KR101585913B1

KR101585913B1 - 말 사골 추출물의 제조방법 및 말 사골 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101585913B1
Application number: KR1020140077097A
Authority: KR
Inventors: 장애라; 김동욱; 김희진; 윤지열; 길주애; 박재인; 이성기
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2014-06-24
Filing date: 2014-06-24
Publication date: 2016-01-18
Also published as: KR20160000142A

Abstract

본 발명은 말 사골 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물 또는 피부 노화 억제용 화장료 조성물 및 말 사골 추출물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 수득된 말 사골 추출물은 우수한 항산화 활성, 피부 주름 개선 효과 및 피부 노화 억제 효과를 발휘한다.

Description

말 사골 추출물의 제조방법 및 말 사골 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 {Method for production of horse leg bone extract and cosmetic composition with the extract of horse leg bone}

본 발명은 말 사골 추출물의 제조방법 및 말 사골 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 단백질 분해효소로 처리한 말 사골 추출물의 제조방법 및 말 사골 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 및 피부 노화 억제용 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 나이를 먹으면서 끊임없이 변화하게 된다. 피부 노화는 크게 자연노화(내인성 노화)와 외적노화로 구분된다. 대표적인 외적 노화인자로는 자외선을 들 수 있으며, 가장 두드러진 외적 노화현상이 바로 피부 주름형성이다.

한편, 자외선에 노출된 피부는 프리라디칼과 활성산소종(ROS)을 생성시켜 피부암, 광독성, 자기면역장애, 광과민증, 피부노화 등을 유발하게 된다(Norins, J. Invest. Dermatol., 39:445, 1962; Cadenas, Ann. Rev.Biochem., 58:79, 1989). 따라서, 자외선 조사에 의해 발생된 활성산소종을 소거하여 세포막을 보호하고, 이미 손상받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생시켜 세포를 증식시켜야 피부가 회복되고, 건강한 피부를 유지할 수 있다.

한편, 노화에는 활성산소종 뿐만 아니라 기질 금속단백질분해효소(matrix metallopretease, MMP)라는 효소가 관여하는데, 젊었을 때는 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포 외 기질의 합성과 분해가 적절하게 조절되나, 노화가 진행되면서 합성이 감소하며, 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한, 자외선 노출에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다. 따라서, 자외선에 의해 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나, 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있는 것이다.

한편, 콜라겐은 대부분 진피층에 존재하며, 피부 전체 건조 중량의 약 70~80%를 차지하고 있다. 콜라겐은 섬유아세포에서 생합성되는데, 자연노화 및 광노화에 의해서 그 양이 감소하며, 20세에서 80세에 이르는 동안 65%의 감소가 일어난다고 알려져 있다(Shuster S., 1975, British journal of determatology, 93(6): 639-643). 또한, 콜라겐 합성의 감소는 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고도 알려져 있다.

한편, MMP 중 엘라스타아제(elastase)는 인체의 중성구 과립구 내에 존재하며, 진피 내 피부 탄력을 유지하는데 중요한 기질 단백질인 엘라스틴과 콜라겐을 분해할 수 있는 비특이적 가수분해 효소이다. 엘라스타아제를 저해함으로써 피부 탄력 소실을 방지할 수 있는데, 엘라스타아제 저해 활성을 가지는 성분으로는 우르솔릭산(ursolic acid)이 알려져 있다. 다만, 우르솔릭산은 물이나 오일 등의 용매에 잘 녹지 않는 성질을 가지고 있기 때문에 제제화하기 어려워 엘라스타아제 저해제로 사용하기 어렵다는 문제점이 있다.

