KR101042718B1

KR101042718B1 - 천선과 추출물을 함유하는 피부노화방지 또는 피부미백용화장료 조성물

Info

Publication number: KR101042718B1
Application number: KR1020080056507A
Authority: KR
Inventors: 김기호; 김영희; 한창성; 박선희; 김지연; 이강혁; 이상일
Original assignee: 주식회사 바이오랜드
Priority date: 2008-06-16
Filing date: 2008-06-16
Publication date: 2011-06-20
Also published as: KR20090130743A

Abstract

본 발명은 천선과 추출물을 함유하는 피부노화방지 또는 피부미백 활성을 갖는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 엘라스타아제 활성억제 및 콜라겐분해효소 활성 억제를 통한 피부주름생성 억제 및 개선, 그리고 티로시나아제 억제효과를 통한 미백효과를 갖는 천선과 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

천선과, 피부노화, 피부미백, 엘라스타아제, 콜라겐 분해효소, 티로시나아제

Description

천선과 추출물을 함유하는 피부노화방지 또는 피부미백용 화장료 조성물 {Cosmetic compositions for preventing skin aging or whitening skin comprising extracts from Ficus erecta Thunb.}

본 발명은 천선과 추출물을 함유하는 피부노화방지 또는 피부미백 활성을 갖는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 엘라스타아제 활성억제 및 콜라겐분해효소 활성 억제를 통하여 피부탄력유지, 피부주름생성 및 티로시나아제 억제효과를 갖는 천선과 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부노화방지 또는 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

신체의 최외각을 이루고 있는 기관인 피부는 항상 대기 중에 노출되어 있어서 태양광선, 산소, 세균, 각종 공해물질 등에 직접적인 영향을 받고 있으며 특히 태양광선의 자외선에 대한 피부노출은 과잉의 활성산소종을 생성하고 체내의 항산화효소와 비타민 E, C, 글루타티온 및 유비퀴놀 등의 항산화제가 감소함으로 인해 산화와 항산화의 불균형이 야기되어 지질 과산화, 단백질 산화, 단백질 분해효소의 활성화, 콜라겐과 엘라스틴의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합, 히알루론산 사슬절단, 멜라닌 생성반응 촉진, DNA 산화와 같은 생체 구성 성분들의 손상을 가져오고 결국에는 피부탄력감소, 주름 및 기미, 주근깨 생성 등의 외인성 피부노화가 일어나게 된다(Oikarinen A., Photodermatol. Photoimmunol. Photomed., 7(1), 3-4(1990); Yamauchi M., J. Invest. Dermatol., 97, 938-941(1991)). 이러한 외인성 노화는 외부환경과는 무관하게 유전적 요소에 영향을 받아 나이가 들어감에 따라 자연스럽게 나타나는 내인성 노화와는 달리 외부환경적인 요인에 의해 유발되는 노화현상이므로 인위적인 조절이 비교적 용이하다고 할 수 있다. 따라서 태양광선, 산소, 세균, 공해물질, 스트레스 등의 외부 환경적 요인들을 완전히 제거하거나 이러한 외부 환경적 요인에 의해 생성된 활성산소나 활성산소가 세포막을 공격하여 피부에 염증을 유발하고 염증화된 조직에서 생리학적 진행 메커니즘에 의해 단백질이나 유전자 물질 등이 파괴되어 기미, 주름 등이 형성되는 일련의 피부노화 메커니즘의 단계를 모두 억제시켜줄 수 있다면 외인성 노화에 의한 피부노화를 근본적으로 방지할 수 있을 것이나 아직까지는 그런 이상적인 항노화제를 개발하지는 못하고 있으며 외부요인에 의해 생성되는 활성산소나 활성산소를 제거해주는 항산화제와 피부노화에 관여하는 대표적인 효소중 하나인 엘라스타아제의 활성억제물질 및 콜라겐분해효소인 MMP-1의 발현을 억제하는 물질을 찾는 연구들이 가장 활발히 이뤄지고 있으며 미백과 관련하여서는 멜라닌생성과정에 관여하는 효소인 티로시나아제(tyrosinase)의 활성억제물질을 찾는 연구들이 활발히 이뤄지고 있다.

활성산소 및 자외선에 의한 피부노화가 진행이 되면 자외선을 흡수하고 활성 산소를 중화시킴으로써 피부세포를 보호하기위해 멜라닌 생성반응 역시 촉진되는데, 이러한 멜라닌은 사람이 갖고 있는 색소로 표피의 기저층에 있는 멜라노사이트(melanocytes)에서 생성이 되며 유멜라닌(eumelanin)과 페오멜라닌(pheomelanin)으로 대별된다. 멜라닌의 생성과정은 다음과 같다. 티로시나아제(tyrosinase)에 의해 타이로신(tyrosine)이 도파(DOPA)를 거쳐 도파퀴논(DOPAquinone)으로 산화되고 도파퀴논(DOPAquinone)은 자발적으로 엔도사이클(endocycle)을 형성하여 레우코도파크롬(leucodopachrome)으로 된다. 이후 여러 단계를 거치면서 CO₂이탈반응, 자동산화반응, 광화학반응, 티로시나아제, 도파크롬 토토머라제(dopachrome tautomerase), DHICA(5,6-dihydroxyindol carboxylic acid)-옥시다제(oxydase) 등에 의해 중합되어 유멜라닌이 생성되며 페오멜라닌은 도파퀴논에 시스테이닐 도파 등의 부가물을 경유하여 생성된다. 상기와 같이 멜라노사이트에서의 멜라닌 생성과정의 핵심은 티로시나아제 등의 효소작용과 자동산화반응에 의해 생성과정이 촉진되는데 있으며, 이러한 티로시나아제 등의 효소작용 및 자동산화반응은 자외선 및 자외선으로 인해 유발된 활성산소에 의해 촉진된다(박수남, 대한화장품학회지, 제25권, 2호, p86-88, 1999). 따라서 티로시나아제의 효소활성을 억제함으로써 멜라닌생성을 억제할 수 있다.

