CN100345867C - 一种酸溶性鱼皮胶原蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种酸溶性鱼皮胶原蛋白，是以海鱼皮为原料，经切碎、NaCl溶液浸泡去杂质、乙醇丙酮脱脂的处理，进而用柠檬酸和醋酸的混合液浸泡提取后离心分离得酸溶性鱼皮胶原溶液，再经Nacl固体盐析得酸溶性鱼皮胶原蛋白沉淀，最后将酸溶性鱼皮胶原蛋白沉淀溶解于醋酸溶液中，而后在Na2HPO4(pH8.6)中透析，或经分子量大于6万的醋酸纤维中空纤维膜进行超滤处理，透析或超滤得到的固体真空冷冻干燥即可得到产品。产品洁白，无腥味，冷冻干燥后呈海绵状。胶原蛋白制品纯度达≥97%。胶原蛋白中含有丰富的甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸，其水解产物中还有生理活性肽，胶原蛋白分子量大于60000。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用海水鱼加工的废弃物——鱼皮，提取酸溶性胶原蛋白及其制备方法，属于生物制品领域。
背景技术
胶原蛋白是构成动物支持组织的结构蛋白质，其制品已广泛应用于医药、保健、食品加工、化妆品等众多领域，迄今其制品主要是从一些陆生哺乳动物如牛、猪等的皮肤中提取。近年来，由于疯牛病和口蹄疫的影响，人们开始寻求从水产动物如鱼类中提取安全、卫生、无害的胶原蛋白，这成为近年来各国研究的一项热门课题。因此从鱼加工废弃物中提取胶原蛋白并加以利用，既能促进加工废弃物的综合利用、变废为宝，增加附加值，又将是一种新型胶原资源的开发。
以往对胶原蛋白的制备，主要采取碱法、盐法、酸法、酶法、或者是酸法和酶法相结合来提取。碱性条件下处理，易造成肽键水解，故在以获得完整胶原为目的的提取中应用很少；盐法提取的工艺不易稳定，且胶原分子结构不及酸溶胶原合适；酸法在低离子浓度酸性条件下，能引起纤维膨胀，溶解，且经酸提后的胶原蛋白的氨基酸组成、晶体长度和性质都与胶原相同；酶法采用对胶原作用较弱的酶(主要用组织蛋白酶如胃蛋白酶)在酸性条件下可使胶原溶解，且只催化水解胶原的端肽非螺旋区，仍能保持胶原的完整螺旋区段。故对胶原采取酸法与酶法的研究比较多。但是，酶法提取胶原蛋白用于工业生产成本较高，酸法提取则会相对降低成本。然而采用单一的酸溶液提取，也会使提取得率受到限制。傅燕凤等对淡水鱼鱼皮提取了胶原蛋白，分别用醋酸、柠檬酸、乳酸对鲢、鳙、草鱼的鱼皮进行胶原蛋白的提取，但其得到的胶原蛋白略有鱼腥味，且鲢鱼皮和鳙鱼皮制品的洁白度略差。王瑾晔等(中国专利申请号02111683.0)通过碱溶液处理鱼皮，又用限制性酶解上述鱼皮，碱性条件易造成肽键水解，不易获得完整的大分子胶原蛋白，而且酶使成本提高。秦玉清等研究了影响鱿鱼皮胶原蛋白提取的部分影响因素，并确认通过水提和酶解方法都可得到胶原蛋白含量较高的溶液，但是热水提取将胶原蛋白变性，最终是作为小分子量的明胶提取出来的，而低温条件下用胃蛋白酶提取对鱼皮胶原蛋白来说成本较高。陈申如等对几种淡水鱼采用醋酸水解得到胶原蛋白，并进行了电泳分析，得出的胶原蛋白纯度很高。G·A·麦克唐纳等(中国专利申请号00816385.5)从冷水鱼皮肤中提取了一种胶原产品，及胶原产品的生产方法，并发明了一种新的检测蛋白质溶液中天然胶原含量的方法。
哺乳动物猪、牛等的皮肤胶原经稀酸处理得到的酸溶性胶原蛋白的含量很低，而鱼皮经稀酸处理后，得到的酸溶性胶原蛋白含量占总胶原的比例相当高。因此较之哺乳动物，从鱼皮中提取酸溶性胶原蛋白用于工业生产可节约成本。然而从鱼皮-特别是海鱼-的鱼皮中提取酸溶性胶原蛋白的高效工艺方法尚未见到报导。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从海水鱼的鱼皮中提取酸溶性胶原蛋白的高效工艺方法，并制得一种新的酸溶性胶原蛋白。
