KR101521239B1

KR101521239B1 - 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101521239B1
Application number: KR1020150040171A
Authority: KR
Inventors: 윤미영
Original assignee: 광주여자대학교 산학협력단
Priority date: 2015-03-23
Filing date: 2015-03-23
Publication date: 2015-06-16

Abstract

본 발명은 황금 추출물을 붉은덕다리버섯 균사체로 발효시켜 수득된 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로 본 발명의 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 우수한 피부 노화 방지효과, 피부 주름 개선효과, 피부 보습 효과, 피부 미백 효과, 피부 장벽 기능 개선효과, 피부 염증 개선효과 및 아토피 개선효과를 발휘한다.

Description

황금 붉은덕다리버섯 발효액을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선용 화장료 조성물 {Cosmetic composition for anti-aging containing the extract of fermentative Scutellaria baicalensis by Laetiporus Sulphureus}

본 발명은 황금 추출물을 붉은덕다리버섯 균사체로 발효시켜 수득된 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로 더욱 구체적으로는 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지용, 피부 주름 개선용, 피부 보습용, 피부 미백용, 피부 장벽 기능 개선용, 피부 염증 개선용 및 아토피 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부노화는 내인성 노화(intrinsic, chronological aging)와 광노화(phtoaging) 두 가지로 나눌 수 있다[Gilchrest BA: J. Am. Acad. Dermatol.,21, 610-613(1989)]. 내인성 노화는 연령이 증가함에 따라 생체의 생리적인 기능이 저하되어 자연적으로 유발되는 노화현상이다[Braverman IM 등: J. Invest. Dermatol., 78, 434-443(1982)]. 광노화는 피부가 광에 반복적으로 노출되어 피부의 외양 또는 기능이 변화되는 것을 의미한다[Ridder GM등: J. Am. Acad. Dermatol., 25, 751-760(1991)]. 상기 외에도, 피부노화는 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 활성산소종이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화 될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 좀더 구체적으로 말하자면, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부 세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 피브로넥틴 등이 절단되어 심한 과다 염증반응이 일어나고, 피부의 탄력에 지장을 주게 되고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다.

그러므로 신체의 대사 과정 중 발생하는 활성산소종이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 활성산소종을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생시켜서 세포를 증식시켜야 피부가 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다. 노화에는 활성산소종 뿐만 아니라 MMP(Matrix metallopretease)라는 효소가 관여하는데, 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포 외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한, 자외선 노출에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다. 그러므로, 자외선에 의해 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 하지만, 지금까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 분해효소(MMP)의 활성만을 단순 억제하는 것이 대부분이었다.

한편, 멜라닌은 색소 세포 내에 존재하는 티로시나제의 작용에 의해 타이로신으로부터 도파(dopa), 도파퀴논(dopaquinone)으로 변환되어 도파크롬(dopachrome) 등을 거처 생성된다. 멜라닌은 피부에 존재하여 자외선 등으로부터 신체를 보호하고 체내 호르몬 분비 조절에 중요한 기능을 나타낸다. 그러나, 멜라닌이 과잉생산되면 기미, 주근깨 등을 형성하고 피부노화를 촉진하며, 피부암 유발에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있는데, 멜라닌 과잉생산을 예방하기 위한 연구개발이 현재 활발히 진행되고 있다. 이미 아스코르빈산(일본특개평 4-9320), 하이드로퀴논(일본특개평 6-192062), 코직산(일본특개소 56-7710), 알부틴(일본특개평 4-93150) 및 식물 추출물 등이 티로시나제 저해 활성을 나타내어 미백 화장료로 이용되고 있다. 하지만, 이들 성분은 화장품 제형 중에서 안정성이 나빠, 분해되어 착색되거나, 이취가 발생하거나, 생체 수준에서의 효능, 효과가 불분명하거나 또는 안전성이 문제가 되어 그 사용이 제한되고 있는 실정이다.