콜라겐(collagen)은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질단백질로 진피의 세포외 간질에 존재하며 진피건조중량의 70%를 차지하고 3중 나선구조를 갖고 있다. 피부의 견고성, 결합조직의 결합력, 세포접착의 지탱, 세포분할과 분화의 유 도 등의 기능을 갖고 있으며 엘라스틴과 함께 피부의 탄력을 유지시켜주는 작용을 하고 있다. 그러나 이러한 콜라겐은 외부 환경적 요인에 의해 유발되는 활성산소와 단백질가수분해효소의 일종인 콜라겐분해효소(MMP-1) 모두에 의해 분해가 가능하여 콜라겐의 절단 및 비정상적인 교차결합이 일어나게 되면 피부에 주름이 생성된다(하병조, 기능성화장품, 신광출판사, p26-33, 2001; 고영수, 화장품학, 화장품신문사, p62-63, 2002; 박수남, 대한화장품학회지, 제25권, 2호, p86-88, 1999). 따라서 활성산소를 제거하거나 콜라겐분해효소(MMP-1)를 억제하게 되면 피부의 주름생성을 억제할 수 있다.

또한 엘라스타아제(elastase)는 피부 탄력을 유지해주는 동물 결합조직의 불용성 탄성섬유단백질인 엘라스틴(elastin)을 분해하는 유일한 분해효소로 알려져 있으며, 외부에서 침입한 미생물을 파괴하거나 손상된 세포를 제거하여 세포재생에 필요한 공간을 제공하는 기능을 갖고 있다(Blondin J., et al., J of clinical investigation. 58(4), 971-979, 1976). 그러나 엘라스타아제는 연령이 증가하거나 자외선 등의 외부피부자극에 의해 과잉생성이 되면 과잉 생성된 엘라스타아제가 엘라스틴을 과도하게 분해시켜 콜라겐간 결합이 약화되어 콜라겐과 엘라스틴이 진피조직에서 형성하고 있는 그물망 구조가 깨어지고 피부가 처지면서 주름이 생성된다. 특히 40대 이후에서 엘라스타아제의 작용에 의해 피부의 탄력이 급격히 감소하게 되는데 이는 엘라스타아제의 작용이 나이가 들어감에 따라 활발해져 엘라스틴 섬유가 일부 소멸되거나 응집현상이 나타나고, 콜라겐섬유가 감소하기 때문이다(Bissett, D. L., Photochem. Photobiol., 46, 367-378, 1987; Bizot-Foulon V., Godeat G., W. Int. J. Cos. Sci., 17, 255-264, 1995). 따라서 이러한 엘라스타아제의 활성을 억제함으로써 피부의 주름생성을 억제할 수 있다.

MMP(Matrix Metalloproteinase)는 활성중심부에 아연을 가지는 금속단백 분해효소로 생체 내에서 잠재성 전효소(zymogen)형태로 분비된다. 효소활성을 가지기 위해서 구조적 변형이 일어나 아미노 말단 부위가 절단, 활성화되며 활성화된 MMP는 2-마크로글로불린(macroglobulin)이나 TIMP(tissue inhibitors of metalloproteinase)와 같은 저해제에 의해 활성이 조절되고 피부의 케라티노사이트(keratinocyte), 섬유아세포(fibroblast)를 포함한 대다수의 많은 세포들이 MMP를 분비한다(Fisher, G. J. et al., Photochem. Photobiol. 69, 154, 1999). 1회의 자외선 조사에도 피부내의 MMP활성이 증가되며 피부내의 콜라겐을 현저하게 붕괴시킴으로써 MMP들이 진피층의 콜라겐 붕괴에 영향을 미치며 광 노화에 매우 중요한 역할을 한다.

좁은잎천선과(Ficus erecta Thunb.)는 무화과과에 속하는 식물로서 가는잎천선과라고도 하며 우리나라에서도 제주도와 남해안 지방 특히 제주도에 주로 자생하는 식물이다. 하늘의 선녀들이 먹는다고 해서 천선과라 불리는 이 열매는 무화과처럼 달지는 않아도 먹을 수는 있어서 아이들이 놀이삼아 따먹기도 한다. 바닷가 산기슭에서 자라며 높이 2-4 m이고, 나무껍질은 잿빛이 섞인 흰색이며 어두운 갈색 피복이 있고 털이 없다. 잎은 어긋나고 천선과 보다 좁은 바소꼴이며 길이 10-20 cm이다. 끝부분이 뾰족하고 가장자리는 밋밋하거나 거친톱니가 난다. 곁맥은 5-6 쌍이고 잎자루는 길이 1-4 cm이다(이창복, 원색대한식물도감, 향문사, 1979). 좁은 잎천선과는 민간에서는 오래전부터 보중, 익기, 건비, 화습, 강근장골, 소종, 활혈, 해독의 효능이 있으며, 류마티스성 관절염, 중기허약, 기혈쇠미, 사디산언, 근골불리, 타박상, 경폐, 산후유즙결핍을 치료 등에 이용되어져왔다.

