CN1803836A - 海蜇胶原蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海蜇胶原蛋白。其是从海蜇的中胶层提取的,该胶原蛋白为白色纤维状固体或浅黄色固体粉末,堆密度为0.110-0.645g/ml,该胶原蛋白在酸性溶液中完全溶解,呈澄清透明溶液;该胶原蛋白的单链分子量在10-30万道尔顿,糖含量为2.5-5%,氨基酸含量为80-95%mg/100mg;其中,天门冬氨酸占7.9-8.3%,谷氨酸占10.0-12.9%,苏氨酸占3.5-4.0%,缬氨酸占3.5-3.9%,异亮氨酸占2.2-2.5%,赖氨酸占3.4-3.8%,羟赖氨酸占2.0-2.7%。该海蜇胶原蛋白的制备方法是:(1)使用盐渍海蜇或新鲜海蜇;(2)原料的预处理;(3)分离中胶层;(4)解离中胶层;(5)超滤分离浓缩;得到分子量在10-30万道尔顿的胶原蛋白,其截留率95%-98%;该方法可以有效回收蛋白酶,使反应体系循环利用,得到的胶原蛋白产品纯度高。
Description
技术领域
本发明涉及海洋生物化工原料的改进,具体讲是一种海蜇胶原蛋白及其制备方法。其属于生物医药化工技术领域。
背景技术
海蜇,又名水母,属腔肠动物。海蜇是肉食性的,以浮游生物,小的甲壳类、多毛类甚至小的鱼类为食。身体呈伞体半球形,伞径一般30至45厘米,大的可达100厘米。海蜇的表皮层与胃层之间为中胶层(mesoglea),中胶层非常发达,占据了其身体的几乎整个厚度,其中含有纤维及少量来源于外胚层的细胞。中胶层硬而厚,电子显微镜下可见中胶层有许多小纤维。中胶层中的主要成分是水分,其中含有极少量的蛋白质及多糖,含有机物为5%,并以胶原蛋白质的形式存在,这种物质具有很强的弹性和粘合力。海蜇是我国久负盛名的食用大型浮游动物,近年来,养殖界攻克了人工育苗、螅状体幼体越冬和幼蜇放流等技术难关,具有持续的海蜇资源供应。海蜇皮主要成分为蛋白质(胶原蛋白),不含胆固醇和脂肪酸。有美国专利(USpatent6,894,029)报道了利用口冠水母科的口冠水母(Stomolophus meleagris)采用冻干、碱洗、酸洗、蛋白酶消化、分级盐析工艺,制得类II胶原,用于治疗类风湿关节炎。还有日本专利(JP2004099513)报道了利用洋须水母科的海月水母(Aureiiaaurita),采用缓冲液萃取胶原、胶原沉淀和分离、胶原脱水、冷冻干燥工艺制备胶原,从海月水母中提取的活性水母胶原具有抗菌活性,microorganismPropionibacterium acnes疮疱丙酸杆菌,是引起面部丘疹的致病菌。国内较多文献报道了从牛腱、猪皮、猪软骨、鱼皮、鱼鳞中提取胶原蛋白的技术和工艺,均是采用酶解盐析提取工艺,采用盐析提取存在的问题是蛋白酶回收困难、盐回收困难和酸性溶液的循环利用困难。现有技术的海蜇胶原提取方法,均是采用将海蜇内外胚层与中胶层混合提取。这种内外胚细胞杂蛋白溶解和解离,对海蜇胶原提取带来影响。另外大多采用胶原蛋白酶解离与盐析工艺结合提取,盐析工艺缺点是采用大量的食盐,对形成含盐废水。
发明内容
本发明的目的在于,提供一种海蜇胶原蛋白及其制备方法,采用新的纯化工艺,有效回收提取工具酶,循环利用反应体系,得到的活性胶原蛋白纯度高,收得率高。
本发明的目的是由以下技术方案实现的,研制了一种海蜇胶原蛋白。所述的胶原蛋白是从海蜇的中胶层提取的,该胶原蛋白为白色纤维状固体或浅黄色固体粉术,堆密度为0.110-0.645g/ml,该胶原蛋白在酸性溶液中完全溶解,呈澄清透明溶液;该胶原蛋白的单链分子量在10-30万道尔顿,糖含量为2.5-5%,氨基酸含量为80-95%mg/100mg;其中,天门冬氨酸占7.9-8.3%,谷氨酸占10.0-12.9%,苏氨酸占3.5-4.0%,缬氨酸占3.5-3.9%,异亮氨酸占2.2-2.5%,赖氨酸占3.4-3.8%,羟赖氨酸占2.0-2.7%。
