CN102344502A - 利用猪肺提取肝素钠的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用猪肺提取肝素钠的方法，步骤如下：将新鲜的猪肺绞碎成猪肺浆料，加入去离子水、细胞裂解剂和防腐剂，反应得到猪肺浆液，再加入去离子水和氯化钠，反应得到猪肺碱解液，将其缓慢加热并加入肝素钠复合蛋白酶，保温反应后缓慢加温继续保温得到猪肺酶解液，将其降温后补加氯化钠，反应得到猪肺盐解液，再将其加热保温，加入复合蛋白沉淀剂，搅拌，静置后收集清液，将其浓缩后加入乙醇，沉淀过夜得到沉淀物，经脱水、干燥得到肝素钠粗品。本发明能够降低肝素生产成本，提高产品品质和收得率，易于规模化生产，同时减少了化学试剂使用，减少废弃物排放，无废气、废水排出。经济效益和社会效益显著。

Description

利用猪肺提取肝素钠的方法

技术领域

本发明涉及生物制药制作技术领域，具体涉及一种利用猪肺提取肝素钠的方法。

背景技术

肝素钠具有阻止血液凝固和溶解血栓的功能，是优良的抗凝血药，自上世纪初被发现以来，广泛应用于治疗心脑血管等药品的生产和化妆品行业中。欧美国家曾从牛肺、羊肝脏中大量提取肝素钠，但后来由于疯牛（羊）病盛行，且多年的实验表明只有从健康生猪脏器中提取出来的肝素才与人体内的肝素分子结构一致，导致猪小肠逐渐成为肝素的主要来源。

目前，我国肝素钠粗品生产多以小肠粘膜作为原料,利用猪小肠粘膜生产肝素钠的小型生化厂有近1500家，几乎每县一家，资源已利用怠尽。肝素动物肺脏中虽然肝素含量高，但由于其组织特异性，存在大量杂质蛋白，肺组织肥大细胞中的蛋白与肝素结合非常牢固，导致不易分离纯化，而难以利用。我国每年出栏生猪约6亿头，猪肺资源十分丰富，对于低廉而滞销的猪肺除少数部分被加工利用外，大部分都没有得到有效利用。猪肺脏中以干物计，含粗蛋白质约70%，油脂16%，碳水化合物4%，因此肝素这种多糖类复合物仅占碳水化合物4%中的一部分，含量并不算很多，如何有效地将肝素提取出来，以及去除一些杂质，以提高粗肝素的纯度，成为当今重要的研究课题。

1933年，Scott等人创立了牛肝肝素分离的传统工艺，效价为3.5u/mg,总活性4200 u/1000g牛肝。1987年台湾林庆文创立了猪肺提取肝素，效价为9.6usp/mg,总活性49029 usp/1000g猪肺。传统工艺包括组织匀浆和自溶，用碱性硫酸铵或氯化钠提取肝素与脂蛋白复台物、乙醇去脂、酶解和沉淀等，传统工艺繁琐，制备的肝素品位低，色泽淡黄，效价低（20u/mg以下），产品收得率低，质量难以保证，生产效益低下而无法规模化生产。

国内也有部分机构在研究提取猪肺肝素，但因其产品提取率极低（每公斤猪肺浆料提取率少于15000国际单位），成本高昂不具备工业化价值，而且其中含有较多类肝素等多硫物和蛋白等杂质，使得产品质量难以达到出售标准而无法规模化生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够降低肝素生产成本、提高产品品质和收得率的利用猪肺提取肝素钠的方法。

本发明为实现上述发明目的，采用如下技术方案：利用猪肺提取肝素钠的方法，该方法采用如下步骤：

（1）取新鲜的猪肺绞碎成猪肺浆料，加入0.5-1倍重量的去离子水，再加入细胞裂解剂和防腐剂，加入量分别为猪肺浆料重量的0.1-0.2%和0.1-0.2%，在25-30℃下间歇搅拌反应4-8小时，得到猪肺浆液；

（2）在上步得到的猪肺浆液中加入1-2.5倍猪肺浆料重量的去离子水，再加入占总液体重量2.5-3.5%的氯化钠，调pH至10-11，搅拌均匀，在25-30℃下间歇搅拌反应4-8小时，得到猪肺碱解液；

