CN103421872B - 一种鳄鱼皮胶原蛋白肽的制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

一种鳄鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，包括：在溶剂中煮已去除脂肪的鳄鱼皮；将煮好的鳄鱼皮用蛋白酶处理，得到酶解液；将所述酶解液离心分离，取上清液干燥，得到鳄鱼皮胶原蛋白肽。所得到的鳄鱼皮胶原蛋白肽可用作化妆品中的抗氧化剂、保湿剂、抗DNA损伤剂或美白添加剂。本发明的制备方法简单、方便，适合大规模生产，不仅可以提高鳄鱼产品开发的附加值，还可以减少环境污染，带来良好的经济价值和社会价值。

Description

一种鳄鱼皮胶原蛋白肽的制备方法及其用途

技术领域

本申请涉及生物制品领域，具体地，涉及一种鳄鱼皮胶原蛋白肽的制备方法及其用途。

背景技术

胶原蛋白是人体或其他动物体内含量最丰富的一类蛋白质，占总蛋白含量的25-33％。胶原蛋白是细胞外基质(ECM)的主要成分，对维持皮肤和血管壁的弹性，保持毛发和指甲柔软亮泽，提高软骨的润滑性等都有重要作用。由于其独特的理化性质和优良的生物相容性，在许多领域得到了广泛应用。

胶原蛋白肽是一种新型胶原蛋白类产品，是以胶原蛋白或富含胶原蛋白的物质为原料进行生产的。它既具有胶原蛋白的特有氨基酸组成，又具有分子量小的特点。因此，它更容易透过表皮被真皮吸收，也容易通过消化道被消化，在日化、食品保健领域有很好的用途。

关于胶原蛋白肽的制备，目前多见于以猪、牛的皮和骨、或鱼的皮、鳞、骨为来源酶解处理获得胶原蛋白肽的研究。而以鳄鱼为原料的胶原蛋白肽还少见报道。对鳄鱼皮的研究还处于初级的制作皮具和工艺品的水平，对其开发尚不完全，一些下脚料也缺少二次利用的机会。目前对鳄鱼皮的开发主要集中在皮具制作上，而加工过程产生的下脚料以及一些专供食用鳄鱼肉的鳄鱼的皮是不能用于工艺品加工的，这些下脚料若不加以有效利用就会成为废弃物，不仅造成极大的浪费，而且还会造成环境的污染。因此对鳄鱼皮的开发和应用将成为焦点和热点，同时会产生巨大的经济效益和社会效益。

发明内容

本发明公开了一种鳄鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，包括：在溶剂中煮已去除脂肪的鳄鱼皮；将煮好的鳄鱼皮用蛋白酶处理，得到酶解液；将所述酶解液离心分离，取上清液干燥，得到鳄鱼皮胶原蛋白肽。

在上述鳄鱼皮胶原蛋白肽的制备方法中，其中所述在溶剂中煮的时间可以是30±5分钟，其中所述溶剂可以是水，优选蒸馏水，其中所述溶剂的量与所述鳄鱼皮重量的比例可以为1L/(100±2)g。

在上述鳄鱼皮胶原蛋白肽的制备方法中，其中所述蛋白酶可以为胰酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、酸性蛋白酶的任一种，优选为碱性蛋白酶，所述碱性蛋白酶优选是地衣芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶，并且其中所述碱性蛋白酶与所述鳄鱼皮的重量比例可以为0.5％-4％，优选为4％。

