CN105463046A

CN105463046A - 一种鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的制备方法及其用途

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Publication number: CN105463046A
Application number: CN201610032440.4A
Authority: CN
Inventors: 陈清西; 曹兴梅; 李华亮; 董欣; 熊佑熊
Original assignee: GUANGZHOU TUOLONG BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: GUANGZHOU TUOLONG BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date: 2016-01-18
Filing date: 2016-01-18
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2036-01-18
Also published as: CN105463046B

Abstract

本发明涉及一种鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的制备方法，包括：A.在溶剂中高压蒸煮已去除肌肉、脂肪的鳄鱼骨，浓缩得鳄鱼骨胶；B.将得到的鳄鱼骨胶用蛋白酶处理，得到酶解液；C.将所述酶解液离心分离，取上清干燥，得到鳄鱼骨胶原蛋白肽粉。本发明的制备方法简单、方便，适合大规模生产，不仅可以提高鳄鱼产品开发的附加值，避免资源浪费，还可以减少环境污染，带来良好的经济效益和社会效益。

Description

一种鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的制备方法及其用途

技术领域

本申请涉及生物制品领域，更具体地，涉及一种鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的制备方法及其用途。

背景技术

胶原蛋白是人体或其他动物体内含量最丰富的一类蛋白质，主要存在于骨、皮、肌腱、血管等组织，作为结缔组织中极为重要的一种蛋白质，起着支撑器官、保护机体的功能。胶原蛋白作为天然的高分子化合物，具有合成高分子材料无法比拟的生物相容性和可降解性，所以用途非常广泛，遍及医药、食品、化妆品等领域。

胶原蛋白肽是一种新型胶原蛋白类产品，是以胶原蛋白或富含胶原蛋白的物质为原料制备的。它具有原胶原蛋白或组成氨基酸所不具有的独特生理功能，可完全溶解于水，水溶液粘度低，分子量较小，因此，它更容易透过表皮被真皮吸收，也容易通过消化道被消化，在日化、保健食品领域有广阔的应用前景。

关于胶原蛋白肽的制备，目前多见于以猪、牛的皮和骨、或水产来源酶解处理获得的胶原蛋白肽的研究。而以鳄鱼特别是鳄鱼骨为原料的胶原蛋白肽还少见报道。随着鳄鱼人工养殖与繁殖技术的日趋成熟，食用鳄的量大增，每年都有大量的鳄鱼骨被丢弃，不仅造成资源浪费，而且还会污染环境。如果能合理利用鳄鱼骨的价值，将变废为宝，并带来显著的经济价值和社会价值。

目前胶原蛋白肽的制备，多采用酶解的生物学方法。酶法作用条件较温和，产品的相对分子质量分布较窄，反应条件和过程容易控制，安全性较高。酶法制备的胶原蛋白肽不仅可应用于功能性食品上，在医学和药学方面的应用也被广泛关注。由于原料为鳄鱼骨，成分质地比较特殊，普通蛋白酶无法对鳄鱼骨胶原蛋白进行彻底地水解，且水解得到的产物其生物学效应不显著。因此，对鳄鱼骨进行水解的难点在于水解酶的选择以及不同酶间的组合。由于不同底物的分子结构和氨基酸序列存在差异，而不同的蛋白酶的水解作用位点又不同，这直接导致不同蛋白酶的水解产物具有不同的生物学性质和不同的相对分子质量分布范围。酶的不同组合方式是调整产物分子质量及分布的有效方法。在选择用于水解鳄鱼骨的蛋白酶时，酶系、酶作用的强弱、酶的作用位点等都会对最终产物产生重要影响，对多肽产品开发起着至关重要的作用。