한편 천선과 추출물에 관한 선행발명의 예를 보면, 좁은잎천선과 추출물을 포함하는 골다공증의 예방 및 치료용 조성물(한국특허 등록 제10-2005-0087290호, 한국특허 등록 제10-0453290호)을 제주도에서 출원한 특허가 등록되어 있으나, 본 발명에서 달성하고자 하는 미백 및 주름개선제로서 천선과 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물과는 무관하다.

이에 본 발명자들은 천선과 추출물의 엘라스타아제 억제활성 및 콜라겐분해효소(MMP-1)의 발현을 살폈으며, 미백활성과 관련하여 티로시나아제 억제활성을 검색한 결과 우수한 피부주름개선, 피부주름 생성억제, 그리고 피부미백효과가 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 우수한 피부주름 개선효과 및 피부미백효과를 갖는 천선과 추출물을 함유하는 피부노화방지 또는 피부미백용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 천선과 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부노화방지 또는 피부미백 활성을 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 추출물은 천선과를 통상적인 식물 추출발법으로 추출할 수 있으며, 바람직하게는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것인 것이 적당하다.

또한 상기 유기용매로는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 글리세린으로 구성된 군에서 선택된 것을 사용할 수 있으며, 이들 유기용매와 물을 적절히 혼합한 용매도 사용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 추출용매를 이용하여 40-95℃에서 4-20시간 동안 가열하거나 5-40℃에서 1-15일간 침적 또는 교반시켜 추출하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 추출용매를 이용한 추출방법으로는 통상적인 식물추출방법 예컨대, 열수추출, 유기용매 추출 등의 방법을 사용할 수 있으며, 구체적으 로 천선과 건조물 또는 그 분쇄물을 상기 추출용매에 투입하고 필요에 따라 교반하면서 5-40℃에서 1-15일간 침적시키거나 40-100℃에서 4-20시간 동안 가열하여 추출하는 것이 적당하다. 추출에 사용되는 용매의 양은 추출원료의 통상 5 내지 20배량(중량비)인 것이 바람직하다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 조성물은 천선과 추출물을 0.01-90중량%로 함유시켜 제조할 수 있으나, 바람직하게는 0.01-50중량%로 함유하는 것이 적당하다.

본 발명에서, 상기와 같이 본 발명의 조성물이 용매를 이용하여 추출한 천선과 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있으나, 이들 추출물을 다시 냉각 콘덴서가 달린 증류장치를 이용하여 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 완전히 감압 농축하여 얻은 잔류분말(건조분말)을 유효성분으로 함유할 수도 있다.

또한 본 발명의 조성물은, 상기의 천선과 추출물을 감압 농축하여 얻어진 잔류분말에 1-10배 부피량의 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물을 단계적으로 처리하여 얻어진 분획들을 유효성분으로 함유할 수 있다. 예를 들어, 상기의 천선과 추출물을 감압 농축하여 얻어진 잔류분말을 물에 분산시킨 후 동량 또는 1~10배 부피량의 n-헥산을 처리하여 분획하고 수득한 물층은 다시 n-헥산을 처리한 동일한 방법으로 에틸아세테이트(초산에틸), 부탄올을 단계적으로 처리하여 분획한다. 이때 각각의 n-헥산층, 에틸아세테이트층, 부탄올층 및 최종적으로 수득되는 물층을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치를 이용하여 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 완전히 감압 농축한 후 각각의 잔류분말을 얻을 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 조성물은 엘라스타아제의 활성을 억제하거나 콜라겐분해효소(MMP-1)의 발현을 감소시킴으로써 피부노화방지 효과를 갖는 것을 특징으로 한다. 엘라스타아제(elastase)는 엘라스틴(elastin)을 분해하는 효소로서 엘라스타아제가 과잉생성되면 엘라스틴을 과도하게 분해시켜 피부가 처지면서 주름이 생성되기 때문에 엘라스타아제의 활성을 억제함으로서 피부노화를 방지할 수 있으며, 콜라겐(collagen)은 엘라스틴과 함께 피부의 탄력을 유지시켜주는 작용을 하고 콜라겐분해효소(MMP-1)에 의해 분해되기 때문에 이러한 콜라겐분해효소의 발현을 감소시킴으로서 피부에 주름이 생성되는 것을 방지할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 조성물은 티로시나아제 활성을 억제함으로써 피부미백효과를 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 종래기술에서 언급한 바와 같이, 멜라노사이트에서의 멜라닌 생성과정은 티로시나아제 등의 효소작용에 의해 촉진되므로 티로시나아제 활성을 억제함으로서 피부미백효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 조성물은 스킨, 스킨로션, 스킨소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 영양로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양크림, 맛사지크림, 모이스쳐크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디클린져, 바디로션, 샴푸, 유액, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이새도우로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 제형을 갖는 것이 바람직하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 추출물의 제조

제주도에 자생하고 있는 천선과의 잎을 세절하여 1kg을 95%(중량%) 에탄올 10L에 넣고 상온에서 5일간 교반 추출한 후 250메쉬 여과포로 여과하고, 4℃에서 7일간 방치하여 숙성시킨 후 와트만 여과지(N0.5)로 여과하여 추출물 9.6L(고형분 165.5 g)를 얻었다.

실시예 2~11.

하기 표 1의 용매를 사용하고 실시예 1과 동일한 방법으로 추출하여 그 결과를 하기 표 1에 기술하였다.

