CN105349604A - 一种抗动脉硬化鱿鱼蛋白质短肽的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗动脉硬化鱿鱼蛋白质短肽的分离方法。其主要解决现有鱿鱼内脏利用率低、附加值小的问题。其是将新鲜鱿鱼内脏捣碎，加去离子水，匀浆，得鱿鱼内脏浆液；鱿鱼内脏浆液采用酶解法制得鱿鱼内脏酶解液，鱿鱼内脏酶解液采用HP-20树脂柱进行层析，依次以水、20%、60%、80%的甲醇溶液对酶解液进行梯度洗脱，收集甲醇洗脱液，旋转蒸发浓缩，最终得到抗动脉硬化鱿鱼蛋白质短肽。本发明工艺合理、操作可行，适合规模化工厂生产，得到的鱿鱼内脏短肽可作为药剂学方面的辅料，其附加值高。
Description
技术领域
本发明涉及肽的制备，尤其是一种从鱿鱼内脏中得到抗动脉硬化鱿鱼蛋白质短肽的分离方法。
背景技术
随着我国远洋捕捞业的迅速发展，鱿鱼已经成为我国主要的水产加工原料。一直以来鱿鱼的加工利用基本停留在其胴体上，内脏、足、耳等一些加工副产物利用率较低，而这些废弃物中含有丰富的蛋白质。鱿鱼内脏约占鱿鱼湿重的15%，而鱿鱼内脏含有约19%的蛋白质。目前，鱿鱼内脏采用酶解发酵法，可作为制造酱油或天然调味品的原料。国外如西班牙和日本已有鱿鱼酱油的生产与销售，而国内也有天然调味品研究报道。但是如何高效对鱿鱼内脏进行水解以得到活性短肽的研究较少。
心脑血管疾病是全球人类死亡的首因，动脉硬化是其中最常见而重要的类型，至今还没有良药。近年研究发现短肽类活性物质能够抑制诸多器官如心、肺、肾、肝的纤维化。
发明内容
为了克服现有技术中鱿鱼内脏利用率低、附加值小的不足，本发明提供一种工艺合理、操作可行、具有抗动脉硬化活性、附加值高的抗动脉硬化鱿鱼蛋白质短肽的分离方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种抗动脉硬化鱿鱼蛋白质短肽的分离方法，其特征在于：经过下列工艺步骤：
(1)原料预处理：选取新鲜的鱿鱼内脏为原料，放入组织捣碎机中捣碎，按照1︰1～3的比例加入去离子水，混匀，得鱿鱼内脏浆液；
(2)酶解：将步骤(1)中得到的鱿鱼内脏浆液放入容器中，加入酶活力0.5～1万U的蛋白酶，置于预热的恒温水浴锅中，恒温温度为55±5℃，计时酶解；酶解完毕后，将酶解液置于沸水浴中加热灭酶10-15min，冷却至室温后，控温离心，得到鱿鱼内脏酶解液；
(3)酶解液分离：将步骤(2)中得到的鱿鱼内脏酶解液用去离子水溶解，采用HP-20树脂柱进行层析，依次以水、20%、60%、80%的甲醇溶液对酶解液进行梯度洗脱，收集甲醇洗脱液，旋转蒸发浓缩，得鱿鱼内脏短肽。
进一步，本发明的一种抗动脉硬化鱿鱼蛋白质短肽的分离方法，其还经过下列工艺步骤：
(4)抗动脉硬化活性评价：将步骤(3)得到的鱿鱼内脏短肽进行HMG-CoA还原酶抑制活性评价。
所述的蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、动物蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一种。
所述的控温离心是控制温度4℃，离心机转速控制6000～8000r/min，离心10～20min。
所述的HMG-CoA还原酶抑制活性评价，其方法为：圆底96孔平板孔内注入2.5mmol/LHMG-CoA、2-8U/mgHMG-CoA还原酶、10mmol/LNADPH和鱿鱼内脏短肽，构成50μL的反应体系；在37℃于337nm处每隔4min连续测定80min，通过NADPH吸光度的变化以评定鱿鱼内脏短肽对HMG-CoA还原酶的抑制作用；
其HMG-CoA还原酶抑制率的计算公式为：；
其中，在计算公式中，R为抑制率(%)；
Ki和KC分别为样品和对照组的吸光度直线斜率。