在上述鳄鱼皮胶原蛋白肽的制备方法中，其中所述蛋白酶处理的条件可以是在保持所述蛋白酶的活性的pH下、在40℃±2℃的温度下水解3小时±5分钟。

在上述鳄鱼皮胶原蛋白肽的制备方法中，其中所述离心可以是在室温以4000rpm离心20±5分钟。

在上述鳄鱼皮胶原蛋白肽的制备方法中，其中所述干燥可包括冷冻干燥和喷雾干燥，优选冷冻干燥。

本发明还公开了一种鳄鱼皮胶原蛋白肽，所述鳄鱼皮胶原蛋白肽由上述鳄鱼皮胶原蛋白肽的制备方法制备。

如以上所述的鳄鱼皮胶原蛋白肽，其中所述鳄鱼皮胶原蛋白肽的平均分子量可以为约1.2KD。

本发明还公开了一种用于化妆品的抗氧化剂、保湿剂、抗DNA损伤剂或美白添加剂，所述抗氧化剂、保湿剂、抗DNA损伤剂和美白添加剂包含以上所述的鳄鱼皮胶原蛋白肽。

本发明还公开了以上所述的鳄鱼皮胶原蛋白肽用作化妆品中的抗氧化剂、保湿剂、抗DNA损伤剂或美白添加剂的应用。

鳄鱼皮含有大量的胶原蛋白，通过现代酶学的生物技术适当的方法处理后，能获得优质的胶原蛋白肽。本申请公开的鳄鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，不同于以往处理原材料的复杂工序，而是跳过了从原料中提取胶原蛋白的工艺，直接对原料进行处理，获得了功效良好的优质胶原蛋白肽，达到了简化制备工艺的目的。本申请制备的鳄鱼皮胶原蛋白肽不仅可以提高鳄鱼生产加工的附加值，同时可减少环境污染，获得良好的社会效益和经济效益。实验表明，本申请的鳄鱼皮胶原蛋白肽在抗氧化、体外保湿、体外抗DNA损伤方面有显著效果；在以小鼠B16黑色素瘤细胞为受试株的实验中，本申请的鳄鱼皮胶原蛋白肽对细胞内活性氧清除、酪氨酸酶活性抑制和黑色素含量的降低有很好的效果，说明具有很好的美白功效。

附图说明

图1显示了不同蛋白酶对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)清除率和总还原力的影响。在图1中，横坐标为不同蛋白酶(胰酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、酸性蛋白酶)，左右纵坐标分别为DPPH清除率和总还原力。

图2显示了不同酶解时间对DPPH清除率和总还原力的影响。其中，横坐标为不同酶解时间(1h、2h、3h、4h、5h、6h)，左右纵坐标分别为DPPH清除率和总还原力。

图3显示了不同酶量对DPPH清除率和总还原力的影响。其中，横坐标为不同酶量(0.5％、1％、2％、3％、4％)，左右纵坐标分别为DPPH清除率和总还原力。

图4显示了本申请的鳄鱼皮胶原蛋白肽的MALDI-TOF MS图谱。

图5是DNA琼脂糖凝胶电泳图，显示了本申请的鳄鱼皮胶原蛋白肽在体外对由羟自由基引发的DNA损伤的保护作用。其中，泳道1：5mg/mL的鳄鱼皮胶原蛋白肽组，泳道2：1mg/mL的鳄鱼皮胶原蛋白肽组，泳道3：0.1mg/mL的鳄鱼皮胶原蛋白肽组，泳道4：损伤对照组，泳道5：无损伤对照组。

图6显示了本申请的鳄鱼皮胶原蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖的影响。横坐标为不同浓度的鳄鱼皮胶原蛋白肽处理组(鳄鱼皮胶原蛋白肽的浓度分别为0、12.5、25、50、100、200、500、1000μg/mL)，纵坐标为细胞相对增殖率。

图7显示了本申请的鳄鱼皮胶原蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞内黑色素含量的影响。横坐标为不同浓度的鳄鱼皮胶原蛋白肽处理组(鳄鱼皮胶原蛋白肽的浓度分别为0、12.5、25、50、100、200μg/mL)，纵坐标为细胞相对黑色素含量。

图8显示了本申请的鳄鱼皮胶原蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸活性的影响。横坐标为不同浓度的鳄鱼皮胶原蛋白肽处理组(鳄鱼皮胶原蛋白肽的浓度分别为0、12.5、25、50、100、200μg/mL)，纵坐标为细胞内酪氨酸活性的相对活力。

图9显示了本申请的鳄鱼皮胶原蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞内活性氧簇含量的影响。图中各小图依次表示不同浓度鳄鱼皮胶原蛋白肽的实验组相对于0μg/mL的对照组的作用效果图。鳄鱼皮胶原蛋白肽的浓度依次为25、50、100、200μg/mL。图中阴影部分为对照组。

具体实施方式

下面将以实施例的方式对本申请作进一步的详细描述，以使本领域技术人员能够实践本申请。应当理解，可以采用其他实施方式，并且可以做出适当的改变而不偏离本申请的精神或范围。为了避免对于使本领域技术人员能够实践本申请来说不必要的细节，说明书可能省略了对于本领域技术人员来说已知的某些信息。因此，以下详细描述不应以限制性的意义来理解，且本发明的范围仅由所附权利要求界定。