한편, 최근 건강한 삶에 대한 관심이 증가하고, 생활수준이 향상, 여성의 사회진출 증가, 고령화 가속화 등의 사회 변화로, 소비자들의 화장품에 대한 욕구는 단순히 아름답게 꾸미기 위한 용도에서 점차 기능적 용도를 요구하는 것으로 변화하고 있다. 이에 따라, 우수한 기능성을 갖는 화장품 원료 소재에 대한 탐색이 광범위하게 일어나고 있는데, 특히 천연 물질에서 기능성 물질을 찾으려는 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

펩타이드는 아미노산이 2개 이상 결합되어 형성된 물질인데, 화학합성, 효소반응 또는 단백질로부터의 가수분해에 의해 제조된다. 최근 펩타이드 성분을 화장료에 응용하여 피부 주름을 개선하는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 하지만, 화학 합성된 펩타이드의 경우, 화학합성에 대한 소비자들의 거부감으로 인해, 활발히 사용되지 못하고 있고, 효소반응의 경우 고가의 효소를 사용하기 때문에 경제적이지 못한 문제점이 있었다. 따라서, 단백질로부터 가수분해하여 펩타이드를 저렴한 비용으로 회수할 수 있는 방법이 대안으로 떠오르고 있다.

한편, 말의 뼈는 국내에서 흔히 사용되지는 않지만, 인터넷 시장 혹은 제주지역에서 소비되고 있는 실정이다. 한의학에서는 말의 뼈가 의약소재로 사용되기도 하였다. 중화 본초에서는 말의 뼈가 성질이 달고 차며, 동의보감에서도 신경통, 관절염, 이명 등에 효과가 있고, 말의 머리뼈는 머리와 귀에 생긴 염증을 제어한다고 보고되어 있다. 그런데, 말뼈와 관련된 연구는 주로 골다공증, 뼈 성장 등에 관해 이루어졌을뿐 화장품 소재로서 연구된 바는 없다. 특히, 말의 사골을 화장품 소재로 개발한 연구는 전혀 개시된바 없다.

대한민국 공개특허 제10-2010-0100466호 (공개일자: 2010. 09. 15)에는, 피부수축 폴리머를 사용하여 피부 위에 필름을 형성하여 피부탄력을 증진하고 피부주름을 개선하는 피부 탄력 증진 및 피부 주름 개선용 화장료 조성물이 기재되어 있다. 대한민국 공개특허 제10-2014-0051763호(공개일자: 2014. 05. 02)에는, 제3형 콜라겐 재조합 단백질, 제3형 콜라겐 유래 펩타이드 및 아시아티코사이드로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상을 함유하는 피부 주름 개선 또는 피부 탄력 증진용 화장료 조성물이 기재되어 있다.

본 발명은 말 사골 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 개발하여 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 말 사골 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 억제용 화장료 조성물을 개발하여 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 단백질 분해효소로 처리하여 말 사골로부터 펩타이드를 수득할 수 있는 방법을 개발하여 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하고자, 본 발명은 말 사골 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 말 사골 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 억제용 화장료 조성물을 제공한다.

한편, 상기 본 발명들에 있어서, 말 사골 추출물은 바람직하게 단백질 분해효소로 말 사골 추출물을 분해시켜 제조된 것을 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 돼지의 췌장에서 유래한 판크레아틴(Pancreatin) 내에 존재하는 단백질 분해효소로 말 사골 추출물을 분해시킨 것을 사용하는 것이며, 가장 바람직하게는 판크레아틴(Pancreatin) 내에 존재하는 단백질 분해효소로 말 사골 추출물을 분해시킨 후, 분자량이 3 KDa 이하인 펩타이드가 함유된 것을 사용하는 것이다. 분자량이 3 KDa 이상인 펩타이드를 함유하는 말 사골 추출물보다 우수한 항산화 활성, 피부 주름 개선 및 피부 노화 억제 효과를 발휘하기 때문이다.

한편, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 말 사골 추출물 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 주 효과에 상승효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유하는 것도 무방하다.

한편, 본 발명에 따른 조성물은 화장 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제, 예컨대 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제 및 염료를 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예컨대 조성물 총중량에 대해 0.001 내지 30중량%이 사용될 수 있다. 다만, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 것이다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물 제형은 특정한 것에 한정되는 것은 아니고, 일 예로 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 에멀젼, 연고로 이루어진 기초화장료 제형, 수중유형 및 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형 중에서 선택되는 어느 하나인 것이 좋다. 또한, 이는 선택적으로 에어로졸 형태로 피부에 적용될 수도 있고, 고체 형태 예컨대, 스틱의 형태일 수도 있으며 피부용 케어 제품 및/또는 메이크업 제품으로서 사용될 수도 있다.

