CN112057614B - 一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫增强剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及灭活疫苗技术领域，公开了一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫增强剂及其制备方法，所述增强剂包括0.15‑1.2mg/mL的单磷酰脂质A、0.5‑0.9mg/mL的β‑葡聚糖和10‑50mg/mL的猪源细胞质多肽；按质量份数所述单磷酰脂质A为6‑12份、β‑葡聚糖7‑11份和猪源细胞质多肽10‑18份；所述制备方法为将含有单磷酰脂质A、猪源细胞质多肽和β‑葡聚糖的混合液与吐温‑80混合，得到水相溶液；然后将白油和司盘‑80混合，得到油相溶液；最后将水相溶液与油相溶液混合乳化后，得到灭活疫苗免疫增强剂。本发明能够提高猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的免疫时间，并提高抗体水平。

Description

一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫增强剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及灭活疫苗技术领域，尤其涉及一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫增强剂及其制备方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(简称PRRS)又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(简称PRRSV)引起的，以妊娠母猪发生早产、流产、产死胎、弱仔和木乃伊胎，仔猪和育肥猪发生呼吸道症状的疾病。PRRS难以有效的防制，首先是PRRSV以肺巨噬细胞为靶细胞，具有抗体依赖性增强作用(ADE)造成了一定的免疫抑制，其次是PRRSV不断的发生着变异，并且PRRS没有有效的治疗药物，当前，疫苗免疫被认为是预防和控制PRRS的重要手段。同时与其他控制手段相比，疫苗免疫也是各种规模猪场(大、中、小型猪场)的最经济的选择。猪繁殖与呼吸综合征疫苗广泛应用以来，该病的传播和蔓延势头有所减缓。目前我国用于预防猪蓝耳病的疫苗共有三种类型：猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(包括进口美洲经典毒株和国内经典毒株)、高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗和猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗。
目前的三种类型疫苗各有优点，比如活疫苗相对于灭活疫苗，弱毒的活疫苗诱导的免疫反应持续时间长且更有效，能激活细胞免疫和体液免疫；灭活疫苗相对于活疫苗，灭活疫苗的主要优点是安全，疫苗株不会传染给其他猪只。但是现有灭活疫苗的缺点很明显，主要体现在抗体产生慢、免疫期短、抗原谱窄，抗体水平较低、不能诱导产生粘膜抗体等；这些灭活疫苗的缺点严重的影响了灭活疫苗的大面积推广使用，因此需要一种能够提高抗原免疫增强作用免疫增强剂来弥补目前灭活疫苗中的缺陷。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫增强剂及其制备方法，能够提高猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的免疫时间，并提高抗体水平。
本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫增强剂，所述增强剂包括0.15-1.2mg/mL的单磷酰脂质A、0.5-0.9mg/mL的β-葡聚糖和10-50mg/mL的猪源细胞质多肽；按质量份数所述单磷酰脂质A为6-12份、β-葡聚糖7-11份和猪源细胞质多肽10-18份。