한편, 인체에 있어서 피부는 외부환경으로부터 생체를 보호하는 보호막의 기능을 하는 기관으로서, 인체 내의 생체성분 즉, 물이나 전해질 등의 손실을 방지하는 동시에 외부로부터 유해물질이 인체 내로 침입하지 못하도록 하는 역할을 한다. 이러한 피부는 크게 표피층, 진피층 및 피하지방층으로 구분된다. 표피층은 각질세포와 멜라닌 세포로 구성되는데, 피부 최외곽의 각질세포층은 외부환경과 직접 접촉하기 때문에 물리적, 화학적 혹은 물질의 투과에 대한 강한 저항성이 요구되며, 인체로부터 외부로 수분이 손실되는 것을 막아줌과 동시에 자체로도 적당한 수분을 보유함으로써 유연성을 유지하여야 한다.

일반적으로 피부의 수분량은 진피층에서는 70% 정도이나 표피층으로 갈수록 감소하여 각질세포층에서는 약 10 내지 30%가 된다. 진피층에서 공급된 물은 주로 수동적 확산에 의해 각질층 상부로 이동하며 최종적으로는 외부로 배출된다. 이를 경피수분 손실(Trans Epidermal Water Loss : TEWL)이라 하며, 이러한 경피수분 손실을 적절한 수준으로 유지시켜주는 것이 각질세포층의 지질막 성분인 피지성분과 표피지질이라고 알려져 있다.

한편, 각질세포층에는 천연보습 인자(Natural Moisturizing Factor : NMF) 라고 하는 친수성의 수분 보유능을 가진 물질이 존재하여 피부의 보습에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 정상적인 각질세포층은 수분이 10내지 30% 정도가 유지되면 피부는 매끄럽고 부드러우며, 신체 보호기능을 정상적으로 발휘하게 된다. 하지만, 각질세포층의 수분함량이 10% 이하가 되면 피부는 거칠어지고 신체의 보호기능을 잃게 되어 노화현상이 일어난다. 예를 들어, 건성피부의 경우에는 각질세포의 결집력이 약화되어 피부표면으로부터 비늘조각과 같이 각질세포가 허옇게 벗겨져 나오는 스케일링현상이 나타난다. 이와 같이 피부가 건성화되는 것은 각질세포층의 수분함량이 정상피부에 비해 적기 때문이다. 이 외에, 건강한 피부라 할지라도 혹독한 외부환경 즉, 바람, 추운 날씨, 햇빛, 세안, 면도 등에 의해 수분 부족현상이 일어나 피부상태가 나빠지기도 한다.

따라서, 피부 각질세포층의 수분함량을 적절히 유지하는 것은 매우 중요하다. 이를 위하여 화장품에는 피지와 유사한 성분이나 NMF 성분 또는 폴리올과 같은 보습제 등이 첨가되어 사용되었다. 예를 들어, 수용성 폴리올로서 수산기(OH 기)가 3개 이상인 글리세린, 솔리톨 등은 뛰어난 보습력을 나타내나 끈적임이 심하여 사용할 때 불쾌감을 느끼게 하며, 수산기(OH 기)가 2개인 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 등은 피부의 부작용이 발생하기도 한다. 또한, 다른 천연보습인자인 피롤리돈 카르복실산 나트륨(PCA-Na), 젖산나트륨(Sodium lactate), 요소 등은 전해성이 강해 화장료의 유화안정성을 해치는 문제점이 있다. 아미노산, 콜라겐, 엘라스틴 등도 보습능력이 있다고 하나 보습능력에 한계가 있었다.

각질층의 수분을 보유할 수 있는 능력은 피지성분과 아미노산, 젖산, 요소 및 무기염 등으로 이루어진 천연보습인자(NMF)에 의해 조절되어질 수 있는데, 피부 외용제에서 천연보습인자와 같이 안전하면서도 사용성이 우수하고, 보습효과가 높은 물질의 개발이 화장품에서 중요한 연구과제 중 하나이다.

한편, 최근에는 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 화장품이 많이 개발되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다.

