CN101003827A - 鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于将鱿鱼皮用清水洗净，加入NaOH的水溶液浸泡，再用清水反复洗涤至pH中性；加入稀酸水溶液浸泡，再洗涤至pH中性；搅拌下，在热水中抽提胶原蛋白，过滤除去不溶物；在搅拌下，加酶酶解1－6h，酶解温度为40－50℃，在90－100℃下灭酶4－10min；用碱液调pH至中性，酶解液经过滤后，再依次经过截留分子量为8KD的超滤膜超滤、纳滤脱盐，最后真空浓缩，喷雾干燥。本发明所用的鱿鱼皮丰富易得，胶原蛋白含量高，工艺步骤简单，设备投资少，无环境污染，产品具有很强的生物活性，可用于制备抗氧化、降血压、抗动脉粥样硬化或美容的保健食品或药品。

Description

鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的制备方法和应用。
背景技术
胶原蛋白在医药、保健、食品及美容等领域已获得了广泛的应用。目前所利用的胶原蛋白主要是从陆生动物的结缔组织中提取。近年来疯牛病、疯羊病、口蹄疫、禽流感等疾病不断出现，陆生动物来源的胶原蛋白在应用方面受到了极大限制。水产动物胶原蛋白的开发和应用已引起了广泛重视，从鱼皮中制备胶原蛋白及其制品已申请了多项发明专利(CN1749296A；CN1629192A；CN1749275A；CN1629191A)。另外，中国发明专利CN 1740199A还公开了海星壳制备胶原蛋白肽的方法。生物活性肽的保健功能和药理作用是目前研究的热点。通过蛋白酶定向水解得到的胶原蛋白活性肽，具有特殊的生理功效，主要体现在免疫调节、抗氧化、降血压、降血脂、抑制肿瘤、活化细胞及促进皮肤代谢和胶原蛋白合成等方面。
鱿鱼为软体动物门、头足纲、枪乌贼科海产动物。据报道，全世界头足类的资源量为1000万至1亿吨，资源潜力非常大。随着我国远洋鱿钓业的迅速发展，鱿鱼成为我国主要的水产加工原料。鱿鱼年加工量约为30-40万吨，在加工过程中产生包括头、足、内脏及表皮等废弃物，其中鱿鱼皮占加工量的8-13％。对这些废弃物的处理，大多数工厂采用了掩埋丢弃的方法，造成了资源的极大浪费和严重的环境污染。鱿鱼皮中胶原蛋白含量约为其干重的70-80％，鱿鱼皮胶原蛋白的开发和利用没有引起重视。秦玉青报道了鱿鱼皮胶原蛋白的提取、测定方法和影响因素(中医研究，2002，1：20-21；上海水产大学学报，2002，2：138-144)，但尚未见鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的制备方法；制得的鱿鱼皮胶原蛋白活性肽在生产抗氧化、降血压、抗动脉粥样硬化或美容的保健食品、或功能食品或药品中能得到应用。
一种鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于将鱿鱼皮用清水洗净，加入NaOH的水溶液浸泡0.5-6h，再用清水反复洗涤至pH中性；加入稀酸水溶液浸泡0.5-3h，再用清水反复洗涤至pH中性；搅拌下，在80-95℃热水中抽提胶原蛋白1-24h，过滤除去不溶物；在搅拌下，加酶酶解1-6h，酶解温度为40-50℃，在90-100℃下灭酶4-10min；用碱液调pH至中性，酶解液经过滤后，再依次经过截留分子量为8KD的超滤膜超滤、纳滤脱盐，最后真空浓缩，喷雾干燥。
上述的鱿鱼皮胶原蛋白活性肽在制备抗氧化、降血压、抗动脉粥样硬化或美容的保健食品或药物中的应用。
本发明采用的原料丰富易得，胶原蛋白含量高，并具有步骤简单、设备投资少、无环境污染等优点，适于工业化生产。
具体实施方式