[표 1]

	용 매	추출액 (L)	고형분 (g)
실시예 2.	정제수	9.5	131.7
실시예 3.	무수 메탄올	9.4	167.2
실시예 4.	무수 에탄올	9.4	159.3
실시예 5.	함수 에탄올 (30 중량%)	9.4	150.7
실시예 6.	함수 에탄올 (70 중량%)	9.1	160.7
실시예 7.	부틸렌글리콜	9.3	130.4
실시예 8.	프로필렌글리콜	9.4	137.4
실시예 9.	글리세린	9.4	130.7
실시예 10.	함수 부틸렌글리콜 (30 중량%)	9.4	137.4
실시예 11.	함수 프로필렌글리콜 (30 중량%)	9.7	140.8

실시예 12.

천선과 잎을 세절하여 1kg을 95%(중량%) 에탄올 10L에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 환류조건하에서 3시간 가열하여 추출한다. 250메쉬 여과포로 여과하고 상온으로 냉각한 후 5~15℃에서 7일간 방치한다. 최종 0.45㎛ 필터로 여과하여 추출물 9.4L (고형분 169.4g)를 얻었다.

실시예 13~17.

하기 표 2에 기술한 용매를 사용하고 실시예 12와 동일한 방법으로 추출하여 그 결과를 하기 표 2에 기술하였다.

[표 2]

	용 매	추출액 (L)	고형분 (g)
실시예 13.	정제수	9.7	160.4
실시예 14.	무수 메탄올	8.4	160.4
실시예 15.	무수 에탄올	8.4	164.0
실시예 16.	함수 에탄올 (30 중량%)	9.2	150.8
실시예 17.	함수 에탄올 (70 중량%)	9.5	178.2

실시예 18.

천선과 가지를 세절하여 1kg을 95%(중량%) 에탄올 10L에 넣고 상온에서 5일간 교반 추출한 후 250메쉬 여과포로 여과하고, 4℃에서 7일간 방치하여 숙성시킨 후 와트만 여과지로 여과하여 추출물 9.7L (고형분 60.7g)를 얻었다.

실시예 19~28.

하기 표 3의 용매를 사용하고 실시예 18과 동일한 방법으로 추출하여 그 결과를 하기 표 3에 기술하였다.

[표 3]

	용 매	추출액 (L)	고형분 (g)
실시예 19.	정제수	9.4	43.1
실시예 20.	무수 메탄올	9.6	57.1
실시예 21.	무수 에탄올	9.1	50.4
실시예 22.	함수 에탄올 (30 중량%)	9.4	48.1
실시예 23.	함수 에탄올 (70 중량%)	9.7	52.1
실시예 24.	부틸렌글리콜	9.1	40.2
실시예 25.	프로필렌글리콜	9.2	43.1
실시예 26.	글리세린	9.1	40.2
실시예 27.	함수 부틸렌글리콜 (30 중량%)	9.6	47.2
실시예 28.	함수 프로필렌글리콜 (30 중량%)	9.1	45.2

실시예 29.

천선과 가지를 세절하여 1kg을 95%(중량%) 에탄올 10L에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 환류조건하에서 3시간 가열, 추출한다. 250메쉬 여과포로 여과하고 상온으로 냉각한 후 5~15℃에서 7일간 방치한다. 최종 0.45㎛ 필터로 여과하여 추출물 8.1L (고형분 49.2g)를 얻었다.

실시예 30~35.

하기 표 4에 기술한 용매를 사용하고 실시예 29와 동일한 방법으로 추출하여 그 결과를 하기 표 4에 기술하였다.

[표 4]

	용 매	추출액 (L)	고형분 (g)
실시예 30.	정제수	9.2	56.1
실시예 31.	무수 메탄올	8.4	53.1
실시예 32.	무수 에탄올	8.9	57.1
실시예 33.	함수 에탄올 (30 중량%)	9.7	64.0
실시예 34.	함수 에탄올 (70 중량%)	9.6	62.7

실시예 35.

상기 실시예 6에서 얻어진 추출물 분말(파우더) 중 50g을 1L 정제수에 분산시킨 후 n-헥산 1L를 넣어 진탕하고 층분리가 될 때까지 정치한 후, 상층액(n-헥산)을 회수하였다. 남아 있는 하층액과 동량의 n-헥산으로 3회 반복 처리한 헥산층 액을 합하여, 얻어진 분획을 감압 농축하여 가루형태의 분획물 13.4g을 얻었다.

실시예 36.

상기 실시예 35에서 얻어진 하층액(물층)에 초산에틸 1L를 넣고 진탕하고 층분리가 될 때까지 정치한 후, 상층액(초산에틸)을 회수하였다. 동일한 방법으로 3회 실시하여 얻어진 분획을 감압농축하여 가루형태의 분획물 9.9g을 얻었다.

실시예 37.

상기 실시예 36에서 얻어진 하층액(물층)에 n-부탄올 1L를 넣고 진탕하고 층분리가 될 때까지 정치한 후, 상층액(부탄올)을 회수하였다. 동일한 방법으로 3회 실시하여 얻어진 분획을 감압농축하여 가루형태의 분획물 12.4g을 얻었다.

실시예 38.

상기 실시예 37에서 얻어진 하층액(물층)을 감압농축하여 가루형태의 분획물 10.0g을 얻었다.

실시예 39.