一种上述海蜇胶原蛋白的制备方法,按如下步骤进行;
(1)采用的原料为大型海蜇,使用盐渍海蜇或新鲜海蜇;
(2)原料的预处理;
将经盐渍脱水后的海蜇,用浓度为0.1-0.5%的碱性溶液洗涤、浸泡;浸泡时间0.5-2h,浸泡后的溶液pH为6-8,碱洗时有氨气产生,气泡明显;海蜇皮的上下皮层由原来的白色不透明,变为透明,而且容易剥离去掉,除去不良气味,氨离子及杂质;
(3)分离中胶层;
将碱性溶液洗涤、浸泡后的盐渍脱水海蜇,去掉透明的上下皮层,可明显见白色的中胶层,磨碎该白色的中胶层;
(4)解离中胶层;
采用蛋白酶解离磨碎的中胶层,酶用量0.1%-2%,解离温度10-30℃,搅拌解离时间10-48h;
(5)超滤分离浓缩;
将上述蛋白酶解离的中胶层离解液,采用超滤膜过滤器,控制膜进口压力在12kg/cm2,或采用外加电场10-70V/cm,截留浓缩分子量在10-30万道尔顿的胶原蛋白,其截留率95%-98%;
再将剩下的含有蛋白酶的离解液,采用醋酸纤维HFA-200膜,将蛋白酶截流分离出来,回收该蛋白酶重复循环使用;
(6)分离浓缩的胶原蛋白再经冷冻干燥,即采用慢速冻结方式,升华阶段的真空度在10-30Pa,冷阱温度在-50±0.1℃,得到白色纤维状固体或浅黄色固体粉末。
所述的(1)步采用的大型海蜇原料包括:根口水母科(Rhizostomalidae)的海蜇属的海蜇(Rhopilema esculentum Kishinouye);黄斑海蜇(Rhopilema hispidum)和叶腕水母科(Lobonematidae)的叶腕水母属(Lobonema)的叶腕海蜇(LobonmaSmithi)。
所述的(1)步原料盐渍海蜇质量符合国家标准,即水分,小于68%,食盐,18-25%,明矾,1.2-2.2%。
所述的(2)步原料的预处理中采用的碱性溶液为氢氧化钠溶液,碳酸钠溶液,碳酸氢钠溶液。
所述的(4)步解离中胶层所采用的蛋白酶或为酸性蛋白酶,或碱性蛋白酶。
所述的(4)步解离中胶层之后,还可将浓缩的湿胶原蛋白,再经胶原酶深度水解,该胶原酶的用量0.1-2.0%,解离温度20-40℃,解离时间10-48h,得到水解多肽,即,得到含30个左右的氨基酸残基的结构胶原多肽,该多肽分子长度为30-50纳米,分子量3000-20000道尔顿。
所述的(5)步超滤分离浓缩中所采用超滤膜,或采用聚合物膜Diaflo(XM30),或采用聚芳醚砜膜,或采用中空纤维素膜,或采用非对称超滤UF膜,或采用非对称超滤FS膜,或采用非对称超滤HF膜,或采用非对称超滤T膜。
本发明海蜇胶原蛋白及其制备方法的优点在于:由于在(2)步原料的预处理中,将经盐渍脱水后的海蜇,用浓度为0.1-0.5%的碱性溶液洗涤、浸泡;碱洗时有氨气产生,气泡明显;碱洗预处理目的是将海蜇皮上下皮层(即表皮层与胃层),由原来的白色不透明,变为透明,软化容易剥离,去除有色层;再是除去盐渍过程中的明矾等杂质和分解的氨类物质等,恢复海蜇蛋白活性;使得(3)步分离中胶层,去掉透明的上下皮层,顺利得到白色的中胶层,以便磨碎该白色的中胶层。由于在(4)步解离中胶层是,采用蛋白酶解离磨碎的中胶层,同时保留胶原蛋白的糖含量。采用苯酚-硫酸法(张维杰,1999)测定样品中糖含量;以果糖为标准,于490nm处测定。由于采用超滤浓缩纯化工艺,可以有效回收蛋白酶,使反应体系循环利用。本工艺得到的胶原蛋白产品,明显不同于牛、猪、鱼等提取的胶原蛋白的特征。采用分离的脱水脱腥的中胶层,经绞碎后,采用蛋白酶解离,超滤工艺,冷冻干燥,得到纯度高,具有活性的胶原蛋白。若进一步得到胶原蛋白多肽,可以将未干燥胶原,再经胶原酶深度水解,得到水解多肽,采用喷雾干燥工艺得到干粉,以利于存储。经不论从紫外吸收,常规氨基酸质量分数测定,还是从红外谱图测定看,所提取的蛋白质凝胶是胶原蛋白,与文献报道的海蜇胶原蛋白相符,而且获得的胶原蛋白纯度也较高。本发明海蜇胶原蛋白以盐渍海蜇原料计算,胶原蛋白收得率为3-5%。