以下的实施例便于更好地理解本申请，但并不用来限制本申请的范围。

下述实施例中所使用的各原料，除特别指出的以外，均可由市售获得。

实施例

不同蛋白酶对DPPH清除率和总还原力的影响

取新鲜鳄鱼皮，刮去脂肪，清洗，切成小块后，加入适量蒸馏水(鳄鱼皮的重量与加入水的比例为100g/L)在电饭锅内煮30分钟后冷却至室温，捣碎。将捣碎后的鳄鱼皮平均分成5份，分别放入5个烧杯中。在各烧杯中分别加入5％的胰酶(无锡杰仁生物科技有限公司)、中性蛋白酶(枯草芽孢杆菌来源的中性蛋白酶，枣庄市杰诺生物酶有限公司)、碱性蛋白酶(地衣芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶，枣庄市杰诺生物酶有限公司)、复合蛋白酶(CN复合蛋白酶，无锡杰仁生物科技有限公司)、酸性蛋白酶(黑曲霉来源的酸性蛋白酶，枣庄市杰诺生物酶有限公司)，具体酶解条件如表1所示。6小时后，将酶解液加热煮沸10分钟使酶灭活。再在室温以4000rpm离心20分钟，取上清液为供试品溶液。检测DPPH清除率和总还原力。DPPH清除率和总还原力反映抗氧化能力。

表1酶解条件

结果见图1。结果表明，由碱性蛋白酶酶解得到的酶解液同时有最高的DPPH清除率和最高的总还原力。

不同酶解时间对DPPH清除率和总还原力的影响

取新鲜鳄鱼皮，刮去脂肪，清洗，切成小块后，加入适量蒸馏水(鳄鱼皮的重量与加入水的比例为100g/L)在电饭锅内煮30分钟后冷却至室温，捣碎。将捣碎后的鳄鱼皮平均分成6份，分别放入6个烧杯中。加入酶量5％的碱性蛋白酶(地衣芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶，枣庄市杰诺生物酶有限公司)，在pH11、40℃水解。设置酶解时间分别为1h、2h、3h、4h、5h、6h，之后将酶解液加热煮沸10分钟使酶灭活。再在室温以4000rpm离心20分钟，取上清液为供试品溶液。检测DPPH清除率和总还原力。

结果见图2。结果表明，在酶解时间为3小时时，得到的酶解液同时有最高的DPPH清除率和最高的总还原力。

不同酶量对DPPH清除率和总还原力的影响

取新鲜鳄鱼皮，刮去脂肪，清洗，切成小块后，加入适量蒸馏水(鳄鱼皮的重量与加入水的比例为100g/L)在电饭锅内煮30分钟后冷却至室温，捣碎。将捣碎后的鳄鱼皮平均分成5份，分别放入5个烧杯中。分别加入酶量为基于新鲜鳄鱼皮的重量的0.5％、1％、2％、3％、4％的碱性蛋白酶(地衣芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶，枣庄市杰诺生物酶有限公司)，在pH11、40℃水解3小时。将酶解液加热煮沸10分钟使酶灭活。再在室温以4000rpm离心20分钟，取上清液为供试品溶液。检测DPPH清除率和总还原力。

结果见图3。结果表明：在酶量为4％时，考虑到生产成本，得到的酶解液同时有最高的DPPH清除率和较高的总还原力。

鳄鱼皮胶原蛋白肽的平均分子量测定

采用以下方法对鳄鱼皮胶原蛋白肽的平均分子量进行测定：用1mL0.5％TFA(三氟乙酸)溶解鳄鱼皮胶原蛋白肽粉样品0.05g，将基质α-HCCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)饱和溶于TA(0.1％TFA∶ACN(乙腈)＝2∶1)，以12000rpm离心5分钟。取0.3μL鳄鱼皮胶原蛋白肽粉样品的TFA的溶液加上0.3μL基质溶液，混匀后直接点样，每点0.6μL。用MALDI-TOF MS测定分子量。

实施例1

取新鲜鳄鱼皮100g，刮去脂肪，清洗，切成边长为2厘米左右的方形小块后，加入1L蒸馏水在电饭锅内煮30分钟后冷却至室温，捣碎。加入基于鳄鱼皮的重量为4％的碱性蛋白酶(地衣芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶，枣庄市杰诺生物酶有限公司)，在pH11、温度40℃水解3小时后，加热煮沸10分钟使酶灭活。再在室温以4000rpm离心20分钟，取上清液，冷冻干燥得到鳄鱼皮胶原蛋白肽粉。

