CN103083663A

CN103083663A - 一种免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法

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Publication number: CN103083663A
Application number: CN2013100429830A
Authority: CN
Inventors: 陈瑾; 郑其升; 侯立婷; 李鹏成; 于晓明; 徐海; 侯继波
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Nanjing Ji Sheng Chemical Technology Co., Ltd.
Priority date: 2013-02-04
Filing date: 2013-02-04
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2033-02-04
Also published as: CN103083663B

Abstract

本发明提供一种免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法,涉及生物制药领域。免疫增强剂含有0.1-21mg/mL的单磷酰脂质A、1.5-125mg/mL的胞壁酰二肽和0.7-4.5mg/mL的β-葡聚糖。一种含有所述免疫增强剂的灭活疫苗。一种所述灭活疫苗的制备方法，将免疫增强剂与灭活的抗原溶液混合，得到水相溶液；将水相溶液与油相溶液混合，得到灭活疫苗。本发明免疫增强剂由于其组分之间的协同效应，提高机体的免疫水平、对抗原的免疫应答，从而提高免疫后的抗体水平、缩短免疫窗口期，增强疫苗的免疫效果。本发明含有免疫增强剂的灭活疫苗，免疫后产生的抗体水平高，保护期长，免疫窗口期短。

Description

一种免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

口蹄疫（Foot and moush disease, FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV）引起的一种使偶蹄类动物发生的急性、热性高度接触性的传染病。目前世界上很多国家都有这种疾病的流行，对畜牧业造成极大地经济损失。而且该病的隐性感染可以使患病动物的生产能力下降，造成巨大的经济损失，我国将其列为第一类动物疾病。

目前，国际上在口蹄疫的防控上主要采取两种措施：紧急捕杀和免疫预防。在我国主要采取强制免疫预防，而对于急性爆发区采取封锁捕杀政策。

疫苗的免疫注射是我国目前预防口蹄疫的主要措施，但现在使用的口蹄疫疫苗主要以灭活疫苗为主，现有的灭活疫苗的缺点也很明显，在使用中存在疫苗免疫后抗体产生慢、抗体水平低、抗体持续期短及对变异毒株保护力差的缺点。兰兽研资料表明，口蹄疫灭活疫苗免疫后40天抗体才能达到有效保护水平，抗体有效期只能维持90天。冉多良等调查发现当前猪口蹄疫疫苗免疫30天后，抗体合格率仅在26%-60%之间。曹波等研究表明猪O型口蹄疫灭活疫苗免疫后3个月抗体效价水平明显下降，免疫保护率仅为67.77%；与孟国庆等研究结果一致（66.7%）；另外，李云岗等检测了3个厂家的O型疫苗抗体水平，结果免疫后3个月基本下降到免疫保护临界值。所以在实际应用中，需要对免疫动物进行多次免疫，这些缺点不但造成了严重的经济损失，也不利于口蹄疫的疫情防控。

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起猪的一种急性肠道传染病。该病由猪流行性腹泻病毒感染猪而引起，以发热、厌食、水样腹泻、呕吐、严重脱水、消化道黏膜发炎及糜烂和食欲下降为主要特征，俗称冬季拉稀病。该病己成为世界流行性的疾病，是各养猪国家导致仔猪早期死亡的重要疫病之一。给养猪业造成严重的经济损失。猪流行性腹泻的灭活疫苗为铝胶佐剂，抗体产生期长，窗口期长，在冬季给免疫后未产生抗体的易感猪健康带来极大的风险。

猪圆环病毒病是主要由猪2 型圆环病毒（PCV2）引起的免疫抑制性疾病，表现为断奶后仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）、繁殖障碍、仔猪心肌炎、增生性和坏死性肺炎、饲料报酬低、死亡率上升等。现有猪圆环病毒灭活苗，副反应较大，且需要免疫后3周加强免疫，给猪体带来严重的外界刺激。

