CN105255981A - 一种非变性海蜇胶原蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种非变性海蜇胶原蛋白的制备方法，属于生物技术领域，以腌制海蜇加工下脚料为原料，建立在中低温条件下采用柠檬酸为提取剂的非变性胶原蛋白提取工艺，得到较高纯度的胶原蛋白产品，有效提高海蜇产品附加值，实现低值海蜇高值化利用，为胶原蛋白的制备提供新来源。

Description

一种非变性海蜇胶原蛋白的制备方法

技术领域

本发明公开的是一种以腌制海蜇加工下脚料为原料制备非变性胶原蛋白的方法，涉及食品生物技术领域。本发明工艺简单、成本低廉，制备的胶原蛋白提取率高、结构完整，适于工业生产，可用于医药、生物材料和美容等领域。

技术背景

胶原蛋白是生物体内含量最丰富的结构蛋白，广泛分布在哺乳动物皮肤、骨、血管和肌腱等结缔组织中，起着支撑、修复和保护的作用。胶原蛋白含有独特的由三条α-肽链组成的三螺旋结构，一般分子量都比较大，难溶于水和稀碱，某种程度上部分可溶于稀酸或中性盐，其独特的三螺旋结构，赋予其可成膜性、低免疫原性等优良特性，在食品、医药、美容、生物材料等领域具有重要地位。

由于哺乳动物体内存在大量的胶原蛋白，长期以来，工业上胶原蛋白的提取原料大部分都是来源于猪皮、牛皮等陆生哺乳动物的毛皮，但是近些年，由于口蹄疫、禽流感等家畜传染病的影响，人们对于家畜来源制品的安全性的不信任感增强，再者某些地区的宗教习俗等原因，对家畜制品也会有排斥心理，因此，寻找这些家畜毛皮以外的胶原蛋白来源成为新的研究热点。海洋来源的胶原蛋白拥有其他来源的胶原蛋白所不可比拟的优点，如含有更多的蛋氨酸(Met)含量、更低的热变性温度等，越来越受到消费者的喜爱。

海蜇是一种暖水性大型食用水母，色鲜味美，兼具多种药用功效，是当前进行人工养殖的最低等海洋动物之一，具有重要的渔业经济价值。21世纪初期，海蜇产品的市场需求量日益增加，人工海蜇养殖的技术取得重大突破，海蜇养殖产业快速发展，海蜇的高值化利用也日益受到人们的关注。研究表明，海蜇皮的干基组分中84.33%是蛋白质，而在这些蛋白质中，大部分都是胶原蛋白。因此，海蜇可以作为一个新型的胶原蛋白制备来源，相信在医药、生物材料和美容领域中都会具有不错的发展前景。

目前，胶原蛋白的提取方法可以归类为三种：利用高压辅助提取的物理方法；在低温或者热水条件下利用溶剂辅助提取的方法，根据溶剂的类型可分为酸法、碱法和盐法；利用蛋白酶在一定的温度和pH下进行酶解提取的酶法。一般来说，高压、高温条件提取的胶原蛋白都已经变性成明胶，只有在低温环境下提取的胶原才有可能保持胶原蛋白本身的三螺旋结构。

在现有的胶原蛋白制备技术中，酸提取法和酶法是最为广泛使用的，但是在这些技术中还存在着两个方面的问题：一方面，胶原蛋白得率不高，酸提取法的胶原得率一般不超过5%，某些原料甚至不含酸溶性胶原，酶法的胶原得率也在80%以下；另一方面，酶法采用的反应温度均在10℃以下，成本昂贵，提取时间也在1d以上，不利于工业推广。

发明内容

本发明提供了一种非变性海蜇胶原蛋白的制备方法，以腌制海蜇加工下脚料为原料，建立在中低温条件下采用柠檬酸为提取剂的非变性胶原蛋白提取工艺，得到较高纯度的胶原蛋白产品，有效提高海蜇产品附加值，实现低值海蜇高值化利用，为胶原蛋白的制备提供新来源。

本发明提供的非变性海蜇胶原蛋白的制备方法，所述方法包括如下：

（1）将腌制的海蜇加工下脚料用清水冲洗几遍，再用蒸馏水浸泡，并每隔2h更换一次蒸馏水，清洗1~2d，取出后搅拌机搅碎至无明显大颗粒，再用四层纱布过滤沥干；

（2）向搅拌获得的海蜇中加入5~20倍体积的丙酮浸泡1~2d，蒸馏水清洗至无味，再加入5~20倍体积的0.01~0.1mol/L的磷酸氢二钠溶液浸泡2~3d，蒸馏水清洗至中性，滤干；

（3）称取海蜇皮匀浆于添加含有1.5~2.0wt.%胃蛋白酶的0.05~0.07mol/L柠檬酸溶液中，使料液比达到1:1.0~1:3.0，15~20℃提取8~12h；

（4）离心取上清液加入NaCl溶液，搅拌过夜；离心取沉淀重新溶于柠檬酸溶液中，转入30~50kDa的透析袋，置于蒸馏水透析2~3d；冷冻干燥后即得胶原蛋白棉状固体。