单磷酰脂质A作为佐剂加入，通过在感染前产生病原体特异性免疫应答，通常，单独使用疫苗抗原进行免疫接种并不能够诱导稳健或持久的免疫反应，从而可能导致抵抗感染的保护性免疫失败，因此，单磷酰脂质A佐剂增强免疫后的细胞或体液免疫应答。β-葡聚糖能够活化巨噬细胞、嗜中性白血球等，因此能提高白细胞素、细胞分裂素和特殊抗体的含量，全面刺激猪的机体免疫系统。猪源细胞质多肽，其通过病毒特异性刺激，产生免疫增强成分，作为添加物特异性提高抗原免疫增强作用。
进一步，所述免疫增强剂包括0.55-75mg/mL的单磷酰脂质A、0.7-0.8mg/mL的β-葡聚糖和20-30mg/mL的猪源细胞质多肽；按质量份数所述单磷酰脂质A为8-10份、β-葡聚糖8-10份和猪源细胞质多肽12-15份。
进一步，所述免疫增强剂包括0.65mg/mL的单磷酰脂质A、0.75mg/mL的β-葡聚糖和25mg/mL的猪源细胞质多肽；按质量份数所述单磷酰脂质A为9份、β-葡聚糖9份和猪源细胞质多肽14份。
进一步，所述免疫增强剂为油乳剂。
本发明还提供了一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫增强剂的制备方法，将含有单磷酰脂质A、猪源细胞质多肽和β-葡聚糖的混合液与吐温-80混合，得到水相溶液；然后将白油和司盘-80混合，得到油相溶液；最后将水相溶液与油相溶液混合乳化后，得到灭活疫苗免疫增强剂。
进一步，所述吐温-80的体积为单磷酰脂质A、猪源细胞质多肽和β-葡聚糖的混合液体积的1.5-2倍，所述白油和司盘-80的体积比为1:3，所述白油和司盘-80油相溶液的体积与吐温-80的体积相等。
进一步，所述猪源细胞质多肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、取新鲜的猪源性组织使用去离子水清洗、分割，加入去离子水高速绞碎成浆液；
S2、在浆液中加入总质量1-2％的氯化钠，加热到80-100℃下溶解，然后进行抽滤，收集滤液，得到第一滤液和滤渣；
S3、向第一滤液中加入第一滤液总重量2-3％的2709碱性蛋白酶和第一滤液总重量1-2％猪源细胞质多肽提取剂，在温度为55-65℃，pH为8-9的条件下间歇搅拌，酶解提取5-7h，得到第一酶解提取液；
S4、在滤渣中加入与滤渣等质量的去离子水，然后加入2709碱性蛋白酶调节混合液的pH为8-9，再加入总质量4-6％的猪源细胞质多肽提取剂，将其控制在45-50℃的温度下酶解提取5-7h，得到第二酶解提取液；
S5、将第一酶解提取液和第二酶解提取液混合，在45-50℃的温度下酶解提取1-2h，然后抽滤，收集滤液，得到第二滤液；
S6、在第二滤液中加入第二滤液质量2-3％的活性炭，搅拌反应50-70min，滤出活性炭，调节滤液pH为7，先经蒸发浓缩，再经过干燥后得到猪源细胞质多肽。
进一步，所述猪源细胞质多肽提取剂，按体积份数，包括磷酸溶液1-2份、乙腈溶液2-3份、甲醇溶液0.5-0.8份和三氟乙酸0.2-0.6份组成的混合溶液。将后的经磷酸、乙腈溶液处理去除磷脂、脂肪和高峰度蛋白，后经疏水性固相萃取柱去除小分子干扰杂质，经溶液三氟乙酸与乙腈洗脱最终得到目标多肽。
进一步，所述猪源细胞质多肽提取剂，按体积份数，包括磷酸溶液1.5份、乙腈溶液2.5份、甲醇溶液0.65份和三氟乙酸0.4份组成的混合溶液。
本发明的有益效果：
1、本发明的单磷酰脂质A通过在感染前产生病原体特异性免疫应答；β-葡聚糖能够活化巨噬细胞、嗜中性白血球等，因此能提高白细胞素、细胞分裂素和特殊抗体的含量，全面刺激猪的机体免疫系统；猪源细胞质多肽，其通过病毒特异性刺激，产生免疫增强成分，作为添加物特异性提高抗原免疫增强作用。增强剂可与灭活疫苗组分之间的协同效应，提高机体的免疫水平、对抗原的免疫应答，从而提高免疫后的抗体水平、缩短免疫窗口期，增强疫苗的免疫效果。
2、本发明的免疫增强剂通过2709碱性蛋白酶和源细胞质多肽提取剂提取猪源细胞中的多肽，提取过程中无废水、废渣产生，制备方法简单，易操作，成本低。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明进行详细说明：