상기 실시예 23에서 얻어진 추출물 파우더 중 30g을 500ml 정제수에 분산시킨 후 n-헥산 500ml을 넣어 진탕하고 층분리가 될 때까지 정치한 후, 상층액(n-헥산)을 회수한다. 동일한 방법으로 3회 실시하여 얻어진 분획을 감압농축하여 가루형태의 분획물 4.2g을 얻었다.

실시예 40.

상기 실시예 39에서 얻어진 하층액(물층)에 초산에틸 500ml을 넣고 진탕하고 층분리가 될 때까지 정치한 후, 상층액(초산에틸)을 회수한다. 동일한 방법으로 3회 실시하여 얻어진 분획을 감압농축하여 가루형태의 분획물 4.8g을 얻었다.

실시예 41.

상기 실시예 40에서 얻어진 하층액(물층)에 n-부탄올 500ml을 넣고 진탕하고 층분리가 될 때까지 정치한 후, 상층액(부탄올)을 회수한다. 동일한 방법으로 3회 실시하여 얻어진 분획을 감압농축하여 가루형태의 분획물 8.1g을 얻었다.

실시예 42.

상기 실시예 41에서 얻어진 하층액(물층)을 감압농축하여 가루형태의 분획물 5.4g을 얻었다.

실험예 1. 엘라스타아제 저해효과 실험

상기 실시예 1~42의 천선과 추출물에 대하여 엘라스타아제 활성저해 효과를 측정하였다.

완충액(0.267M Tris 액을 pH 8.0이 되도록 0.267M 염산으로 조정) 60㎕에 엘라스타아제 기질액(Succ-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide 표준품 8.8mM, Sigma사, 미국) 20㎕, 시료 100㎕(실시예 각각의 추출물을 정제수에 일정농도로 희석)를 넣어 섞고, 효소액(돼지 췌장 엘라스타아제(Porcine Pancreatic Elastase) 표준품 10㎍/㎖) 20㎕를 넣어 흔들어 섞어 25℃에서 15분간 반응시키고, p-nitroaniline의 생성량을 파장 410nm에서 흡광도 B를 측정하였다.

상기와 동일한 완충액 60㎕에 기질액 20㎕, 정제수 20㎕, 시료 100㎕를 넣어 상기와 동일한 방법으로 조작하여 얻은 액을 대조액으로 하여 흡광도 C를 측정하였다. 따로 시료 대신 정제수 100㎕를 가지고 검액과 같은 방법으로 조작하여 얻은 액을 공시험액으로 하여 그 흡광도 A를 측정하였으며, 효소액 및 검액 대신 정제수 120㎕를 넣어 검액과 같은 방법으로 조작하여 얻은 액을 색보정액으로 하여 그 흡광도 D를 측정하였고 하기 식에 따라 엘라스타아제 억제율(%)을 구하였다.

엘라스타아제 저해율(%) = [1 - (각 농도 혼합 식물 추출물의 효소 활성도/대조군의 효소 활성도)] X 100

실시예 6와 23의 엘라스타아제 저해율을 도 1에 나타내었으며, 도 1과 동일한 방법으로 실시예들의 엘라스타아제 저해활성 IC₅₀을 구하였다. 엘라스타아제 저해활성 IC₅₀은 엘라스타아제의 활성을 50% 저해하는데 요구되는 추출물의 농도(㎍/㎖)로써 표시하였으며, 그 결과를 표 5에 나타내었다.

[표 5]. 천선과 추출물의 엘라스타아제 억제 효과

실 시 예	IC₅₀(㎍/㎖)
실시예 1 (천선과 잎추출물)	64.2
실시예 2 (천선과 잎추출물)	58.1
실시예 3 (천선과 잎추출물)	60.2
실시예 4 (천선과 잎추출물)	48.1
실시예 5 (천선과 잎추출물)	55.2
실시예 6 (천선과 잎추출물)	42.1
실시예 7 (천선과 잎추출물)	59.3
실시예 8 (천선과 잎추출물)	69.2
실시예 9 (천선과 잎추출물)	70.1
실시예 10 (천선과 잎추출물)	55.2
실시예 11 (천선과 잎추출물)	55.2
실시예 12 (천선과 잎추출물)	47.2
실시예 13 (천선과 잎추출물)	50.1
실시예 14 (천선과 잎추출물)	48.1
실시예 15 (천선과 잎추출물)	49.5
실시예 16 (천선과 잎추출물)	51.2
실시예 17 (천선과 잎추출물)	48.2
실시예 18 (천선과 가지추출물)	79.2
실시예 19 (천선과 가지추출물)	80.2
실시예 20 (천선과 가지추출물)	80.1
실시예 21 (천선과 가지추출물)	84.2
실시예 22 (천선과 가지추출물)	77.2
실시예 23 (천선과 가지추출물)	75.2
실시예 24 (천선과 가지추출물)	80.1
실시예 25 (천선과 가지추출물)	95.2
실시예 26 (천선과 가지추출물)	97.2
실시예 27 (천선과 가지추출물)	89.2
실시예 28 (천선과 가지추출물)	87.1
실시예 29 (천선과 가지추출물)	79.3
실시예 30 (천선과 가지추출물)	84.2
실시예 31 (천선과 가지추출물)	79.2
실시예 32 (천선과 가지추출물)	87.2
실시예 33 (천선과 가지추출물)	85.4
실시예 34 (천선과 가지추출물)	80.1
실시예 35 (천선과 잎 헥산 분획물)	42.1
실시예 36 (천선과 잎 초산에틸 분획물)	20.1
실시예 37 (천선과 잎 부탄올 분획물)	6.1
실시예 38 (천선과 잎 물분획물)	77.2
실시예 39 (천선과 가지 헥산 분획물)	45.2
실시예 40 (천선과 가지 초산에틸 분획물)	39.2
실시예 41 (천선과 가지 부탄올 분획물)	1.0
실시예 42 (천선과 가지 물분획물)	18.9
대조구(Oleanolic acid)	9.2
대조구(빈랑자 추출물)	31.2