图4显示了实施例1得到的鳄鱼皮胶原蛋白肽的MALDI-TOF MS图谱。实施例1得到的鳄鱼皮胶原蛋白肽粉的分子量为1.2KD。分子量较小，说明在碱性蛋白酶处理时酶解充分。羟脯氨酸是胶原蛋白中特有的氨基酸，对羟脯氨酸的测定可以反映胶原蛋白的含量。用羟脯氨酸测试盒(南京建成生物工程研究所)通过碱水解法测量羟脯氨酸的含量。测得羟脯氨酸的含量为6.2μg/mg，说明所得的鳄鱼皮胶原蛋白肽粉中胶原蛋白的含量很高。鳄鱼皮胶原蛋白肽粉的水溶液经紫外全波长扫描后在220nm左右有最大吸收峰，这是胶原蛋白的特征吸收峰。

实施例2

取新鲜鳄鱼皮500g，刮去脂肪，清洗，切成小块后，加入5L蒸馏水在电饭锅内煮30分钟后冷却至室温，捣碎。加入基于鳄鱼皮的重量为4％的碱性蛋白酶(地衣芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶，枣庄市杰诺生物酶有限公司)，在pH11、温度40℃水解3小时后，加热煮沸10分钟使酶灭活。再在室温以4000rpm离心20分钟，取上清液，喷雾干燥得到鳄鱼皮胶原蛋白肽粉。

所得到的鳄鱼皮胶原蛋白肽粉的分子量为1.2KD。分子量较小，说明在碱性蛋白酶处理时酶解充分。测得羟脯氨酸的含量为6.2μg/mg。鳄鱼皮胶原蛋白肽粉的水溶液经紫外全波长扫描后在220nm左右有最大吸收峰。

实施例3：本申请鳄鱼皮胶原蛋白肽的体外保湿效果

根据保湿剂保湿性能的差异，不同保湿剂对水分子的作用力不同，吸收水分和保持水分的能力也不同。将含一定水分的样品放在恒温恒湿的干燥器中干燥，定时称量样品质量的减少，通过对比分析，能够比较出不同样品保湿性的大小。为了更好地模拟皮肤的实际情况，给载玻片贴上3M胶布，将各受试物(分别为蒸馏水(阴性对照)、0.3％透明质酸(阳性对照)、实施例1所制备的鳄鱼皮胶原蛋白肽和鲨鱼皮胶原蛋白肽)的水溶液(料液比为1∶4)涂敷其上，放到盛有饱和硫酸铵溶液(相对湿度为85％)的干燥器中，每隔1～2小时进行称重，计算该时段的失水率，结果见表2。失水率计算公式是：

失水率＝(m₀-m_t)/m₀×100％

其中m_t为样品放置t小时后的水分质量，m₀为样品的初始的水分质量。

由表2可知，与其它受试物相比，本申请实施例1制备的鳄鱼皮胶原蛋白肽的单位时间间隔的失水率和失水总和较小。在第6-7小时时由于阴性对照的水分丧失殆尽，所以单位时间的失水率比本申请实施例1制备的鳄鱼皮胶原蛋白肽小，这也说明本申请实施例1制备的鳄鱼皮胶原蛋白肽可以更持久而稳定地保持水分。

表2各受试物体外保湿效果比较表

实施例4：本申请鳄鱼皮胶原蛋白肽在体外对DNA损伤的保护能力

为了研究实施例1所制得的鳄鱼皮胶原蛋白肽在体外对由羟自由基引发的DNA损伤是否具有保护作用，我们构建了体外羟自由基DNA损伤模型。

准备实验组、无损伤对照组和损伤对照组样品：

实验组样品的准备：依次加入1μL的pET-32αDNA、2μL磷酸缓冲液(PBS)(50mM、pH7.4)、5μL不同浓度的鳄鱼皮胶原蛋白肽(分别为5mg/mL、1mg/mL、0.1mg/mL)、1μL8mM FeSO₄和1μL8.8mM H₂O₂；

无损伤对照组样品的准备：依次加入1μL的pET-32αDNA和9μLPBS(50mM、pH7.4)；

损伤对照组样品的准备：依次加入1μL的pET-32αDNA、7μLPBS(50mM、pH7.4)、1μL8mM FeSO₄、1μL8.8mM H₂O₂。

将上述各样品分别混匀后37℃孵育30分钟，然后在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳条件设置是：控制电压降不高于5V/cm(电压值V/电泳板两极之间的距离)，当最前端的溴酚蓝跑过2/3的泳道距离时即可停止电泳。泳道1含5mg/mL的鳄鱼皮胶原蛋白肽、泳道2含1mg/mL的鳄鱼皮胶原蛋白肽，泳道3含0.1mg/mL的鳄鱼皮胶原蛋白肽，泳道4为损伤对照组，泳道5为无损伤对照组。结果如图5所示。