한편, 본 발명은 말 사골을 열수추출하여 젤라틴 함유 추출물을 제조하는 단계 (A); 상기 젤라틴 함유 추출물로부터 지방을 제거하는 단계 (B); 상기 지방이 제거된 젤라틴 함유 추출물에 증류수를 첨가하고 교반한 후, 알칼리를 첨가하여 pH를 7.0~9.0으로 조정하는 단계 (C); 및 상기 pH 조정 후, 단백질 분해효소를 첨가하여 효소분해한 후, 말 사골 추출물을 수득하는 단계 (D);를 포함하는 과정으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 말 사골 추출물의 제조방법을 제공한다.

이하에서는 본 발명의 말 사골 추출물 제조방법에 대해 상세히 설명하겠다.

<단계 (A): 말 사골을 열수추출하여 젤라틴 함유 추출물을 제조하는 단계>

본 단계는 말 사골을 열수추출하여 젤라틴 함유 추출물을 제조하는 단계이다. 상기 젤라틴 함유 추출물은, 일 예로, 불순물이 제거된 말 사골에 말 사골 중량의 5~10배의 물을 첨가하고 8~24시간 동안 열수추출하여 수득될 수 있다. 이때, 열수추출은 8시간 간격으로 3차로 나누어 추출하는 것이 좋으며, 1~3차 각각의 열수추출물을 여과한 뒤, 동량으로 혼합한 것을 사용할 수 있다.

또한, 말 사골의 불순물을 제거하는 방법은, 일 예로, 말 사골을 찬물에 12~16시간 동안 침수시켜 핏물을 제거하고, 말 사골 중량의 3~5배의 물을 첨가하고 30~60분간 가열한 뒤, 깨끗히 세척함으로써 수행될 수 있다.

<단계 (B): 상기 젤라틴 함유 추출물로부터 지방을 제거하는 단계>

본 단계는 상기 젤라틴 함유 추출물로부터 지방을 제거하는 단계이다. 지방을 제거함으로써, 젤라틴 함유 추출물에 함유되어 있는 불순물을 더욱 제거할 수 있다. 지방을 제거하는 방법은, 일 예로, 상기 젤라틴 함유 추출물을 냉동하여 지방을 제거할 수 있다.

<단계 (C): 상기 지방이 제거된 젤라틴 함유 추출물에 증류수를 첨가하고 교반한 후, 알칼리를 첨가하여 pH를 7.0~9.0으로 조정하는 단계>

본 단계는 상기 지방이 제거된 젤라틴 함유 추출물에 증류수를 첨가하고 교반한 후, 알칼리를 첨가하여 pH를 7.0~9.0으로 조정하는 단계이다. 상기 지방이 제거된 젤라틴 함유 추출물을 약염기성으로 조정함으로써, 단백질을 침전시키기 위함이다.

<단계 (D): 상기 pH 조정 후, 단백질 분해효소를 첨가하여 효소분해한 후, 말 사골 추출물을 수득하는 단계>

본 단계는 상기 pH 조정 후, 단백질 분해효소를 첨가하여 효소분해한 후, 말 사골 추출물을 수득하는 단계이다. 즉, 말 사골로부터 우수한 항산화 활성, 피부 주름 개선 및 피부 노화 억제능이 우수한 펩타이드 함유 말사골 추출물을 수득하는 단계이다.

이때, 효소분해는, 바람직하게 젤라틴 함유 추출물 건물 100중량부 대비 단백질 분해효소 0.1~0.3중량부를 첨가한 후, 40~60℃에서 3~5시간 동안 수행하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 단백질 분해효소로서 판크레아틴(Pancreatin) 내에 존재하는 단백질 분해효소를 사용하는 것이다. 이와 같은 조건으로 효소분해된 수득된 말 사골 추출물은 우수한 항산화 활성, 피부 주름 개선 및 피부 노화 억제능을 발휘한다.

한편, 상기 판크레아틴(Pancreatin)은 동물, 주로 돼지의 췌장에서 추출한 효소제제로서, 프로테아제(protease), α-아밀라아제(α-amylase), 리파아제(lipase) 등을 함유하여, 탄수화물, 단백질, 지방을 분해하는 활성을 모두 가지고 있다.