步骤（2）具体步骤为：添加丙酮至料液比1:5~1:20，静置过夜，大量蒸馏水清洗至无异味，再用四层纱布过滤沥干；置于5~20倍体积的0.01~0.1mol/L的磷酸氢二钠溶液中浸泡2~3d，每隔6h更换一次溶液，大量蒸馏水清洗至中性，再用四层纱布过滤沥干，于4℃存放备用。

步骤（3）中柠檬酸浓度0.05mol/L、胃蛋白酶添加量1.5wt.%、料液比（m/V）1:2.0，在15℃下提取时间8h。

步骤（4）中上清液的NaCl终浓度为1.0mol/L，重溶的柠檬酸溶液浓度为1mmol/L。

本发明的优点在于：以腌制海蜇加工下脚料为原料，为海蜇高值化利用提供理论基础，为胶原蛋白的制备提供新途径；该工艺建立在中低温15~20℃条件下，与传统工艺相比提升了10~15℃，大幅度降低了温控成本；将提取阶段的时间控制在了8h，与现有的技术中24~72h的长时间浸提相比，大大缩短了制备时间，更易实现工业化生产；获得的胶原蛋白提取率高，可以达到97%以上，提高原料利用率，实现了资源最大化；该胶原蛋白还兼具色泽白、纯度高、结构完整、易溶于弱酸和低抗原性等优点，可应用于食品、医药、美容、生物材料等领域。

附图说明

图1酸种类对胶原蛋白提取率的影响。

图2盐酸、柠檬酸对胶原蛋白结构的影响。其中a:Marker，b:柠檬酸提粗胶原蛋白，c:盐酸提粗胶原蛋白。

图3提取温度对胶原蛋白提取率的影响。

图4不同提取温度对胶原蛋白结构的影响。其中a:Marker，b:4℃，c:10℃，d:15℃，e:20℃，f:25℃，g:30℃。

图5酸浓度的确定曲线。

图6提取时间的确定曲线。

图7料液比的确定曲线。

图8加酶量的确定曲线。

图9海蜇胶原蛋白的SDS-PAGE图谱。其中a:Marker，b:最优工艺条件制备胶原蛋白，c:牛皮Ⅰ型胶原。

图10海蜇胶原蛋白的近紫外扫描图谱。

图11温度对海蜇胶原蛋白黏度的影响曲线。

图12海蜇胶原蛋白的傅里叶红外光谱。

图13NaCl浓度对海蜇胶原蛋白溶解度的影响曲线。

图14pH值对海蜇胶原蛋白溶解度的影响曲线。

具体实施方式

实施例1腌制海蜇加工下脚料的预处理

（1）除盐：将腌制的海蜇加工下脚料用清水冲洗几遍，再用蒸馏水浸泡，并每隔2h更换一次蒸馏水，清洗1~2d；

（2）匀浆：保持一定比例的水分，搅拌机搅碎至无明显大颗粒，再用四层纱布过滤沥干；

（3）脱脂：添加丙酮至料液比1:5~1:20，静置过夜，大量蒸馏水清洗至无异味，再用四层纱布过滤沥干；

（4）去杂蛋白：置于5~20倍体积的0.01~0.1mol/L的磷酸氢二钠溶液中浸泡2~3d，每隔6h更换一次溶液，大量蒸馏水清洗至中性，再用四层纱布过滤沥干，于4℃存放备用。

实施例2海蜇胶原蛋白提取工艺的优化

（1）胶原蛋白提取率的测定：采用国标GB/T9695.23-2008中羟脯氨酸的测定方法，通过羟脯氨酸含量来间接定量胶原蛋白，胶原蛋白转换为羟脯氨酸的转换系数为11.1。以标准物L-羟脯氨酸的浓度（μg/mL）为横坐标，以吸光值A560为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程A560=0.2193C+0.011，R=0.9993；

（2）胶原蛋白三螺旋结构完整性的测定：采用SDS-PAGE的方法分析胶原蛋白三螺旋结构是否被破坏。分离胶浓度为7.5%，浓缩胶浓度为3.5%；

（3）最佳酸种类的确定：在4℃、1.0wt.%胃蛋白酶添加量、料液比（m/V）1:2.0和提取时间24h条件下考察不同提取剂（冰乙酸、盐酸、柠檬酸和乳酸）对胶原蛋白提取率及结构完整性的影响，最佳酸种类为柠檬酸（图1-2）；

（4）最适提取温度的确定：在1.0wt.%胃蛋白酶添加量、0.05mol/L柠檬酸为提取剂、料液比（m/V）1:2.0和提取时间12h条件下考察不同温度（4~30℃）对胶原蛋白提取率及结构完整性的影响，最适提取温度为15℃（图3-4）；

（5）酸浓度的确定：在15℃、1.0wt.%胃蛋白酶添加量、料液比（m/V）1:2.0和提取时间6h条件下比较不同柠檬酸浓度（0.00~0.08mol/L）对胶原蛋白提取率的影响，最适柠檬酸浓度为0.05mol/L（图5）；