由图5可知：只加入了质粒DNA的无损伤对照组(泳道5)的电泳结果中存在开环DNA和超螺旋DNA。损伤对照组(泳道4)中的FeSO₄和H₂O₂会产生羟自由基，对超螺旋DNA产生损伤，使其变成开环DNA，因此电泳结果中只有开环DNA的一条带。从不同浓度的鳄鱼皮胶原蛋白肽(泳道1到3)的电泳结果可以看出，高浓度的鳄鱼皮胶原蛋白肽能够很好地清除自由基从而保护DNA免受损伤。实验证明，鳄鱼皮胶原蛋白肽具有在体外保护DNA免受损伤的能力。

实施例5：本申请的鳄鱼皮胶原蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞的美 白功效

1、鳄鱼皮胶原蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖的影响

用RPMI1640培养基(含有10％新生小牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL)，在CO₂孵箱中37℃、CO₂＝5％和饱和湿度的条件下培养细胞。待细胞生长至近融合状态，经0.25％胰蛋白酶消化后，收集并调整细胞浓度为10⁴/mL到96孔细胞培养板中。每孔加入200μL的小鼠B16黑色素瘤细胞单细胞悬液，过夜。待细胞贴壁后弃去原培养基，分别加入含0、12.5、25、50、100、200、500、1000μg/mL的本申请实施例2得到的鳄鱼皮胶原蛋白肽的RPMI1640培养基200μL。继续培养48h后弃培养液。于结束前4小时，用pH7.4的PBS缓冲液(137mM NaCl、2.7mMKCl、10mM Na₂HPO₄、2mM KH₂PO₄)洗涤2次，每孔加入20μL的0.5mg/mL MTT和180μL新鲜的RPMI1640培养液，在CO₂孵箱中在37℃、CO₂＝5％和饱和湿度的条件下培养细胞4小时后，弃上清液。每孔加入200μL DMSO，在37℃条件下，震荡10分钟，使蓝紫色结晶甲臜完全溶解。立即用酶标仪测定570nm光吸收值。每一浓度处理设3个重复，取平均值。每次实验均取同一传代细胞。结果如图6所示。

由图6可知：0～200μg/mL的鳄鱼皮胶原蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞的增殖没有明显影响，说明无细胞毒性。

2、鳄鱼皮胶原蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞内黑色素含量的影响

细胞培养方法同上。待细胞生长至近融合状态，经0.25％胰蛋白酶消化收集并调整细胞浓度，2×10⁴接种于6孔板中，过夜，待贴壁后换液，分别加入含0、12.5、25、50、100、200μg/mL的鳄鱼皮胶原蛋白肽的培养基2mL。继续培养48小时后弃培养液。用pH7.4的PBS缓冲液洗涤2次，加入1.0mL10％DMSO的1.0M NaOH溶液，80℃培养2小时，1000g离心10分钟，取上清液于405nm处测定吸光度值。每一浓度处理设3个重复，取平均值。每次实验均取同一传代细胞。结果如图7所示。

由图7可知：在浓度范围为0～200μg/mL的鳄鱼皮胶原蛋白肽的作用下，小鼠B16黑色素瘤细胞内黑色素含量受到抑制，并且抑制作用呈现出浓度依赖性。

3、鳄鱼皮胶原蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸活性的影响

细胞培养方法同上。待细胞生长至近融合状态，经0.25％胰蛋白酶消化收集并调整细胞浓度，2×10⁴接种于6孔板中，过夜，待贴壁后换液，分别加入含0、12.5、25、50、100、200μg/mL的鳄鱼皮胶原蛋白肽的培养基2mL。继续培养48小时后弃培养液。用pH7.4的PBS缓冲液洗涤2次，每孔加入体积分数为1％TritonX-100的PBS缓冲液900μL，然后加入100μL1.0mg/mL L-DOPA，超声2分钟，随后在30℃培养30分钟，测定475nm处的吸光度值。每一浓度处理设3个重复，取平均值。每次实验均取同一传代细胞。结果如图8所示。