提供以鱼皮为原料制备的纯度高、溶解性好、无不良气味、质量稳定、成本低廉、色泽良好(符合产品色泽呈白色或乳白色的质量要求)的胶原蛋白产品。
提供制备上述胶原蛋白产品的方法。以海水鱼加工废弃物——鱼皮为原料，在适当的低温条件下，经除杂、脱脂后，将鱼皮置于两种复合酸溶液的最适作用环境中充分溶胀提取，最终得到了最大限度的酸溶性胶原蛋白。
本发明的鱼皮胶原蛋白的制备方法的工艺为原料处理、提取、盐析、纯化干燥，具体操作步骤如下：
一、原料处理
a、取新鲜或冷冻鱼皮经解冻，沥干，将其切成小块，最好是切成小于0.5cm3的碎块。
b、加入鱼皮重量5～25倍的1～10％的NaCl溶液，于4～10℃浸泡4～24h，于4℃以3000～5000rpm的速度离心5～20min，将离心后的上清液除去，即除去了非胶原蛋白及杂质；
c、再将上述处理的鱼皮放入-20℃预冷过的，鱼皮重量5～25倍的丙酮与乙醇(1∶1)的混合液中脱脂4～24h，倒掉处理液，于通风厨内晾干。
二、鱼皮胶原蛋白的提取
将上述处理的鱼皮溶解于鱼皮重量5～25倍的0.1mol/L柠檬酸与0.5mol/L醋酸的混合液中，其中柠檬酸与醋酸的体积比为1.0∶0.1～10.0，4～10℃下浸泡10～24h，于4℃温度条件下以10000～20000rpm的速度离心20～60min，分离的上清液得酸溶性胶原溶液，于4℃温度条件下保存；也可以将分离所得的沉淀再重复此步骤提取1～2次，合并上清液，于4℃温度条件下保存。
三、盐析
向上述酸溶性胶原溶液中直接加入NaCl固体进行盐析，使NaCl最终浓度达到1～4mol/L，盐析1～36h，然后于4～10℃以6000～12000rpm的速度冷冻离心10～20min，得到酸溶性胶原蛋白沉淀。
四、纯化干燥
可以用如下两种纯化干燥的方法中的任一方法均可得到本发明的产品：
1、盐析后得到的胶原沉淀溶解于0.5mol/L的醋酸溶液中，然后在0.02mol/L的pH8.6的Na2HPO4中透析，所得胶原沉淀，真空冷冻干燥即得到高纯度的产品。
2、盐析后得到的胶原沉淀溶解于0.5mol/L的醋酸溶液中，用分子量大于6万的醋酸纤维中空纤维膜进行超滤处理，得到的产物真空冷冻干燥即可得到高纯度产品。
本发明提取得到的胶原蛋白洁白，无腥味，冷冻干燥后呈海绵状。鱼皮胶原蛋白纯度较高，达≥97％。鱼皮胶原蛋白在低温下可溶于中性盐溶液或酸性溶液，容易调制得到可溶性胶原溶液。所提的胶原蛋白为天然的、未变性的大分子胶原蛋白，同原胶原具有相同的形状、大小及氨基酸组成。胶原蛋白中含有丰富的甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸，其水解产物中还有生理活性肽。胶原蛋白分子量大于60000，含有3条异种α链，即α1(I)α2(I)α3(I)。
与现有技术相比本发明具有如下优点：
1、本发明提供了一种以海水鱼皮为原料的提取酸溶性胶原蛋白非常有效的方法。工艺简单、合理、有效，产品得率达12％以上，产品纯度高达97％以上，有的甚至超过99％，其色泽洁白，无腥味，可广泛使用。
2、哺乳动物猪、牛等的皮肤胶原经稀酸处理得到的酸溶性胶原蛋白的含量很低，而鱼皮经稀酸处理后，得到的酸溶性胶原蛋白含量占总胶原的比例相当高。因此较之哺乳动物，从鱼皮中提取可溶性胶原蛋白用于工业生产可节约成本。
3、本发明中除非胶原蛋白的方法能最大限度的除去总的粗蛋白，而且胶原蛋白损失量最小，除非胶原蛋白效果好。
4、本发明所用的脱脂方法，既能充分脱除脂肪，胶原蛋白未变性，亦不影响盐析和后续回收胶原蛋白，又有效的除去了鱼腥味和一部分鱼皮色素，使胶原蛋白产品质量好、纯度高。