한편, 상기 말 사골 추출물은, 바람직하게 분자량이 3 KDa 이하인 펩타이드를 함유하는 것이 좋다. 3 KDa 이상의 분자량을 펩타이드를 함유하는 말 사골 추출물 보다 우수한 항산화 활성, 피부 주름 개선 및 피부 노화 억제능을 발휘하기 때문이다.

한편, 본 발명에 있어서, 단계 (D) 후, 바람직하게 80~100℃에서 5~15분 동안 가열하여 단백질 분해효소를 불활성화 하는 단계 (E);를 더욱 포함하는 것이 좋다. 본 단계를 포함함으로써 말 사골 추출물에 함유된 펩타이드가 아미노산으로 더 분해되는 것을 방지할 수 있다.

본 발명은 말 사골 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 말 사골 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 억제용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 저렴한 공급처인 말 사골로부터 피부 주름 개선 및 피부 노화 억제 효과를 가지는 말 사골 추출물의 제조방법을 제공할 수 있다.

도 1은 말 사골 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다. 'HM4'는 말 사골 가수분해물, 'HO4'는 3 KDa 이상의 말 사골 고분자 효소 분해물, 'HL4'는 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물을 의미한다.
도 2는 말 사골 추출물의 ABTS 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다. 'HM4'는 말 사골 가수분해물, 'HO4'는 3 KDa 이상의 말 사골 고분자 효소 분해물, 'HL4'는 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물을 의미한다.
도 3은 말 사골 추출물의 FRAP 활성을 측정한 그래프이다. 'HM4'는 말 사골 가수분해물, 'HO4'는 3 KDa 이상의 말 사골 고분자 효소 분해물, 'HL4'는 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물을 의미한다.
도 4는 말 사골 추출물의 ORAC 활성을 측정한 그래프이다. 'HM4'는 말 사골 가수분해물, 'HO4'는 3 KDa 이상의 말 사골 고분자 효소 분해물, 'HL4'는 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물을 의미한다.
도 5는 말 사골 추출물의 엘라스타아제 저해 활성을 측정한 그래프이다.
도 6은 말 사골 추출물의 콜라게나아제 저해 활성을 측정한 그래프이다.
도 7은 말 사골 추출물의 자외선 조사 후 세포 회복율을 측정한 그래프이다. 'CON'은 정상 대조군, 'UVB-CON'은 음성 대조군, 'HL4'는 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물을 의미한다.
도 8은 말 사골 추출물의 자외선 조사 후 현미경으로 세포 형태를 관찰한 사진이다. 'CON'은 정상 대조군, 'UVB-CON'은 음성 대조군, 'HL4'는 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물을 의미한다.
도 9는 말 사골 추출물의 프로콜라겐 타입-1 생합성 효과를 확인한 그래프이다. 'CON'은 정상 대조군, 'UVB-CON'은 음성 대조군, 'HL4'는 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물을 의미한다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[실시예 1: 말 사골 추출물 제조]

깨끗이 세척된 말 사골 1 kg을 찬물에 16시간 동안 침수시켜 핏물을 제거하였다. 그 후, 3 L의 물을 넣고 끓는 물에서 30분간 끓인 후, 물을 제거하고 말 사골을 찬물로 깨끗이 세척하였다. 그 후, 이물질이 제거된 말 사골에 6 L의 물을 넣고 1차(8시간), 2차(8시간), 3차(8시간)로 나누어 가열하여 젤라틴 함유 추출물을 제조하였다. 상기 젤라틴 함유 추출물을 거즈로 각각 여과하여 동결 건조한 다음 1차 추출물, 2차 추출물, 3차 추출물을 동일한 양 즉, 각각의 추출물을 100 g씩 혼합하여 말 사골 가수분해물 300 g을 제조하였다. 그 후, 상기 말 사골 가수분해물을 냉동하여 지방을 제거한 후, 동결건조하였다. 상기 동결건조된 말 사골 가수분해물 100 g에 증류수 800 ㎖를 넣고 80℃에서 1시간 동안 교반한 후, 1M NaOH를 첨가하여 pH를 8.0으로 조정하였다. 그 후, 판크립신(Pancripsin, 판크레아틴의 제품명, 비젼바이오켐) 0.2 g을 넣고, 50℃에서 4시간 동안 효소분해를 하여 말 사골 추출물을 수득하였다. 그 후, 10분 동안 90℃를 유지하여 효소를 불활성화하였다.

