导的免疫力而实现的，包括长时间记忆和细胞毒性T-细胞。
US 2001/0024649 A1描述了局部施用免疫原和一些在这项发明中归类为兴奋剂的试剂。发明者提供了对于DC成熟以及需要兴奋剂的良好概述，然而没有提及引导分子和兴奋剂的联合。
WO 99/43350描述了局部预处理试剂和佐剂，其中所述的一些归类为兴奋剂，但没讨论抗原目标。输递途径限于IM、口服、鼻腔和直肠。
在WO 02/11669中，本发明者描述了皂苷和α2-M和HSP的联合。所述文献列出了其它的反应修饰成分，这项发明归之为兴奋剂。虽然没有为促进关系提供数据或事实，但描述了一种兴奋剂(皂苷)和两种不同引导分子的联合。由于所有引导分子是相同受体(CD91)，本发明者不能认识和证明两类佐剂之间更广泛的联系。进而，由于HSP和受激细胞相关联，并期待拥有“兴奋剂”类型-表位，来自皂苷的作用不清楚。本发明者没有对抗体的应用作任何评论。
WO 99/13915讨论了抗原目标，然而缺乏对于协作的描述，它可以通过两类佐剂的联合而实现。所述工作关注DNA抗原，包含抗原和引导分子必须和如PEI的试剂结合。通过第一输递途径仅观察到2x的增强，这看上去和通过第二输递途径输递不带引导分子的抗原是相匹配的。如早些时候在这项申请中所讨论的，DNA抗原如传统免疫原仍需要兴奋剂。所述WO文献列出了其它引导分子，它们中的一些归在了这项发明中。US出版的申请20020022034讲述了一种输递带有目标分子的基因输递复合体的方法，同时进行抗逆转录病毒药物治疗。
从另外一个角度来看，也需要减少动物所暴露的毒性，当研究者和试剂研发者尝试制造体内和活体外应用的抗体时。1985年，美国公共健康服务建立了授权动物机构建立实验动物保护和应用委员会(IACUC)。IACUC任务之一是确保减少动物实验中使用的毒性试剂如的完全弗氏佐剂。直到现在，还没有一种物质可替代CFA的效力但不表现出一些水平的毒性，无论是局部还是系统的。
在历史上，引导分子和兴奋剂是分开应用的，因为免疫学家认为一类佐剂会包含其它类。实际上，许多抗原的引导方法特别是为了回避兴奋剂的需要，兴奋剂如单磷酰脂A(MPL)曾经被竭力推荐作为完全弗氏佐剂的独立选择。在这项发明中，有意的将免疫原和兴奋剂和引导(呈递)抗体和/或α2-巨球蛋白一起运用。
需要有佐剂和选择这样佐剂的方法，它可以促进稀少的未成熟的抗原呈递细胞(APC)捕捉抗原，APC的成熟和装载，并最终增加APC和抗原-特异T细胞的作用。这些佐剂的作用对于传统的免疫原是需要的，就和更新的DNA/RNA免疫原一样(Iwasaki等1997.J.Imminol.159：11)，它们也受相同的限制。和仅仅充当一种作用的佐剂结合的抗原不会辨认最可能的免疫应答。
有需要有和完全弗氏佐剂(CFA)的佐剂性相竞争以及理想的超过它，但没有和CFA相关联的毒性的试剂。需要有新的能和大范围输递途径和微装置基础的设备相容的佐剂形式。需要新的佐剂和较少的免疫原和目标一起发挥作用，其免疫原性是弱的，除了“加入和混合”不需要任何处理，能够耐受冷冻，可能被冻干而不丧失活性。因此，接下来的工作将有意避免储存例如脂质体和油，它们也会限制佐剂混合物的效果，这是受体介导的。
发明概述
本发明涉及一种免疫原性组合物以及制造和应用所述组合物的方法。
所述免疫原性组合物包含引导分子、兴奋剂和免疫原。所述兴奋剂和引导分子在化学上是不同的。所述兴奋剂和免疫原以相关的量存在而导致免疫应答的增强，这是和免疫原和引导分子或兴奋剂之一导致的结果是相关的。
本发明进一步涉及不含导致可见外部毒性或过敏症状试剂的免疫原性组合物。优选的所述组合物是没有明矾的。不存在必要将所述成分装入胶囊或运用脂质体。所述组合物可在冷冻或冻干状态下保存。可有意的将第一佐剂和第二佐剂混合。如果需要，所述组合物可包括另外的不是免疫原特异的抗体或片段。更清楚的所述组合物包括另外的抗体或片段，其中互补决定区(CDR)是对免疫原、APC和/或兴奋剂特异的。相比之下，CDR对于APC、兴奋剂或免疫原特异不是必须的。
本发明进一步涉及诱导产生抗体的组合物。所述抗体适合诊断、研究和治疗应用。所述组合物可以用作疫苗。在这点上，任何药学上可接受的载体可加入所述组合物。所述组合物可运用任何常规的给药方式，如黏膜，来对受试者给药。
                         附图简述
图1显示了由本发明的组合物以1∶5,000稀释刺激产生的活性，未进行任何优化，例如改变抗体、抗原：抗体比例或免疫途径。
图2显示了预先采集的血，对于涂层的HCG抗原没有任何活性。HCG单独以1∶3,333稀释运用3x背景标准不能被称之为阳性。HCG+皂苷的联合要比HCG单独有改善。HCG+α2-巨球蛋白会有进一步的改善，但最好的明显是HCG(免疫原)+α2-巨球蛋白(引导分子)+皂苷(兴奋剂)的联合。本发明的联合也超过HCG和弗氏佐剂的联合(未显示数据)。
图3显示了HCG和引导分子(α2-M)联合不会在所分析的最低稀释中产生活性(3x背景)。HCG+兴奋剂(Qiagen公司的CpG)的联合显示活性，但仅仅稀释至1∶270。对比之下，HCG和引导分子(α2-M)或兴奋剂(CpG)的联合产生了对于应用单克隆抗体足够的功能性效价。
图4显示了一种动物代表性的实验采血，这种动物没有接受在任何稀释时都没有活性的胰腺膜抗原(非免疫的)。来自免疫接种过胰腺膜抗原和CpG小鼠的血清池几乎不能和任何浓度时的非免疫性相区别。对比之下，胰腺膜抗原和引导分子(CK19抗体)兴奋剂(CpG)的联合产生1∶30K的效价，最低限度的比包含CpG和胰腺抗原的接种体有250x的增强。
图5显示了一种动物代表性的实验采血，这种动物没有接受在任何稀释时都没有活性的未激活的衣原体抗原(非免疫的)。以2x bkgd+0.30D作为截止标准，将接触衣原体和CFA的动物血清滴定至10K。对比之下，来自免疫接种过包含衣原体EBs、L1AB和皂苷动物的血清池滴定至90K。有9x的增强。
图6显示了每个动物在1∶8筛选稀释时的单个组织液体反应。三个动物没有接受任何免疫原(非免疫-3)并作为阴性对照。刚接受衣原体EB微粒的5个动物没有一个产生阳性信号(2x bkgd+0.30D)。接受衣原体EB微粒和皂苷的5个动物都是阴性的。所有接受衣原体EB微粒和L1抗体的5个动物也都是阴性的。相比之下，接受包含衣原体EB微粒、L1AB和皂苷的5个动物中的3个产生令人信服的特异性IgA信号。
图7显示了每个动物在1∶8筛选稀释时的单个组织液体反应。三个动物没有接受任何免疫原(非免疫-3)并作为阴性对照。所有5个接受包含衣原体EB微粒、L1AB和皂苷接种体的动物都产生令人信服的特异性IgA信号(2x bkgd+0.30D)，正如接受包含衣原体EB微粒、α2-巨球蛋白和皂苷接种体的所有5个动物一样。
                      发明详述
根据发明者的观点，“佐剂”是含义较广的名词，通过它们的功能分类看上去至少包括三类材料。一类材料是那些用作存储的物质。存储物的例子包括明矾和完全弗氏佐剂，它们保持免疫原浓缩，并控制释放。另外一类是兴奋剂，其中来自有机体如C.Parvum的表面抗原和植物提取物兴奋抗原呈递细胞并最终导致更广泛的免疫应答。第三类是免疫原引导或抗原目标分子，它们能帮助将抗原集中在免疫抗原呈递细胞(APC)表面，从而提高摄取。第三种类型物质的例子是分子例如抗体和α2-巨球蛋白。虽然所有佐剂都有可认识的初级功能，但一些还有不是显而易见的次级特性。例如一些油主要用做存储剂，较小程度上用做兴奋剂。名词如弱、中和强经常用来描述佐剂的效能，它在历史上和毒性相关联。
筛选免疫原
免疫原可以是任何天然或合成的和任何病原体、癌症以及其它临床上有意义的目标相关联或衍生而来的抗原。更优选的抗原材料包括全细胞、蛋白质、碳水化合物、脂类或DNA。全细胞“抗原”包括衣原体，尤其是沙眼、肺炎或鹦鹉衣原体。如果合适或需要，可以运用各种类型的免疫原，例如多价疫苗。
选择5种不同的免疫原来证明当合适的配对两类佐剂时会发生的增效反应。将人类绒毛膜促性腺激素(HCG)的纯净蛋白质制剂和α2-M联合。所述全细胞免疫原，沙眼衣原体原粒体用三种独立的方法使之失活，并与特异和非特异的鼠抗体匹配来证明了特定的处理对于引导分子的选择有影响。进而，配制包含衣原体、皂苷和非特异性抗体的接种体，并通过三种独立的途径输递来显示效果的变化，这可随着不同的组织发生。最终，哺乳动物膜蛋白的混合物从人类岛祖代细胞提取，并和商业上应用的抗体结合来证明现存的抗体是如何产生有相似和不同性质的新抗体的。
抗原寻靶和兴奋剂