实施例1、
本实施例为第一种猪源细胞质多肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、取新鲜的猪源性组织使用去离子水清洗、分割，加入去离子水高速绞碎成浆液；
S2、在浆液中加入总质量1％的氯化钠，加热到80℃下溶解，然后进行抽滤，收集滤液，得到第一滤液和滤渣；
S3、向第一滤液中加入第一滤液总重量2％的2709碱性蛋白酶和第一滤液总重量1％猪源细胞质多肽提取剂，在温度为55℃，pH为8的条件下间歇搅拌，酶解提取5h，得到第一酶解提取液；其中本实施例的猪源细胞质多肽提取剂，按体积份数包括磷酸溶液1L、乙腈溶液2L、甲醇溶液0.5L和三氟乙酸0.2L组成的混合溶液；
S4、在滤渣中加入与滤渣等质量的去离子水，然后加入2709碱性蛋白酶调节混合液的pH为8，再加入总质量4％的猪源细胞质多肽提取剂，将其控制在45℃的温度下酶解提取5h，得到第二酶解提取液；
S5、将第一酶解提取液和第二酶解提取液混合，在45℃的温度下酶解提取1h，然后抽滤，收集滤液，得到第二滤液；
S6、在第二滤液中加入第二滤液质量2％的活性炭，搅拌反应50min，滤出活性炭，调节滤液pH为7，先经蒸发浓缩，再经过干燥后得到猪源细胞质多肽。
实施例2、
本实施例为第二种猪源细胞质多肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、取新鲜的猪源性组织使用去离子水清洗、分割，加入去离子水高速绞碎成浆液；
S2、在浆液中加入总质量1.5％的氯化钠，加热到90℃下溶解，然后进行抽滤，收集滤液，得到第一滤液和滤渣；
S3、向第一滤液中加入第一滤液总重量2.5％的2709碱性蛋白酶和第一滤液总重量1.5％猪源细胞质多肽提取剂，在温度为60℃，pH为8.5的条件下间歇搅拌，酶解提取6h，得到第一酶解提取液；其中本实施例的猪源细胞质多肽提取剂，按体积份数包括磷酸溶液1.5L、乙腈溶液2.5L、甲醇溶液0.65L和三氟乙酸0.4L组成的混合溶液；
S4、在滤渣中加入与滤渣等质量的去离子水，然后加入2709碱性蛋白酶调节混合液的pH为8.5，再加入总质量5％的猪源细胞质多肽提取剂，将其控制在47℃的温度下酶解提取6h，得到第二酶解提取液；
S5、将第一酶解提取液和第二酶解提取液混合，在47℃的温度下酶解提取1.5h，然后抽滤，收集滤液，得到第二滤液；
S6、在第二滤液中加入第二滤液质量2.5％的活性炭，搅拌反应60min，滤出活性炭，调节滤液pH为7，先经蒸发浓缩，再经过干燥后得到猪源细胞质多肽。
实施例3、
本实施例为第三种猪源细胞质多肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、取新鲜的猪源性组织使用去离子水清洗、分割，加入去离子水高速绞碎成浆液；
S2、在浆液中加入总质量2％的氯化钠，加热到100℃下溶解，然后进行抽滤，收集滤液，得到第一滤液和滤渣；
S3、向第一滤液中加入第一滤液总重量3％的2709碱性蛋白酶和第一滤液总重量2％猪源细胞质多肽提取剂，在温度为65℃，pH为9的条件下间歇搅拌，酶解提取7h，得到第一酶解提取液；其中本实施例的猪源细胞质多肽提取剂，按体积份数包括磷酸溶液2L、乙腈溶液3L、甲醇溶液0.8L和三氟乙酸0.6L组成的混合溶液；
S4、在滤渣中加入与滤渣等质量的去离子水，然后加入2709碱性蛋白酶调节混合液的pH为9，再加入总质量6％的猪源细胞质多肽提取剂，将其控制在50℃的温度下酶解提取7h，得到第二酶解提取液；
S5、将第一酶解提取液和第二酶解提取液混合，在50℃的温度下酶解提取2h，然后抽滤，收集滤液，得到第二滤液；
S6、在第二滤液中加入第二滤液质量3％的活性炭，搅拌反应70min，滤出活性炭，调节滤液pH为7，先经蒸发浓缩，再经过干燥后得到猪源细胞质多肽。
实施例4、
本实施例的一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫增强剂的制备方法，将含有单磷酰脂质A、实施例1中制备的猪源细胞质多肽和β-葡聚糖的混合液与吐温-80混合，得到水相溶液；然后将白油和司盘-80混合，得到油相溶液；最后将水相溶液与油相溶液混合乳化后，得到灭活疫苗免疫增强剂。