发明内容

本发明涉及一种鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的制备方法，包括：A.在溶剂中高压蒸煮已去除肌肉、脂肪的鳄鱼骨，浓缩得鳄鱼骨胶；B.将得到的鳄鱼骨胶用蛋白酶处理，得到酶解液；C.将所述酶解液离心分离，取上清干燥，得到鳄鱼骨胶原蛋白肽粉。在所述制备方法的优选的实施方案中，所述在溶剂中高压蒸煮的时间可以是30±5分钟，其中所述溶剂可以是水，优选蒸馏水，其中所述鳄鱼骨的重量与所述溶剂的体积的比例可以为1:3，其中所述浓缩可以是浓缩至溶液的总体积的50％。在所述制备方法的优选的实施方案中，其中所述蛋白酶可以为木瓜蛋白酶，所述木瓜蛋白酶与所述鳄鱼骨胶的重量比例可以为0.8％-1.8％，优选为1.6％。在所述制备方法的优选的实施方案中，其中所述蛋白酶处理的条件可以是在保持所述蛋白酶活性的pH下、在55℃±2℃的温度下水解4小时±5分钟。在所述制备方法的优选的实施方案中，其中所述离心可以是在室温以4500rpm离心15±5分钟。在所述制备方法的优选的实施方案中，其中所述干燥可以包括冷冻干燥和喷雾干燥，优选冷冻干燥。

本发明还涉及由本发明的制备方法制备的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉。

本发明还涉及包含本发明的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的用于保健品或化妆品的抗氧化剂、抗DNA损伤剂或美白添加剂。

本发明还涉及本发明的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉作为保健品或化妆品中的抗氧化剂、抗DNA损伤剂或美白添加剂的用途。

鳄鱼骨含有丰富的胶原蛋白，通过现代生物技术的酶法适当处理后，能够获得优质的胶原蛋白肽。

本申请的实施方案中，本发明人所选择的木瓜蛋白酶为巯基蛋白酶，是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶，可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端，并能优先水解那些在肽键的N-端具有两个羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽键。本申请的实施例示出，木瓜蛋白酶水解鳄鱼骨胶原蛋白的产物为具有还原性末端的产物，具有很好的生物学效应。

此外，本申请公开的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的制备方法，不同于以往处理原材料的复杂工序，而是跳过了从原料中提取胶原蛋白的工艺，直接对原材料进行处理，获得了功效良好的优质胶原蛋白肽，达到了简化制备工艺的目的。

本申请制备的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉不仅可以提高鳄鱼生产加工的附加值，同时可减少环境污染、避免资源浪费，从而取得良好的社会价值和经济价值。本申请实施例中的实验结果表明，本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉在抗氧化、体外抗DNA损伤方面效果显著；在对蘑菇酪氨酸酶活性的实验中，本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉对酪氨酸酶活性具有显著的抑制效果，说明其具有很好的美白功效。

附图说明

图1显示了不同蛋白酶对鳄鱼骨胶水解的影响。在图1中，横坐标为不同蛋白酶(中性蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶和胰蛋白酶)，纵坐标为羟脯氨酸含量。

图2显示了不同酶量对鳄鱼骨胶水解的影响。其中，横坐标为不同酶量(0.8％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％)，纵坐标为羟脯氨酸含量。

图3显示了不同时间对鳄鱼骨胶水解的影响。其中，横坐标为不同酶解时间(1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h)，纵坐标为羟脯氨酸含量。

图4显示了本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的全波长扫描结果。其中，横坐标为波长，纵坐标为吸光度值。

图5是本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的抗氧化活性检测，显示了本申请的不同浓度的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉对DPPH和OH的清除率及相对总还原力的影响。

图6显示了本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉对小鼠线粒体肿胀的影响。横坐标为不同的时间(0min、5min、10min、15min、20min、25min)，纵坐标为吸光度值OD₅₂₀nm。

图7是DNA琼脂糖凝胶电泳图，显示了本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉在体外对由羟自由基引发的DNA损伤的保护作用。其中，泳道1：无损伤对照组，泳道2：损伤对照组，泳道3：0.5mg/mL的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉组，泳道4：1.0mg/mL鳄鱼骨胶原蛋白肽粉组。

图8显示了本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉对蘑菇酪氨酸酶活性的影响。横坐标为不同浓度的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉(0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL)，纵坐标为酪氨酸酶的相对活性。

图9显示了本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖的影响。横坐标为不同浓度的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉处理组(浓度分别为12.5、25、50、100、200、400、800μg/mL)，纵坐标为细胞相对增殖率。

具体实施方式

下面将以实施例的方式对本申请作进一步的详细描述，以使本领域技术人员能够实践本申请。应当理解，可以采用其他实施方式，并且可以做出适当的改变而不偏离本申请的精神或范围。为了避免对于使本领域技术人员能够实践本申请来说不必要的细节，说明书可能省略了对于本领域技术人员来说已知的某些信息。因此，以下详细描述不应以限制性的意义来理解，且本发明的范围仅由所附权利要求界定。