抗原瞄准成为一种避免从最强佐剂体验到的毒性效应的常用方法，例如完全弗氏佐剂和TiterMax，它们都没有被证明可应用于人类。许多工作都是在18世纪70年代后期开始的，主要关注的是增强单克隆抗体技术，这是由Kohler和Milstein在1975提出的。虽然反应增强了，毒性消除了，效价总的提高却很少。奇怪的是，自从那以后，许多实验室的努力都集中在独立应用引导分子而不考虑增效作用，它是将引导分子和不表现或表现有限的毒性症状的特定“较弱的佐剂”结合产生的结果。
许多“较弱的佐剂”都可以归为兴奋剂，不导致产生持续的坏死性皮炎或可触知的肿块或皮肤溃疡，正如广阔的为CFA提供证明。单独应用这些较弱佐剂就会发现有应用的限制。免疫学家典型的采取这样的佐剂和油结合或混合脂质体来提高效力。不幸的是，这些混合剂需要更多的处理，很少可以被冷冻或冻干(为了广泛的商业化)，和更少的输递途径/装置相容，在一些例子中，由于佐剂混合剂变得更复杂而使得毒性增加。
抗原被不同APC摄取的容量看上去和呈递的效力(Stockinger，B.1992)相关，可包括抗原集中或细胞内的信号。通常，抗原瞄准APC表面看来增强了免疫应答。抗原对于APC的瞄准已经在活体外和体内广泛的研究。为了回顾抗原瞄准见Fossum，S.等，1992。“抗原寻靶抗原呈递细胞(Targeting Antigens to Antigen PresentingCells)”Semin.In Immunol.4：275，更近的(Chattergoon M.A.等，2000)通过利用细胞凋亡级联将抗原直接瞄准树突状细胞来提高抗原呈递。
所述兴奋剂选自常规佐剂，有以下特性，例如CpG DNA、核酸、皂苷、皂苷衍生物或有必备活性的皂苷成分。皂苷衍生物包括化合物，例如有皂苷结构和兴奋活性的盐。皂苷成分是那些有天然化合物相同兴奋活性的皂苷部分，即使所述活性在程度上是不同的。所述皂苷类是可以合成的。
皂苷类和特定的三萜烯糖苷皂苷是天然存在的物质，可以收获于Quillaja肥皂草属。它们作为佐剂的性质已被文献证明过了，包括诱导CTL反应，刺激产生对于T-依赖和T-独立抗原的强反应(Kensil R.C.，1996)。
由于它所能兴奋的反应范围以及用最粗的提取物观察到的相对低水平的毒性，皂苷选自兴奋类佐剂。由于这项工作用提纯的皂苷、更严格的预备和合成形式实施，性能提高了使得它们通过了临床试验，例如Stimulon QS-21。
CpG是短序列的DNA(寡核苷酸)，它包含在特定碱性环境中的未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤双核苷酸。哺乳动物的免疫系统已经进化到能认出这些序列，它们自然会在细菌DNA中发现，作为感染的指示剂。
GM-CSF、IL-1-β、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、单磷酰脂A(MPL)、3-Q-去乙酰(desacyl)-4’-单磷酰脂A(3D-MLA)、IL-1β163-171肽(Sclavo肽)、25-二羟维生素D3、降钙素基因调节肽、脱氢表雄酮(DHEA)、N-乙酰葡糖胺基-(P1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺(GMDP)，二甲基联十八烷基(dioctadecyla)或二硬脂基溴化铵(DDA)/L-脯氨酸锌、胞壁酰二肽(MDP)、甲酰化的-Met-Leu-Phe(fMLP)、N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(苏氨酰-MDP)、N-乙酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-(羟基-磷酰氧)乙酰胺单钠盐(MTP-PE)、Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3、Nac-Mur-L-Thr-D-异Gln-sn-二二棕榈酰甘油、Nac-Mur-D-Ala-D-异Gln-sn-二棕榈酰甘油、1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺、4-氨基-辛-二甲基-2-乙氧甲基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-乙醇、N-乙酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-异Glu-L-Ala-二棕榈酰甘油(DTP-GDP)、N-乙酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-异Glu-L-Ala-二棕榈酰丙酰胺(DTP-DPP)、γ干扰素、7-烯丙基-8-氧鸟苷、聚-腺苷酸-聚-尿苷酸复合物、MIP-1a、MIP-3a、二丁基邻苯二甲酸酯、二丁基邻苯二甲酸酯的类似物和C5a
虽然兴奋剂的例子在糖苷、皂苷和核酸、CpG范围之内，但其它类型的分子也可以预期以相似的方式和引导分子一起起作用，特殊的GM-CSF、IL-1-β、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、如单磷酰脂A(MPL)、3-Q-去乙酰(desacyl)-4’-单磷酰脂A(3D-MLA)、甲酰化的-Met-Leu-Phe(fMLP)和IL-1β163-171肽(“Sclavo肽”)。前面所有的都描述为“刺激”、“刺激的”、“免疫刺激的”、“刺激”或“兴奋剂”。此外，预计25-二羟维生素D3(骨化三醇)、降钙素基因调节肽、脱氢表雄酮(DHEA)、N-乙酰葡糖胺基-(P1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺(GMDP)/二甲基联十八烷基(dioctadecyla)或二硬脂基溴化铵(DDA)/L-脯氨酸锌、胞壁酰二肽(MDP)、N-乙酰葡糖胺基-(P1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺(GMDP)、N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(苏氨酰-MDP)、N-乙酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-(羟基-磷酰氧)乙酰胺单钠盐(MTP-PE)、Nac-Mur-D-Ala-D-Gln-OCH3、Nac-Mur-L-Thr-D-异Gln-sn-二棕榈酰甘油、Nac-Mur-D-Ala-D-异Gln-sn-二棕榈酰甘油、1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺、4-氨基-辛-二甲基-2-乙氧甲基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-乙醇、N-乙酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-异Glu-L-Ala-二棕榈酰甘油(DTP-GDP)、N-乙酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-异Glu-L-Ala-二棕榈酰丙酰胺(DTP-DPP)、γ干扰素、7-烯丙基-8-氧鸟苷、聚-腺苷酸-聚-尿苷酸复合物、MIP-1a、MIP-3a、RANTES和二丁基邻苯二甲酸酯以及二丁基邻苯二甲酸酯的类似物和C5a和引导分子协同起作用。以上的是各种化合物组，每个都有佐剂的性质(单独)并在水中是可溶的。在一些情况中，以上的兴奋剂将自发的在水溶液中形成聚集或微胶粒，并可以用来配制脂质体。然而，本文中应用的浓度始终是低于临界微胶粒浓度(CMC)，接下来的皂苷例子就是这个情况。不追求处理实施包装是因为先前描述的沉淀限制。C5a补体和片段是预期的，但不是优选的，因为补体蛋白质已经显示出拥有象抗体一样的调理素作用性质。如下面所讨论的，同时拥有瞄准和兴奋性质的天然物质可以和在一个方面有专门作用的材料相竞争。每种作用有独特的分子将提供最好的调谐。用来支持这种推理的事实被包含进来，正如在有效建立的佐剂被论证后有空前的250x血清Ig增强。
这里所述兴奋剂的特点描述为它们和人类的关系，其中CpG和皂苷是外源性兴奋剂的例子。IL-2和GM-CSF是内原性兴奋剂的例子，是免疫级联的一部分并在人类中产生。