（3）将上步得到的猪肺碱解液缓慢加热至40-45℃，调pH至8-10，加入占猪肺浆料重量0.05-0.15%的肝素钠复合蛋白酶，搅拌均匀，保温反应2-3小时后，缓慢加温至50-60℃，保温反应2-3小时，得到猪肺酶解液；

（4）将上步得到的猪肺酶解液降温至35-37℃，补加占猪肺酶解液重量10-14%的氯化钠，调pH至9.0-9.5，搅拌均匀，间歇搅拌反应6-8小时，得到猪肺盐解液；

（5）将上述猪肺盐解液加热至80-85℃，保温0.5-1小时，加入占猪肺盐解液重量0.5-1.5%的复合蛋白沉淀剂，搅拌0.5-1小时，静置后收集清液；

（6）用膜浓缩器将清液浓缩至原体积的1/20-1/10，得到浓缩液；

（7）在浓缩液中加入1-1.5倍体积的预冷乙醇，沉淀过夜后吸除乙醇，得到沉淀物，将其用无水乙醇脱水，在50-60℃下真空干燥得到肝素钠粗品。

所述步骤（1）中细胞裂解剂由十二烷基硫酸钠、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠中任意两种以上组成。

所述步骤（1）中防腐剂为甲苯或苯酚。

所述步骤（3）中肝素钠复合蛋白酶由胰酶、木瓜蛋白酶、脂肪酶、2709碱性蛋白酶、1398中性蛋白酶任意两种以上组成。

所述步骤（5）中复合蛋白沉淀剂由珍珠岩晶粉、明矾、碳酸钙、氯化钙、碳酸钡中任意两种以上组成。

所述步骤（7）中乙醇的质量百分浓度为85～90％。

本发明方法的积极效果如下：本发明的方法在萃取猪肺肝素时，以细胞裂解剂来对猪肺萃取，不仅有助于肝素的萃取，以提高肝素的产率，还有助于去除纤维蛋白组织，以提高粗肝素的纯度，肝素钠效价达120usp/mg以上，每公斤猪肺可提取总活力达70000-90000 usp，提高猪肺的生物利用价值，采用复合蛋白沉淀剂精制肝素钠，克服了以往采用强酸性去杂蛋白而使肝素钠活性大大降低的缺陷，无需在强酸性条件下即可较完全地去除杂蛋白质，活性收率仍可在99%左右，减少了化学试剂使用，减少废弃物排放，废渣回收后作为高档蛋白饲料，无废气、废水排出。采用膜浓缩器，将分子膜技术引入肝素钠的生产中，克服了以往单纯采用大孔树脂吸附、洗脱繁琐、效价低而无法出售的缺陷，最大限度地清除了产品中的蛋白、核酸等降解物以及氧化剂、有机溶剂等残留物，有效地提高了产品的内在质量，提高了产品效价和收得率，保存了肝素天然分子结构的完整性，易于规模化生产，经济效益和社会效益显著。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明方法作进一步详述。

实施例1：

本实施例方法步骤如下：

（1）取新鲜的猪肺（或冷冻猪肺自然解冻之后），清洗去污，剥离气管，绞碎成肉糜状，得猪肺浆料，取1000g猪肺浆料，加入1000g去离子水，再加入1.5g细胞裂解剂和1.5g防腐剂，其中细胞裂解剂由十二烷基硫酸钠和硫代硫酸钠混合组成，防腐剂为甲苯，在25℃下，每1小时搅拌一次，每次10分钟，反应6小时，得到猪肺浆液；

（2）在上步得到的猪肺浆液中加入2500g去离子水，再加入135g氯化钠，用氢氧化钠溶液调pH至10，搅拌均匀，在26℃下，每2小时搅拌一次，每次10分钟，反应7小时，得到猪肺碱解液；

（3）将上步得到的猪肺碱解液缓慢加热至40℃，调整pH至9，加入0.5g肝素钠复合蛋白酶，其中肝素钠复合蛋白酶由胰酶、木瓜蛋白酶和脂肪酶混合组成，搅拌均匀，保温反应2.5小时后，缓慢加温至55℃，保温反应2小时，得到猪肺酶解液；