상기 표 5에서, 본 발명의 천선과 추출물은 형태(추출용매 및 조건에 따른 형태)에 관계없이 모두 엘라스타아제 저해활성 IC₅₀ 값이 100 ㎍/㎖이 넘지 않는 것 으로 나왔으며, 이는 소량으로도 엘라스타아제 저해활성 효과가 뛰어남을 보여주는 것이다. 또한 대조구로 사용된 올레아놀릭산(Oleanolic acid)과 빈랑자 추출물과 비교할 때, 유사한 효과가 나거나 몇몇 추출물 형태에서는 더 낮은 수치를 보이는 것도 나타났다. 따라서 본 발명의 천선과 추출물은 엘라스타아제 저해활성 효과가 뛰어남을 알 수 있다.

실험예 2. 콜라겐 분해효소(MMP-1) 저해 효과 측정

상기 실시예로부터 얻어진 천선과 추출물에 대하여 콜라겐 분해효소(MMP-1) 유전자의 발현정도를 측정하기 위하여 RT-PCR(Reverse Transcription -Polymerase Chain Reaction)을 실시하였다. 인간 정상 섬유아세포(ATCC-2706)를 60mm 배양접시에 1× 10⁶의 밀도로 10% 소혈청(Gibco/BRL)을 포함하는 DMEM 배지(Gibco/BRL)로 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 하루 동안 배양하였다. 그 후 혈청이 2% 첨가된 배지로 교환해 주고 소디움 니트로프루사이드(Sodium Nitroprusside, 시그마사) 50 ?M을 산화질소의 공급원으로 사용하여 배지에 첨가하고 시료를 농도별로 첨가하여 24시간 37℃에서 배양하였다. 그 후, 세포로부터 트라이졸 시약(Trizole reagent, Gibco/BRL)을 이용한 구아니디움 티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출방법(Guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)으로 총 RNA를 분리하였다. RT-PCR을 하기 위해 상기 방법으로 얻어진 RNA에 RNA 분해효소가 없는 DNA 분해효소(RNase-free DNase, Promega)를 37℃에서 30분간 처리하여 DNA의 오염을 제 거하였으며 페놀/클로로포름 추출법과 에탄올 침전으로 순수 RNA를 얻었다. 1 ㎍의 RNA를 올인원 RT/PCR 키트(All in one RT/PCR kit, Superbio)를 사용하여 RT-PCR를 실시하였다. 대조군으로 베타-엑틴을 사용하였으며 RT-PCR에 사용된 MMP-1의 프라이머(primer)는 서열번호 1 및 서열번호 2(표 6 참조)로 구성되어 있고, 베타-엑틴의 프라이머는 서열번호 3 및 서열번호 4(표 6 참조)로 구성되어 있다. 반응조건으로, MMP-1은 95℃ 1분, 48℃ 1분, 72℃ 1분, 29사이클이며, 베타-엑틴은 95℃ 1분, 62℃ 1분, 72℃ 1분, 22사이클이며, PCR 생산물은 1.5%(w/v) 아가로즈(agarose, Sigma사)젤에 전기영동하여 젤 이미지 분석기(Biorad)로 정량하였다. 그 결과를 표 7과 도 2에 나타내었다.

[표 6]

서열번호 1	5'-TGGGAGCAAACACATCTGA-3'
서열번호 2	5'-ATCACTTCTCCCCGAATCGT-3'
서열번호 3	5'-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3'
서열번호 4	5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3'

[표 7] 천선과 추출물의 MMP-1 발현량

시 료		MMP-1 발현량 (%)
시 료		250 ㎍/㎖	500 ㎍/㎖
A	대조군(베타-액틴)	100	100
B	소디움 니트로프루사이드	118.2	109.45
C	소디움 니트로프루사이드 + 실시예 6 (천선과 잎추출물)	72.2	30.1
D	소디움 니트로프루사이드 + 실시예 23 (천선과 가지추출물)	74.11	29.44
E	소디움 니트로프루사이드 + 실시예 2(물 가용 추출물)	70.12	33.12
F	소디움 니트로프루사이드 + 실시예 11(함수 프로필렌글리콜 가용 추출물)	98.41	87.23
G	소디움 니트로프루사이드 + EGCG (Epigallocatechin gallate ; 11.46 ㎍/㎖)	81.44

상기 표 7과 도 2에서, 본 발명의 천선과 추출물은 MMP-1 발현량을 양성대조군의 사용한 EGCG와 비교할 때 유사하거나 더 많이 저해하는 것으로 나타났다. 이는 천선과 추출물이 MMP-1 발현량을 감소시키는 효과가 있음을 보여주는 것이다.

실험예 3. 머쉬롬 티로시나아제 저해효과 실험

상기 실시예 1~34의 천선과 추출물에 대하여 티로시나아제 활성저해 효과를 측정하였다.