本发明采用酶解法制备鱿鱼内脏酶解液，鱿鱼内脏酶解液采用HP-20树脂柱进行层析，依次以水、20%、60%、80%的甲醇溶液对酶解液进行梯度洗脱，收集甲醇洗脱液，旋转蒸发浓缩，最终得到具有抗动脉硬化作用的活性短肽。本发明提取得到的鱿鱼内脏短肽可作为药剂学方面的辅料，可制成供临床应用片剂、软胶囊剂、颗粒剂、冲剂、口服液、注射剂，其附加值高。本发明工艺合理、操作可行，适合规模化工厂生产，且提取得到的鱿鱼内脏短肽进行HMG-CoA还原酶抑制活性评价，证明具有抗动脉硬化的活性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
一种抗动脉硬化鱿鱼蛋白质短肽的分离方法，经过下列工艺步骤：
(1)原料预处理：选取新鲜的鱿鱼内脏为原料，放入组织捣碎机中捣碎，按照1︰2的比例加入去离子水，混匀，得鱿鱼内脏浆液；
(2)酶解：将步骤(1)中得到的鱿鱼内脏浆液放入容器中，加入酶活力8000U的碱性蛋白酶，置于预热的恒温水浴锅中，恒温温度为55℃，计时酶解，每隔10min用玻璃棒搅拌一次；酶解完毕后，将酶解液置于沸水浴中加热灭酶15min，冷却至室温后，控制温度4℃，离心机转速控制8000r/min，离心10min，得到鱿鱼内脏酶解液；
(3)酶解液分离：将步骤(2)中得到的鱿鱼内脏酶解液用去离子水溶解，采用HP-20树脂柱进行层析，依次以水、20%、60%、80%的甲醇溶液对酶解液进行梯度洗脱，收集甲醇洗脱液，旋转蒸发浓缩，得鱿鱼内脏短肽；
(4)抗动脉硬化活性评价：将步骤(3)得到的鱿鱼内脏短肽进行HMG-CoA还原酶抑制活性评价；其中，所述的HMG-CoA还原酶抑制活性评价，其方法为：圆底96孔平板孔内注入2.5mmol/LHMG-CoA、5U/mgHMG-CoA还原酶、10mmol/LNADPH和鱿鱼内脏短肽，构成50μL的反应体系；在37℃于337nm处每隔4min连续测定80min，通过NADPH吸光度的变化以评定鱿鱼内脏短肽对HMG-CoA还原酶的抑制作用；
其HMG-CoA还原酶抑制率的计算公式为：其中，；
在计算公式中，R为抑制率(%)；
Ki和KC分别为样品和对照组的吸光度直线斜率。
实施例2
一种抗动脉硬化鱿鱼蛋白质短肽的分离方法，经过下列工艺步骤：
(1)原料预处理：选取新鲜的鱿鱼内脏为原料，放入组织捣碎机中捣碎，按照1︰3的比例加入去离子水，混匀，得鱿鱼内脏浆液；
(2)酶解：将步骤(1)中得到的鱿鱼内脏浆液放入容器中，加入酶活力10000U的中性蛋白酶，置于预热的恒温水浴锅中，恒温温度为50℃，计时酶解，每隔10min用玻璃棒搅拌一次；酶解完毕后，将酶解液置于沸水浴中加热灭酶10min，冷却至室温后，控制温度4℃，离心机转速控制6000r/min，离心20min，得到鱿鱼内脏酶解液；
(3)酶解液分离：将步骤(2)中得到的鱿鱼内脏酶解液用去离子水溶解，采用HP-20树脂柱进行层析，依次以水、20%、60%、80%的甲醇溶液对酶解液进行梯度洗脱，收集甲醇洗脱液，旋转蒸发浓缩，得鱿鱼内脏短肽；
(4)抗动脉硬化活性评价：将步骤(3)得到的鱿鱼内脏短肽进行HMG-CoA还原酶抑制活性评价；其中，所述的HMG-CoA还原酶抑制活性评价，其方法为：圆底96孔平板孔内注入2.5mmol/LHMG-CoA、8U/mgHMG-CoA还原酶、10mmol/LNADPH和鱿鱼内脏短肽，构成50μL的反应体系；在37℃于337nm处每隔4min连续测定80min，通过NADPH吸光度的变化以评定鱿鱼内脏短肽对HMG-CoA还原酶的抑制作用；
其HMG-CoA还原酶抑制率的计算公式为：；
其中，在计算公式中，R为抑制率(%)；
Ki和KC分别为样品和对照组的吸光度直线斜率。
实施例3
一种抗动脉硬化鱿鱼蛋白质短肽的分离方法，经过下列工艺步骤：
(1)原料预处理：选取新鲜的鱿鱼内脏为原料，放入组织捣碎机中捣碎，按照1︰1的比例加入去离子水，混匀，得鱿鱼内脏浆液；
(2)酶解：将步骤(1)中得到的鱿鱼内脏浆液放入容器中，加入酶活力5000U的胰蛋白酶，置于预热的恒温水浴锅中，恒温温度为60℃，计时酶解，每隔10min用玻璃棒搅拌一次；酶解完毕后，将酶解液置于沸水浴中加热灭酶12min，冷却至室温后，控制温度4℃，离心机转速控制7000r/min，离心15min，得到鱿鱼内脏酶解液；