（4）将上步得到的猪肺酶解液降温至36℃，补加556g氯化钠，调整pH至9.0，搅拌均匀，每3小时搅拌一次，每次10分钟，反应8小时，此反应彻底切断了肝素与蛋白的结合部位，获得完全游离的肝素溶解于盐水中，得到猪肺盐解液；

（5）将上述猪肺盐解液加热至82℃，保温1小时，使蛋白高温变性，加入26g复合蛋白沉淀剂，复合蛋白沉淀剂由明矾、碳酸钙和氯化钙混合组成，搅拌0.6小时，静置后收集清液3900ml；

（6）用膜浓缩器将清液浓缩至390ml，得到浓缩液；

（7）在浓缩液中加入470ml质量百分浓度为85％的预冷乙醇，沉淀过夜后吸除乙醇，得到沉淀物，将其用无水乙醇脱水，在60℃下真空干燥得到0.65g肝素钠粗品，效价为135usp/ mg。

实施例2：

本实施例方法步骤如下：

（1）取新鲜的猪肺（或冷冻猪肺自然解冻之后），清洗去污，剥离气管，绞碎成肉糜状，得猪肺浆料，取1000g猪肺浆料，加入500g去离子水，再加入1g细胞裂解剂和2g防腐剂，其中细胞裂解剂由亚硫酸钠、亚硫酸氢钠和磷酸二氢钠混合组成，防腐剂为甲苯，在30℃下，每1小时搅拌一次，每次10分钟。反应4小时，得到猪肺浆液；

（2）在上步得到的猪肺浆液中加入1000g去离子水，再加入63g氯化钠，用氢氧化钠溶液调pH至10，搅拌均匀，在25℃下，每2小时搅拌一次，每次10分钟。反应4小时，得到猪肺碱解液；

（3）将上步得到的猪肺碱解液缓慢加热至43℃，调整pH至9.5，加入1.5g肝素钠复合蛋白酶，其中肝素钠复合蛋白酶由2709碱性蛋白酶和脂肪酶混合组成，搅拌均匀，保温反应3小时后，缓慢加温至50℃，保温反应2.5小时，得到猪肺酶解液；

（4）将上步得到的猪肺酶解液降温至35℃，补加257g氯化钠，调整pH至9.5，搅拌均匀，每3小时搅拌一次，每次10分钟，反应7小时，此反应彻底切断了肝素与蛋白的结合部位，获得完全游离的肝素溶解于盐水中，得到猪肺盐解液；

（5）将上述猪肺盐解液加热至85℃，保温0.5小时，使蛋白高温变性，加入28g复合蛋白沉淀剂，复合蛋白沉淀剂由氯化钙和碳酸钡混合组成，搅拌0.5小时，静置后收集清液2200ml；

（6）用膜浓缩器将清液浓缩至200ml，得到浓缩液；

（7）在浓缩液中加入200ml质量百分浓度为90％的预冷乙醇，沉淀过夜后吸除乙醇，得到沉淀物，将其用无水乙醇脱水，在55℃下真空干燥得到0.73g肝素钠粗品，效价为122usp/ mg。

实施例3：

本实施例方法步骤如下：

（1）取新鲜的猪肺（或冷冻猪肺自然解冻之后），清洗去污，剥离气管，绞碎成肉糜状，得猪肺浆料，取1000g猪肺浆料，加入800g去离子水，再加入2g细胞裂解剂和1g防腐剂，其中细胞裂解剂由磷酸二氢钠和磷酸氢二钠混合组成，防腐剂为苯酚，在28℃下，每1小时搅拌一次，每次10分钟。反应8小时，得到猪肺浆液；

（2）在上步得到的猪肺浆液中加入2000g去离子水，再加入133g氯化钠，用氢氧化钠溶液调pH至11，搅拌均匀，在30℃下，每2小时搅拌一次，每次10分钟。反应8小时，得到猪肺碱解液；