发明内容

本发明的目的是提供一种免疫增强剂，能够显著提高免疫动物对抗原的免疫应答，提高抗体水平，从而提高疫苗的免疫效果，同时能够缩短免疫窗口期，延长保护期。

本发明的另一目的是提供含有所述免疫增强剂的灭活疫苗，其免疫后抗体水平高，免疫效果好，免疫窗口期短，保护期延长。

本发明的目的是提供上述灭活疫苗的制备方法，该方法简单方便，成本低。

一种免疫增强剂，所述免疫增强剂含有0.1-21mg/mL的单磷酰脂质A、1.5-125mg/mL的胞壁酰二肽和0.7-4.5mg /mL的β-葡聚糖。

所述免疫增强剂为油乳剂。

所述油乳剂的制备方法如下：

（1）配制水相溶液：将含有单磷酰脂质A、胞壁酰二肽和β-葡聚糖的母液与吐温-80混合，得到成水相溶液；

（2）配制油相溶液：将白油和司盘-80混合，得到油相溶液；

（3）将所述水相溶液与油相溶液混合乳化后，得所述兽用免疫增强剂。

一种含有所述免疫增强剂的灭活疫苗。

所述灭活疫苗还包括灭活的抗原溶液。

所述灭活疫苗还包括油相溶液。

所述免疫增强剂与灭活的抗原溶液组成了水相溶液，所述水相溶液与油相溶液的体积比为46:40-60；所述水相溶液中免疫增强剂与灭活的抗原溶液的体积比为1:1-3。

所述油相溶液为ISA206。

所述灭活的抗原溶液为灭活的猪O型口蹄疫病毒液、猪圆环病毒2型病毒液和猪流行性腹泻病毒液。

一种所述灭活疫苗的制备方法，将免疫增强剂与灭活的抗原溶液混合，得到水相溶液；将水相溶液与油相溶液混合，得到灭活疫苗。

本发明免疫增强剂由于其组分之间的协同效应，提高机体的免疫水平、对抗原的免疫应答，从而提高免疫后的抗体水平、缩短免疫窗口期，增强疫苗的免疫效果。

本发明含有免疫增强剂的灭活疫苗，免疫后产生的抗体水平高，保护期长，免疫窗口期短。

本发明含有免疫增强剂的灭活疫苗的制备方法简单，易操作，成本低。

附图说明：

图1表示仔猪免疫不同疫苗后平均液相阻断ELISA抗体滴度随时间的变化。

图2表示仔猪免疫不同疫苗后平均液相阻断ELISA抗体滴度随时间的变化。

图3：各组仔猪免疫后血清的平均中和抗体水平;其中PEDV灭活苗是猪流行性腹泻灭活疫苗的缩写，PEDV灭活苗B是猪流行性腹泻灭活疫苗B的缩写，PEDV灭活苗C是猪流行性腹泻灭活疫苗C的缩写，PEDV灭活苗D是猪流行性腹泻灭活疫苗D的缩写。

图4 免疫后21天各组仔猪的ELISA抗体水平；其中PCV2自制灭活苗是猪圆环病毒灭活疫苗的缩写，PCV2灭活苗B是猪圆环病毒灭活疫苗B的缩写、PCV2灭活苗C是猪圆环病毒灭活疫苗C的缩写、PCV2灭活苗D是猪圆环病毒灭活疫苗D的缩写。