皂苷和CpG被选择进行这些研究是因为它们都有较好的溶解性，它们是大大不同的分子并且因此成功证明了存在于兴奋剂和目标分子之间的广泛关系，这时它们两者是合适配对的。
本发明进一步定义兴奋剂为对于APC脱离组织、APC迁移至淋巴结和APC成熟有贡献的物质。所述兴奋剂常常是细胞活素以及更特定的是化学激活素或具有化学引诱剂的性质。
用抗体寻靶抗原
每个引导分子和其在抗原呈递细胞上的相应受体被预期以不同的效率结合，接着以不同的率推动免疫级联反应。一些引导分子在多种类型的APC上有受体，并且每种类型细胞上的受体频率预期是唯一的。如先前所讨论的呈递细胞的类型和数目可随着组织的类型而改变。同样，每种免疫原和引导分子之间的作用将是不同的。因此，选择引导分子将是一个仔细的过程，因为推动摄取的能力将随着免疫原和给药途径而变化。兴奋剂的选择也同样如此。
存在关于利用抗体瞄准抗原的出版物的长列表。以前的抗体作用包括天然和合成的系链步骤，例如交联抗原瞄准表面蛋白质(Kawamura和Berzofsky，1986)和形成由FcR辨认的免疫复合物(Manca等，1991)。在先前研究中的免疫原模型包括链球菌M糖肽(Bahr等，1985)其中应用佐剂成分的抗体(抗胞壁酸二肽)，肝炎抗原(Balsap等，2000)其中包括抗原特异性IgM，疟疾抗原(Harte等1983)也和特异的IgM结合。最早的抗原瞄准工作主要集中在制造单克隆抗体(MAB)试剂，现在使蛋白质和特异性抗体人化的能力使得抗原瞄准(通过疫苗)疫苗的希望更接近现实。以下是FDA批准的有不同程度的人化的抗体治疗：
Orthoclone(抗CD3)，ReoPro(抗-11b/111a)，Rituxan(抗-CD20)，Zenapax(抗-IL2受体)，Herceptin(抗-Her2受体)，Remicade(抗-TNF)，Synagis(抗-RSV)，Simulect(抗-IL2)，Mvlotara(抗-CD33)，Campath(抗CD52)。
本发明所述的组合物或制剂可以用来诱导抗体。将所述组合物施用给受试者的任何部位来诱导抗体形成。免疫原的量可以低至每次40ng或甚至更低，例如每次约8ng。如果需要，一种或多种组合物成分可以分别施用给受试者，或如果一种成分存在于受试者的理想部位，可以修饰所述组合物这样就能达到理想的效果。诱导产生抗体的Ka值在104-1013分子/升并可以从受试者重新获得。重新获得的抗体然后做对于表位的亲和力分析。进一步，就获得了保护性的抗体效价。所述组合物可以用做为疫苗。在这点上任何药学上可接受的组合物都可以加入组合物。所述组合物可以运用任何传统的给药方式施用给受试者，包括黏膜给药。进一步，给药可以通过多于一种的途径，多于一种的途径是同时或连续的。一系列的接种是可能的。
用α2-巨球蛋白进行抗原寻靶
这里所应用的引导分子包括通过不同方法配制的α2-巨球蛋白(α2-M或A2M)和各种特性不同纯度的抗体。补体和其它调理分子(oposonizing molecule)是期望的。能够结合免疫原的这些分子的片段也被视为引导分子。所述引导分子不需要对于组合物中存在的免疫原有特异性。这里抗体的例子是对免疫原特异性的或非特异性。所述引导分子是对APC受体有特异性的。作为选择，所述瞄准分子可以直接或间接和APC受体连接。虽然抗体和α2-M是优选的引导分子，那些和转铁球蛋白、甘露糖(manose)和唾液酸糖蛋白受体结合的是期望的。哺乳动物热休克蛋白是期望的但不是优选的，因为已经很好建立了HSP是应激蛋白并且可怀有“兴奋”表位。同时拥有瞄准和兴奋性质的天然物质可以和专有一种作用的材料竞争。如先前所详述的，每种作用有独特的分子将提供最好的调谐。
B细胞拥有Ig的特异性抗体(Rock等，1984)，巨噬细胞和其它非B细胞，APC细胞知道应用其它机制，包括吞噬作用和内吞作用。由巨噬细胞摄取和呈递的可溶性抗原没有完全理解。然而已知α2-巨球蛋白和CD91的受体介导机制(Binder，R.J.等，J of Immunol，2001，166：4968-4972)，热休克蛋白使用了相同的受体。
在免疫细胞中，巨噬细胞是特别重要的，因为它们在广泛的免疫系统中起的关键作用。巨噬细胞调节广泛免疫作用的能力部分是因为它们表达1a表面抗原。膜1a表面抗原的表达对于诱导特异的T-细胞抗原反应是必需的(Unanvel，1981)。由于这些原因，α2-巨球蛋白系统现在受到了许多关注，并且利用α2-M产生的增强和先前利用抗体产生的抗原瞄准数据相当。
人类α2-M在血浆中(2-5mg/ml)是丰富的蛋白质。它包括4个相同的亚单位组合形成一个双面的分子“陷阱”。当酶或甲胺激活高度易伸长的氨基酸时，“诱饵区域“，导致可追踪的构象变化，陷阱就被触发(Barret和Starkey，1973)。所导致的受体-辨认α2-M有效的被巨噬细胞、树突状细胞和其它表达α2-M受体的细胞内在化(Pizzo等，1984)。到此为止，将α2-M结合至非蛋白水解的蛋白质，天然或合成的看来不会影响APC导致的内在化，但是大小和电荷会影响结合的程度。α2-M看来很可能在今后的抗原-瞄准应用中有广泛的应用。
选择抗体和α2-M进行这些研究是因为它们都在正常条件下高浓度的存在于系统循环和组织中，因此并不期望它们拥有会混淆结果的兴奋类型表位。此外，α2-M和抗体结构是大大不同的分子并应用不同的APC受体，因此成功证明了存在于兴奋剂和瞄准分子之间的广泛关系，当它们合适的配对时。
                               实施例
          抗体引导分子，全细胞免疫原(衣原体EB)和皂苷兴奋剂
三种感染人类的衣原体种类是沙眼、肺炎和鹦鹉衣原体。眼和生殖器对于沙眼衣原体的感染是世界范围主要发病的原因，并且治疗是昂贵的。生产一种能够预防感染或严重疾病的疫苗提供了特殊的挑战，但是控制衣原体疾病最有效的长期选择。
肺炎衣原体(TWAR)第一次从呼吸系统感染中分离出来大约是在15年前，接着就显示是肺炎、气管炎、窦炎和咽炎的普通病因。近来，冠状动脉粥样硬化中肺炎衣原体的存在使得许多药物公司采用传统的疫苗方法来治疗动脉粥样硬化。由于衣原体类是血清学相似的，就有可能单一的疫苗可以提供对于直接和间接的衣原体疾病的保护。
衣原体已经出现侵入免疫系统的能力。大多数人认为对于这些病原体的保护需要一种强的激素和细胞介导的反应。在理解这些感染的病理学和保护上已经取得了进展。最有希望的数据已经由全细胞、主要外膜蛋白质(MOMP)和MOMP DNA产生。如果选择一种疫苗途径，全细胞免疫原通常比亚单位疫苗更具有免疫性。这对于衣原体也是真的；然而，当全衣原体微粒未激活时，它在历史上就已经失去了免疫原性。例1显示未激活的衣原体微粒是如何通过结合引导分子和兴奋类佐剂增强免疫原性的。
实施例1
免疫原    ＝  全细胞(沙眼衣原体)
引导      ＝  抗体(鼠的，对于衣原体LPS特异)
分子
兴奋剂    ＝  皂苷
免疫原的配制
将大约108福尔马林固定的沙眼衣原体(L2血清型)主要部分(EBs)分配入100μlHBSS。对于EB原料，以25μl磷酸缓冲盐加入90mg提纯的#403鼠抗体。最后，加入2μl 10μg的提纯皂苷。将以上的混合，并在室温下温浴10分钟。然后将体积变为1ml使得每个动物接受200μl所配制的接种物。
免疫接种
指定5只balb/c小鼠进行传统CFA免疫接种，指定5只进行新佐剂联合以及作为对照的每种可能的成分联合。所有动物以2×107，200μl Hanks缓冲盐接受4次IP免疫接种，缓冲液是在两周前隔开的。总的接种物量总是200μl。
表1
Balb/c小鼠组1对照 Balb/c小鼠组2对照 Balb/c小鼠组3对照 Balb/c小鼠组4发明 Balb/c小鼠组5对照
衣原体免疫原+传统CFA/IFA佐剂 衣原体免疫原+兴奋剂(Quil A皂苷) 衣原体免疫原+引导分子(特异性抗体)+传统CFA/IFA佐剂 衣原体免疫原+引导分子(特异性抗体)+兴奋剂(Quil A皂苷) 衣原体免疫原+非特异性抗体+兴奋剂(Quil A皂苷)
第0天IP免疫接种 第0天IP免疫接种 第0天IP免疫接种 第0天IP免疫接种 第0天IP免疫接种
第13天IP增强 第13天IP增强 第13天IP增强 第13天IP增强 第13天IP增强
第26天IP增强 第26天IP增强 第26天IP增强 第26天IP增强 第26天IP增强
第39天IP增强 第39天IP增强 第39天IP增强 第39天IP增强 第39天IP增强