한편, 황금은 꿀풀과에 속하는 여러해살이 초본식물인 황금(Scutellaria baicalensis)의 뿌리로 만는 약재를 말한다. 약효성분으로 바이카레인(Baicalein),바이카린(Baicalin), 워고닌(Wogonin), 워고노사이드(Wogonoside) 등을 포함하고 있어 널리 약용으로 쓰이고 있다. 황금은 해열, 담즙분비 촉진, 위액분비 억제 및 동맥경화 방지 효능이 있으며, 항균 및 항진균의 활성이 있다고 알려져 있다.

붉은덕다리버섯(Leatiporus sulphureus var. miniatus)은 담자균류의 구멍장이버섯과에 속하며 봄부터 여름까지 침엽수의 생목, 고목, 그루터기 위에 중생하는 1년생 심재 갈색 부후성 버섯이다. 붉은덕다리버섯은 예로부터 기능 조절, 건강 증진, 항질병에 효과가 있다고 전해내려 왔으나 정확한 약리효과에 대해서는 잘 알려져 있지 않았다. 붉은덕다리버섯 자실체에는 N-메틸레이티드 티라민 유도체, 다당류, 라노스테인 트리터페노이드류, 레티포릭산 및 다른 다양한 혼합물들이 포함되어 있다. 최근에는 붉은덕다리버섯이 항암제와 인슐린 분비 조절 효과가 있다고 보고된 바 있으며, 항암효과로는 붉은덕다리버섯의 세포외 다당체가 암전이억제 및 면역력 증강을 나타내며, 이 외에도 붉은덕다리버섯 균사체의 세포외 다당체는 피부세포 성장인자의 생성을 촉진하고 상처치유 효과 및 피부 보습 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 특히 붉은덕다리버섯은 글루코시다제를 비롯한 기능성 효소를 다량 생성하는 것으로도 알려져 있다.

한편, 아직까지 황금 추출물, 특히 황금 추출물을 붉은덕다리버섯 균사체로 발효시킨 황금 붉은덕다리버섯 발효액에 대한 효능에 대해 알려진 바가 거의 없는 실정이다. 이에, 본 발명의 발명자들은 황금 붉은덕다리버섯 발효액에 대해 예의 연구한 결과, 대한민국 등록특허 제10-1375137호 (등록일자: 2014.03.11)와 같이 황금 붉은덕다리버섯 발효액의 피부 보습 효능을 규명하였고, 황금 붉은덕다리버섯 발효액의 효능에 대해 더욱 예의연구한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

대한민국 공개특허 제10-2002-0061196호 (공개일자: 2002.07.24)에는 황금 추출물을 함유하는 iNOS 효소 발현 억제용 화장료 조성물에 대해 기재되어 있다. 다만, 이에는 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지용, 피부 주름 개선용, 피부 미백용, 피부 장벽 기능 개선용, 피부 염증 개선용 및 아토피 개선용 화장료 조성물에 대해서는 기재된 바 없다.

본 발명은 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지용, 피부 주름 개선용, 피부 보습용, 피부 미백용, 피부 장벽 기능 개선용, 피부 염증 개선용 및 아토피 개선용 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황금(Scutellaria baicalensis) 추출물을 붉은덕다리버섯 균사체(Laetiporus Sulphureus myselium) CS0218 (KFCC 11494P)로 발효시켜 수득된 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

한편, 상기 황금 추출물은, 당 업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있다. 일예로, 탄소수 1~4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매를 사용하여 추출할 수 있다.

상기 용매 중 바람직하게는 알코올이 좋으며, 더욱 바람직하게는 에탄올이 좋다. 이때, 상기 에탄올은 바람직하게 70% 에탄올인 것이 좋다. 상기 추출 용매의 적합한 양은 황금 건조 중량의 1~15 배이며, 더욱 바람직하게는 5~10배이며, 가장 바람직하게는 7배이다.

한편, 본 발명의 황금 붉은덕다리버섯 발효액은 상술한 추출법에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 황금 붉은덕다리버섯 발효액에 포함된다고 해석된다.