具体实施方式：

单磷酰脂质A缩写为 MPL。

胞壁酰二肽缩写为MDP 。

MPL、MDP和β-葡聚糖均购自InvivoGen公司。

ISA206购自赛百克公司。

本发明，采用口蹄疫液相阻断ELISA试剂盒（兰州兽医研究所）检测液相阻断ELISA抗体滴度。

实施例1 免疫增强剂1对口蹄疫灭活疫苗免疫效力的影响

1、实验材料

灭活的猪O型口蹄疫病毒液（毒株为猪O型口蹄疫病毒缅甸98株），经二乙烯亚胺灭活，146s含量为4ug/mL。

6-7周龄健康易感仔猪，液相阻断ELISA抗体滴度≤1:8。

2、疫苗的配制：

免疫增强剂1含有2mg/mL的MPL、20mg/mL的MDP和0.4 mg/mL的β-葡聚糖，溶剂为蒸馏水。

将免疫增强剂1与灭活的猪O型口蹄疫病毒液按照体积比为1:3混合制备水相溶液。先将ISA206和水相溶液分别放置于室温，大约30分钟。将ISA206放入乳化罐中，在200转/分，将水相溶液放入乳化罐中，搅拌均匀；在2000转/分搅拌10分钟，得到疫苗1。其中水相溶液与ISA206的体积比为46:54。疫苗1中MPL浓度为0.23mg/mL，MDP浓度为2.3mg/mL，β-葡聚糖浓度为0.046mg/mL。

配制MPL水溶液，其中MPL浓度为2mg/mL。采用MPL水溶液替代免疫增强剂1，按照疫苗1的制备方法制备对照疫苗1-1.

配制MDP水溶液，其中MDP浓度为20mg/mL。采用MDP水溶液替代免疫增强剂1，按照疫苗1的制备方法制备对照疫苗1-2.

配制β-葡聚糖水溶液，其中β-葡聚糖浓度为0.4 mg/mL。采用β-葡聚糖水溶液替代免疫增强剂1，按照疫苗1的制备方法制备对照疫苗1-3.

配制MPL、β-葡聚糖水溶液，其中MPL浓度为2mg/mL，β-葡聚糖浓度为0.4mg/mL。采用MPL、β-葡聚糖水溶液替代免疫增强剂1，按照疫苗1的制备方法制备对照疫苗1-4.

配制MPL、MDP水溶液，其中MPL浓度为2mg/mL，MDP浓度为20mg/mL。采用MPL、MDP水溶液替代免疫增强剂1，按照疫苗1的制备方法制备对照疫苗1-5.

配制MDP、β-葡聚糖水溶液，其中MDP浓度为20mg/mL，β-葡聚糖浓度为0.4 mg/mL。采用MDP、β-葡聚糖水溶液替代免疫增强剂1，按照疫苗1的制备方法制备对照疫苗1-6.

用蒸馏水替代免疫增强剂1，按照疫苗1的制备方法制备对照疫苗1-7。

3、分组、免疫和抗体检测

将健康易感仔猪随机分组，每组10头，共8组。将疫苗1、对照疫苗1-1、对照疫苗1-2、对照疫苗1-3、对照疫苗1-4、对照疫苗1-5、对照疫苗1-6和对照疫苗1-7各免疫一组健康易感仔猪，免疫剂量为2 mL。

免疫后第14天和第28天，对各组健康易感仔猪采血分离血清，检测液相阻断ELISA抗体滴度。当液相阻断ELISA抗体滴度大于等于2⁶为抗体合格。

免疫后第14天和第28天抗体合格率如表1所示。

表1 各组仔猪免疫后第14天和第28天抗体合格率（抗体合格头数/免疫总头数）

仔猪的组别	免疫的疫苗	免疫后14d	免疫后28d
				1	疫苗1	7/10	10/10
2	对照疫苗1-1	1/10	3/10
				3	对照疫苗1-2	2/10	2/10
4	对照疫苗1-3	2/10	3/10
				5	对照疫苗1-4	3/10	4/10
6	对照疫苗1-5	1/10	3/10
				7	对照疫苗1-6	2/10	3/10
8	对照疫苗1-7	2/10	4/10

从表1可以看出，免疫对照疫苗1-7的仔猪，第14天和第28天抗体合格率合格率仅为2/10和4/10；而免疫了疫苗1的仔猪，第14天和第28天抗体合格率很高，分别为7/10和10/10。该结果说明，免疫增强剂1能显著提高仔猪对抗原的免疫应答，提高抗体水平，从而提高疫苗的免疫效果。对照疫苗1-1、对照疫苗1-2和对照疫苗1-3与对照疫苗1-7相比，分别添加了MPL、MDP和β-葡聚糖，但是并没有提高抗体合格率；对照疫苗1-4、对照疫苗1-5和对照疫苗1-6与对照疫苗1-7相比，各添加了两种成分，但是同样，也没有提高抗体水平，提高免疫效果。由于免疫增强剂1中MPL、MDP和β-葡聚糖的协同效应，能够显著提高仔猪对抗原的免疫应答，提高抗体水平和抗体合格率，从而提高疫苗的免疫效果。