第40天实验采血 第40天实验采血 第40天实验采血 第40天实验采血 第40天实验采血
在第四次IP注射后采试验血，并与固态相ELISA中的CTL2感染MeCoy细胞对比滴定。
用来量化衣原体免疫原抗体水平的方法和材料
材料：PVC平皿，L2沙眼衣原体(CT)MeCoy溶解产物，牛血清白蛋白，磷酸缓冲盐(PBS)，碳酸盐缓冲液，有0.5％吐温20的磷酸缓冲盐水(PBS-T)，有20％血清的DMEM培养基，5ml玻璃管，在第40天采自每个笼子的试验血池，山羊抗-小鼠IgG(全分子)HRP Sigma A-4416，磷酸-柠檬酸盐缓冲胶囊Sigma p-4922，OPD底物30mg片剂Sigma p-8412，4.5mol硫酸
ELISA步骤：
1.以106沙眼衣原体微粒/ml涂布PVC平皿，每100μl/孔，pH9.5碳酸缓冲液，在37℃下1小时。
2.通过用PBS中3％BSA冲孔并在37℃下温育来去掉涂层并封闭一小时。
3.去除封闭并通过冲孔用PBS-T漂洗2次。
4.加入50μl每种试验/采血前稀释液，并在37℃下温育1小时。每种稀释液由90％PBS-T和20％是血清的10％DMEM培养基构成。
5.丢弃并通过每次冲洗孔而洗涤3次。
6.加入50μl用PBS-T以1∶10K稀释的山羊抗-小鼠IgG HRP并在37℃下温育1小时。
7.丢弃并通过每次冲洗孔而洗涤3次。
8.加入50μl是2mg/mlOPD的柠檬酸-磷酸缓冲液，并保温直至当在495nm处扫描时最高稀释反应的最低稀释液估计达到10D。
9.用50μl 4.5mol硫酸终止反应并用Titertek平板阅读器在495nm读出最终结果。
衣原体结果的总结
在一系列的实验中，当一种兴奋剂(提纯的皂苷“Quil A”)和未激活的沙眼衣原体(CT)微粒联合C-LPS特异性抗体混合时，发现它会产生即刻并且持久的血清效价的上升。所述结果更奇怪的是，由于所述增强超过完全弗氏佐剂，不超过单独免疫原。
出版的文章显示了小鼠(免疫接种后)和人类(感染后)衣原体的效价大约为1∶500。由以上所述的新组合刺激产生的效价，在图1中追踪为1∶5,000或没有优选而超过，例如变化抗体、抗原：抗体比例或免疫接种途径。
稀释一开始是1∶100，并和预采血以及代表性的CFA反应作比较。所述预采血对于1∶100的CT抗体是阴性的，CFA处理仅可以在最低稀释时被称为是阳性的，通过将量化值降至最大信号的30％。值得注意的是，特异性抗体和免疫原联合不显示超过弗氏佐剂。同样的，Quil-A和免疫原联合不显示超过弗氏佐剂。
α2-巨球蛋白引导分子，提纯的蛋白质免疫原(HCG)和皂苷兴奋剂
HCG是一种分子量为38,000道尔顿的糖蛋白。它包含2个亚单位，α和β链。所述α亚单位包括92-aa序列，它和垂体糖蛋白是相同的：FSH、LH和TSH。所述β亚单位，N-末端115-aa片是和β-LH亚单位是相同的；然而，C-末端30-aa序列是独特的，经常指分子的交易末端。HCG由胎盘分泌，它的水平在怀孕头三个月上升。
HCG是一个用来评价伴随HCG-A2M免疫原的增强优秀的候选物。在过去的20年中，许多学院和诊断实验室已经追踪到了HCG在产生OTC怀孕试验试剂的过程中的效价，因此创造了许多可对比的血清效价数据。
α2-巨球蛋白可提供另外一种好处。一旦抗原被APC内在化，在核内体中就发生部分蛋白水解降解，处理过的抗原肽片段变成和MHC分子相连。然而，虽然抗原的部分蛋白水解降解对于产生合适的MHC和结合其肽片段的T-细胞是必要的，但是，过量的降解证明对免疫应答有损害。完全蛋白水解不是必要的处理，α2-M的掩盖可以保护需要中和和保护的主要表位。
直到现在，还没有证明α2-M对于产生带有诊断应用的必要Ka值(从104-1013mol/l)的抗体有贡献，但避免了典型的对于实验室动物的毒性。进一步，由于所揭示的佐剂制剂，以低浓度给予的免疫原可以刺激产生功能性抗体的效价。名词“功能性效价”在每一领域有不同的意思。由Kohler和Milstein发明的那些作为单克隆抗体工具的功能性效价通常是1∶10,000。效价少于10,000的动物典型的不是用来输注的初级B-细胞的好来源。这里也通过抗体质量描述了功能性效价，例如包括中和或保护性抗体。
实施例2
免疫原     ＝  提纯蛋白质(HCG)
引导分子   ＝  巨球蛋白(鼠的，α2)
兴奋剂     ＝  皂苷
免疫原的配制
HCG从4240Hollis街，Emeryville CA 94608的BioPacific获得，提供为来自50mM碳酸铵溶液的冻干粉末。
一些实验室已经经历了将物质结合至α2-M。也可以应用通常的蛋白质-蛋白质连接，自Pierce Chemicals应用简单的服从指导。协同疫苗有限公司是“IncubatorCompany”位于Becton Dickinson’s RTP，NC机构，选择它来实施结合步骤。
免疫接种和血清取样
以两个星期的间隔腹膜内给予所有的免疫接种。同样，选择IP途径这样就创造了一种对于以后收获的脾B-细胞以及用于个体抗体分析的MAB产生的选择。每个动物接受200μl Hanks缓冲盐溶液中1μg HCG/增强。血清样品采自试验组的每个动物，集中做滴定。
表2
Balb/c小鼠组1发明 Balb/c小鼠组2对照 Balb/c小鼠组3对照 Balb/c小鼠组4对照 Balb/c小鼠组5对照
HCG+α2巨球蛋白+皂苷 HCG+皂苷 HCG+弗氏完全/不完全 HCG+α2巨球蛋白 HCG
第0天IP免疫接种 第0天IP免疫接种 第0天IP免疫接种 第0天IP免疫接种 第0天IP免疫接种
第14天IP增强 第14天IP增强 第14天IP增强 第14天IP增强 第14天IP增强
第27天IP增强 第27天IP增强 第27天IP增强 第27天IP增强 第27天IP增强
第33天试验采血 第33天试验采血 第33天试验采血 第33天试验采血 第33天试验采血
量化HCG抗体血清水平的方法和材料
材料：PVC平皿，牛血清白蛋白，磷酸缓冲盐(PBS)，碳酸盐缓冲液，有0.5％吐温20的磷酸缓冲盐水(PBS-T)，有20％血清的DMEM培养基，5ml玻璃管，在第33天采自每个笼子的试验血池，山羊抗-小鼠IgG(全分子)HRP Sigma A-4416，磷酸-柠檬酸盐缓冲胶囊Sigma p-4922，OPD底物30mg片剂Sigma p-8412，4.5mol硫酸。
步骤：
1.用100μl pH9.5碳酸缓冲液中的HCG以1μg/ml涂布PVC平皿，在37℃下温育1小时。
2.通过用PBS中3％BSA冲孔并在37℃下温育来去掉涂层并封闭一小时。
3.去除封闭并通过冲孔用PBS-T漂洗2次。
4.加入50μl每种试验/采血前稀释液，并在37℃下温育1小时。每种稀释液由90％PBS-T和20％是血清的10％DMEM培养基构成。
5.丢弃并通过每次冲洗孔而洗涤3次。
6.加入50μl用PBS-T以1∶10K稀释的山羊抗-小鼠IgG HRP并在37℃下温育1小时。
7.丢弃并通过每次冲洗孔而洗涤3次。
8.加入50μl是2mg/mlOPD的柠檬酸-磷酸缓冲液，并保温直至当在495nm处扫描时最高稀释反应的最低稀释液估计达到10D。
9.用50μl 4.5mol硫酸终止反应并用Titertek平板阅读器在495nm读出最终结果。
效价和毒性试验
图2显示了对于涂上的HCG抗原没有活性的预采血。HCG单独在运用3x背景标准的1∶3,333稀释时不能被称为阳性。HCG+皂苷的联合比HCG单独有提高。HCG+α2-巨球蛋白会有进一步的改善，但最好的明显是HCG(免疫原)+α2-巨球蛋白(引导分子)+皂苷(兴奋剂)的联合。本发明的联合也超过HCG和弗氏佐剂的联合(没显示数据)。
更重要的是，给予组1和3(上面)的接种物再次配制，对第二组5只小鼠皮下输递，唯一的目的是监测毒性。再次，所有的动物接受200μl接种物，然而，这次所述材料在6个部位划分。然后监测所述动物两周，察觉到四头肌和脚中产生的结果。表3总结了观察报告。
表3
HCG+弗氏完全/不完全 HCG+α2-巨球蛋白+皂苷
脚 5/5水肿和红斑 正常
后四头肌 2/5开放脓肿 正常
如表3所示，接受HCG+α2-M+皂苷的动物和接受乳化在弗氏佐剂中的HCG的动物相比，不显示任何局部毒性征象，后者产生有很好文件证明的脓肿。
α2-巨球蛋白引导分子，提纯的蛋白质免疫原(HCG)和CpG兴奋剂
                        实施例3
免疫原      ＝  提纯蛋白质(HCG)
引导分子    ＝  巨球蛋白(鼠的，α2)