将新鲜或室温解冻的鱿鱼皮1Kg，用清水洗5次，沥干。加入5Kg浓度为0.2％(重量百分数，下同)的NaOH水溶液浸泡3h，4000rpm离心15min，除去上清液。将沉淀物用清水反复洗涤至pH中性。加入5Kg浓度为0.2％的HCl水溶液浸泡1h，4000rpm离心15min，除去上清液。将沉淀物用清水反复洗涤至pH中性。将蒸馏水预热到90℃，在恒温搅拌下，加入10Kg的蒸馏水抽提胶原蛋白16h，过滤除去不溶物。将过滤液温度冷却至45℃，用NaOH水溶液调pH至9，在恒温搅拌下，先加入40g碱性蛋白酶Properase E酶解3h，然后在100℃下灭酶5min，酶解液冷却到45℃。用酸液调酶解液pH至2，再加入40g胃蛋白酶，酶解3h，在100℃下灭酶5min。酶解液用NaOH水溶液调pH至中性，过滤酶解液，再将酶解液依次经过截留分子量为8KD的超滤膜超滤、纳滤脱盐，最后真空浓缩、喷雾干燥，即得鱿鱼皮胶原蛋白活性肽。
本发明制备方法中所述0.2％的NaOH水溶液浸泡3h，可改用0.2-0.5％的NaOH水溶液浸泡0.5-6h；所述0.2％的HCl浸泡1h，可改用0.1-0.5％的HCl或H2SO4水溶液浸泡0.5-3h；90℃温度下抽提胶原蛋白16h，可改用80-100℃温度下抽提胶原蛋白1-24h；所述的两种酶用量均为鱿鱼皮重量的1-5％，酶解时间均为1-3h，酶解温度均为40-50℃；所述的用碱液调节pH为8.0-10，用酸液调节pH为1.0-4.0；所述的离心速度为3000-5000rpm。
本发明以鱿鱼皮为原料，以酶解物对超氧阴离子自由基和羟自由基的抑制率为评价指标，从六种蛋白酶中筛选得到具有最高清除自由基活性的两种酶，又采用正交试验确定了该两种酶的最佳酶解条件，然后进行复合酶解试验，最后确定了复合酶制备鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的方法。
本发明制得的鱿鱼皮胶原蛋白活性肽可作为抗氧化、降血压、抗动脉粥样硬化或美容的保健食品及相关药物的活性成份，根据保健及治疗需要，与食用及药用辅料制成各种食品或制剂。
下面对本发明制得的鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的抗氧化、降血压、抗动脉粥样硬化、美容作用作进一步说明：
一.鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的药效学研究：
1.通过体外、体内实验证明，制得的鱿鱼皮胶原蛋白活性肽具有显著的抗氧化活性。
1)体外实验采用连苯三酚和Cu2+-H2O2系统测定了鱿鱼皮胶原蛋白活性肽对超氧阴离子自由基和羟自由基清除活性。结果表明，上述鱿鱼皮胶原蛋白活性肽能够显著清除超氧阴离子自由基与羟自由基，其IC50分别为2.14mg/mL和0.17mg/mL。
2)体内实验采用D-半乳糖诱导的亚急性衰老模型小鼠。将昆明小鼠随机分为4组，第1-2组分别为正常和模型对照组，均灌胃生理盐水(0.1ml/10g.bw)；第3组为阳性对照组，灌胃肌肽40mg/kg；第4组为给药组，灌胃鱿鱼皮胶原蛋白活性肽100mg/kg。同时，第2-4组小鼠颈背部皮下注射D-半乳糖1000mg/kg，正常对照组小鼠注射相同体积的生理盐水。灌胃和皮下注射均为1次/d，连续42d。末次灌胃24h后，摘眼球收集血液，分离血清。分别测定血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量。结果见表1，鱿鱼皮胶原蛋白活性肽能显著抑制D-半乳糖诱导的机体过氧化反应，显著降低小鼠血清MDA含量，提高抗氧化酶SOD和GSH-PX活性。表明鱿鱼皮胶原蛋白活性肽具有抗氧化作用。
表1鱿鱼皮胶原蛋白活性肽对亚急性衰老模型小鼠血清MDA含量和抗氧化酶
活性的影响(n＝10，
组别 剂量(mg/kg) SOD活性(U/mL) GSH-Px活性(U/mL) MDA含量(nmol/mL)
正常对照模型对照阳性对照给药组 --1000100 295.90±61.31136.40±29.86△223.98±45.07*237.47±31.67* 1096.99±72.46698.49±68.45△917.19±33.49*1026.46±143.71* 3.39±0.705.90±0.40△3.49±0.44*3.76±0.34*