实施例2 免疫增强剂2对口蹄疫灭活疫苗免疫效力的影响

1、实验材料

灭活的O型猪口蹄疫病毒液（毒株为猪O型口蹄疫病毒缅甸98株），经二乙烯亚胺灭活，146s含量为5.87ug/mL。

6-7周龄健康易感仔猪，液相阻断ELISA抗体滴度≤1:8。

2、疫苗的配制：

配制免疫增强剂2。免疫增强剂2含有2mg/mL的MPL、40mg/mL的MDP和0.4 mg/mL的β-葡聚糖，溶剂为蒸馏水。

将免疫增强剂2与灭活的猪口蹄疫病毒液按照体积比1:1混合，得到水相溶液。先将ISA206和水相溶液分别放置于室温，大约30分钟。将ISA206放入乳化罐中，在200转/分，将水相溶液放入乳化罐中，搅拌均匀，在2000转/分搅拌10分钟，得到疫苗2。其中水相溶液与ISA206的体积比为46:46。疫苗2中MPL浓度为0.5mg/mL，MDP浓度为10mg/mL，β-葡聚糖浓度为0.1mg/mL。

配制MPL水溶液，其中MPL浓度为2mg/mL。采用MPL水溶液替代免疫增强剂2，按照疫苗2的制备方法制备对照疫苗2-1.

配制MDP水溶液，其中MDP浓度为40mg/mL。采用MDP水溶液替代免疫增强剂2，按照疫苗2的制备方法制备对照疫苗2-2.

配制β-葡聚糖水溶液，其中β-葡聚糖浓度为400 ug/mL。采用β-葡聚糖水溶液替代免疫增强剂2，按照疫苗2的制备方法制备对照疫苗2-3.

配制MPL、β-葡聚糖水溶液，其中MPL浓度为2mg/mL，β-葡聚糖浓度为400 ug/mL。采用MPL、β-葡聚糖水溶液替代免疫增强剂2，按照疫苗2的制备方法制备对照疫苗2-4.

配制MPL、MDP水溶液，其中MPL浓度为2mg/mL，MDP浓度为40mg/mL。采用MPL、MDP水溶液替代免疫增强剂2，按照疫苗2的制备方法制备对照疫苗2-5.

配制MDP、β-葡聚糖水溶液，其中MDP浓度为40mg/mL，β-葡聚糖浓度为400 ug/mL。采用MDP、β-葡聚糖水溶液替代免疫增强剂2，按照疫苗2的制备方法制备对照疫苗2-6.

用蒸馏水替代免疫增强剂2，按照疫苗2的制备方法制备对照疫苗2-7。

3、分组、免疫和抗体持续期监测

将健康易感仔猪随机分组，每组10头，共8组。将疫苗2、对照疫苗2-1、对照疫苗2-2、对照疫苗2-3、对照疫苗2-4、对照疫苗2-5、对照疫苗2-6和对照疫苗2-7各免疫一组健康易感仔猪，免疫剂量为2 mL。

免疫后第14天、28天、60天、90天、120天和150天，对各组健康易感仔猪采血分离血清，检测液相阻断ELISA抗体滴度。当液相阻断ELISA抗体滴度大于等于2⁶抗体为合格。

免疫后，计算各组仔猪不同时间的平均抗体水平，具体结果如图1所示。从图1可以看出，疫苗2免疫后的仔猪在14天-150天内平均液相阻断抗体滴度均大于2⁷，显著高于各对照疫苗；同时疫苗2免疫后的窗口期很短。从该结果，可以看出免疫增强剂2由于其各组分之间的协同效应，能够显著提高仔猪对抗原的免疫应答，提高抗体水平，缩短免疫窗口期，从而提高疫苗的免疫效果。