또한, 본 발명의 황금 붉은덕다리버섯 발효액은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수도 있다.

한편, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 화장료 조성물에 첨가되는 황금 붉은덕다리버섯 발효액의 함량은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~100.0중량%이며, 바람직하게는 0.001~90.0중량%이며, 가장 바람직하게는 0.1~85.0중량%이다. 상기 황금 붉은덕다리버섯 발효액의 함량이 0.0001 중량% 미만인 경우에는 피부 노화 방지효과, 피부 주름 개선효과, 피부 보습 효과, 피부 미백 효과, 피부 장벽 기능 개선효과, 피부 염증 개선효과 및 아토피 개선효과가 미미하다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은 유효 성분으로서 상기 황금 붉은덕다리버섯 발효액 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있다. 일예로, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물의 제형은 특정한 것에 한정되는 것은 아니고, 일 예로 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 에멀젼, 연고로 이루어진 기초화장료 제형, 수중유형 및 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형 중에서 선택되는 어느 하나인 것이 좋다. 또한, 이는 선택적으로 에어로졸 형태로 피부에 적용될 수도 있고, 고체 형태 예컨대, 스틱의 형태일 수도 있으며, 피부용 케어 제품 및/또는 메이크업 제품으로서 사용될 수도 있다.

한편, 상기 화장료 조성물은, 바람직하게 피부 노화 방지용일 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은, 바람직하게 피부 주름 개선용일 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은, 바람직하게 피부 미백용일 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은, 바람직하게 피부 염증 개선용일 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은, 바람직하게 아토피 개선용일 수 있다.

본 발명은 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 유효성분으로 함유하여 우수한 피부 노화 방지효과, 피부 주름 개선효과, 피부 보습 효과, 피부 미백 효과, 피부 장벽 기능 개선효과, 피부 염증 개선효과 및 아토피 개선효과를 발휘하는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 황금 붉은덕다리버섯 발효액의 자유라디칼 소거활성을 확인한 결과 그래프이다.
도 2는 황금 붉은덕다리버섯 발효액의 항염 효과를 확인한 결과 그래프이다.
도 3은 황금 붉은덕다리버섯 발효액의 피부 주름 개선효과를 확인한 결과 그래프이다.
도 4는 황금 붉은덕다리버섯 발효액의 피부 미백 효과를 확인한 결과 그래프이다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[제조예 1: 황금 추출물의 제조]

황금을 정제수로 세척하고 건조한 다음 모두 분쇄한 후, 100메시의 체를 이용하여 미세한 황금 분쇄물을 제조하였다. 상기 황금 분쇄물을 150 g/L가 되도록 70% 에탄올을 첨가하여 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(whatman) #3 여과지로 여과한 다음, 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결 건조하여 황금 추출물을 제조하였다.

[실시예 1: 황금 붉은덕다리버섯 발효액의 제조]

상기 제조예 1에서 제조된 황금 추출물 5 g에 탄소원으로 포도당 2%를 첨가한 후, 펩톤 0.3%를 추가로 첨가하여 멸균하였다. 여기에 25 g/L가 되도록 붉은덕다리버섯(Laetiporus Sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P) 균주 배양액을 접종하여 배양하였다. 배양은 5 L 발효조를 이용하여 7일간, 37℃, pH 5~7를 유지하며 배양하였다. 배양 후, 배양액을 원심분리하여 배양균을 1차 제거한 후, 더 이상 배양이 되지 않도록 멸균(121℃, 15분, 1.5기압)하였다. 그 후, 최종 70%(V/V) 에탄올 수용액이 되도록 에탄올을 첨가하여 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(whatman) #3 여과지로 여과하였다. 여과 후, 농축조로 이송하여 50℃ 이하에서 감압농축을 한 다음 동결 건조하여 본 발명의 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 제조하였다.