한편, 상기 효소분해된 말 사골 추출물을 멤브레인 여과 장치를 이용하여 3 KDa 이상의 고분자 분해물, 3 KDa 이하의 저분자 분해물로 분리하였다. 그 후, 상기 말 사골 가수분해물을 'HM4(hydrolysates)', 3 KDa 이상의 말 사골 고분자 효소 분해물을 'HO4(hydrolysates over 3 KDa)', 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물을 'HL4(hydrolysates less than 3 KDa)'로 지칭한 후, 하기 실험예에서 사용하였다.

[실험예 1: 말 사골 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성 측정]

본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 수득된 말 사골 추출물의 항산화 활성을 확인하고자 DPPH 라디칼 소거활성을 측정하였다. 시료로서 10 mg/㎖로 고정한 말 사골 가수분해물(HM4), 3 KDa 이상의 말 사골 고분자 효소 분해물(HO4), 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물(HL4)를 각각 이용하였고, 표준시약으로서 트롤록스(trolox)를 이용하였다.

시료 1 ㎖ 각각에 0.2 mM DPPH 용액(in methanol) 1 ㎖를 혼합하여 암실(상온)에서 30분간 반응시킨 다음, 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 트롤록스(trolox)를 표준물질로 하여, 트롤록스(trolox)의 항산화 효과를 나타내는 μM trolox equivalent로 나타내었다.

실험결과, 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물(HL4)이 99.57 μM trolox equivalent를 나타내어 효소분해를 하지 않은 말 사골 가수분해물(HM4) 보다 높은 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었다 (도 1).

[실험예 2: 말 사골 추출물의 ABTS 라디칼 소거활성 측정]

본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 수득된 말 사골 추출물의 항산화 활성을 확인하고자 ABTS 라디칼 소거활성을 측정하였다. 시료로서 10 mg/㎖로 고정한 말 사골 가수분해물(HM4), 3 KDa 이상의 말 사골 고분자 효소 분해물(HO4), 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물(HL4)를 각각 이용하였고, 표준시약으로서 트롤록스(trolox)를 이용하였다.

7 mM ABTS 용액 10 ㎖ 및 2.45 mM 포타슘 퍼설페이트(Potassium persulphate)용액 10 ㎖를 혼합하고, ABTS+라디칼을 만들기 위해 실온에서 14시간 동안 암소 반응시켰다. 라디칼이 생성된 용액을 735 nm에서 흡광도 값이 0.700±0.02가 되도록 희석하여 ABTS+용액을 제조하였다. 그 후, 각각의 시료 50 ㎕와 ABTS+용액 950 ㎕를 각각 혼합하여 30℃ 암실에서 30분간 반응시킨 뒤, 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 735 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거활성은 트롤록스(trolox)를 표준물질로 하여 트롤록스(trolox)의 항산화효과를 나타내는 μM trolox equivalent로 나타내었다.

실험결과, 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물이 228.63 μM trolox equivalent를 나타내어 효소분해를 하지 않은 말 사골 가수분해물(HM4) 보다 높은 ABTS 라디칼 소거활성을 나타내었다 (도 2).

[실험예 3: 말 사골 추출물의 FRAP 활성 측정]

본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 수득된 말 사골 추출물의 항산화 활성을 확인하고자 FRAP(Ferric reducing antioxidants power)활성을 측정하였다. 시료로서 10 mg/㎖로 고정한 말 사골 가수분해물(HM4), 3 KDa 이상의 말 사골 고분자 효소 분해물(HO4), 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물(HL4)를 각각 이용하였고, 표준시약으로서 트롤록스(trolox)를 이용하였다.

반응용액은 300 mM 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 3.6), 40 mM HCl에 녹인 10 mM TPTZ(2,4,6-tris(2- pyridyl)-s-triazine), 20 mM FeCl₃.6H₂O를 각각 10:1:1의 비율로 섞어 37℃로 유지 하면서 사용하였다.