计算各组仔猪免疫后不同时间的抗体合格率，具体结果见表2.从表2可以看出，采用免疫增强剂2配制的疫苗2，免疫仔猪后14-150天内，所有被免仔猪的液相阻断抗体滴度均合格。免疫各对照疫苗的仔猪，在14-150天内，抗体合格率均很低。该结果说明，MPL、MDP和β-葡聚糖中的任意一种或两种的混合物添加到疫苗中，均不能提高仔猪对抗原的免疫应答，提高抗体水平，提高抗体合格率。但是，免疫增强剂2由于其各组分之间的协同效应，能够显著提高仔猪对抗原的免疫应答，提高抗体水平，提高抗体合格率。

表2 各组仔猪免疫后不同时间的抗体合格率（合格头数/免疫总头数）

仔猪组别

接种的疫苗

14d

28d

60d

90d

120d

150d

1

疫苗2

10/10

9/10

2

对照疫苗2-1

0/10

2/10

3/10

2/10

3

对照疫苗2-2

1/10

2/10

4

对照疫苗2-3.

1/10

3/10

2/10

1/10

5

对照疫苗2-4

2/10

3/10

2/10

6

对照疫苗2-5

2/10

1/10

7

对照疫苗2-6.

1/10

3/10

2/10

8

对照疫苗2-7

2/10

3/10

2/10

实施例3 免疫增强剂3对口蹄疫灭活疫苗免疫效力的影响

1、实验材料

灭活的猪O型口蹄疫病毒液（毒株为猪O型口蹄疫病毒缅甸98株），经二乙烯亚胺灭活，146s含量为5.87ug/mL。

6-7周龄健康易感仔猪，采用口蹄疫液相阻断ELISA试剂盒（兰州兽医研究所）检测得到液相阻断ELISA抗体滴度≤1:8。

2、疫苗的配制：

免疫增强剂3含有0.1 mg/mL的MPL、2 mg/mL的MDP和0.1 mg/mL的β-葡聚糖，溶剂为蒸馏水。

将免疫增强剂3与灭活的猪口蹄疫病毒液按照体积比为1:1混合，得到水相溶液。先将ISA206和水相溶液分别放置于室温，大约30分钟。将ISA206放入乳化罐中，在200转/分，将水相溶液放入乳化罐中，搅拌均匀，在2000转/分搅拌10分钟，得到疫苗3。其中水相溶液与ISA206的体积比为46:46。

配制MPL水溶液，其中MPL浓度为0.1mg/mL。用MPL水溶液替代免疫增强剂3，按照疫苗3的制备方法制备对照疫苗3-1.

配制MDP水溶液，其中MDP浓度为2mg/mL。将MDP水溶液替代免疫增强剂3，按照疫苗3的制备方法制备对照疫苗3-2.

配制β-葡聚糖水溶液：其中β-葡聚糖浓度为100 ug/mL。将β-葡聚糖水溶液替代免疫增强剂3，按照疫苗3的制备方法制备对照疫苗3-3.

用蒸馏水替代免疫增强剂3，按照疫苗3的制备方法制备对照疫苗3-4.

3、免疫和分组

将健康易感仔猪随机分组，每组10头，共5组。将疫苗3、对照疫苗3-1、对照疫苗3-2、对照疫苗3-3和对照疫苗3-4各免疫一组健康易感仔猪，免疫剂量为2 mL。

免疫后第14天、28天、60天、90天、120天和150天，对各组健康易感仔猪采血分离血清，检测液相阻断ELISA抗体滴度。当液相阻断ELISA抗体滴度大于等于2⁶为抗体合格。

免疫后，计算各组仔猪不同时间的平均抗体水平，具体结果如图2所示。从图2可以看出，疫苗3免疫后的仔猪在14天-150天内平均液相阻断ELISA抗体滴度均大于2⁷，显著高于各对照疫苗，并且缩短了疫苗免疫后的窗口期。从该结果，可以看出免疫增强剂3由于其各组分之间的协同效应，能够显著提高仔猪对抗原的免疫应答，提高抗体水平，从而提高疫苗的免疫效果。