[비교실시예 1~4: 황금 추출물 발효액의 제조]

본 실시예에서는 하기 표 1에 기재된 버섯의 균사체를 이용하여 황금 추출물 발효액을 제조하고자 하였다. 제조방법은 버섯의 균사체 종류를 달리한 것을 제외하고 상기 실시예 1과 동일하였다.

	균사체
비교실시예 1	송이버섯
비교실시예 2	능이버섯
비교실시예 3	상황버섯
비교실시예 4	영지버섯

[실험예 1: 황금 붉은덕다리버섯 발효액의 항산화 효과 확인]

본 실험예에서는 황금 붉은덕다리버섯 발효액의 항산화 효과를 확인하고자 DPPH법을 이용하여 자유라디칼 소거활성(free radical scavenging activity)을 측정하였다.

DPPH 측정법은 억제제(inhibitor)가 안정한 라디칼 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl radical)를 소거하여 탈색되는 정도를 540 nm에서 흡광도를 측정하는 방법이다.

시료는 상기 제조예 1에서 제조한 황금 추출물, 상기 실시예 1에서 제조한 황금 붉은덕다리버섯 발효액 및 상기 비교실시예 1 내지 4에서 제조한 황금 추출물 발효액을 농도별(0.001, 0.002, 0.005, 0.01%)로 사용하였다. 또한, 시료의 양은 하기 표 2와 같이 하였고, 양성 대조군으로 25 μM 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG, Epigallocatechin gallate)를 이용하였다. 실험 후, 자유라디칼 소거활성은 하기 수학식 1을 이용하여 계산하였다.

	Material	Ctrol group	Blank of C	Exp. Group	Blank of E
A	DPPH(MeOH)	180 ㎕	(180) ㎕	180 ㎕	(180) ㎕
B	Sample(용매)	(20) ㎕	(20) ㎕	20 ㎕	20 ㎕

A: 시험구의 흡광도(Abs of experimental group)

B: 시험구의 공시험 흡광도(Abs blank of experimental group)

C: 대조구의 흡광도(Abs of control group)

D: 대조구의 공시험 흡광도(Abs of blank of control group)

실험결과, 황금 추출물 발효액(실시예 1 및 비교실시에 1 내지 4)이 황금 추출물(제조예 1)에 비하여 자유라디칼 소거활성이 우수하였다. 특히, 발효액 중에서 황금 붉은덕다리버섯 발효액(실시예 1)이 가장 높은 자유라디칼 소거활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 황금 붉은덕다리 버섯 발효액은 양성 대조군인 에피갈로카테킨 갈레이트의 자유라디칼 소거활성과 비교하여 동등 이상의 자유라디칼 소거활성을 나타내었다(도 1).

[실험예 2: 황금 붉은덕다리버섯 발효액의 세포 생존율 평가]

본 실험예에서는 황금 붉은덕다리버섯 발효액이 세포에 미치는 독성을 확인하고자 세포 생존율을 평가하고자 하였다.

세포 독성은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하는 모스만(Mosmann)의 방법을 변형하여 실시하였다.

인간섬유아세포(HDF)를 96-웰 플레이트(96-well plate)에 1×10⁴ cells/well의 농도로 분주한 후, 37℃, 5 % CO₂에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고 시료(실시예 1에서 제조한 황금 붉은덕다리버섯 발효액)를 농도별(0.001, 0.002, 0.005, 0.01%)로 처리한 배지에 24시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하고 PBS(Phosphate buffered saline)로 두 번씩 세척하였다. 그 후, MTT를 5 mg/㎖로 PBS에 녹여 50 L 첨가하고 37℃, 5 %의 CO₂에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후, DMSO를 한 웰(well) 당 100 L를 넣고 10분 동안 교반한 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험결과, 각 시료의 모든 농도에서 세포 독성은 나타나지 않았다. 이로부터 본 발명의 황금 붉은덕다리버섯 발효액은 인체에 무해하며 안전성이 매우 우수함을 확인할 수 있었다.

[실험예 3: 황금 붉은덕다리버섯 발효액의 항염 효과 확인]

본 실험예에서는 황금 붉은덕다리버섯 발효액의 항염 효과를 확인하고자 5-리폭시게나아제(5-Lipoxygenase) 저해 활성 실험을 실시하였다.