5、鱼皮胶原蛋白由于其抗原性比其它蛋白质弱、生物相容性好而被广泛应用于生物制品，广泛用于创伤和烧伤的修复、整形美容、神经再生及血瓣膜手术等。鱼皮胶原蛋白特别是深海鱼皮胶原蛋白变性温度低，不能限制细胞的增值，它能促进细胞的粘着和增值，不会诱发细胞的癌变。
6、不同的酸对胶原链的作用位点不同，所以使用两种复合酸比单独使用一种酸对鱼皮的作用更彻底，经济效益好。然而，还没有用复合酸来提取胶原蛋白的报道。
7、本发明综合利用了低温提取技术、低温过滤技术、冷冻离心技术及冷冻干燥技术，能充分保持胶原蛋白的生物活性。
具体实施方式
实施例一：
取1Kg冷冻鱼皮经解冻，沥干，将其切成小于0.5cm3的碎块。加入10L2％的NaCl溶液，于4℃浸泡18h，然后3000rpm离心20min，弃去混浊的上清液。再将鱼皮放入-20℃预冷过的5L丙酮与5L乙醇的混合液中，作用4h后，取出鱼皮，于通风厨内晾干。然后将鱼皮溶解于13.7L 0.1mol/L柠檬酸与1.36L0.5mol/L醋酸的混合液中(10∶1共15L)，于4℃下浸泡24h，4℃，10000rpm离心40min，将沉淀再重复此步骤提取2次，合并上清液，于4℃保存，即得酸溶性胶原溶液；向上述溶液中直接加入NaCl固体1.75Kg，使最终浓度达1mol/L，进行盐析4h，然后于4℃，6000rpm离心20min，将胶原沉淀复溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，然后在0.02mol/L的Na2HPO4(pH8.6)中透析，真空冷冻干燥即可得到纯度为97％的高纯度产品132.1g，得率13.21％(按湿重计)。
实施例二：
取1Kg冷冻鱼皮经解冻，沥干，将其切成小于0.5cm3的碎块。加入10L 4％的NaCl溶液，于4℃浸泡20h，然后3000rpm离心20min，弃去混浊的上清液。再将鱼皮放入-20℃预冷过的7.5L丙酮与7.5L乙醇的混合液中，作用8h后，取出鱼皮，于通风厨内晾干。然后将鱼皮溶解于17.5L 0.1mol/L柠檬酸与2.5L0.5mol/L醋酸的混合液中(7∶1共20L)，于4℃下浸泡22h，4℃，12000rpm离心20min，将沉淀再重复此步骤提取1次，合并上清液，于4℃保存，即得酸溶性胶原溶液；向上述溶液中直接加入NaCl固体4.68Kg，使最终浓度达2mol/L，进行盐析12h，然后于4℃，8000rpm冷冻离心15min，将胶原沉淀复溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，进行超滤处理，再经真空冷冻干燥即可得到纯度为97.52％的高纯度产品128g，得率为12.8％(按湿重计)。
实施例三：
取1Kg冷冻鱼皮经解冻，沥干，将其切成小于0.5cm3的碎块。加入20L 5％的NaCl溶液，于4℃浸泡12h，4℃，4000rpm离心10min，弃去混浊的上清液。再将鱼皮放入-20℃预冷过的12.5L丙酮与12.5L乙醇的混合液中，作用12h后，取出鱼皮，于通风厨内晾干。然后将鱼皮溶解于5L 0.1mol/L柠檬酸与5L 0.5mol/L醋酸的混合液中(1∶1共10L)，于4℃下浸泡20h，4℃，10000rpm离心50min，得到上清液，于4℃保存，即得酸溶性胶原溶液；向上述溶液中直接加入NaCl固体3.5Kg，使最终浓度达3mol/L，进行盐析1h，然后4℃，6000rpm冷冻离心15min，将胶原沉淀复溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，然后在0.02mol/L的Na2HPO4(pH8.6)中透析，真空冷冻干燥即可得到纯度为98％的高纯度产品130g，得率为13％(按湿重计)。
实施例四：