兴奋剂    ＝  CpG DNA
免疫原的配制
在这个实施例中所应用的CpG兴奋剂是ImmunoEasyTM购自Qiagen有限公司，28159 Stanford Avenue Valencia CA 91355。CpG兴奋剂是一条较短的DNA，它包含未甲基化的胞嘧啶和在特殊碱性内容物中的鸟嘌呤二核苷酸。再次，HCG由BioPacific提供并进一步在室内处理。如先前所述，HCG+α2-M复合物由SynergyVaccines有限公司配制。
免疫接种和血清取样
由于先前的创造功能性效价的实施例都是IP注射，这项工作仅包括皮下(SQ)免疫接种，因此证明本发明不局限于特定的途径。每个动物每周接受40ngHCG，以200μl体积。当需要稀释时，应用Hanks缓冲盐水。血清样品采自试验组的每个动物，集中做滴定。
表4
Balb/c小鼠组  1对照 Balb/c小鼠组2对照 Balb/c小鼠组  3发明
HCG+CpG  HCG+α2-M  HCG+α2-M+CpG
第0天SQ免疫接种 第0天SQ免疫接种 第0天SQ免疫接种
第7天SQ增强 第7天SQ增强 第7天SQ增强
第14天SQ增强 第14天SQ增强 第14天SQ增强
第20天SQ增强 第20天SQ增强 第20天SQ增强
第25天SQ增强 第25天SQ增强 第25天SQ增强
第27天试验采血 第27天试验采血 第27天试验采血
        量化HCG抗体血清水平的方法和材料和实施例2中说明的相同。
血清效价结果
图3显示了HCG和引导分子(α2-M)的结合不能在所测定的最低稀释时产生活性(3x背景)。HCG+兴奋剂(Qiagen公司的CpG)的结合显示活性，但仅仅是在扩大为1∶270稀释。相比之下，HCG和引导分子(α2-M)的结合和兴奋剂(CpG)一起产生足够单克隆抗体应用的功能性效价。
鼠细胞角蛋白抗体(DIR.MOL.)和用来增强胰腺细胞膜抗原反应的CpG DNA兴奋剂
胰腺细胞膜抗原(PCMA)是从人类胰腺细胞收集来的蛋白质复合体，主要包括导管和腺泡类型的细胞。尝试应用干细胞或祖代细胞来治疗如糖尿病等疾病的公司正应用这些膜蛋白质来监测和指导岛祖代细胞进化为功能性的胰岛素产生细胞。这些膜蛋白标记物，如许多癌标记物经常是瞬时表达，并在高峰产生期间也仅仅以低浓度存在。由于它是来源于人类，瞬间表达并且在高峰产生期间也仅仅以低浓度存在，因此使得它很难，或常常不可能制造这样目标的抗体。因此，人类PCMA是另外一种评价来自于组合兴奋剂和引导分子类型佐剂增强的优秀后选物。任何由免疫接种产生的抗体都将可能成为有价值的研究和/或那些致力于岛细胞治疗的研发试剂。
                         实施例4
免疫原       蛋白质复合物(胰腺细胞膜抗原)
引导分子     抗体(鼠，对CK19特异)
兴奋剂       CpG
免疫原的配制
配制用来试验的总免疫原和对照免疫接种时间表来自于一个单1502cm烧瓶(培养2天后)的人类胰腺细胞。包含血清的培养基从粘附细胞的烧瓶抽吸并且在把细胞从表面刮下之前用HBSS冲洗烧瓶内部4x。收集到的细胞放在一个50ml的圆锥管中，并以2,000rpms离心5分钟。丢弃上清，应用20mls新鲜HBSS重悬浮细胞。重复所述步骤3次而去除任何残留的培养基成分。在第四次旋转后，在10mls pH8的溶解缓冲液中悬浮颗粒状物，缓冲液包括：10mM HEPES、1mM MgCl2、1mM EDTA和1mM PMSF。将所述混合物简单的旋转，使其在冰上保温10分钟。接着，所述溶解产物以3,000rpms离心10分钟。去除上清，再以100xg离心90分钟。丢弃上清，应用1,300μl溶解缓冲液溶解颗粒状物。通过Lowry蛋白质分析来测定通常的终浓度14.3μg/ml。在这个实施例中所应用的CpG兴奋剂是ImmunoEasyTM购自Qiagen有限公司。所述CK19鼠抗体由Biogenex Cat.AM246-5M获得，并在全腹水形式中应用。
免疫接种
5只Balb/c小鼠接受免疫原加CpG，5只接受免疫原加新型的CpG和CK19抗体的佐剂化合物。两组每周接受IP免疫接种，持续4周，接着在第5次增强后3天试验性的采血。试验性采血后，动物在第40天和第46天进行免疫接种。在第49天为了融合去除脾脏。试验和对照组中的每只动物接受20μl或286ng全蛋白/增强。聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步证实了所述PCMA是至少10种单独的蛋白质或平衡比例抗原的混合物，表明每种免疫接种的蛋白质大约都是以28ngs存在。CpG动物接受一种如上所述的包含50μl Qiagen CpG、150μl hanks缓冲盐水和20μl免疫原存货的混合物。接受本发明混合剂的动物接受50μl Qiagen CpG、10μl Biogenex腹水(在10μg和100μgCK19特异性抗体之间)，120μlHBSS和20μl免疫原存货。
表5
对照组1    Balb/c小鼠 试验组2    Balb/c小鼠
胰腺细胞膜抗原+CpG 胰腺细胞膜抗原+CpG+CK19鼠抗体
第0天，IP免疫接种 第0天，IP免疫接种
第7天，IP增强 第7天，IP增强
第13天，IP增强 第13天，IP增强
第21天，IP增强 第21天，IP增强
第28天，IP增强 第28天，IP增强
第31天，试验性采血 第31天，试验性采血
第40天，IP增强 第40天，IP增强
第46天，IP增强 第46天，IP增强
第49天，采集脾脏 第49天，采集脾脏
应用预先准备在固相ELISA中的相似胰腺细胞膜滴定第31天的试验采血。
           量化胰腺细胞膜抗原血清抗体水平的方法和材料
材料：PVC平皿，胰腺细胞膜抗原，牛血清白蛋白，磷酸缓冲盐(PBS)，碳酸盐缓冲液，有0.5％吐温20的磷酸缓冲盐水(PBS-T)，有20％血清的DMEM培养基，5ml玻璃管，在第31天采自每个笼子的试验血池，山羊抗-小鼠IgG(全分子)HRP SigmaA-4416，磷酸-柠檬酸盐缓冲胶囊Sigmap-4922，OPD底物30mg片剂Sigma p-8412，4.5mol硫酸。
ELISA步骤：
1.用胰腺细胞膜抗原以3.34μg/ml涂布PVC平皿，100μl/孔pH9.5碳酸缓冲液，37℃下1小时。
2.去掉涂层并通过用PBS中3％BSA冲孔封闭一小时并在37℃下温育。
3.去除封闭并通过冲孔用PBS-T漂洗2次。
4.加入50μl每种试验/采血前稀释液，并在37℃下温育1小时。每种稀释液由90％PBS-T和20％是血清的10％DMEM培养基构成。
5.丢弃并通过每次冲洗孔而洗涤3次。
6.加入50μl用PBS-T以1∶10K稀释的山羊抗-小鼠IgG HRP并在37℃下温育1小时。
7.丢弃并通过每次冲洗孔而洗涤3次。
8.加入50μl是2mg/mlOPD的柠檬酸-磷酸缓冲液，并保温直至当在495nm处扫描时最高反应的最低稀释液估计达到10D。
9.用50μl 4.5mol硫酸终止反应并用Titertek平板阅读器在495nm读出最终结果。
PEG融合和稀有目标MABS的回收
虽然效价数据没有证明应该追踪来自CpG安排的MAB，但脾细胞还是从CpG和CpG-Ck19安排收集。大约2×108的脾细胞从每个表融合。10天过后，对每个表的平皿(10)进行全杂种和杂种产生特异性抗体数量的筛选。
表6
    胰腺细胞膜抗原+CpG+CK19抗体     胰腺细胞膜抗原+CpG
杂种筛选     98     481
 Pos克隆     4     0
血清效价和融合结果
图4显示所述CpG兴奋剂不能在所测定的最低稀释时产生活性(3x背景)。相比之下，引导分子(鼠CK19抗体)和兴奋剂(CpG)的联合会导致产生1∶30K的效价(3xBkgd)很容易满足用来努力前进移动以回收单克隆抗体的室内标准(1∶10K)。在表6中，虽然几乎5x所述杂种从CpG初始细胞筛分出来，但没有发现产生特异性PCMA抗体的杂种。相比之下，产生特异性抗体的四种克隆在筛分98种杂种后被标记。进一步，所有四种杂交瘤细胞都是稳定的IgG同种型。
在先前的实施例中，所述新型佐剂混合物产生的效价足够单克隆抗体从第一次增强开始的一个月内应用。这个关于PCMA免疫原的实施例使得不容质疑本发明混合剂可产生理想目标的抗体(单克隆和多克隆)，这时传统佐剂不能。最有意义的是，所述CK19抗体在应用前不需要纯化，因为它以全腹水的形式加入接种物。全血清形式的抗体、全组织培养上清液形式或半-纯化形式预期也是同样有效的。