（3）将上步得到的猪肺碱解液缓慢加热至45℃，调pH至8.5，加入1.3g肝素钠复合蛋白酶，其中肝素钠复合蛋白酶由1398中性蛋白酶和木瓜蛋白酶混合组成，搅拌均匀，保温反应2小时后，缓慢加温至60℃，保温反应3小时，得到猪肺酶解液；

（4）将上步得到的猪肺酶解液降温至37℃，补加551g氯化钠，调pH至10.0，搅拌均匀，每3小时搅拌一次，每次10分钟，反应6小时，此反应彻底切断了肝素与蛋白的结合部位，获得完全游离的肝素溶解于盐水中，得到猪肺盐解液；

（5）将上述猪肺盐解液加热至80℃，保温0.7小时，使蛋白高温变性，加入67g复合蛋白沉淀剂，复合蛋白沉淀剂由珍珠岩晶粉、明矾和碳酸钙混合组成，搅拌1小时，静置后收集清液3400ml；

（6）用膜浓缩器将清液浓缩至170ml，得到浓缩液；

（7）在浓缩液中加入250ml质量百分浓度为85％的预冷乙醇，沉淀过夜后吸除乙醇，得到沉淀物，将其用无水乙醇脱水，在50℃下真空干燥得到0.70g肝素钠粗品，效价为130usp/ mg。

以上所述，为发明的较佳实施案例，并非对发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (6)

1.一种利用猪肺提取肝素钠的方法，其特征在于，采用如下步骤：

（1）取新鲜的猪肺绞碎成猪肺浆料，加入0.5-1倍重量的去离子水，再加入细胞裂解剂和防腐剂，加入量分别为猪肺浆料重量的0.1-0.2%和0.1-0.2%，在25-30℃下间歇搅拌反应4-8小时，得到猪肺浆液；

（2）在上步得到的猪肺浆液中加入1-2.5倍猪肺浆料重量的去离子水，再加入占总液体重量2.5-3.5%的氯化钠，调pH至10-11，搅拌均匀，在25-30℃下间歇搅拌反应4-8小时，得到猪肺碱解液；

（3）将上步得到的猪肺碱解液缓慢加热至40-45℃，调pH至8-10，加入占猪肺浆料重量0.05-0.15%的肝素钠复合蛋白酶，搅拌均匀，保温反应2-3小时后，缓慢加温至50-60℃，保温反应2-3小时，得到猪肺酶解液；

（4）将上步得到的猪肺酶解液降温至35-37℃，补加占猪肺酶解液重量10-14%的氯化钠，调pH至9.0-9.5，搅拌均匀，间歇搅拌反应6-8小时，得到猪肺盐解液；

（5）将上述猪肺盐解液加热至80-85℃，保温0.5-1小时，加入占猪肺盐解液重量0.5-1.5%的复合蛋白沉淀剂，搅拌0.5-1小时，静置后收集清液；

（6）用膜浓缩器将清液浓缩至原体积的1/20-1/10，得到浓缩液；

（7）在浓缩液中加入1-1.5倍体积的预冷乙醇，沉淀过夜后吸除乙醇，得到沉淀物，将其用无水乙醇脱水，在50-60℃下真空干燥得到肝素钠粗品。

2.根据权利要求1所述的利用猪肺提取肝素钠的方法，其特征在于，所述步骤（1）中细胞裂解剂由十二烷基硫酸钠、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠中任意两种以上组成。

3.根据权利要求1所述的利用猪肺提取肝素钠的方法，其特征在于，所述步骤（1）中防腐剂为甲苯或苯酚。

4.根据权利要求1所述的利用猪肺提取肝素钠的方法，其特征在于，所述步骤（3）中肝素钠复合蛋白酶由胰酶、木瓜蛋白酶、脂肪酶、2709碱性蛋白酶、1398中性蛋白酶任意两种以上组成。

5.根据权利要求1所述的利用猪肺提取肝素钠的方法，其特征在于，所述步骤（5）中复合蛋白沉淀剂由珍珠岩晶粉、明矾、碳酸钙、氯化钙、碳酸钡中任意两种以上组成。

6.根据权利要求1所述的利用猪肺提取肝素钠的方法，其特征在于，所述步骤（7）中乙醇的质量百分浓度为85～90％。