其中所述吐温-80的体积为单磷酰脂质A、猪源细胞质多肽和β-葡聚糖的混合液体积的1.5倍，所述白油和司盘-80的体积比为1:3，所述白油和司盘-80油相溶液的体积与吐温-80的体积相等。
其中增强剂包括0.15mg/mL的单磷酰脂质A、0.5mg/mL的β-葡聚糖和10mg/mL的猪源细胞质多肽；按质量份数所述单磷酰脂质A为6g、β-葡聚糖7g和猪源细胞质多肽10g。
实施例5、
本实施例的一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫增强剂的制备方法，将含有单磷酰脂质A、实施例2中制备的猪源细胞质多肽和β-葡聚糖的混合液与吐温-80混合，得到水相溶液；然后将白油和司盘-80混合，得到油相溶液；最后将水相溶液与油相溶液混合乳化后，得到灭活疫苗免疫增强剂。
其中所述吐温-80的体积为单磷酰脂质A、猪源细胞质多肽和β-葡聚糖的混合液体积的1.7倍，所述白油和司盘-80的体积比为1:3，所述白油和司盘-80油相溶液的体积与吐温-80的体积相等。
其中增强剂包括0.65mg/mL的单磷酰脂质A、0.75mg/mL的β-葡聚糖和25mg/mL的猪源细胞质多肽；按质量份数所述单磷酰脂质A为9g、β-葡聚糖9g和猪源细胞质多肽14g。
实施例6、
本实施例的一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫增强剂的制备方法，将含有单磷酰脂质A、实施例3中制备的猪源细胞质多肽和β-葡聚糖的混合液与吐温-80混合，得到水相溶液；然后将白油和司盘-80混合，得到油相溶液；最后将水相溶液与油相溶液混合乳化后，得到灭活疫苗免疫增强剂。
其中所述吐温-80的体积为单磷酰脂质A、猪源细胞质多肽和β-葡聚糖的混合液体积的2倍，所述白油和司盘-80的体积比为1:3，所述白油和司盘-80油相溶液的体积与吐温-80的体积相等。
其中增强剂包括1.2mg/mL的单磷酰脂质A、0.9mg/mL的β-葡聚糖和50mg/mL的猪源细胞质多肽；按质量份数所述单磷酰脂质A为12g、β-葡聚糖11g和猪源细胞质多肽18g。
实施例7、
本实施例使用实施例4制备的猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗增强剂与市场上某公司生产的蓝耳病灭活疫苗相混合使用，其中每头仔猪增强剂的剂量为0.5ml，市售的灭活疫苗的剂量为1ml。
实施例8、
本实施例使用实施例5制备的猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗增强剂与市场上某公司生产的蓝耳病灭活疫苗相混合使用，其中每头仔猪增强剂的剂量为0.5ml，市售的灭活疫苗的剂量为1ml。
实施例9、
本实施例使用实施例6制备的猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗增强剂与市场上某公司生产的蓝耳病灭活疫苗相混合使用，其中每头仔猪增强剂的剂量为0.5ml，市售的灭活疫苗的剂量为1ml。
实施例10、
本实施例直接使用市场上某公司生产的蓝耳病灭活疫苗，每头仔猪剂量为1ml。
根据上述的灭活疫苗增强剂制备，现选取健康易感仔猪随机分组，每组20头，共4组。将实施例7-实施例10制备的疫苗免疫一组健康易感仔猪。
免疫后第14天和第28天，对各组健康易感仔猪采血分离血清，检测液相阻断ELISA抗体滴度。当液相阻断ELISA抗体滴度大于等于26为抗体合格。
免疫后第14天和第28天抗体合格率如表1所示。
表1：各组仔猪免疫后第14天和第28天抗体合格率
Figure BDA0002717860170000081