그 후, 각각의 시료 및 표준시약 25 ㎕와 상기 반응용액 175 ㎕를 각각 혼합하여 암실에서 5분간 방치한 후, 590 nm에서 흡광도를 측정하였다. FRAP 활성은 표준물질로 사용한 트롤록스(trolox) 농도에 상당하는 μM trolox equivalent로 나타내었다.

실험결과, 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물(HL4)이 66.05 μM trolox equivalentalent를 나타내어 효소분해를 하지 않은 말 사골 가수분해물(HM4) 보다 높은 FRAP 활성을 나타내었다 (도 3).

[실험예 4: 말 사골 추출물의 ORAC 활성 측정]

본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 수득된 말 사골 추출물의 항산화 활성을 확인하고자 ORAC(Oxygen radical absorbance capacity)활성을 측정하였다. 시료로서 1 mg/㎖로 고정한 말 사골 가수분해물(HM4), 3 KDa 이상의 말 사골 고분자 효소 분해물(HO4), 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물(HL4)를 각각 이용하였고, 표준시약으로서 트롤록스(trolox)를 이용하였다.

블랙 96 웰 플레이트(Black 96 well plate)에 각각의 시료와 표준시약 25 ㎕를 각각 넣고, 80 nM 플루오세인(fluorescein) 150 ㎕를 각각 넣어 혼합한 뒤, 37℃ 인큐베이트(incubate)에서 15분 동안 방치 하였다. 그 후, 150 mM AAPH(2,2′-Azobis(2-Amidinopropane) Dihydrochloride) 25 ㎕를 넣고 잘 혼합한 뒤, 형광분광광도계(fluorescent microplate reader)를 사용하여 37℃에서 여기 파장(excitation wavelength) 485 nm과 방사 파장(emission wavelength) 520 nm에서 60분 동안 1분 간격으로 측정하였다. 그 후, 시료와 표준시약의 AUC(area under the curve)를 측정한 후, 표준시약 농도와 AUC간의 회귀곡선을 이용하여 μM trolox equivalentalent로 나타내었다.

실험결과, 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물(HL4)이 350.53 μM trolox equivalent를 나타내어 효소분해를 하지 않은 말 사골 가수분해물(HM4) 보다 높은 ORAC 활성을 나타내었다(도 4).

[실험예 5: 말 사골 추출물의 아미노산 서열 분석]

본 실험예에서는 말 사골 추출물 중 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물의 아미노산 서열을 분석하고자 하였다. 아미노산 서열 분석은 LC/MS를 이용하여 분석하였다. 실험결과, QGDRGEAGAQGPMGPAGPAGA으로 21개의 아미노산 서열의 1851.839 Da 크기의 펩타이드가 가장 높은 강도를 나타내는 것으로 확인되었다.

[실험예 6: 말 사골 추출물의 엘라스타아제 저해활성 측정]

본 실험예에서는 말 사골 추출물의 피부 주름 개선 효과를 확인하고자 엘라스타아제(elastase) 저해활성을 측정하였다. 시료로서 25, 50, 100, 200 ㎎/㎖의 농도로 고정한 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물을 이용하였다.

0.2 M Tris-HCl buffer(pH 8.0) 120 ㎕, 1.0 mM SANA(N-succinyl-(Ala)3-p-nitro anilide) 20 ㎕, 농도별 시료 100 ㎕를 각각 넣고, 25℃에서 10분간 배양한 다음, 1 U/㎖ 돼지 췌장 엘라스테이즈(porcine pancreas elastase) 효소를 20 ㎕ 넣고, 25℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후, 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 양성 대조군으로는 100 ㎍/㎖의 우르솔릭산(ursolic acid)을 이용하였다. 또한, 엘라스타아제 저해율은 하기 수학식 1을 이용하여 계산하였다.

실험결과, 농도 의존적으로 엘라스타아제 저해활성이 높게 나타났다. 특히, 농도 200 mg/㎖일 때, 42.75%로 가장 높은 저해 활성을 나타내었다(도 5).

상기와 같은 결과로부터, 말 사골 추출물의 우수한 피부 주름 개선 효과 및 피부 노화 억제 효과를 확인할 수 있었다.