(3)酶解液分离：将步骤(2)中得到的鱿鱼内脏酶解液用去离子水溶解，采用HP-20树脂柱进行层析，依次以水、20%、60%、80%的甲醇溶液对酶解液进行梯度洗脱，收集甲醇洗脱液，旋转蒸发浓缩，得鱿鱼内脏短肽；
(4)抗动脉硬化活性评价：将步骤(3)得到的鱿鱼内脏短肽进行HMG-CoA还原酶抑制活性评价；其中，所述的HMG-CoA还原酶抑制活性评价，其方法为：圆底96孔平板孔内注入2.5mmol/LHMG-CoA、2U/mgHMG-CoA还原酶、10mmol/LNADPH和鱿鱼内脏短肽，构成50μL的反应体系；在37℃于337nm处每隔4min连续测定80min，通过NADPH吸光度的变化以评定鱿鱼内脏短肽对HMG-CoA还原酶的抑制作用；
其HMG-CoA还原酶抑制率的计算公式为：；
其中，在计算公式中，R为抑制率(%)；
Ki和KC分别为样品和对照组的吸光度直线斜率。
实施例4
一种抗动脉硬化鱿鱼蛋白质短肽的分离方法，经过下列工艺步骤：
(1)原料预处理：选取新鲜的鱿鱼内脏为原料，放入组织捣碎机中捣碎，按照1︰2.5的比例加入去离子水，混匀，得鱿鱼内脏浆液；
(2)酶解：将步骤(1)中得到的鱿鱼内脏浆液放入容器中，加入酶活力6000U的动物蛋白酶，置于预热的恒温水浴锅中，恒温温度为52℃，计时酶解，每隔10min用玻璃棒搅拌一次。；酶解完毕后，将酶解液置于沸水浴中加热灭酶15min，冷却至室温后，控制温度4℃，离心机转速控制6000r/min，离心15min，得到鱿鱼内脏酶解液；
(3)酶解液分离：将步骤(2)中得到的鱿鱼内脏酶解液用去离子水溶解，采用HP-20树脂柱进行层析，依次以水、20%、60%、80%的甲醇溶液对酶解液进行梯度洗脱，收集甲醇洗脱液，旋转蒸发浓缩，得鱿鱼内脏短肽；
(4)抗动脉硬化活性评价：将步骤(3)得到的鱿鱼内脏短肽进行HMG-CoA还原酶抑制活性评价；其中，所述的HMG-CoA还原酶抑制活性评价，其方法为：圆底96孔平板孔内注入2.5mmol/LHMG-CoA、6U/mgHMG-CoA还原酶、10mmol/LNADPH和鱿鱼内脏短肽，构成50μL的反应体系；在37℃于337nm处每隔4min连续测定80min，通过NADPH吸光度的变化以评定鱿鱼内脏短肽对HMG-CoA还原酶的抑制作用；
其HMG-CoA还原酶抑制率的计算公式为：；
其中，在计算公式中，R为抑制率(%)；
Ki和KC分别为样品和对照组的吸光度直线斜率。
实施例5
一种抗动脉硬化鱿鱼蛋白质短肽的分离方法，经过下列工艺步骤：
(1)原料预处理：选取新鲜的鱿鱼内脏为原料，放入组织捣碎机中捣碎，按照1︰1.5的比例加入去离子水，混匀，得鱿鱼内脏浆液；
(2)酶解：将步骤(1)中得到的鱿鱼内脏浆液放入容器中，加入酶活力8500U的风味蛋白酶,置于预热的恒温水浴锅中，恒温温度为55℃，计时酶解，每隔10min用玻璃棒搅拌一次；酶解完毕后，将酶解液置于沸水浴中加热灭酶10min，冷却至室温后，控制温度4℃，离心机转速控制8000r/min，离心20min，得到鱿鱼内脏酶解液；
(3)酶解液分离：将步骤(2)中得到的鱿鱼内脏酶解液用去离子水溶解，采用HP-20树脂柱进行层析，依次以水、20%、60%、80%的甲醇溶液对酶解液进行梯度洗脱，收集甲醇洗脱液，旋转蒸发浓缩，得鱿鱼内脏短肽；
(4)抗动脉硬化活性评价：将步骤(3)得到的鱿鱼内脏短肽进行HMG-CoA还原酶抑制活性评价；其中，所述的HMG-CoA还原酶抑制活性评价，其方法为：圆底96孔平板孔内注入2.5mmol/LHMG-CoA、7U/mgHMG-CoA还原酶、10mmol/LNADPH和鱿鱼内脏短肽，构成50μL的反应体系；在37℃于337nm处每隔4min连续测定80min，通过NADPH吸光度的变化以评定鱿鱼内脏短肽对HMG-CoA还原酶的抑制作用；