计算各组仔猪免疫后不同时间的抗体合格率，具体结果见表3.从表3可以看出，采用免疫增强剂3配制的疫苗3，免疫仔猪后14-150天内，所有被免仔猪抗体均合格。免疫各对照疫苗的仔猪，在14-150天内，抗体合格率均很低。该结果说明，MPL、MDP和β-葡聚糖中的任意一种或两种的混合物添加到疫苗中，均不能提高仔猪对抗原的免疫应答，提高抗体水平，提高抗体合格率。但是，免疫增强剂3由于其各组分之间的协同效应，能够显著提高仔猪对抗原的免疫应答，提高抗体水平，提高抗体合格率，缩短免疫窗口期。

表3：疫苗免疫后不同时间各组抗体合格率（合格头数/免疫总头数）

组别

接种疫苗

免疫后14d

免疫后28d

免疫后60d

免疫后90d

免疫后120d

免疫后150d

1

疫苗3

9/10

10/10

9/10

2

对照疫苗3-1

1/10

2/10

3/10

2/10

1/10

3

对照疫苗3-2

2/10

4

对照疫苗3-3

2/10

3/10

2/10

5

对照疫苗3-4

2/10

3/10

2/10

实施例4疫苗2的安全性检测

1、实验材料

6-7周龄健康易感仔猪，液相阻断ELISA抗体滴度≤1:8。

2、分组、免疫和抽检

将健康易感仔猪随机分组，每组10头，共6组。

用实施例2中制备的疫苗2和对照疫苗2-7来评价本发明免疫增强剂的安全性。各组仔猪免疫情况见表4.

表4 各组仔猪的免疫方法

仔猪组别	免疫方法
		一组	免疫2mL疫苗2
二组	免疫4mL疫苗2
		三组	免疫2ml对照疫苗2-7
四组	免疫2次，每次免疫2mL疫苗2，两次免疫之间间隔14天
		五组	免疫2次，每次免疫2mL对照疫苗2-7，两次免疫之间间隔14天
六组	不免

其中一组、二组、三组和六组仔猪，均在免疫后第14天，从各组随机抽出5只剖杀，观察疫苗吸收情况；在免疫后第28天，取剩余的仔猪全部剖杀，观察疫苗吸收情况。

四组和五组仔猪，在第二次免疫后第14天，从各组中随机抽出5只剖杀，观察疫苗吸收情况；在二次免疫后第28天，取剩余的仔猪全部剖杀，观察疫苗吸收情况。

免疫后连续观察28天，记录是否出现任何发病症状。

结果：

连续观察28天，所有试验猪采食正常，无任何异常情况。

一组、二组和三组仔猪疫苗吸收情况：在免疫后第14天，一组、二组和三组仔猪在疫苗注射部位含有一些淡黄色米粒或粟粒大小类似脂肪样颗粒物。六组仔猪无此淡黄色米粒大小类似脂肪样颗粒物。在免疫后第28天，二组仔猪中有2头在注射部位含有淡黄色粟粒大小类似脂肪样颗粒物，其余均与六组仔猪无异。

四组和五组仔猪疫苗吸收情况：在第二次免疫后第14天，四组和五组仔猪在疫苗注射部位含有少量米粒大小乳白色颗粒，部分含有米粒大小淡黄色类似脂肪样颗粒物。在免疫后第28天，四组和五组中个别仔猪有米粒大小淡黄色类似脂肪样颗粒物。