         应用作为引导分子的非特异性抗体和皂苷兴奋剂来增强
                      对于衣原体微粒的血清反应
到目前为止，单基因或基因产物不能和由全衣原体细胞获得的保护相比(R.C.Brunham等，2000.J.of Infectious Di sease 538-543)。更特别的是，大多数出版物表明仅仅活的衣原体才产生保护性效价(J.J Donnelly，等1997.Ann.Review of Immunology 15：617-648)。虽然许多实验室正在追求减少的衣原体链，来自这样努力的产物看上去至少还得等10年。如实施例1所描述的，一种无活性的衣原体典型的失去其免疫原的特征。实施例1、5和6显示了一种无活性的衣原体微粒的免疫原性是怎样通过结合引导分子和兴奋剂类的佐剂而恢复的。
下面的实施例显示了无活性的衣原体微粒，当和兴奋剂和抗体(不是对免疫原特异的)结合时可以产生高血清Ig效价。
                            实施例5
免疫原     沙眼衣原体感染MeCoy细胞，溶解产物
引导       抗体(鼠，对免疫原非特异)
分子
兴奋剂     皂苷
免疫原的配制
将大约36μgUV无活性的沙眼衣原体(LGV类型2)MeCoy细胞溶解产物输递一个1ml的Nunc小瓶中。90mg的提纯LI特异性鼠抗体加入到77μl的体积中，接着是2μl 10μg的提纯皂苷。将上述混合并使其在室温中保温10分钟。然后用HBSS使体积为1ml，使得5只动物每个都接受200μl的配制接种物。所述衣原体从MicrobixBiosystems有限公司(341 Bering Avenue Toronto Ontario Canada M8Z 3A8)获得。所述提纯的皂苷从Superfos Specialty Chemical(a/s Frydenlundsvej 30，DK-2950 Vedbaek，丹麦)获得。所述L1特异性抗体在室内产生，并在应用前用蛋白质-A树脂亲和提纯。L1是在脑组织中发现的细胞粘附分子。所述L1细胞粘附分子，起初是在小鼠中确认和描述为一种介导神经元-神经元和神经原-施旺氏细胞粘附的细胞表面糖蛋白。一种L1转录本已经在神经母细胞瘤(IM-32)和视网膜神经胶质瘤(Y-79)细胞索中发现。L1也表达于横纹肌肉瘤细胞索(RD)和A-204(R.A.Reid和J.J.Hemperly，1992.J of Mol Neuroscience 3：127-135)。注意在这个实施例中所应用的衣原体用UV辐射使其失活，在先前的衣原体实施例中(实施例1)，衣原体微粒由福尔马林使其失活。在这个实施例中所应用的衣原体不是提纯的(作为宿主细胞溶解产物存在)并且所述L1抗体对于衣原体不是特异的。
免疫接种
5只Balb/c小鼠用CFA免疫接种，5只接受兴奋剂和引导分子的新型佐剂联合。所有动物接受3次初始IP免疫接种，间隔为2周。在第39天获取试验性的采血。
表7
对照组    Balb/c小鼠 试验组    Balb/c小鼠
衣原体免疫原+CFA/IFA 衣原体免疫原+L1非特异性抗体+兴奋剂Quil-A皂苷
第0天     IP免疫接种 第0天     IP免疫接种
第14天    IP增强 第14天    IP增强
第28天    IP增强 第28天    IP增强
第39天    血清样品 第39天    血清样品
第3次IP注射后获取的试验采血，对固相ELISA中的提纯CT EBs滴定。
               量化衣原体免疫原抗体水平的方法和材料
材料：Nunc Maxisorb 96孔平皿，LGV2沙眼衣原体，培养在人类Hep2中(Cat#V501-D3271)从East Coast Biologics获得，脱水牛奶粉末、磷酸缓冲盐水(PBS)、碳酸缓冲液、Tween-20、5ml玻璃管、试验采血、TMB基质Sigma T-8665、硫酸、山羊抗-小鼠IgG(1、2A、2B和3)，来自Accurate Chemical用来滴定血清样品的HRP复合物。
ELISA步骤：
1.以约1×107EBs/孔用East Coast衣原体微粒涂布Nunc Maxi sorb平皿，37℃下约1小时。
2.去掉涂层溶液并通过用250μl/孔 PBS/Tween-20中5％牛奶粉末在37℃下封闭2小时。
3.去除封闭并用PBS-Tween20漂洗3次。
4.加入100μl稀释在0.5％-0.75％脱水牛奶粉末种的每种血清样品，并在37℃下温育1小时。。
5.用PBS/Tween20漂洗3次。
6.加入100μl用PBS-Tween20以4-10K稀释的山羊抗-小鼠IgG HRP并在37℃下温育45分钟。
7.用PBS/Tween20漂洗3次。
8.每孔加入100μlTMB基质并保温30分钟(不在直接光照下)。
9.用100μl 0.5mol硫酸终止反应并用平板阅读器在450nm处读出结果。
样品收集和处理
所有血清样品通过用来自VWR Scientific Cat.53432-921的100μl微吸液管眼眶采血而获得。所述血清样品可以过夜凝结，接着离心而在冻结前去除细胞。测定稀释范围是从1∶123-1∶90K。
血清结果
图5显示了弗氏佐剂对于10K血清效价的贡献，以及包含非特异性抗体和皂苷的佐剂混合物对于90K效价(＞3x背景)的贡献。如所预期的，非免疫血清对照是阴性的。上述结果没有在任何尝试使免疫原剂量最优化的条件下获得的，也不考虑佐剂和免疫原的比例，输递途径或样品采集的时间。
衣原体结果的总结
在一系列的实验中，一种兴奋剂(提纯的皂苷“Quil A”)，当它和无活性的沙眼衣原体(CT)微粒以及一种L1非特异性抗体混合时，会产生超过相同免疫原和弗氏佐剂混合产生的血清效价。所述血清抗体增强估计在9x。结果由粗衣原体预备物获得表明可以不用提纯的免疫原获得增强。值得注意的是，当实施例1中所述的衣原体特异性抗体和UV无活性的微粒(对比福尔马林处理)以及皂苷结合时，然后通过IP输递，仅仅包含衣原体微粒和皂苷的接种物上没观察到增强。同样当上述接种物(UV-衣原体-L1AB-皂苷)IM和ID输递时，仅仅包含衣原体微粒和皂苷的接种物上没观察到增强(没显示数据)。最后的两个结果强调了需要使得混合剂/免疫原以及输递途径变得合适。
              用非特异性抗体作为引导分子以及一种皂苷兴奋剂
                  来产生阴道粘膜中的衣原体特异性IgA
在设计疫苗时，主要考虑的是感染部位。由于衣原体典型的感染粘膜组织，因此需要粘摸免疫接种来获得最好的保护。因此下面的实验设计用来测定本发明中描述的新型佐剂当输递粘膜时是否会显示增强。
无一例外的是，科学文章都指出局部(阴道)抗-衣原体Ig和特殊的IgA和感染的结果相符合(R.P.Morrison等，1995.Infection and Immunity 4661-4668)和(A..L.Baron等.，1984 Infection and Immunity 82-85)。
用无活性的衣原体微粒获得的增强对于衣原体的局部抗体反应的机制将为普通人提供很大益处，并且可能降低美国每年将近1百万新发病例。
实施例6显示了怎样鼻腔内输递无活性的衣原体微粒，当它和兴奋剂和引导分子佐剂结合时，可产生阴道粘膜IgA效价。
                            实施例6
免疫原    沙眼衣原体感染MeCoy细胞，溶解产物
引导      抗体(鼠，对免疫原非特异)
分子
兴奋剂    皂苷
免疫原配制
将大约36μgUV无活性的沙眼衣原体(LGV类型2)MeCoy细胞溶解产物输递埃彭道夫管中。加入45mg的提纯L1特异性鼠抗体，接着是5μg提纯皂苷。总体积是35μl，每个动物接受7μl的配制接种物。所述衣原体溶解产物、皂苷和L1抗体的来源如先前所述。
免疫接种
5只Balb/c小鼠仅接受衣原体抗原，5只接受有皂苷的衣原体抗原，5只接受有L1抗体的衣原体抗原，5只接受包括衣原体、皂苷、L1抗体的接种物。所有动物接受四次免疫接种持续2个月时间，接着2周后阴道冲洗。鼻腔免疫接种通过应用约3.5μl到每个鼻孔末端来实施。
表8
对照组Balb/c小鼠 对照组Balb/c小鼠 对照组Balb/c小鼠 对照组Balb/c小鼠
衣原体免疫原 衣原体免疫原+皂苷 衣原体免疫原+L1抗体 衣原体免疫原+L1抗体+皂苷
第0天IN免疫接种 第0天IN免疫接种 第0天IN免疫接种 第0天IN免疫接种