리폭시게나아제(lipoxygenase)는 아라키돈산(arachidonic acid)으로부터 생체내 염증반응이나 알레르기 반응 등에 관여하는 다양한 화학적인 매개체 역할을 하는 여러 물질들을 생성한다. 리폭시게나아제(lipoxygenase)의 저해 활성은 기질과 효소를 이용하여 과산화물 생성 정도로 측정하는 실험이다.

시료는 상기 제조예 1에서 제조한 황금 추출물, 상기 실시예 1에서 제조한 황금 붉은덕다리버섯 발효액 및 상기 비교실시예 1 내지 4에서 제조한 황금 추출물 발효액을 농도별(0.001, 0.002, 0.005, 0.01%)로 사용하였고, 시료의 양은 하기 표 3과 같았다. 또한, 양성 대조군으로 250 nM 노르디히드로구아이아레트산(NDGA, Nordihydroguaiaretic acid)을 이용하였다.

	Material	Ctrol group	Blank of C	Exp. Group	Blank of E
A	Buffer	2 ㎖	2 ㎖	2 ㎖	2 ㎖
B	Sample(용매)	(20 ㎕)	(20 ㎕)	20 ㎕	20 ㎕
C	Enzyme	40 ㎕	-	40 ㎕	-
D	Substrate	70 ㎕	70 ㎕	70 ㎕	70 ㎕

실험결과, 황금 추출물 발효액(실시예 1 및 비교실시예 1 내지 4)이 황금 추출물(제조예 1)에 비하여 우수한 5-리폭시게나제 저해 활성을 나타내었다. 특히, 황금 추출물 발효액 중에서 황금 붉은덕다리버섯 발효액(실시예 1)이 가장 높은 5-리폭시게나제 저해 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 황금 붉은덕다리 버섯 발효액은 양성 대조군인 노르디히드로구아이아레트산의 5-리폭시게나제 저해 활성과 비교하여 동등 이상의 5-리폭시게나제 저해 활성을 나타내었다(도 2).

[실험예 4: 황금 붉은덕다리버섯 발효액의 주름 개선 효과 확인]

본 실험예에서는 황금 붉은덕다리버섯 발효액의 주름 개선 효과를 확인하고자 자외선 조사 후, 기질 금속단백질분해효소(MMP-1) 저해 활성 실험을 실시하였다.

시료는 상기 제조예 1에서 제조한 황금 추출물, 상기 실시예 1에서 제조한 황금 붉은덕다리버섯 발효액 및 상기 비교실시예 1 내지 4에서 제조한 황금 추출물 발효액을 농도별(0.001, 0.002, 0.005, 0.01%)로 사용하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간섬유아세포(HDF)에 UVA를 5 J/㎝³의 에너지로 조사하였다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA 가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후, 시료500 ㎕가 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양한 후, 배지를 회수하여 96-웰 플레이트에 코팅하였다. 그 후, 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체 100 ㎕와 MMP-2(Ab-3) 단일클론항체 100 ㎕)를 처리하고 37℃에서 60분 동안 반응시켰다. 그 후, 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액(1 mg/㎖-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액) 100 ㎕를 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더로 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였고, 양성 대조군으로 1 mg/㎖ 레티놀을 사용하였다.

실험결과, 황금 추출물 발효액(실시예 1 및 비교실시예 1 내지 4)이 황금 추출물(제조예 1)에 비하여 우수한 MMP-1 발현 저해능을 나타냈다. 특히, 황금 추출물 발효액 중에서 황금 붉은덕다리버섯 발효액(실시예 1)이 가장 높은 MMP-1 발현 저해능을 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 황금 붉은덕다리 버섯 발효액은 양성 대조군인 레티놀의 MMP-1 발현 저해능과 비교하여 동등 이상의 MMP-1 발현 저해능을 나타내었다(도 3).