（6）提取时间的确定：在15℃、1.0wt.%胃蛋白酶添加量、0.05mol/L柠檬酸为提取剂和料液比（m/V）1:2.0条件下比较不同提取时间（0~14h）对胶原蛋白提取率的影响，最适提取温度为8h（图6）；

（7）料液比的确定：在15℃、1.0wt.%胃蛋白酶添加量、0.05mol/L柠檬酸为提取剂、提取时间8h条件下比较不同料液比（m/V）（1:1.0~1:8.0）对胶原蛋白提取率的影响，最适料液比为1:2.0（图7）；

（8）酶添加量的确定：在15℃、0.05mol/L柠檬酸为提取剂、料液比（m/V）1:2.0和提取时间8h条件下考察、0.00~2.00wt.%胃蛋白酶添加量对胶原蛋白提取率的影响，最适胃蛋白酶添加量为1.50%（图8）；

（9）在上述单因素实验的基础上，以料液比(因素A)、酸浓度(因素B)、加酶量（因素C）和提取时间(因素D)为考察因素，选取合适的三水平，以胶原蛋白提取率为目标函数，选用正交表L₉(3⁴)进行正交实验。确定主次因素为B>D>A>C，确定最佳提取工艺为柠檬酸浓度0.05mol/L、胃蛋白酶添加量1.5wt.%、料液比（m/V）1:2.0和提取时间8h，在该条件下胶原蛋白提取率为97.41%。

表因素水平表

实施例3海蜇胶原蛋白的分离纯化

（1）向海蜇胶原蛋白粗提液中缓慢加入高浓度NaCl溶液至终浓度为1.0mol/L，搅拌过夜；

（2）将粗提液于4℃条件下20000g离心15min，取沉淀重新溶于1mmol/L的柠檬酸中，转入40kDa的透析袋，置于蒸馏水透析3d，期间每隔6h置换一次蒸馏水；

（3）将透析液于4℃条件下20000g离心15min，取沉淀冷冻干燥后即为胶原蛋白干棉。

实施例4海蜇胶原蛋白的理化性质特征

本发明提供的一种非变性海蜇胶原蛋白的提取及其制备方法，该方法制备的产品具有以下特征：

（1）由三条相同α1链构成，结构为[α1]₃，为典型水产类I型胶原，其α1链分子量为124kDa（图9）；

（2）氨基酸组成：

表海蜇胶原蛋白氨基酸组成

（3）近紫外光区扫描图谱中，在238nm和274nm处有吸收峰（图10）；

（4）将黏度变化50%时所对应的温度定义为热变性温度，则其热变性温度为22.7℃（图11）；

（5）傅里叶红外光谱中，在3416cm^-1、2931cm^-1、1653cm^-1、1555cm^-1、1453cm^-1、1397cm^-1、1244cm^-1、1069cm^-1和615cm^-1处有吸收峰（图12）；

（6）将0.05mol/L柠檬酸溶液中产品的溶解度定义为1，则其在1.0mol/L的NaCl溶液中的相对溶解度为6.1%；在pH值为6的溶液中的相对溶解度为7.9%（图13-14）。

Claims (4)

1.一种非变性海蜇胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下：

（1）将腌制的海蜇加工下脚料用清水冲洗几遍，再用蒸馏水浸泡，并每隔2h更换一次蒸馏水，清洗1~2d，取出后搅拌机搅碎至无明显大颗粒，再用四层纱布过滤沥干；

（2）向搅拌获得的海蜇中加入5~20倍体积的丙酮浸泡1~2d，蒸馏水清洗至无味，再加入5~20倍体积的0.01~0.1mol/L的磷酸氢二钠溶液浸泡2~3d，蒸馏水清洗至中性，滤干；

（3）称取海蜇皮匀浆于含有1.5~2.0wt.%胃蛋白酶的0.05~0.07mol/L柠檬酸溶液中，使料液比达到1:1.0~1:3.0，15~20℃提取8~12h；

（4）离心取上清液加入NaCl溶液，搅拌过夜；离心取沉淀重新溶于柠檬酸溶液中，转入30~50kDa的透析袋，置于蒸馏水透析2~3d；冷冻干燥后即得胶原蛋白棉状固体。

2.根据权利要求1所述的一种非变性海蜇胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（2）具体步骤为：添加丙酮至料液比1:5~1:20，静置过夜，大量蒸馏水清洗至无异味，再用四层纱布过滤沥干；置于5~20倍体积的0.01~0.1mol/L的磷酸氢二钠溶液中浸泡2~3d，每隔6h更换一次溶液，大量蒸馏水清洗至中性，再用四层纱布过滤沥干，于4℃存放备用。

3.根据权利要求1所述的一种非变性海蜇胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（3）中柠檬酸浓度0.05mol/L、胃蛋白酶添加量1.5wt.%、料液比（m/V）1:2.0，在15℃下提取时间8h。

4.根据权利要求1所述的一种非变性海蜇胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（4）中上清液的NaCl终浓度为1.0mol/L，重溶的柠檬酸溶液浓度为1mmol/L。