2.通过体外、体内实验证明，制得的鱿鱼皮胶原蛋白活性肽具有显著的降血压活性。
1)体外实验采用乙酸乙酯抽提和紫外分光光度法测定鱿鱼皮胶原蛋白活性肽对血管紧张素转换酶(ACE)活性的影响。结果表明，上述鱿鱼皮胶原蛋白活性肽能够显著抑制ACE活性，其IC50为0.79mg/mL。
2)体内实验采用两肾一夹型建立肾血管性高血压大鼠模型。将雄性Wistar大鼠随机分为5组，第1-2组分别为正常和模型对照组，均灌胃生理盐水(1ml/100g.bw)；第3组为阳性对照组，灌胃卡托普利14mg/kg；第4-5组为给药组，分别灌胃鱿鱼皮胶原蛋白活性肽50和100mg/kg。第2-5组大鼠用戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后，于左侧腹手术，分离出左肾动脉。用消毒的手术线将直径为0.2mm的银丝紧贴左肾动脉扎紧，然后小心抽出银丝，使之左肾动脉狭窄。第1组大鼠除了不进行肾动脉狭窄手术处理外，其他手术环节相同。大鼠造模后第3d开始灌胃给药，1次/d，连续30d。于末次灌胃24h，大鼠以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，颈总动脉插管，经压力换能器与LMS-2A型四道生理记录仪连接，测定动脉血压；颈总动脉取血，分别置入预冷的含有抑肽酶、依地酸二钠的抗凝管内。于4℃下，3000rpm离心10min，分离血浆，采用均相竞争法测定血管紧张素II(Ang II)的含量。结果见表2，鱿鱼皮胶原蛋白活性肽能显著降低高血压模型大鼠的收缩压和舒张压，降低血液中Ang II水平。表明鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的降血压作用与抑制ACE活性、阻止Ang II生成有关。
表2鱿鱼皮胶原蛋白活性肽对高血压模型大鼠血压和Ang II的影响(n＝8，
Figure A20071001314000061
组别 剂量(mg/kg) 收缩压(mmHg) 舒张压(mmHg) Ang II(pg/ml)
正常对照模型对照阳性对照给药组 --1450100 103.65±8.75149.73±16.55△115.44±21.13**132.49±10.88*106.01±1.63** 90.84±6.85131.99±11.30△96.47±0.91**119.40±12.27*103.86±8.17** 242.32±16.27668.46±14.52△346.45±10.24**487.96±6.67*372.35±4.28**
3.通过体外实验证明，制得的鱿鱼皮胶原蛋白活性肽具有抗动脉粥样硬化作用。
采用ox-LDL建立体外培养的人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)损伤模型。取对数生长期的ECV304细胞，经0.25％胰酶消化，用DMEM完全培养基制成密度为1×106/ml的细胞悬液，加入不同孔径的培养板。贴壁12h后，换为无血清DMEM培养基继续培养12h，使细胞生长同步于G0期。吸弃培养液，分别加入不含或含有不同浓度鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的无血清DMEM培养基，于37℃、5％CO2培养箱中24h。分别加入不含或含有ox-LDL(终浓度为25μg/mL)无血清DMEM培养基作用12h。用MTT法检测血管内皮细胞增殖活性，用硝酸还原酶法分别测定血管内皮细胞一氧化氮合酶(NOS)活性和NO释放量，用TBA法测定细胞内MDA含量，用DNA-Ladder法检测血管内皮细胞的凋亡。结果见表3，不同浓度的鱿鱼皮胶原蛋白活性肽均能显著抑制ox-LDL对ECV304细胞的损伤，促进血管内皮细胞增殖，降低ECV304细胞内MDA含量，增加细胞膜的稳定性，提高ECV304细胞的NO释放量和细胞内NOS活力，拮抗血管内皮细胞凋亡，且剂量-效应关系明显。