[실험예 5: 황금 붉은덕다리버섯 발효액의 피부 미백 효과 확인]

본 실험예에서는 황금 붉은덕다리버섯 발효액의 피부 미백 효과를 확인하고자 티로시나아제(Tyrosinase) 저해 활성 실험을 실시하였다.

티로시나아제(Tyrosinase) (EC 1. 14. 18. 1)를 1,100 unit/㎖ (final 55 unit)이 되도록 0.05 M 포스페이트 버퍼(phosphate buffer, pH 6.5)에 용해하고, 기질(Substrate)인 L-티로신(L-Tyrosine, C₉H₁₁NO₃,181.19)을 1.5 mM (final 225 uM)이 되도록 0.1 M 포스페이트 버퍼(phosphate buffer, pH 6.5)에 용해한 후, 각각 0.1 M 소디움 포스페이트 버퍼(sodium phosphate buffer, pH 6.5)에 시료를 혼합하고, 37℃에서 20분간 반응시킨 다음 492 nm에서 ELISA 리더를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 그 후, 하기 수학식 2를 이용하여 티로시나제 저해활성을 계산하였다. 한편, 양성 대조군으로 50 μM 코직산을 이용하였다.

	Material	Ctrol group	Blank of C	Exp. Group	Blank of E
A	Buffer	140 ㎕	150 ㎕	140 ㎕	150 ㎕
B	Sample(용매)	용매 20 ㎕	용매 20 ㎕	20 ㎕	20 ㎕
C	Enzyme	10 ㎕	-	10 ㎕	-
D	Substrate	30 ㎕	30 ㎕	30 ㎕	30 ㎕

A: 시험구의 흡광도(Abs of experimental group)

B: 시험구의 공시험 흡광도(Abs blank of experimental group)

C: 대조구의 흡광도(Abs of control group)

D: 대조구의 공시험 흡광도(Abs of blank of control group)

실험결과, 황금 추출물 발효액(실시예 1 및 비교실시예 1 내지 4)이 황금 추출물(제조예 1)에 비하여 우수한 티로시나아제 저해 활성을 나타냈다. 특히, 황금 추출물 발효액 중에서 황금 붉은덕다리버섯 발효액(실시예 1)이 가장 높은 티로시나아제 저해 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 황금 붉은덕다리 버섯 발효액은 양성 대조군인 코직산의 티로시나아제 저해 활성과 비교하여 동등 이상의 티로시나아제 저해 활성을 나타내었다(도 4).

[제조예 2: 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 함유하는 화장료 조성물의 제조]

본 제조예에서는 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 함유하는 화장료 조성물을 제조하고자 하였다.

상기 실시예 1에서 제조된 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 함유하는 화장료 조성은 처방예 1이라고 지칭하고, 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 함유하지 않은 화장료 조성물은 비교처방예 1이라고 지칭하였다. 또한, 화장료 조성물은 조성은 하기 표 5와 같았다.

성분	처방예 1 함량(중량%)	비교처방예 1 함량(중량%)
실시예 1	30.0	-
1,3-BG	10.0	10.0
글리세린	5.1	5.1
프로필렌글리콜	4.2	4.2
토코페릴아세테이트	3.0	3.0
유동파라핀	4.6	4.6
트리에탄올아민	1.0	1.0
스쿠알란	3.1	3.1
마카다미아너트오일	2.5	2.5
폴리아위베이트60	1.6	1.6
아위비탄세스퀴롤레이트	1.6	1.6
프로필파라벤	0.6	0.6
카르복실비닐폴리머	1.5	1.5
향	미량	미량
방부제	미량	미량
정제수	잔량	잔량
계	100	100

[실험예 6: 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 함유하는 화장료 조성물의 피부 보습 효과 확인]

본 실험예에서는 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 함유하는 화장료 조성물의 피부 보습 효과를 확인하고자 하였다.