第14天IN增强 第14天IN增强 第14天IN增强 第14天IN增强
第33天IN增强 第33天IN增强 第33天IN增强 第33天IN增强
第64天IN增强 第64天IN增强 第64天IN增强 第64天IN增强
第85天阴道液体样品 第85天阴道液体样品 第85天阴道液体样品 第85天阴道液体样品
通过用25μl Hanks缓冲盐水冲洗穹窿2x而获得阴道样品。在50μl样品中加入12.5μl 20μg/ml的抑肽酶和12.5μl的0.01M DTT。立即将阴道样品涡旋和冷冻。在分析的那天，将样品解冻并以10K rpm离心净化。
量化衣原体特异IgA水平的方法和材料
将所述阴道液样品对提纯的CT EBs滴定如实施例5所描述的，仅仅有以下例外：一种单一的1∶8筛选稀释液应用于阴道液样品，所述接下去的混合物换为山羊抗-小鼠IgA HRP cat1040-05来自Southern Biotech。稀释液在包含0.5％的脱水牛奶粉末和是20％血清的10％培养基的稀释剂中制成。
阴道液结果
图6显示5组小鼠的各自反应。粘膜样品筛选显示3/5的接种过感染细胞溶解产物-L1抗体-皂苷的动物产生衣原体特异的IgA。包含接种物、和皂苷混合的免疫原以及和L1抗体混合的免疫原的接种物不能在1∶8筛选稀释时产生阳性信号(＞2x背景和0.30D)。三种非免疫样品作为背景。
衣原体结果的总结
在一系列的鼻腔内输递实验中，仅一种包含兴奋剂(提纯皂苷“Quil A”)
无活性的沙眼衣原体感染细胞溶解产物和L1抗体(免疫原非特异性的)的接种物产生阴道IgA效价。结果由粗衣原体预备物获得表明可以不用提纯的免疫原获得增强。上述结果没有在任何尝试使免疫原剂量最优化的条件下获得的，也不考虑佐剂和免疫原的比例，样品采集的时间或免疫接种的间隔。值得注意的是能够在粘膜中产生IgA反应的佐剂混合物首先是在实施例5中提出，一个IP给予接种物的实验。实施例5和6提供了一个事实就是这样的用作粘膜应用的佐剂混合物可以在腹膜中筛选，其中反应在血清中测定并且有更好的精确性。
          用α2-巨球蛋白作为引导分子以及一种皂苷兴奋剂
               来产生阴道粘膜中的衣原体特异性IgA
在实施例7中，鼻内输递一种包含预先冻干的鼠α2-M、皂苷和无活性的预先冻干的衣原体微粒的制剂。所述制剂产生和那些由包含抗体的接种物获得的相似阴道IgA水平。
               实施例7
    免疫原  ＝沙眼衣原体提纯的EBs引导    ＝鼠α2-巨球蛋白或分子      鼠L1抗体兴奋剂  ＝皂苷
免疫原的配制
在埃彭道夫管中输递大约8×108的UV-补骨脂素，无活性的沙眼衣原体(LGV类型2)，20μg提纯的皂苷和115μg提纯的L1鼠抗体或10μg鼠α2-巨球蛋白。总体积是50μl，每个动物接受10μl的配制接种物。所述皂苷和L1抗体的来源如先前所述。所述衣原体EBs从East Coast Biologics获得，和实施例5、6、7的ELISA中应用的材料是相同的。所述鼠α2-巨球蛋白在室内配制，通过将采自Balb/c小鼠的全血清通过带有固定兔抗鼠α2-巨球蛋白的亲和树脂。所述衣原体微粒、α2-M、L1抗体和皂苷预先冻干，并在刚好在配制接种物前水合。所述α2-M如实施例2和3中所做的那样不和免疫原结合。
免疫接种
5只Balb/c小鼠接受包括衣原体、皂苷和L1抗体的接种物。另外一组5只接受包含衣原体、皂苷和α2-巨球蛋白的接种物。两组都接受3次鼻腔内免疫接种持续1个月的时间，接着8天后阴道冲洗。鼻免疫接种通过应用约5μl到每个鼻孔末端来实施。
表9
对照组    5只Balb/c小鼠 实验组    5只Balb/c小鼠
衣原体免疫原+L1抗体+皂苷 衣原体免疫原+α2-M+皂苷
第0天     IN免疫接种 第0天     IN免疫接种
第15天    IN增强 第15天    IN增强
第28天    IN增强 第28天    IN增强
第36天    阴道液样品 第36天    阴道液样品
如实施例6所述将所述阴道液样品收集、处理、稀释和对提纯的CT EBs滴定。
阴道液结果
图7显示了2组小鼠的各自反应。每一条是两个ELISA孔的平均值。免疫接种包含α2-M接种体的5个免疫动物也产生衣原体特异性IgA。样品为了筛选再次稀释为1∶8，当观察到信号＞2x背景和0.3OD时样品才称之为阳性。如信号密度显示，包含α2-M的接种体产生的效价和那些由对照组产生的不相上下。3个非免疫样品作为背景。
衣原体结果的总结
在先前的实施例6中，鼻输递的带有皂苷和L1抗体的衣原体抗原导致产生阴道IgA效价。实施例7表明α2-M可以替代抗体。结果由冻干和无活性的衣原体预备物获得，使得这些制剂更有益于商品化。
这里的数据显示6中不同的兴奋剂和引导分子的组合通过各种途径输递会导致血清抗体效价附加的和协同的增强，而没有毒性的征象。
总而言之，所提供的实施例显示当兴奋剂和引导分子组合时，会有意想不到的协同增强效应。所述实施例包括5种不同的免疫原，4种不同的引导分子，两种独特的兴奋剂，6种佐剂对(7个实施例都包括引导分子和兴奋剂)以及3条不同的途径。这些兴奋剂和引导分子之间的阳性作用表明其中包含了明朗可预知的机制，并且可以简单的运用于其它免疫原。进而，任何引导分子(在APC上有受体的)应该会产生相似的增强。虽然所述实施例共同的是皮下、腹膜内和鼻腔内；通过阴道、肌肉内、真皮内(没显示数据)，静脉内、局部、血管内和其它粘膜例如口和直肠途径预期也适合本发明的实施。利用病毒微粒和分裂的病毒颗粒也已经获得成功(没显示数据)。
通过各种途径接受安全的包含兴奋剂和引导分子的混合物可产生疫苗的增强，其中沉积物如明矾排除在外。这些新的混合物可能会更适合新微针和微研磨装置，其中明矾和其它大微粒是有限制的。
在其它实验室的早期工作显示沉积物和引导分子，或沉积物和兴奋剂的联合仅仅会比他们的成分产生“附加的增强”。这里，联合引导分子和兴奋剂会产生如实施例1所表明的协同增强。
在实施例2中，引导分子和兴奋剂的联合使得产生功能性的效价而没有毒性。由于效价协同性的增强，兴奋剂的浓度可以减少到安全水平，其中任何局部或系统的毒性征象消失。
最后，单独应用引导分子或特定兴奋剂的拥护者要求他们的试剂需要更少的免疫原。然而，实施例3清楚的表明商业上应用的α2-M和CpG DNA单独应用，在有40ng免疫原时不能诱导产生功能性的效价。相比之下，所述的联合可产生的效价足够单克隆抗体从第一次增强开始的一个月内应用。这种能和超低量免疫原一起起作用的能力提高了产生仅小量存在的临床目标的抗体的前景。
通过各种途径的沙眼衣原体的成功为相关的有机物例如肺炎衣原体和鹦鹉衣原体提供了清晰的策略。通过鼻施用衣原体和在阴道穹隆获得IgA而获得的穿粘膜结果是特别有价值的，因为鼻免疫接种需要较少的技术并且一次性使用物中不包括针。腹膜的成功使得腹腔中的恶性物是这里本发明佐剂混合物的主要候选。抗体机构和学院实验室可舍弃完全弗氏佐剂和其它毒性物质，它们典型的是用来产生研究和商业等级的抗体试剂。
例如，当产生单克隆抗体试剂时，医生也许希望选择一种佐剂混合物和途径，能够灌注脾脏，体内最大的B-细胞单一来源。如果目标是产生对于较浅粘膜抗原的保护，那么医生也许希望选择一种佐剂混合物，当其鼻输递时(经过粘膜)会产生阴道IgA效价。
这项发明将教导免疫学家期待每种兴奋剂和引导分子以各种效率起作用，这依赖于免疫原、免疫原的处理、输递途径和所追逐的免疫应答的类型。然而，效果最好的佐剂总是拥有兴奋剂和引导分子的特性。这项发明将商业上应用的材料放进了基于功能的有用类别中，并教导如何将每个类别的后选物配对而获得优良的结果。这里的实施例提供了关于免疫原纯度水平和用来认识结果的引导分子纯度的细节。多种类型的免疫原、引导分子和兴奋剂的浓度和建议的比例一起提供，从而获得理想的免疫应答。
在回顾了本发明中的实施例以后，文中那些技术人员将意识到增强的重要，同时也将明白单一一对引导分子/兴奋剂类型的佐剂不会对于所有的免疫原和应用产生最佳效果。
任何用来配制免疫原或疫苗组合物的传统方法也可以用来配制所述组合物。理想的是配制一种免疫原和引导分子符合物来增强所述组合物的有益作用。
如预期的所述疫苗或接种物将产生增强的保护和/或治疗。进而，所述组合物的应用提高了发现频率和用来诊断与治疗的抗体的质量，它们是由已经建立的单克隆、多克隆和重组技术产生的，但对于人类和动物无毒性副作用。
如预期的同时拥有兴奋剂和引导特性的佐剂也会提高局部输递。正如Mitragotri等报导的在这里所述佐剂大小范围内的分子可以应用低频超声诱导其穿过角质层(Mitragotri等1995 Science 269：850-853)。