[실험예 7: 말 사골 추출물의 콜라게나아제 저해활성 측정]

본 실험예에서는 말 사골 추출물의 피부 주름 개선 효과를 확인하고자 콜라게나아제(collagenase) 저해활성을 측정하였다.

시료로서 1, 10, 25, 50, 100, 200 ㎎/㎖의 농도로 고정한 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물을 이용하였다.

0.3 mg/㎖ 콜라게나아제 발색단(Colaagenase Chromophore) 기질 0.25 ㎖에 농도별로 시료 0.1 ㎖를 넣고, 0.2 mg/㎖ 콜라게나아제(Collagenase) 효소를 0.15 ㎖ 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후, 6% 시트릭산(citric acid) 0.5 ㎖를 넣어 효소반응을 정지시켰다. 그 후, 에틸아세테이트(ethylacetate) 1.5 ㎖를 첨가하여 상등액을 320 nm에서 흡광도를 측정하였다. 콜라게나아제(Collagenase) 저해활성은 하기 수학식 2를 이용하여 계산하였다.

실험결과, 농도 의존적으로 콜라게나아제(Collagenase) 저해활성이 높게 나타났다. 특히, 농도 200 mg/㎖일 때, 98.35%로 가장 높은 저해 활성을 나타내었다(도 6).

[실험예 8: 말 사골 추출물의 자외선 조사 후 세포 회복율 측정]

본 실험예에서는 말 사골 추출물의 피부 노화 억제 효과를 확인하고자 자외선 조사 후, 세포 회복율을 측정하였다. 시료로서 10, 50, 100, 250, 500 ㎍/㎖의 농도로 고정한 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물을 이용하였다.

인간 섬유 아세포를 1.5×10⁵cells/㎖의 농도로 24 웰 플레이트(well plate)에 24시간 동안 배양하였다. 그 후, PBS로 세척하고 100 mJ/cm² UVB를 조사한 후, PBS로 세척하였다. 그 후, 배지 내 세럼(serum)성분을 제거한 배지를 넣고, 농도별로 시료 10 ㎕를 넣은 다음 24시간 동안 배양하였다. 그 후, MTT(methylthiazol-2.5 diphenyltetrazolium bromide) 시약 50 ㎕를 4시간 동안 처리하였다. 그 후, 배지를 제거하고 생성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystals)을 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 대조군에 대한 백분율로 값을 나타내었다. 이때, 시료 및 자외선 무처리군을 정상 대조군으로 하였고, 시료 무처리 및 자외선 처리군을 음성 대조군으로 하였다.

실험결과, 농도가 증가함에 따라 세포 회복율이 증가하였다. 특히 농도 250 mg/㎖에서 세포 생존율이 56.25%로 약 6%의 세포 회복율을 나타내었고, 농도 500 mg/㎖에서 세포 생존율이 60%로 약 12%의 세포 회복율을 나타내었다 (도 7).

상기와 같은 결과로부터, 말 사골 추출물의 우수한 피부 노화 억제 효과를 확인할 수 있었다.

[실험예 9: 말 사골 추출물의 자외선 조사 후 세포 형태학적 관찰]

본 실험예에서는 말 사골 추출물의 피부 노화 억제 효과를 확인하고자 자외선 조사 후, 세포 형태학적 관찰을 하였다. 시료로서 10, 50, 100, 250, 500 ㎍/㎖의 농도로 고정한 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물을 이용하였다.

인간 섬유 아세포를 1.5×10⁵ cells/㎖의 농도로 24 웰 플레이트(well plate)에 24시간 동안 배양하였다. 그 후, PBS로 세척하고 100 mJ/cm²UVB를 조사한 후, PBS로 세척하였다. 그 후, 배지 내 세럼(serum)성분을 제거한 배지를 넣고, 농도별로 시료 10 ㎕를 넣은 다음 24시간 배양하였다. 24시간 뒤 배지를 제거하고 현미경으로 세포 형태를 관찰하였다. 이때, 시료 및 자외선 무처리군을 정상 대조군으로 하였고, 시료 무처리 및 자외선 처리군을 음성 대조군으로 하였다.