티로시나아제 활성저해 효과는 머쉬롬 티로시나아제를 사용하여 반니(A. Vanni) 등의 방법을 이용하여 측정하였다(A. Vanni, Annali di Chimica., 80, p35, 1990). L-Tyrosine(0.3㎎/㎖,katayama ch.) 1.0㎖에 포타슘 포스페이트 완충액(Potassium phosphate buffer solution; pH 6.8, 0.1M) 1.0㎖을 혼합한 후 시료를 각 농도별로 0.9ml을 상온조건에서 넣고 37℃에서 10~20분간 유지하였다. 그 후 티로시나아제(Tyrosinase, 1250 units/ml, SIGMA, T-7755) 0.1㎖를 넣고 10분간 방치하여 효소반응을 진행시켰다. 10분± 5초 이내로 꺼내서 얼음물로 구성된 냉동조건에서 반응을 종결시켰다. 이때 대조군은 각 농도별 시료 대신 추출용매를 넣었고 블랭크(blank)는 티로시나아제 대신 포타슘 포스페이트 완충액을 동량 넣었다. 마지막으로 475㎚에서 흡광도를 조사하였다. 각 농도별 시료의 티로시나아제 저해 효과는 하기의 식으로 구하였고, 실시예 6과 23의 티로시나아제 저해율을 도 3에 나타내었으며, 도 3과 동일한 방법으로 실시예들의 티로시나아제 저해활성 IC₅₀을 구 하였다. 티로시나아제 저해활성 IC₅₀은 티로시나아제 활성을 50% 저해하는데 요구되는 추출물의 농도(㎍/㎖)로써 표시하였으며, 그 결과를 표 8에 나타내었다.

티로시나아제 저해율(%) = [1 - (각 농도별 시료추출물의 효소 활성도/대조군의 효소 활성도)]× 100

[표 8]. 천선과 추출물의 티로시나아제 억제효과

실 시 예	IC₅₀(㎍/㎖)
실시예 1 (천선과 잎추출물)	179.2
실시예 2 (천선과 잎추출물)	177.2
실시예 3 (천선과 잎추출물)	179.2
실시예 4 (천선과 잎추출물)	179.2
실시예 5 (천선과 잎추출물)	199.3
실시예 6 (천선과 잎추출물)	180.2
실시예 7 (천선과 잎추출물)	197.2
실시예 8 (천선과 잎추출물)	206.3
실시예 9 (천선과 잎추출물)	178.2
실시예 10 (천선과 잎추출물)	175.2
실시예 11 (천선과 잎추출물)	199.2
실시예 12 (천선과 잎추출물)	196.2
실시예 13 (천선과 잎추출물)	180.6
실시예 14 (천선과 잎추출물)	197.0
실시예 15 (천선과 잎추출물)	180.2
실시예 16 (천선과 잎추출물)	178.2
실시예 17 (천선과 잎추출물)	200.2
실시예 18 (천선과 가지추출물)	298.2
실시예 19 (천선과 가지추출물)	300이상
실시예 20 (천선과 가지추출물)	300이상
실시예 21 (천선과 가지추출물)	298.2
실시예 22 (천선과 가지추출물)	287.4
실시예 23 (천선과 가지추출물)	278.2
실시예 24 (천선과 가지추출물)	298.2
실시예 25 (천선과 가지추출물)	289.3
실시예 26 (천선과 가지추출물)	299.2
실시예 27 (천선과 가지추출물)	300이상
실시예 28 (천선과 가지추출물)	300이상
실시예 29 (천선과 가지추출물)	277.2
실시예 30 (천선과 가지추출물)	287.3
실시예 31 (천선과 가지추출물)	275.2
실시예 32 (천선과 가지추출물)	300이상
실시예 33 (천선과 가지추출물)	281.2
실시예 34 (천선과 가지추출물)	276.3
실시예 35 (천선과 잎 헥산 분획물)	81.2
실시예 36 (천선과 잎 초산에틸 분획물)	24.2
실시예 37 (천선과 잎 부탄올 분획물)	58.2
실시예 38 (천선과 잎 물분획물)	107.2
실시예 39 (천선과 가지 헥산 분획물)	267.2
실시예 40 (천선과 가지 초산에틸 분획물)	155.2
실시예 41 (천선과 가지 부탄올 분획물)	130.2
실시예 42 (천선과 가지 물분획물)	273.3
대조구(알부틴)	128.2

상기 표 8에서, 본 발명의 천선과 추출물은 모두 티로시나아제 저해활성을 나타냈으며, 대조구로 사용된 알부틴과 비교할 때, 유사한 효과가 나거나 몇몇 추 출물 형태에서는 더 낮은 수치를 보이는 것도 나타났다. 따라서 본 발명의 천선과 추출물은 티로시나아제 저해활성 효과가 뛰어남을 알 수 있다.

제형예 1.

상기 실시예 6의 천선과 잎 추출물을 함유한 화장료 중 화장수(스킨)의 제형예를 표 9에 나타내었다. 이때 비교예는 천선과 잎 추출물을 함유하지 않은 경우이다.

[표 9]

번호	원 료	실시제형예 1	비교제형예 1
1	천선과 추출물 (실시예 6)	10.0	-
2	1,3-부틸렌 글라이콜	2.00	2.00
3	글리세린	3.00	3.00
4	올레일알콜	2.00	2.00
5	폴리솔베이트 20	1.00	1.00
6	에탄올	6.00	6.00
7	방부제	미량	미량
8	조합향료	미량	미량
9	정제수	잔량	잔량
	계	100.00	100.00

제형예 2.