以下的实施例便于更好地理解本申请，但并不用来限制本申请的范围。

下述实施例中所使用的各原料，除特别指出的以外，均可由市售获得。

实施例1

不同蛋白酶对鳄鱼骨胶水解的影响

取新鲜鳄鱼骨，去掉多余的肉、脂肪，清洗，剁成小块后，加入适量蒸馏水，鳄鱼骨的重量与加入水的体积比例为1:3，在高压锅(GI54，Zealway，美国)内煮(压力约0.4MPa)30分钟后，冷却，浓缩至溶液的总体积的50％，得鳄鱼骨胶。取6份等量鳄鱼骨胶，分别放入6个烧杯中，在各烧杯中分别加入基于骨胶重量的1％的中性蛋白酶(枯草芽孢杆菌来源的中性蛋白酶，枣庄市杰诺生物酶有限公司)、酸性蛋白酶(黑曲霉来源的酸性蛋白酶，枣庄市杰诺生物酶有限公司)、碱性蛋白酶(地衣芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶，枣庄市杰诺生物酶有限公司)、木瓜蛋白酶(上海生工)、复合蛋白酶(CN复合蛋白酶，无锡杰仁生物科技有限公司)和胰蛋白酶(无锡杰仁生物科技有限公司)，具体酶解条件如表1所示。3小时后，将酶解液加热煮沸10分钟使酶失活。再在室温以4500rpm离心15分钟，取上清液为供试品溶液，检测羟脯氨酸含量。

表1酶解条件

结果见图1。结果表明：木瓜蛋白酶的酶解效果最好。

不同酶量对鳄鱼骨胶水解的影响

取新鲜鳄鱼骨，去掉多余的肉、脂肪，清洗，剁成小块后，加入适量蒸馏水(鳄鱼骨的重量与加入水的体积比例为1:3)在高压锅(GI54，Zealway，美国)内煮(压力约0.4MPa)30分钟后，冷却，浓缩至溶液的总体积的50％，得鳄鱼骨胶。取6份等量鳄鱼骨胶，分别放入6个烧杯中，分别加入酶量为基于骨胶重量的0.8％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％的木瓜蛋白酶(上海生工)，55℃水解4小时后，将酶解液加热煮沸10分钟使酶失活。再在室温以4500rpm离心15分钟，取上清液为供试品溶液，检测羟脯氨酸的含量。

结果见图2。结果表明：在酶量为1.6％时，水解效果最好。

不同酶解时间对鳄鱼骨胶水解的影响

取新鲜鳄鱼骨，去掉多余的肉、脂肪，清洗，剁成小块后，加入适量蒸馏水(鳄鱼骨的重量与加入水的体积比例为1:3)在高压锅(GI54，Zealway，美国)内煮(压力约0.4MPa)30分钟后，冷却，浓缩至溶液的总体积的50％，得鳄鱼骨胶。取6份等量鳄鱼骨胶，分别放入6个烧杯中，加入酶量为基于骨胶重量的1.6％的木瓜蛋白酶(上海生工)，在55℃水解。设置酶解时间分别为1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h，之后将酶解液加热煮沸10分钟使酶失活。再在室温以4500rpm离心15分钟，取上清液为供试品溶液，检测羟脯氨酸的含量。

结果见图3。结果表明：在酶解时间4小时时，与酶解7、8小时时有几乎相同的酶解效果，综合考虑时间成本，确定4小时为最佳的酶解时间。

实施例2：鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的制备

取新鲜鳄鱼骨，去掉多余的肉、脂肪，清洗，剁成小块后，加入适量蒸馏水(鳄鱼骨的重量与加入水的体积比例为1:3)在高压锅(GI54，Zealway，美国)内煮(压力约0.4MPa)30分钟后，冷却，浓缩至溶液的总体积的50％，得鳄鱼骨胶。加入基于鳄鱼骨胶重量的1.6％的木瓜蛋白酶(上海生工)，温度55℃水解4小时后，加热煮沸10分钟使酶失活。再在室温以4500rpm离心15分钟，取上清液，冷冻干燥得到粉末状的鳄鱼骨胶原蛋白肽。

鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的水溶液经紫外全波长扫描后在220nm左右有最大吸收峰，这是胶原蛋白的特征吸收峰。对以上所得的粉末进行了全波长扫描，结果如图4所示。通过分光光度法测得其中羟脯氨酸的含量为12.38g/100g，说明所得鳄鱼骨胶原蛋白肽粉中胶原蛋白的含量很高。

实施例3：本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的抗氧化效果

1、本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉对DPPH、^.OH清除能力及还原力的影响1)对DPPH清除能力的影响：

取2mL的实施例2制备的不同浓度的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的水溶液(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2mg/mL)置于15mL试管中，加入2mL0.1mol/LDPPH溶液(用95％乙醇配制)，混匀，室温反应30min，同时以95％乙醇为空白对照，于517nm波长处测定吸光度值(A)，计算DPPH^.清除率。清除率＝(A_样品－A_空白)/A_空白×100％。

2)对^.OH清除能力的影响：

采用水杨酸法测定样品清除羟自由基(^.OH)能力。在反应体系中加入1mL9mmol/LFeSO₄(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)溶液和1mL9mmol/L的水杨酸(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)-乙醇溶液，然后加入不同浓度(4、6、8、10、12、14、16、18、20mg/mL)的实施例2制备的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的水溶液1mL，最后加入1mL8.8mmol/LH₂O₂(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)启动反应。对照液中以1mL蒸馏水替换同体积的样品液，37℃下保温30min。以蒸馏水为参比液，在510nm处测定其吸光度值(A)。计算清除羟自由基的能力。清除率(％)＝[Ac-(Ai-Aj)/Ac]×100％。其中，Ac为空白对照液的吸光度值；Ai为加入样品液后的吸光度值；Aj为样品液的本底吸光度值。

3)对还原力的影响：

取1mL不同浓度(0.5、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4mg/mL)的实施例2制备的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的水溶液(其中空白组为1mL蒸馏水)，加入1mL的磷酸盐(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)缓冲液(0.2mol/L，pH6.6)和1mL质量分数为1％铁氰化钾(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)溶液，混匀，置于50℃水浴20min后加入1mL质量分数为10％的三氯乙酸(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)，混匀后5000r/min离心10min。取上清2mL，加入2mL蒸馏水和0.5mL0.1％三氯化铁(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)，混匀后测定混合液在700nm处吸光度值(A)。吸光度值越高说明还原力越强。

相对还原力(％)＝(A_样品-A_空白)/A_空白×100％

结果见图5。由图5A-C可知：清除率、还原力均随着鳄鱼骨胶原蛋白肽粉浓度的增大而增大，呈现明显的量效关系。

2、本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉对小鼠红细胞氧化溶血抑制率的影响

红细胞悬浮液的制备：小鼠眼球取血，抗凝血用生理盐水洗涤三次后，制成0.5％的悬浮液。

取0.5％红细胞悬液1mL于试管中，加入不同浓度(10、20、30mg/mL，对照为0mg/mL)的实施例2制备的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的水溶液0.1mL，混匀，最后加入0.1mL200mmol/LH₂O₂(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)启动反应，37℃温育1h后，用4mL生理盐水稀释，1000g离心5min，取上清液，测定OD₄₁₅nm。结果示于表2中(见下)。

由表2可知，不同浓度的鳄鱼骨胶原蛋白肽对小鼠红细胞氧化性溶血均具有一定的抑制作用，随着鳄鱼骨胶原蛋白肽浓度的增加，对小鼠红细胞氧化性溶血抑制率也逐渐增加，表现出一定的量效关系。

表2鳄鱼骨胶原蛋白肽对H₂O₂诱导的小鼠红细胞溶血的抑制作用

3、本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉对小鼠肝线粒体肿胀的影响

肝线粒体的制备：取肝组织在冰浴下，以预冷过的0.25mol/L蔗糖(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)制成10g/100mL匀浆，3000g4℃离心20min，上清液再以10000g4℃离心20min，所得沉淀用10mmol/L(pH7.4)Tris-HCl(上海生工)缓冲液洗涤2次后，即为线粒体沉淀，用10mmol/LTris-HCl(上海生工)缓冲液配成含蛋白质为0.5mg/mL线粒体悬浮液，置4℃备用。