由图8可知：在浓度范围为0～200μg/mL的鳄鱼皮胶原蛋白肽的作用下，小鼠B16黑色素瘤细胞内的酪氨酸活性受到抑制，并且抑制作用呈现出浓度依赖性。

4、鳄鱼皮胶原蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞内活性氧簇(ROS)含量的影响

细胞培养方法同上。待细胞生长至近融合状态，经0.25％胰蛋白酶消化收集并调整细胞浓度，2×10⁴接种于6孔板中，过夜，待贴壁后换液，分别加入含0、25、50、100、200μg/mL的鳄鱼皮胶原蛋白肽的培养基2mL。继续培养48小时后弃培养液。用pH7.4的PBS缓冲液洗涤2次，用胰蛋白酶消化收集细胞于1.5mL的Ep管中。再用1mL PBS清洗剩余细胞一次，也收集到同一Ep管中，800g离心6分钟，去上清后再用1mL PBS重悬细胞，再次离心去上清。1mL PBS重悬细胞后，加入10mM的探针DCFH-DA(二氯荧光素二乙酸酯)1μL，置于37℃孵育30分钟。然后再离心取上清，用1mL PBS重悬细胞。在流式细胞仪上以FS(正向散射强度)和SS(侧向散射强度)为参数，选取活细胞，将其限定在Gate(门)内，对Gate(门)内的细胞进行ROS的分析。结果如图9所示。

图9中依次为不同浓度鳄鱼皮胶原蛋白肽实验组(25、50、100、200μg/mL的鳄鱼皮胶原蛋白肽)相对于对照组(0μg/mL的鳄鱼皮胶原蛋白肽)的作用效果图。图中阴影部分表示对照组。由图9可以看出相对于对照组，实验组的曲线有明显的左移。而且浓度越大，左移越明显，反映出ROS含量降低，说明鳄鱼皮胶原蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞内活性氧簇(ROS)具有清除能力，而且呈现浓度依赖性。鳄鱼皮胶原蛋白肽浓度越高，活性氧簇的清除能力越强。

以上结果说明，本申请的鳄鱼皮胶原蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞无细胞毒性，而且可以抑制小鼠B16黑色素瘤细胞内黑色素的含量，抑制作用可能主要通过清除活性氧和抑制酪氨酸酶活性来实现。因此，本申请的鳄鱼皮胶原蛋白肽具有很好的美白功效，可以作为化妆品的美白添加剂。

综上所述，以上仅为本申请的较佳实施例而已，并非用于限定本申请的保护范围，因此，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种鳄鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，包括：

在溶剂中煮已去除脂肪的鳄鱼皮；

将煮好的鳄鱼皮捣碎后用蛋白酶处理，得到酶解液，其中所述蛋白酶为碱性蛋白酶；

将所述酶解液离心分离，取上清液干燥，得到鳄鱼皮胶原蛋白肽，

其中所述在溶剂中煮的时间是30±5分钟，其中所述溶剂是水，其中所述溶剂的量与所述鳄鱼皮重量的比例为1L/(100±2)g，其中所述鳄鱼皮胶原蛋白肽的平均分子量为约1.2KD。

2.如权利要求1所述的制备方法，其中所述溶剂是蒸馏水。

3.如权利要求1所述的制备方法，其中所述碱性蛋白酶是地衣芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶，并且其中所述碱性蛋白酶与所述鳄鱼皮的重量比例为0.5％-4％。

4.如权利要求1所述的制备方法，其中所述碱性蛋白酶与所述鳄鱼皮的重量比例为4％。

5.如权利要求1所述的制备方法，其中所述蛋白酶处理的条件是在保持所述蛋白酶的活性的pH下、在40℃±2℃的温度下水解3小时±5分钟。

6.如权利要求1所述的制备方法，其中所述离心是在室温以4000rpm离心20±5分钟。

7.如权利要求1所述的制备方法，其中所述干燥包括冷冻干燥和喷雾干燥。

8.如权利要求1所述的制备方法，其中所述干燥是冷冻干燥。

9.一种鳄鱼皮胶原蛋白肽，所述鳄鱼皮胶原蛋白肽由权利要求1-8中任一项所述的制备方法制备。

10.一种用于化妆品的抗氧化剂、保湿剂、抗DNA损伤剂或美白添加剂，所述抗氧化剂、保湿剂、抗DNA损伤剂和美白添加剂包含权利要求9所述的鳄鱼皮胶原蛋白肽。

11.权利要求9所述的鳄鱼皮胶原蛋白肽用作化妆品中的抗氧化剂、保湿剂、抗DNA损伤剂或美白添加剂的应用。