Claims (40)

1.一种包括免疫原的免疫原性组合物，一种起引导分子作用的第一佐剂和一种起兴奋剂作用的第二佐剂，其特征在于，所述第一和第二佐剂是化学上不同的分子，所述免疫原和第一、第二佐剂存在的量足以产生增强的免疫应答，这是与免疫原仅和第一或第二佐剂之一产生的反应相比较而言。
2如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述兴奋剂是弱兴奋剂。
3.如权利要求1所述的免疫原性组合物，不包括会导致可见外部毒性或过敏症状的试剂。
4.如权利要求1所述的免疫原性组合物，适合鼻腔内、腹膜内，或皮下、真皮内、肌肉内、静脉内、血管内、阴道、直肠、口腔、局部或粘膜输递。
5.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述兴奋剂是皂苷或其包含皂苷成分的衍生物。
6.如权利要求5所述的免疫原性组合物，其中，所述皂苷是合成的。
7.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述兴奋剂是CpG DNA、核酸、细胞因子或趋化因子。
8.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述免疫原是抗原。
9.如权利要求8所述的免疫原性组合物，其中，所述抗原是核酸的表达产物。
10.如权利要求8所述的免疫原性组合物，其中，所述抗原是全细胞、蛋白质、蛋白质混合物、膜提取物、哺乳动物细胞、病毒或细菌。
11.如权利要求10所述的免疫原性组合物，其中，所述细菌是衣原体。
12.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其中，所述衣原体是沙眼、肺炎或鹦鹉衣原体。
13.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其中，所述衣原体是原生小体。
14.如权利要求13所述的免疫原性组合物，其中，所述沙眼原生小体是无活性的。
15.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述引导分子是α2-巨球蛋白(α2-M)或A2M的CD19结合片段。
16.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述引导分子是抗体或其免疫原特异片段。
17.如权利要求16所述的免疫原性组合物，其中，所述抗体或其片段对于抗原呈递细胞(APC)受体特异。
18.如权利要求16所述的免疫原性组合物，其中，所述抗体或其片段具有能够结合APC受体的表位。
19.如权利要求16所述的免疫原性组合物，其中，所述抗体或其免疫原特异片段对于免疫原是非特异的。
20.如权利要求16所述的免疫原性组合物，其中，所述抗体互补决定区(CDR)对于APC、免疫原或兴奋剂特异。
 21.如权利要求16所述的免疫原性组合物，其中，所述抗体CDR对于APC、免疫原或兴奋剂不是特异的。
22.如权利要求16所述的免疫原性组合物，其中，所述抗体对于兴奋剂特异。
23.如权利要求16所述的免疫原性组合物，其中，所述抗体对于兴奋剂不是特异的。
24.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述引导分子结合运铁蛋白、甘露糖(manose)、脱唾液酸糖蛋白受体或CD91。
25.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述引导分子是补体或热休克蛋白或其能够结合APC的片段。
26.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述引导分子是调理分子。
27.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述引导分子包含一种直接或间接和APC受体结合的分子。
28.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述引导分子和免疫原形成复合体。
29.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物是疫苗。
30.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物是冷冻、冻干、冷冻干燥或其它可复水的。
31.如权利要求1所述的免疫原性组合物，它基本上不含脂质体。
32.如权利要求1所述的免疫原性组合物，它基本上不含明矾。
33.如权利要求1所述的免疫原性组合物，还包括至少一种对于免疫原特异或非特异的抗体或其片段。
34.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述兴奋剂选自GM-CSF、IL-1-β、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、单磷酰脂A(MPL)、3-Q-去乙酰(desacyl)-4’-单磷酰脂A(3D-MLA)、IL-1β 163-171肽(Sclavo肽)、25-二羟维生素D3、降钙素基因调节肽、脱氢表雄酮(DHEA)、N-乙酰葡糖胺基-(P1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺(GMDP)，二甲基联十八烷基(dioctadecyla)或二硬脂基溴化铵(DDA)/L-脯氨酸锌、胞壁酰二肽(MDP)、甲酰化的-Met-Leu-Phe(fMLP)、N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(苏氨酰-MDP)、N-乙酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-(羟基-磷酰氧)乙酰胺单钠盐(MTP-PE)、Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3、Nac-Mur-L-Thr-D-异Gln-sn-二棕榈酰甘油、Nac-Mur-D-Ala-D-异Gln-sn-二棕榈酰甘油、1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺、4-氨基-辛-二甲基-2-乙氧甲基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-乙醇、N-乙酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-异Glu-L-Ala-二棕榈酰甘油(DTP-GDP)、N-乙酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-异Glu-L-Ala-二棕榈酰丙酰胺(DTP-DPP)、γ干扰素、7-烯丙基-8-氧鸟苷、聚-腺苷酸-聚-尿苷酸复合物、MIP-1a、MIP-3a、二丁基邻苯二甲酸酯、二丁基邻苯二甲酸酯的类似物和C5a。
35.一种通过在受试者的理想部位施用免疫原性组合物诱导免疫应答的方法，其中，所述免疫原性组合物包含：
免疫原，起引导分子作用的第一佐剂和起兴奋剂作用的第二佐剂，其中，所述第一和第二佐剂是化学上不同的分子，所述免疫原和第一、第二佐剂存在的量足以产生增强的免疫应答，这是与免疫原仅和第一或第二佐剂之一产生的反应相比较而言。
36.如权利要求35所述的方法，其中，所述免疫应答包括产生抗体。
37.如权利要求36所述的方法，还包括从受试者回收抗体的步骤。
38.如权利要求37所述的方法，其中，所述抗体的Ka值在104-1013mol/l之间。
39.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述兴奋剂有助于APC迁移。
40.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述兴奋剂有助于APC成熟。
41如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述兴奋剂吸引APC。
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