取3mL肝线粒体悬浮液，加入不同浓度(1、5、10mg/mL，对照为0mg/mL)的实施例2制备的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的水溶液0.1mL后，以1mmol/LFeSO₄(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)50μL和1mmol/LV_C(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)50μL激发线粒体膨胀，测定不同时间(0、1、5、10、15、20、25min)的OD₅₂₀nm。结果示于图6中。

由图6可知：随着时间的延长各实验组在520nm处吸光度值下降，说明线粒体膜被氧化损伤而发生了肿胀，其中对照组下降幅度最大，加入鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的组随鳄鱼骨胶原蛋白肽的浓度的增加下降趋势减缓，表明本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉可抑制^.OH所致氧化损伤程度，肿胀减轻，而且呈现剂量依赖关系。

4、本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉对小鼠组织及肝线粒体丙二醛含量的影响

组织提取液的制备：处死小鼠后，迅速取小鼠的肝、脾、心、肾组织各1g，用冷生理盐水漂洗，除去血液，剪碎，离心，匀浆，整个过程于冰浴中完成。匀浆完全后将匀浆液以3000r/min离心10min，上清液即为组织匀浆液。取1.5mL组织匀浆液或0.5mg/mL肝线粒体，加不同浓度(10、20、30mg/mL)的实施例2制备的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的水溶液0.1mL及6mmol/LFeSO₄(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)200μL，混匀，最后加60mmol/L80μLH₂O₂(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)。在37℃水浴1h后，加入1.5mL10％三氯乙酸(TCA)(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)结束反应，再加入1.5mL0.67g/100mL硫代巴比妥酸(TBA)(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)，沸水浴15min，冷却后3500r/min离心10min，测定上清液的OD₅₃₂nm。结果示于表3中。

由表3可知，鳄鱼骨胶原蛋白肽对Fe²⁺激发的肝脏、肾脏、心脏、脾脏及肝线粒体的脂质过氧化反应(MDA生成)均有明显的抑制作用。

表3鳄鱼骨胶原蛋白肽对小鼠组织及肝线粒体丙二醛含量的影响

5、本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉在体外对DNA氧化损伤的保护能力

为了研究实施例2所制得的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉在体外对由羟自由基引发的DNA损伤是否具有保护作用，我们构建了体外羟自由基DNA损伤模型。

实验组依次加入1μLpET-32αDNA、2μLPBS(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)(100mM，pH7.4)、2μL不同浓度(0、0.5、1.0mg/mL)的实施例2制备的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的水溶液、3μL2mMFeSO₄(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)及4μL8.8mMH₂O₂(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)。损伤对照组依次加入1μLpET-32αDNA、4μLPBS(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)(100mM，pH7.4)、3μL2mMFeSO₄(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)及4μL8.8mMH₂O₂(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)。无损伤对照组加入1μLpET-32αDNA和11μLPBS(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)(100mM，pH7.4)。混匀，37℃孵育30min。然后在1％的琼脂糖(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)凝胶上进行电泳。结果示于图7中。

由图7可知，第1泳道是无损伤对照组，主要以超螺旋形式存在，另外还有少量的开环和复制中间体形式。第2泳道是损伤对照组，硫酸亚铁和过氧化氢产生羟自由基，对超螺旋DNA产生损伤，变成开环DNA。第3和4泳道分别加入了0.5和1.0mg/mL实施例2制备的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的水溶液，结果表明本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽对羟自由基介导的DNA链断裂有显著的保护作用。

实施例4：本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉对酪氨酸酶活力的影响

以L-DOPA(Sigma-Aldrich公司)为底物，在3mL反应体系中含有pH6.8、0.2mol/L2.55mL磷酸缓冲液(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)和300μL1mg/mLL-DOPA(Sigma-Aldrich公司)底物，加入50μL200μg/mL蘑菇酪氨酸酶(美国Sigma)、100μL不同浓度(0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL)的实施例2制备的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的水溶液，立刻混匀，30℃恒温下测定475nm的光密度值随时间的增长直线，从直线的斜率求得酶活力，消光系数按ε＝3700(mol/L_.cm)^-1计算。以酶的相对剩余活力对鳄鱼骨胶原蛋白肽的浓度作图，求得IC₅₀值。结果示于图8中。