表明上述鱿鱼皮胶原蛋白活性肽对血管内皮细胞具有显著的保护作用。Ox-LDL作为启动分子，在动脉粥样硬化发生的最早期起了关键作用：刺激血管内皮细胞凋亡和抑制血管内皮细胞迁移，导致细胞内Ca2+超载而直接损伤内皮细胞，直接灭活NO，并通过抑制内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的基因表达和降低eNOS的活性，减少内皮型NO的生成，导致血管内皮细胞功能紊乱。而血管内皮细胞损伤和功能障碍是动脉粥样硬化发生、发展的启动步骤。因此，鱿鱼皮胶原蛋白活性肽具有抗动脉粥样硬化作用。
表3鱿鱼皮胶原蛋白活性肽对ECV304细胞增殖、凋亡、NOS活性和NO释放量的影响
分组 剂量μg/mL 增殖活性A值 MDA含量μmol/L NO释放量(μmol/L) NOS活性(U/mgprot) 凋亡比例
正常对照ox-LDL活性肽+ox-LDL -2550+25100+25200+25 0.58±0.010.29±0.01△0.40±0.01**0.46±0.01**0.49±0.01** 2.2±0.86.7±0.3△4.4±0.9**3.1±0.4**2.7±0.3** 95.4±3.821.3±2.1△38.1±4.1**66.6±4.7**73.5±1.9** 2.83±0.120.89±0.10△1.59±0.11**1.89±0.10**2.54±0.69** 3.2±0.619.8±1.7△15.5±2.012.2±0.9*7.8±0.4**
4.通过体外、体内实验证明，制得的鱿鱼皮胶原蛋白活性肽具有美容保健作用。
1)体外实验采用小鼠B16黑素瘤细胞为黑素细胞模型。取对数生长期的B16细胞，经0.25％胰酶消化，以RPMI-1640完全培养基配成密度为4×104/mL或5×105/ml细胞悬液，接种于96孔或6孔培养板，置于37℃、5％CO2的培养箱内培养。贴壁24h后，弃培养液，分别加入含不同浓度鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的完全培养液，对照组加等体积的完全分别加入含不同浓度鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的完全培养液，对照组加等体积的完全培养基，继续培养48h。采用MTT法测定细胞增殖活性，NaOH裂解法测定黑素含量，多巴氧化法测定酪氨酸酶活性，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定酪氨酸酶mRNA表达。结果见表4，不同浓度鱿鱼皮胶原蛋白活性肽对B16细胞增殖活性无显著影响，但能显著降低B16细胞黑素含量，抑制酪氨酸酶活性，并下调酪氨酸酶mRNA表达量，剂量效应关系明显。表明鱿鱼皮胶原蛋白活性肽无细胞毒性，且具有显著抑制黑素细胞黑素合成的作用。
表4鱿鱼皮胶原蛋白活性肽对小鼠B16黑素瘤细胞增殖、黑素含量、酪氨酸酶活性和酪氨酸酶mRNA表达量的影响
浓度(μg/ml) 增殖活性(A值) 黑素相对含量(％) 酪氨酸酶相对活性(％) 酪氨酸酶mRNA表达(％)
06.2512.52550100 0.97±0.030.99±0.011.00±0.031.03±0.030.96±0.021.03±0.01 100.1±1.693.1±3.285.9±2.9**77.2±4.3**52.2±2.6**45.9±3.3** 100.1±2.798.4±2.794.6±4.579.1±5.4**55.7±5.1**42.3±1.2** 100.1±0.4--83.8±2.9*77.8±2.1**64.6±1.4**