피부 질환이 없는 20~40대 25명을 대상으로 1조당 20명씩 2개조로 나누고, 각 조별로 상기 제조예 2에서 제조한 처방예 1 및 비교처방예 1의 화장료 조성물을 매일 2회씩 1개월간 얼굴 및 전박부에 도포하게 하였다. 미리 도포 시작 전 항온, 항습 조건(24℃, 습도 40%)에서 수분측정기(corneometer, CM820 courage Khazaka electronic GmbH, Germany)를 이용하여 피부 전도도를 측정하여 기본 값을 삼고, 1주, 2주, 4주 경과 후의 피부 전도도 증가율(%)을 측정하여 그 증가율을 평가하였다. 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

시료	1 주 후	2 주 후	4 주 후
처방예 1	55 %	59 %	64 %
비교처방예 1	26 %	30 %	36 %

실험결과, 본 발명의 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 함유하는 화장료 조성물인 처방예 1의 경우, 비교처방예 1에 비하여 피부 전도도 증가율이 매우 우수함을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명의 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 함유하는 화장료 조성물의 우수한 피부 보습 효과를 확인할 수 있었다.

[실험예 9: 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 함유하는 화장료 조성물의 아토피 개선효과 확인]

본 실험예에서는 상기 제조예 2에서 제조한 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 함유하는 화장료 조성물의 아토피 개선효과를 확인하고자 하였다.

아토피가 있는 실험자 3세~40세 20명을 대상으로 이중 10명에게는 아토피 피부 부위에 상기 제조예 2에서 제조된 처방예 1의 화장료 조성물을, 나머지 10명에게는 비교처방예 1의 화장료 조성물을 각각 1일 2회씩 연속 4주간 도포하였다. 화장료 조성물 도포 전(0주), 화장료 조성물 도포 4주 후에 피험자의 시험 부위의 아토피 피부염 중증도, IgE 변화, 산호성 백혈구(Eosinophil) 변화, 수분함유량, 피부산성도를 각각 측정하였다.

아토피 피부염 중증도는 4주동안 육안으로 관찰한 후, 0점:증상 없음(none)

10점:증상이 약함(weak) 20점:증상이 미약함(경증, mild) 30점: 증상이 심함(중증도, severe) 40점:증상이 매우 심함(중증, extremely severe)으로 점수를 부여하였다.

또한, 면역글로불린(IgE) 변화는 ELISA kit(Yamasa,Tokyo, Japan)를 이용하여 총 IgE의 양을 측정하였다.

또한, 산호성 백혈구 변화는 혈구 자동 측정기를 이용하여 카운팅하여 측정하였다.

또한, 수분함유량은 수분측정기(Corneometer 825)를 이용하여 측정하였다.

또한, 피부산성도는 피부 pH 측정기(Skin pH meter)를 이용하여 측정하였다.

한편, 4주간 시험에 참여한 모든 피험자들에게서 이상반응은 없었으며, 그 결과는 하기 표 7과 같았다(n=20, p＜0.05).

구분	아토피 피부염 중증도 (index)		IgE 변화 (mg/㎖)		산호성 백혈구 변화 (ea)		수분함유량 (g/cm²h)		피부산성도 (pH)
구분	전	후	전	후	전	후	전	후	전	후
처방예 1	37.41	28.12	435.9	321.4	317	249	25.84	26.57	5.719	6.071
비교처방예 1	37.68	31.53	443.7	363.8	321	275	26.31	25.11	5.717	5.833

실험결과, 아토피 피부 진단 기준이 되는 아토피 피부염 중증도, 혈액에서의 IgE 및 산호성 백혈구의 변화, 수분함유량, 피부산성도 등이 본 발명의 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 함유하는 화장료 조성물(처방예 1)이 우수한 값을 나타내어, 본 발명의 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 함유하는 화장료 조성물은 아토피 개선 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

Claims

황금(Scutellaria baicalensis) 추출물을 붉은덕다리버섯 균사체(Laetiporus Sulphureus mycelium) CS0218 (KFCC 11494P)로 발효시켜 수득된 황금 붉은덕다리버섯 발효액을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선용 화장료 조성물.