其HMG-CoA还原酶抑制率的计算公式为：；
其中，在计算公式中，R为抑制率(%)；
Ki和KC分别为样品和对照组的吸光度直线斜率。
实施例6
一种抗动脉硬化鱿鱼蛋白质短肽的分离方法，经过下列工艺步骤：
(1)原料预处理：选取新鲜的鱿鱼内脏为原料，放入组织捣碎机中捣碎，按照1︰3的比例加入去离子水，混匀，得鱿鱼内脏浆液；
(2)酶解：将步骤(1)中得到的鱿鱼内脏浆液放入容器中，加入酶活力10000U的木瓜蛋白酶，置于预热的恒温水浴锅中，恒温温度为52℃，计时酶解，每隔10min用玻璃棒搅拌一次。；酶解完毕后，将酶解液置于沸水浴中加热灭酶10min，冷却至室温后，控制温度4℃，离心机转速控制6000r/min，离心10min，得到鱿鱼内脏酶解液；
(3)酶解液分离：将步骤(2)中得到的鱿鱼内脏酶解液用去离子水溶解，采用HP-20树脂柱进行层析，依次以水、20%、60%、80%的甲醇溶液对酶解液进行梯度洗脱，收集甲醇洗脱液，旋转蒸发浓缩，得鱿鱼内脏短肽；
(4)抗动脉硬化活性评价：将步骤(3)得到的鱿鱼内脏短肽进行HMG-CoA还原酶抑制活性评价；其中，所述的HMG-CoA还原酶抑制活性评价，其方法为：圆底96孔平板孔内注入2.5mmol/LHMG-CoA、4U/mgHMG-CoA还原酶、10mmol/LNADPH和鱿鱼内脏短肽，构成50μL的反应体系；在37℃于337nm处每隔4min连续测定80min，通过NADPH吸光度的变化以评定鱿鱼内脏短肽对HMG-CoA还原酶的抑制作用；
其HMG-CoA还原酶抑制率的计算公式为：；
其中，在计算公式中，R为抑制率(%)；
Ki和KC分别为样品和对照组的吸光度直线斜率。
Claims (5)
1.一种抗动脉硬化鱿鱼蛋白质短肽的分离方法，其特征在于：经过下列工艺步骤：
(1)原料预处理：选取新鲜的鱿鱼内脏为原料，放入组织捣碎机中捣碎，按照1︰1～3的比例加入去离子水，混匀，得鱿鱼内脏浆液；
(2)酶解：将步骤(1)中得到的鱿鱼内脏浆液放入容器中，加入酶活力0.5～1万U的蛋白酶，置于预热的恒温水浴锅中，恒温温度为55±5℃，计时酶解；酶解完毕后，将酶解液置于沸水浴中加热灭酶10-15min，冷却至室温后，控温离心，得到鱿鱼内脏酶解液；
(3)酶解液分离：将步骤(2)中得到的鱿鱼内脏酶解液用去离子水溶解，采用HP-20树脂柱进行层析，依次以水、20%、60%、80%的甲醇溶液对酶解液进行梯度洗脱，收集甲醇洗脱液，旋转蒸发浓缩，得鱿鱼内脏短肽。
2.根据权利要求1所述的一种抗动脉硬化鱿鱼蛋白质短肽的分离方法，其特征在于：其还经过下列工艺步骤：
(4)抗动脉硬化活性评价：将步骤(3)得到的鱿鱼内脏短肽进行HMG-CoA还原酶抑制活性评价。
3.根据权利要求1所述的一种抗动脉硬化鱿鱼蛋白质短肽的分离方法，其特征在于：所述的蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、动物蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种抗动脉硬化鱿鱼蛋白质短肽的分离方法，其特征在于：所述的控温离心是控制温度4℃，离心机转速控制6000～8000r/min，离心10～20min。
5.根据权利要求2所述的一种抗动脉硬化鱿鱼蛋白质短肽的分离方法，其特征在于：所述的HMG-CoA还原酶抑制活性评价，其方法为：圆底96孔平板孔内注入2.5mmol/LHMG-CoA、2-8U/mgHMG-CoA还原酶、10mmol/LNADPH和鱿鱼内脏短肽，构成50μL的反应体系；在37℃于337nm处每隔4min连续测定80min，通过NADPH吸光度的变化以评定鱿鱼内脏短肽对HMG-CoA还原酶的抑制作用；
其HMG-CoA还原酶抑制率的计算公式为：；
其中，在计算公式中，R为抑制率(%)；
Ki和KC分别为样品和对照组的吸光度直线斜率。
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