安全性检测实验结果说明，本发明免疫增强剂不影响疫苗的正常吸收，对猪是安全的。

实施例5配制油乳剂型的免疫增强剂

配制免疫增强剂B：单磷酰脂质A浓度为0.78mg/mL，胞壁酰二肽浓度为1.56 mg/mL,β-葡聚糖为0.78mg/mL。

配制免疫增强剂C：单磷酰脂质A浓度为3.12mg/mL，胞壁酰二肽浓度为15.6mg/mL，β-葡聚糖为1.56mg/mL。

配制免疫增强剂D：单磷酰脂质A浓度为20.8mg/mL，胞壁酰二肽浓度为125mg/mLβ-葡聚糖为4.17mg/mL

配制方法如下：

（1）配制水相溶液：将单磷酰脂质A、胞壁酰二肽和β-葡聚糖溶于水，得到母液，将母液与吐温-80按照体积比为96:4混合，得到水相溶液；

（2）配制油相溶液：将白油和司盘-80按照体积比为96:4混合，得到油相溶液。

（3）将水相溶液与油相溶液按照体积比为1:2混合乳化后，得油乳剂型的免疫增强剂。

实施例6免疫增强剂对猪流行性腹泻灭活疫苗的影响

1.实验材料

灭活的猪流行性腹泻病毒液（毒株：PEDV NJ株），灭活前毒价5x10⁷TCID₅₀/mL。将灭活的猪流行性腹泻病毒液作为水相溶液。将白油佐剂和水相溶液按照体积2:1混合均匀后乳化制得猪流行性腹泻灭活疫苗。

将免疫增强剂B、C和D分别与猪流行性腹泻灭活疫苗按照体积比为1:9混合均匀，获得猪流行性腹泻灭活疫苗B、C和D。

2. 分组、免疫及检测

将健康易感仔猪随机分成五组，每组20头。将猪流行性腹泻灭活疫苗B、猪流行性腹泻灭活疫苗C、猪流行性腹泻灭活疫苗D和猪流行性腹泻灭活疫苗各免疫一组仔猪，免疫剂量为2mL/头，免疫方法为肌肉注射。留一组仔猪不免作为空白对照。

免疫后14、28、60、74天采血，超净台内无菌分离血清，检测血清的中和抗体（中和抗体滴度大于1:32为抗体阳性）。计算各组仔猪血清的中和抗体平均滴度，具体结果见图3.从图3可以看出，猪流行性腹泻灭活疫苗B、C和D免疫后14天，中和抗体的平均滴度就合格，随后一直升高直到74天，说明免疫增强剂B、C和D能够缩短灭活疫苗的免疫窗口期，延长保护期，提高抗体水平。而猪流行性腹泻灭活疫苗免疫后60天，中和抗体平均滴度才合格，到72天的时候又下降到合格抗体水平之下。

3.安全性实验

分组和免疫：将6-7周龄健康易感仔猪分为四组，每组10头。其中一组每头免疫2ml猪流行性腹泻灭活疫苗D；二组免疫4ml猪流行性腹泻灭活疫苗D；三组免疫两次猪流行性腹泻灭活疫苗D，两次之间间隔14天，免疫剂量为每次2ml/头。四组不免作为空白对照。

（1）观察方法

其中一组、二组、四组仔猪，均在免疫后第14天，从各组中随机抽出5只剖杀，观察疫苗吸收情况；在免疫后第28天，取剩余的仔猪全部剖杀，观察疫苗吸收情况。

三组仔猪，在第二次免疫结束后，第14天从各组中随机抽出5只剖杀，观察疫苗吸收情况；免疫后第28天，取剩余的仔猪全部剖杀，观察疫苗吸收情况。

免疫后连续观察28天，记录是否出现任何发病症状。

(2)结果

观察的结果如表5所示

表5 猪流行性腹泻灭活疫苗D吸收情况

Figure 2013100429830100002DEST_PATH_IMAGE001

从表中可以看出采用本发明免疫增强剂制备的猪流行性腹泻灭活疫苗对猪是安全的。

实施例7免疫增强剂对猪圆环灭活疫苗影响

1.实验材料

试验动物为3-4周龄健康易感仔猪。

猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒购自武汉科前动物生物制品有限公司，用于检测血清的ELISA抗体。