从上述的试验中，我们可以看出，在灭活疫苗中添加本发明的灭活疫苗增强剂之后，实施例7-实施例9中的三种灭活疫苗在对仔猪进行免疫接种14天后，就有大部分的仔猪拥有了合格的抗体，在接种28天之后，则全部仔猪均拥有了合格的抗体，但没有添加增强剂的实施例10则在免疫接种28天之后，有15头仔猪获得合格的疫苗抗体。因此，本发明的猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫增强剂可以提高仔猪机体的免疫水平、对抗原的免疫应答，从而提高免疫后的抗体水平、缩短免疫窗口期，增强疫苗的免疫效果。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

Claims (6)

1.一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫增强剂，其特征在于：所述免疫增强剂包括0.15-1.2mg/mL的单磷酰脂质A、0.5-0.9mg/mL 的β-葡聚糖和10-50mg/mL 的猪源细胞质多肽；按质量份数所述单磷酰脂质A为6-12份、β-葡聚糖7-11份和猪源细胞质多肽10-18份；所述猪源细胞质多肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、取新鲜的猪源性组织使用去离子水清洗、分割，加入去离子水高速绞碎成浆液；
S2、在浆液中加入总质量1-2%的氯化钠，加热到80-100℃下溶解，然后进行抽滤，收集滤液，得到第一滤液和滤渣；
S3、向第一滤液中加入第一滤液总重量2-3%的2709碱性蛋白酶和第一滤液总重量1-2%猪源细胞质多肽提取剂，在温度为55-65℃，pH为8-9的条件下间歇搅拌，酶解提取5-7h，得到第一酶解提取液，所述猪源细胞质多肽提取剂，按体积份数，包括磷酸溶液1-2份、乙腈溶液2-3份、甲醇溶液0.5-0.8份和三氟乙酸0.2-0.6份组成的混合溶液；
S4、在滤渣中加入与滤渣等质量的去离子水，然后加入2709碱性蛋白酶调节混合液的pH为8-9，再加入总质量4-6％的猪源细胞质多肽提取剂，将其控制在45-50℃的温度下酶解提取5-7h，得到第二酶解提取液；
S5、将第一酶解提取液和第二酶解提取液混合，在45-50℃的温度下酶解提取1-2h，然后抽滤，收集滤液，得到第二滤液；
S6、在第二滤液中加入第二滤液质量2-3％的活性炭，搅拌反应50-70min，滤出活性炭，调节滤液pH为7，先经蒸发浓缩，再经过干燥后得到猪源细胞质多肽。
2.根据权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫增强剂，其特征在于：所述免疫增强剂包括0.65mg/mL的单磷酰脂质A、0.75mg/mL的β-葡聚糖和25mg/mL的猪源细胞质多肽；按质量份数所述单磷酰脂质A为9份、β-葡聚糖9份和猪源细胞质多肽14份。
3.根据权利要求2所述的一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫增强剂，其特征在于：所述免疫增强剂为油乳剂。
4.一种如权利要求1-3任一权利要求所述的猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫增强剂的制备方法，其特征在于：将含有单磷酰脂质A、猪源细胞质多肽和β-葡聚糖的混合液与吐温-80混合，得到水相溶液；然后将白油和司盘-80混合，得到油相溶液；最后将水相溶液与油相溶液混合乳化后，得到灭活疫苗免疫增强剂。
5.根据权利要求4所述的一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫增强剂的制备方法，其特征在于：所述吐温-80的体积为单磷酰脂质A、猪源细胞质多肽和β-葡聚糖的混合液体积的1.5-2倍，所述白油和司盘-80的体积比为1:3，所述白油和司盘-80油相溶液的体积与吐温-80的体积相等。
6.根据权利要求5所述的一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫增强剂的制备方法，其特征在于：所述猪源细胞质多肽提取剂，按体积份数，包括磷酸溶液1.5份、乙腈溶液2.5份、甲醇溶液0.65份和三氟乙酸0.4份组成的混合溶液。
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