具体实施方式
实施例1)
取盐渍海蜇120g,在0.2M氢氧化钠溶液100ml,浸泡2h,浸泡后的溶液为pH6.5,碱洗时有氨气产生,气泡明显,可以除去氨离子及杂质。海蜇皮由白色不透明,变为透明(与冷冻脱水海蜇类似),可明显见中胶层。去掉上下皮层,白色中胶层切片后置冰柜中保存。
取上述中胶层,磨碎,加0.1M乙酸,20ml,再加600mg胃蛋白酶(华美,Sina-American Biotec,pepsin 1∶3000),在室温下搅拌解离30h。
采用超滤膜过滤器,控制膜进口压力在1-2kg/cm2,并采用外加电场10-70V/cm,截留浓缩分子量在10-30万道尔顿的胶原蛋白,其截留率98%;所采用超滤膜,或采用聚合物膜Diaflo(XM30),或采用聚芳醚砜膜,或采用中空纤维素膜,或采用非对称超滤UF膜,或采用非对称超滤FS膜,或采用非对称超滤HF膜,或采用非对称超滤T膜。
分离浓缩的胶原蛋白再经冷冻干燥,即采用慢速冻结方式,升华阶段的真空度在10-30Pa,冷阱温度在-50±0.1℃,得到3.851g纤维状浅色固体的胶原蛋白,其收得率3.21%。本发明海蜇胶原蛋白以盐渍海蜇原料计算,收得率的计算公式:C%=(m1/m)×100%,其中,C%为收率,m1为胶原蛋白重量(g),m为盐渍海蜇的重量(g)。
该胶原蛋白的堆密度为0.110-0.645g/ml;该胶原蛋白在酸性溶液中完全溶解,呈澄清透明溶液;该胶原蛋白的单链分子量在10-30万道尔顿,糖含量为2.5-5%,氨基酸含量为80-95%mg/100mg;其中,天门冬氨酸占7.9-8.3%,谷氨酸占10.0-12.9%,苏氨酸占3.5-4.0%,缬氨酸占3.5-3.9%,异亮氨酸占2.2-2.5%,赖氨酸占3.4-3.8%,羟赖氨酸占2.0-2.7%。
胶原蛋白的糖含量,采用苯酚-硫酸法(张维杰,1999)测定样品中糖含量。以果糖为标准,于490nm处测定。以吸光值(A490)为横坐标,糖浓度为横坐标,绘制标准曲线,得线性回归方程:A490=0.004×C-0.0016,R=0.9999。称取0.114g样品,用0.5M乙酸溶解定容至50ml,测定糖含量为3.09%。
再将剩下的含有蛋白酶的离解液,使用醋酸纤维膜(HFA-200),将胃蛋白酶(分子量35000)截流以回收循环使用。
实施例(1)-(7)具体工艺条件与结果见表1:
对照实施例:
取50g盐渍海蜇,0.2M氢氧化钠,100ml浸泡2h,取40g中胶层,破碎,0.5M乙酸250ml,0.5%蛋白酶250mg,搅拌室温温育,48h,15℃。离心,有大量为解离物。3.5M盐析,有泡沫产生,4.5M有白色固体物,5.5M有大量絮状沉淀,透析袋(8000-12000D)透析。冷冻,干燥24h,得到0.761g浅絮状白色固体。得率1.52%。
本发明海蜇胶原蛋白氨基酸组成含量测定:
称取干燥的海蜇胶原蛋白10mg,加入浓度为5.7mol/L的盐酸溶液2mL,置于110度烘箱内水解24h,用HITACHI835氨基酸自动分析仪测定,氨基酸含量为92.57mg/100mg。氨基酸组成含量结果见表2。
表2海蜇胶原蛋白氨基酸组成含量结果
氨基酸种类 | 海蜇胶原蛋白(mg/100mg) | 氨基酸种类 | 海蜇胶原蛋白(mg/100mg) |
天门冬氨酸Asp | 8.31 | 缬氨酸Val | 3.92 |
谷氨酸Glu | 12.99 | 蛋氨酸Met | 0.62 |
丝氨酸Ser | 3.19 | 苯丙氨酸Phe | 1.21 |
组氨酸His | 0.25 | 异亮氨酸Iso | 2.46 |
甘氨酸Gly | 18.01 | 亮氨酸Leu | 3.66 |
苏氨酸Thr | 4.05 | 赖氨酸Lys | 3.40 |
丙氨酸Ala | 7.74 | 羟赖氨酸Hydroxylys | 2.41 |
精氨酸Arg | 7.77 | 脯氨酸Pro | 7.42 |