실험결과, 정상 대조군에 비해, 시료 무처리 및 자외선 조사 군은 피부 섬유아세포가 손상되고 사멸되었음을 관찰할 수 있었고, 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물을 농도별로 처리 한 결과 농도 의존적으로 회복 되는 형태를 관찰하였다 (도 8).

[실험예 10: 말 사골 추출물의 프로콜라겐 타입-1 생합성 효과 확인]

본 발명에서는 말 사골 추출물의 피부 주름 개선 효과 및 피부 노화 억제 효과를 확인하고자 프로콜라겐 타입-1(procollagen type-1) 생합성 효과를 확인하였다.

시료로서 10, 50, 100, 250, 500 ㎍/㎖의 농도로 고정한 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물을 이용하였다.

인간 섬유 아세포를 1.5×10⁵ cells/㎖의 농도로 24 웰 플레이트(well plate)에 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, PBS로 세척하고 100 mJ/cm² UVB를 조사한 후, PBS로 세척하였다. 그 후, 배지 내 세럼(serum) 성분을 제거한 배지를 넣고, 농도별로 시료 10 ㎕를 넣은 다음 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포의 배양액을 실험에 사용하였다. 세포 배양액 내 콜라겐 생합성 정도는 프로콜라겐 타입-IC 펩타이드 EIA 키트{procollagen type-IC peptide(PIP) EIA kit(Takara Bio, Japan)}를 사용하여 프로펩타이드(propeptide)의 양을 측정하였다. 이때, 시료 및 자외선 무처리군을 정상 대조군으로 하였고, 시료 무처리 및 자외선 처리군을 음성 대조군으로 하였다.

실험결과, 정상 대조군에 비해, 자외선을 조사한 음성 대조군의 콜라겐 생합

성량이 감소하였으며, 3 KDa 이하의 말 사골 저분자 효소 분해물은 농도 의존적으로 콜라겐 생합성량이 증가하는 경향을 나타내었다. 특히, 농도 250, 500 ㎍/㎖에서 각각 1.78, 1.82 ㎍/㎖의 우수한 프로콜라겐 타입-1 생합성 효과를 나타내었다(도 9).

Claims

말 사골 추출물을 유효성분으로 함유하고,
상기 말 사골 추출물은 분자량이 3 KDa 이하인 펩타이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
말 사골 추출물을 유효성분으로 함유하고,
상기 말 사골 추출물은 분자량이 3 KDa 이하인 펩타이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 억제용 화장료 조성물.
제1항 또는 2항에 있어서,
상기 말 사골 추출물은,
말 사골을 열수추출한 후 단백질 분해효소를 처리하여 분해시킨 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제3항에 있어서,
상기 단백질 분해효소는,
돼지 췌장에서 유래한 판크레아틴(Pancreatin) 내에 존재하는 단백질 분해효소인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
삭제
말 사골을 열수추출하여 젤라틴 함유 추출물을 제조하는 단계 (A);
상기 젤라틴 함유 추출물로부터 지방을 제거하는 단계 (B);
상기 지방이 제거된 젤라틴 함유 추출물에 증류수를 첨가하고 교반한 후, 알칼리를 첨가하여 pH를 7.0~9.0으로 조정하는 단계 (C); 및
상기 pH 조정 후, 단백질 분해효소를 첨가하여 효소분해한 후, 말 사골 추출물을 수득하는 단계 (D);를 포함하는 과정으로부터 제조되며,
상기 말 사골 추출물은 멤브레인 여과장치를 거쳐 분자량이 3 KDa 이하인 펩타이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선 및 피부 노화 억제 효과가 있는 말 사골 추출물의 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 단계 (D)의 효소분해는,
젤라틴 함유 추출물 건물 100중량부 대비 단백질 분해효소를 0.1~0.3중량부를 첨가한 후, 40~60℃에서 3~5시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 말 사골 추출물의 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 단계 (D)의 단백질 분해효소는,
돼지 췌장에서 유래한 판크레아틴(Pancreatin) 내에 존재하는 단백질 분해효소인 것을 특징으로 하는 말 사골 추출물의 제조방법.
삭제
제6항에 있어서,
80~100℃에서 5~15분 동안 가열하여 단백질 분해효소를 불활성화 하는 단계 (E);를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 말 사골 추출물의 제조방법.