상기 실시예 6의 천선과 추출물을 함유한 화장료 중 영양화장수(로션)의 제형예를 표 10에 나타내었다. 이때 비교예는 천선과 추출물을 함유하지 않은 경우이다.

[표 10]

번호	원 료	실시제형예 2	비교제형예 2
1	천선과 추출물(실시예 6)	10.0	-
2	1,3-부틸렌글라이콜	4.00	4.00
3	글리세린	3.00	3.00
4	올레일알콜	0.05	0.05
5	폴리솔베이트 20	1.00	1.00
6	방부제	미량	미량
7	조합향료	미량	미량
8	정제수	잔량	잔량
	계	100.00	100.00

제형예 3.

상기 실시예 6의 천선과 잎 추출물을 함유한 화장료중 영양크림의 제형예를 표 11에 나타내었다. 이때 비교예는 천선과 잎 추출물을 함유하지 않은 경우이다.

[표 11]

번호	원 료	실시제형예 2	비교제형예 2
1	천선과 추출물 (실시예 6)	10.0	-
2	글리세린	5.00	5.00
3	트리에탄올아민	0.50	0.50
4	토코페릴 아세테이트	1.00	1.00
5	유동파라핀	5.00	5.00
6	스쿠알란	5.00	5.00
7	마카다미아너트 오일	15.00	15.00
8	폴리솔베이트 60	1.00	1.00
9	솔비탄세스퀴올레이트	1.00	1.00
10	카르복실비닐폴리머	0.20	0.20
11	방부제	미량	미량
12	조합향료	미량	미량
13	정제수	잔량	잔량
	계	100.00	100.00

제형예 4.

상기 실시예 6의 천선과 잎 추출물을 함유한 화장료 중 맛사지크림의 제형예를 표 12에 나타내었다. 이때 비교예는 천선과 잎 추출물을 함유하지 않은 경우이 다.

[표 12]

번호	원 료	실시제형예 2	비교제형예 2
1	천선과 추출물(실시예 6)	10.0	-
2	바세린	5.00	5.00
3	유도파라핀	30.00	30.00
4	밀납	3.00	3.00
5	폴리솔베이트 60	1.00	1.00
6	솔비탄세스퀴올레이트	1.00	1.00
7	1,3-부틸렌글라이콜	5.00	5.00
8	글리세린	5.00	5.00
9	방부제	미량	미량
10	조합향료	미량	미량
11	정제수	잔량	잔량
	계	100.00	100.00

실험예 4. 피부에 대한 탄력성 증가시험

제형예 2의 실시제형예 2와 비교제형예 2의 영양화장수(로션)를 피부에 도포했을 때 피부의 탄력성이 증가되는 효과를 측정하기 위하여 20-55세의 여성층으로서 정상, 지성, 건성, 복합성 피부의 소유자 20명에게 안면 왼쪽부분에는 실시제형예 2의 영양로션을, 안면 오른쪽부분에는 비교제형예 2의 영양로션을 아침, 저녁으로 1일 2회 도포하여 사용하게 한 후 1주, 2주, 3주 및 4주후에 피부 탄력 측정기기(Ballistometer)를 이용하여 피부의 탄력성을 측정하였다. 측정결과는 다음의 표 13에 나타내었다.

[표 13]

			실시제형예 2의 화장료					비교제형예 2의 화장료					비 고
			T₀	T₁	T₂	T₃	T₄	T₀	T₁	T₂	T₃	T₄
탄 력 성	튀어오름 수		0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0
	튀어오름 수		0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0
	진 폭	첫번째	1.9	4.8	5.0	5.1	5.5	1.9	3.5	3.8	3.8	3.7
		두번째	1.5	4.6	5.2	5.2	5.6	1.3	2.0	2.3	2.4	2.5
		세번째	0.0	2.5	2.6	3.6	3.7	0.0	0.0	1.9	2.1	2.5
		네번째	0.0	1.4	1.7	2.0	2.9	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0
평 균			0.85	3.33	3.63	3.98	4.42	0.80	1.38	2.00	2.08	2.17

T₀; 사용 전, T₁; 1주 사용 후, T₂ ; 2주 사용 후

T₃; 3주 사용 후, T₄; 4주 사용 후

이상의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 천선과 추출물을 함유하는 실시제형예 2의 영양화장수(로션)는 추출물이 첨가되지 않고 제조된 비교제형예 2의 영양화장수(로션)에 비해 피부상태 개선효과에 의한 피부탄력 효과가 매우 우수함을 확인할 수 있었다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 천선과 추출물은 주름개선효능, 미백효능이 우수하면서도 안전성에 문제가 없는 천연재료이다. 따라서 본 발명의 천선과 추출물을 이용한 화장료 조성물은 기능성 화장품 관련 분야에서 다양하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 천선과 추출물의 엘라스타아제 활성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.

도 2는 본 발명에 따른 천선과 추출물의 콜라겐 분해효소(MMP-1) 저해 효과를 측정한 그래프이다.

도 3은 본 발명에 따른 천선과 추출물의 티로시나아제 활성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.

Claims

천선과 잎을 에탄올로 추출한 후 n-헥산, 초산에틸 및 n-부탄올로 순차적으로 분획하여 제조된, 천선과 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름개선용 화장료 조성물.
삭제
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 천선과 추출물을 0.01-50중량%로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 스킨, 스킨로션, 스킨소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 영양로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양크림, 맛사지크림, 모이스쳐크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디클린져, 바디로션, 샴푸, 유액, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이새도우로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.