取1Kg冷冻鱼皮经解冻，沥干，将其切成小于0.5cm3的碎块。加入25L 8％的NaCl溶液，于4℃浸泡4h，然后5000rpm离心10min，弃去混浊的上清液。再将鱼皮放入-20℃预冷过的10L丙酮与10L乙醇的混合液中，作用16h后，取出鱼皮，于通风厨内晾干。然后将鱼皮溶解于12.5L 0.1mol/L柠檬酸与2.5L0.5mol/L醋酸的混合液中(5∶1共15L)，于4℃下浸泡12h，4℃，12000rpm离心40min，得到上清液，于4℃保存，即得酸溶性胶原溶液；向上述溶液中直接加入NaCl固体7Kg，使最终浓度达4mol/L，进行盐析18h，然后4℃，10000rpm冷冻离心10min，将胶原沉淀复溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，进行超滤处理，再经真空冷冻干燥即可得到纯度为97.3％的高纯度产品126g，得率为12.6％(按湿重计)。
实施例五：
取1Kg冷冻鱼皮经解冻，沥干，将其切成小于0.5cm3的碎块。加入5L 1％的NaCl溶液，于4℃浸泡24h，然后5000rpm离心5min，弃去混浊的上清液。再将鱼皮放入-20℃预冷过的2.5L丙酮与2.5L乙醇的混合液中，作用20h后，取出鱼皮，于通风厨内晾干。然后将鱼皮溶解于6.2L 0.1mol/L柠檬酸与18.8L0.5mol/L醋酸的混合液中(1∶3共25L)，于4℃下浸泡10h，4℃，18000rpm离心20min，将沉淀再重复此步骤提取1次，合并上清液，于4℃保存，即得酸溶性胶原溶液；向上述溶液中直接加入NaCl固体5.84Kg，使最终浓度达2mol/L，进行盐析16h，然后4℃，12000rpm冷冻离心10min，将胶原沉淀复溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，然后在0.02mol/L的Na2HPO4(pH8.6)中透析，真空冷冻干燥即可得到纯度为98.5％的高纯度产品124.6g，得率为12.46％(按湿重计)。
实施例六：
取1Kg冷冻鱼皮经解冻，沥干，将其切成小于0.5cm3的碎块。加入15L 10％的NaCl溶液，于10℃浸泡4h，然后4000rpm离心20min，弃去混浊的上清液。再将鱼皮放入-20℃预冷过的10L丙酮与10L乙醇的混合液中，作用24h后，取出鱼皮，于通风厨内晾干。然后将鱼皮溶解于0.8L 0.1mol/L柠檬酸与4.2L0.5mol/L醋酸的混合液中(1∶5共5L)，于4℃下浸泡20h，4℃，20000rpm离心20min，将沉淀再重复此步骤提取2次，合并上清液，于4℃保存，即得酸溶性胶原溶液；向上述溶液中直接加入NaCl固体2.3Kg，使最终浓度达4mol/L，进行盐析24h，然后4℃，10000rpm冷冻离心15min，将胶原沉淀复溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，进行超滤处理，再经真空冷冻干燥即可得到纯度为99％的高纯度产品135g，得率为13.5％(按湿重计)。
实施例七：
取1Kg冷冻鱼皮经解冻，沥干，将其切成小于0.5cm3的碎块。加入25L 6％的NaCl溶液，于6℃浸泡8h，4℃，4000rpm离心10min，弃去混浊的上清液。再将鱼皮放入-20℃预冷过的12.5L丙酮与12.5L乙醇的混合液中，作用12h后，取出鱼皮，于通风厨内晾干。然后将鱼皮溶解于1.2L O.1mol/L柠檬酸与8.8L0.5mol/L醋酸的混合液中(1∶7共10L)，于4℃下浸泡20h，4℃，10000rpm离心50min，将沉淀再重复此步骤提取1次，合并上清液，于4℃保存，即得酸溶性胶原溶液；向上述溶液中直接加入NaCl固体3.5Kg，使最终浓度达3mol/L，进行盐析36h，然后4℃，6000rpm冷冻离心15min，将胶原沉淀复溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，然后在0.02mol/L的Na2HPO4(pH8.6)中透析，真空冷冻干燥即可得到纯度为99.4％的高纯度产品118g，得率为11.8％(按湿重计)。