猪圆环病毒2型灭活病毒液（毒株PCV2 NJ ），灭活前毒价10^6.5TCID₅₀/mL。先将ISA206和猪圆环病毒2型灭活病毒液，分别放置于室温，大约30分钟。将ISA206放入乳化罐中，在200转/分，将猪圆环病毒2型灭活病毒液放入乳化罐中，搅拌均匀；在2000转/分搅拌10分钟，得到猪圆环病毒灭活疫苗。其中猪圆环病毒2型灭活病毒液与ISA206的体积比为46:54。

将免疫增强剂B、C和D分别与猪圆环病毒灭活疫苗按照体积比为1:9混合均匀，获得猪圆环病毒灭活疫苗B、C和D。

2. 分组、免疫和检测

将健康易感仔猪随机分成五组，每组10头。将猪圆环病毒灭活疫苗B、猪圆环病毒灭活疫苗C、猪圆环病毒灭活疫苗D和猪圆环病毒灭活疫苗各免疫一组仔猪，免疫剂量为2mL/头，免疫方法为颈部肌肉注射。留一组仔猪不免作为空白对照。

将各组仔猪，免疫后21天采血分离血清，检测血清的ELISA抗体。当样品OD₆₃₀值＞0.42，判为阳性。计算各组仔猪免疫后的平均抗体水平，具体结果见图4.从图4可以看出，仔猪免疫猪圆环病毒灭活疫苗B、C和D后21天，OD₆₃₀值均达到阳性值之上，而免疫猪圆环病毒灭活疫苗的仔猪血清ELISA抗体没有达到阳性。可见免疫增强剂B、C和D具有明显的免疫增强效果，缩短免疫窗口期，提高血清抗体水平。而且，只需要免疫一次，即可达到阳性，降低生产成本，减少对猪体的应激，提高生产效率。

3.安全性实验

分组和免疫：将6-7周龄健康易感仔猪分为四组，每组10头。其中一组每头免疫2ml猪圆环病毒灭活疫苗D；二组免疫4ml猪圆环病毒灭活疫苗D；三组免疫两次猪圆环病毒灭活疫苗D，两次之间间隔14天，免疫剂量为每次2ml/头。四组不免作为空白对照。

（2）观察方法

免疫后连续观察28天，记录是否出现任何发病症状。

(2)结果

观察的结果如表6所示

表6 猪圆环病毒灭活疫苗D吸收情况

从表中可以看出采用本发明免疫增强剂制备的猪圆环病毒灭活疫苗对猪是安全的。

Claims

1.一种免疫增强剂，其特征在于：所述免疫增强剂含有0.1-21mg/mL的单磷酰脂质A、1.5-125mg/mL的胞壁酰二肽和0.7-4.5mg /mL的β-葡聚糖。

2.根据权利要求1所述免疫增强剂，其特征在于所述免疫增强剂为油乳剂。

3.根据权利要求2所述免疫增强剂，其特征在于所述油乳剂的制备方法如下：

（2）配制油相溶液：将白油和司盘-80混合，得到油相溶液；

（3）将所述水相溶液与油相溶液混合乳化后，得所述免疫增强剂。

4.一种含有权利要求1所述免疫增强剂的灭活疫苗。

5.根据权利要求4所述灭活疫苗，其特征在于：所述灭活疫苗还包括灭活的抗原溶液。

6.根据权利要求5所述灭活疫苗，其特征在于：所述灭活疫苗还包括油相溶液。

7.根据权利要求6所述灭活疫苗，其特征在于：所述免疫增强剂与灭活的抗原溶液组成了水相溶液，所述水相溶液与油相溶液的体积比为46:40-60；所述水相溶液中免疫增强剂与灭活的抗原溶液的体积比为1:1-3。

8.根据权利要求7所述灭活疫苗，其特征在于：所述油相溶液为ISA206。

9.根据权利要求8所述灭活疫苗，其特征在于：所述灭活的抗原溶液为灭活的猪O型口蹄疫病毒液、猪圆环病毒2型病毒液和猪流行性腹泻病毒液。

10.一种权利要求5-8之一所述灭活疫苗的制备方法，其特征在于：将免疫增强剂与灭活的抗原溶液混合，得到水相溶液；将水相溶液与油相溶液混合，得到灭活疫苗。