2)体内实验采用光老化小鼠模型。将昆明小鼠颈背部脱毛处理后，随机分为5组，第1-2组分别为正常和模型对照组，均灌胃生理盐水(0.ml/10g.bw)；第3-5组为给药组，分别灌胃鱿鱼皮胶原蛋白活性肽25、50和100mg/kg。1次/d，连续8周。同时，第2-5组小鼠照射紫外(UVA+UVB)，每周隔日共照射3次，UVA总剂量为48000J/cm2，UVB总剂量为1200J/cm2。于末次灌胃24h，脱颈椎处死小鼠，取背部皮肤，制备皮肤匀浆。于4℃下，16000rmp离心20min，上清液于-80℃冻存备用。分别测定皮肤SOD、GSH-Px、过氧化氢酶(CAT)活性及MDA和羟脯氨酸含量。结果见表5，鱿鱼皮胶原蛋白活性肽能显著降低光老化小鼠皮肤MDA含量，提高抗氧化酶SOD、GSH-PX、CAT活性，提高羟脯氨酸含量。表明鱿鱼皮胶原蛋白活性肽具有显著的延缓皮肤衰老、促进真皮内胶原蛋白合成的作用。
表5鱿鱼皮胶原蛋白活性肽对光老化模型小鼠皮肤MDA、羟脯氨酸含量和抗氧化酶活性的影响(n＝10，
Figure A20071001314000091
组别 剂量mg/kg mDAnmol/mg.prot. SODU/mg.prot. GSH-PXU/mg.prot CATU/mg.prot. 羟脯氨酸ug/mg.prot
正常对照模型对照给药组 --2550100 5.1±1.112.5±0.7△9.4±1.68.6±1.9*7.2±0.9** 214.5±49.9162.0±22.5△170.6±9.6185.0±3.9*196.0±7.87* 39.5±1.720.35±0.7△26.95±1.132.45±0.9*36.3±4.4** 11.4±0.77.9±0.7△10.1±0.8**11.2±0.7**13.1±0.4** 0.60±0.070.37±0.07△0.46±0.050.49±0.08*0.53±0.08**
二.鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的安全性实验
ICR小鼠一次性灌服不同剂量的鱿鱼皮胶原蛋白活性肽(0.464、1.00、2.15、4.64g/kg)，14d后，各剂量组动物均无死亡，且无任何行为异常，体重无明显增长，血常规、肝、肾功各项检查，无明显差别，动物脏器的病理组织学检查无异常，表明鱿鱼皮胶原蛋白活性肽无毒副作用和无累积毒性。

Claims (6)

1.一种鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于将鱿鱼皮用清水洗净，加入NaOH的水溶液浸泡0.5-6h，再用清水反复洗涤至pH中性；
加入稀酸水溶液浸泡0.5-3h，再用清水反复洗涤至pH中性；在80-95℃热水中抽提胶原蛋白1-24h，过滤除去不溶物；在搅拌下，加酶酶解1-6h，酶解温度为40-50℃，在90-100℃下灭酶4-10min；用碱液调pH至中性，酶解液经过滤后，再依次经过截留分子量为8KD的超滤膜超滤、纳滤脱盐，最后真空浓缩，喷雾干燥。
2.按权利要求1所述鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于所述的NaOH水溶液中NaOH浓度为0.2-0.5％。
3.按权利要求1所述鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于所述的稀酸为0.1-0.5％的HCl或H2SO4水溶液。
4.按权利要求1所述鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于所述的加酶酶解是先用碱液调节pH至8.0-10.0，再加碱性蛋白酶Properase E酶解1-3h，然后在90-100℃下灭酶4-10min，冷却到40-50℃；用酸液调pH至1.0-4.0，再加入胃蛋白酶酶解1-3h；所述的两种酶用量均为鱿鱼皮重量的1-5.0％。
5.权利要求1所述的鱿鱼皮胶原蛋白活性肽在制备抗氧化、降血压、抗动脉粥样硬化或美容的保健食品中的应用。
6.权利要求1所述的鱿鱼皮胶原蛋白活性肽在制备抗氧化、降血压、抗动脉粥样硬化的药物中的应用。
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