实施例八：
取1Kg冷冻鱼皮经解冻，沥干，将其切成小于0.5cm3的碎块。加入15L 3％的NaCl溶液，于8℃浸泡20h，然后4000rpm离心15min，弃去混浊的上清液。再将鱼皮放入-20℃预冷过的5L丙酮与5L乙醇的混合液中，作用10h后，取出鱼皮，于通风厨内晾干。然后将鱼皮溶解于1.8L O.1mol/L柠檬酸与18.2L0.5mol/L醋酸的混合液中(1∶10共20L)，于4℃下浸泡12h，4℃，10000rpm离心40min，将沉淀再重复此步骤提取2次，合并上清液，于4℃保存，即得酸溶性胶原溶液；向上述溶液中直接加入NaCl固体2.33Kg，使最终浓度达1mol/L，进行盐析20h，然后4℃，10000rpm冷冻离心10min，将胶原沉淀复溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，进行超滤处理，再经真空冷冻干燥即可得到纯度为98.8％的高纯度产品137g，得率为13.7％(按湿重计)。
Claims (5)
1.一种酸溶性鱼皮胶原蛋白，其特征在于是以海水鱼的鱼皮为原料，通过鱼皮切碎、除去非胶原蛋白和杂质、脱脂、提取、盐析、纯化、干燥而得的胶原蛋白；胶原蛋白洁白，无腥味，冷冻干燥后呈海绵状，纯度达97％以上，分子量大于60000，含有3条异种α链，即α1(I)α2(I)α3(I)；鱼皮胶原蛋白在低温下可溶于中性盐溶液或酸性溶液，容易调制得到可溶性胶原溶液；胶原蛋白为天然的、未变性的大分子胶原蛋白，同原胶原具有相同的形状、大小及氨基酸组成；胶原蛋白中含有丰富的甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸，其水解产物中还有生理活性肽。
2.一种酸溶性鱼皮胶原蛋白的制法，其特征在于工艺步骤为原料处理，提取，盐析，纯化干燥；
其中所述原料处理为常温下的鱼皮切成小块，而后进行：①浸入5～25倍4～10℃的1～10％Nacl溶液，浸泡4～24h；②于4℃以3000～5000rpm速度离心分离5～20min，分出鱼皮；③将鱼皮置入5～20倍，经-20℃预冷过的1∶1的丙酮和乙醇溶液中脱脂4～24h，脱脂鱼皮晾干；
所述提取为：①脱脂晾干鱼皮溶解于鱼皮重量5～25倍的0.1mol/L柠檬酸与0.5mol/L醋酸的混合液中，其中柠檬酸与醋酸的体积比为1.0∶0.1～10.0，4～10℃下浸泡10～24h；②于4℃以10000～20000rpm速度离心分离20～60min；上清液于4℃保存得酸溶胶原溶液；
所述盐析为在酸溶胶原溶液中加入固体NaCl，搅拌使其溶解，其最终浓度1～4mol/L，盐析1～36小时，于4～10℃，以6000～12000rpm离心分离10～20min得酸溶胶原沉淀；
所述纯化干燥为；将所得酸溶胶原沉淀溶入0.5mol/L的醋酸溶液中，而后在0.02mol/L的pH为8.6的磷酸氢二钠溶液中透析，所得的胶原沉淀真空冷冻干燥而得产品。
3.根据权利要求2所述酸溶性鱼皮胶原蛋白的制法，其特征在于所述原料处理中鱼皮切成小块为切成≤0.5cm3。
4.根据权利要求2所述酸溶性鱼皮胶原蛋白的制法，其特征在于所述提取步骤中提取后的离心分离所得的沉淀重复提取1～2次，上清液合并，4℃保存得酸溶胶原溶液。
5.根据权利要求2所述酸溶性鱼皮胶原蛋白的制法，其特征在于所述纯化干燥步骤中将得酸溶胶原沉淀溶入0.5mol/L的醋酸溶液中，用分子量大于6万的醋酸中空纤维膜进行超滤处理，得到的产物经过真空冷冻干燥而得最终产品。
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