半胱氨酸Cys | 0 | 羟脯氨酸Hydroxypro | 3.62 |
酪氨酸Tyr | 0.33 | 色氨酸Try | 0 |
本领域的普通技术人员都会理解,在本发明的保护范围内,对于上述实施例进行修改,添加和替换都是可能的,其都没有超出本发明的保护范围。
Claims (7)
1、一种海蜇胶原蛋白,其特征在于:所述的胶原蛋白是从海蜇的中胶层提取的,该胶原蛋白为白色纤维状固体或浅黄色固体粉末,堆密度为0.110-0.645g/ml,该胶原蛋白在酸性溶液中完全溶解,呈澄清透明溶液;该胶原蛋白的单链分子量在10-30万道尔顿,糖含量为2.5-5%,氨基酸含量为80-95%mg/100mg;其中,天门冬氨酸占7.9-8.3%,谷氨酸占10.0-12.9%,苏氨酸占3.5-4.0%,缬氨酸占3.5-3.9%,异亮氨酸占2.2-2.5%,赖氨酸占3.4-3.8%,羟赖氨酸占2.0-2.7%。
2、一种如权利要求1所述海蜇胶原蛋白的制备方法,其特征在于:所述的制备方法按如下步骤进行;
(1)采用的原料为大型海蜇,使用盐渍海蜇或新鲜海蜇;
(2)原料的预处理;
将经盐渍脱水后的海蜇,用浓度为0.1-0.5%的碱性溶液洗涤、浸泡;浸泡时间0.5-2h,浸泡后的溶液pH为6-8,碱洗时有氨气产生,气泡明显;海蜇皮的上下皮层由原来的白色不透明,变为透明,而且容易剥离去掉,除去不良气味,氨离子及杂质;
(3)分离中胶层;
将碱性溶液洗涤、浸泡后的盐渍脱水海蜇,去掉透明的上下皮层,可明显见白色的中胶层,磨碎该白色的中胶层;
(4)解离中胶层;
采用蛋白酶解离磨碎的中胶层,酶用量0.1%-2%,解离温度10-30℃,搅拌解离时间10-48h;
(5)超滤分离浓缩;
将上述蛋白酶解离的中胶层离解液,采用超滤膜过滤器,控制膜进口压力在1-2kg/cm2,或采用外加电场10-70V/cm,截留浓缩分子量在10-30万道尔顿的胶原蛋白,其截留率95%-98%;
再将剩下的含有蛋白酶的离解液,采用醋酸纤维HFA-200膜,将蛋白酶截流分离出来,回收该蛋白酶重复循环使用;
(6)分离浓缩的胶原蛋白再经冷冻干燥,即采用慢速冻结方式,升华阶段的真空度在10-30Pa,冷阱温度在-50±0.1℃,得到白色纤维状固体或浅黄色固体粉末。
3、根据权利要求2所述海蜇胶原蛋白的制备方法,其特征在于:所述的(1)步采用的大型海蜇原料包括:根口水母科(Rhizostomalidae)的海蜇属的海蜇(Rhopilemaesculentum Kishinouye);黄斑海蜇(Rhopilema hispidum)和叶腕水母科(Lobonematidae)的叶腕水母属(Lobonema)的叶腕海蜇(Lobonma Smithi)。
4、根据权利要求2所述海蜇胶原蛋白的制备方法,其特征在于:所述的(2)步原料的预处理中采用的碱性溶液为氢氧化钠溶液,碳酸钠溶液,碳酸氢钠溶液。
5、根据权利要求2所述海蜇胶原蛋白的制备方法,其特征在于:所述的(4)步解离中胶层所采用的蛋白酶或为酸性蛋白酶,或碱性蛋白酶。
6、根据权利要求2所述海蜇胶原蛋白的制备方法,其特征在于:所述的(4)步解离中胶层之后,还可将浓缩的湿胶原蛋白,再经胶原酶深度水解,该胶原酶的用量0.1-2.0%,解离温度20-40℃,解离时间10-48h,得到水解多肽,即得到含30个左右的氨基酸残基的结构胶原多肽,该多肽分子长度为30-50纳米,分子量3000-20000道尔顿。
7、根据权利要求2所述海蜇胶原蛋白的制备方法,其特征在于:所述的(5)步超滤分离浓缩中所采用超滤膜,或采用聚合物膜Diaflo(XM30),或采用聚芳醚砜膜,或采用中空纤维素膜,或采用非对称超滤UF膜,或采用非对称超滤FS膜,或采用非对称超滤HF膜,或采用非对称超滤T膜。
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