由图8可知，随着鳄鱼骨胶原蛋白肽浓度的增大，酪氨酸酶活力逐渐下降，说明鳄鱼骨胶原蛋白肽对蘑菇酪氨酸酶活力具有明显的抑制作用。测定导致酶活力下降50％时的鳄鱼骨胶原蛋白肽浓度为175μg/mL。

实施例5：本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉对小鼠B16黑色素瘤细胞的毒性实验

采用RPMI-1640培养基(Gibco公司)(含有10％新生小牛血清(上海生工)、青霉素(Gibco公司)100U/mL、链霉素(Gibco公司)100μg/mL)，在CO₂培养箱37℃，CO₂为5％的饱和湿度条件下培养小鼠B16黑色素瘤细胞。待细胞生长近融合状态，用0.25％胰蛋白酶(Gibco公司)消化，收集后调整细胞浓度，将得到的小鼠B16黑色素瘤单细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔200μL，过夜，待细胞贴壁后，吸出原培养基，再加入不同浓度(0、12.5、25、50、100、200、400、800mg/mL)的200μL含本申请实施例2制备的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的培养基，继续培养48h后弃培养液，用pH7.4的PBS(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)缓冲液(137mmol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，10mmol/LNa₂HPO₄，2mmol/LKH₂PO₄)洗涤2次，每孔加入10μL的5mg/mLMTT(Sigma-Aldrich公司)和90μL新鲜的RPMI-1640(Gibco公司)培养基，在CO₂培养箱37℃、CO₂为5％的饱和湿度条件下继续培养4h后，弃上清，每孔加入200μLDMSO(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)，在37℃条件下，避光震荡10min，使紫色结晶全部溶解。立即于酶标仪上测定在490nm的吸光度值。每一浓度设5个复孔，取平均值。每一次实验均取同一传代细胞。结果示于图9中。

由图9可知，用12.5-800μg/mL的鳄鱼骨胶原蛋白肽与小鼠B16黑色素瘤细胞共培养48h后，对B16黑色素瘤细胞的增殖没有明显影响，表明鳄鱼骨胶原蛋白肽无细胞毒性。

以上结果表明，本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉对小鼠B16黑色素瘤细胞无细胞毒性，不仅具有良好的抗氧化活性，而且能够抑制酪氨酸酶活性，抑制作用可能是通过清除活性氧来实现的。因此，本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉具有很好的保护组织氧化损伤和潜在的美白功效，可以开发为保健食品或作为化妆品的美白添加剂。

综上所述，以上仅为本申请的较佳实施例而已，并非用于限定本申请的保护范围，因此，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的制备方法，包括：

A.在溶剂中高压蒸煮已去除肌肉、脂肪的鳄鱼骨，浓缩得鳄鱼骨胶；

B.将得到的鳄鱼骨胶用蛋白酶处理，得到酶解液；

C.将所述酶解液离心分离，取上清干燥，得到鳄鱼骨胶原蛋白肽粉。

2.如权利要求1所述的制备方法，其中所述在溶剂中高压蒸煮的时间是30±5分钟，其中所述溶剂是水，优选蒸馏水，其中所述鳄鱼骨的重量与所述溶剂的体积的比例为1:3，其中所述浓缩是浓缩至溶液的总体积的50％。

3.如权利要求1所述的制备方法，其中所述蛋白酶为木瓜蛋白酶，所述木瓜蛋白酶与所述鳄鱼骨胶的重量比例为0.8％-1.8％，优选为1.6％。

4.如权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其中所述蛋白酶处理的条件是在保持所述蛋白酶活性的pH下、在55℃±2℃的温度下水解4小时±5分钟。

5.如权利要求1所述的制备方法，其中所述离心是在室温以4500rpm离心15±5分钟。

6.如权利要求1所述的制备方法，其中所述干燥包括冷冻干燥和喷雾干燥，优选冷冻干燥。

7.一种鳄鱼骨胶原蛋白肽粉，所述鳄鱼骨胶原蛋白肽粉由根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法制备。

8.一种用于保健品或化妆品的抗氧化剂、抗DNA损伤剂或美白添加剂，所述抗氧化剂、抗DNA损伤剂和美白添加剂包含根据权利要求7所述的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉。

9.根据权利要求7所述的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉作为保健品或化妆品中的抗氧化剂、抗DNA损伤剂或美白添加剂的用途。