CN102688181A - 医用鱿鱼皮胶原蛋白寡肽凝胶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种医用鱿鱼皮胶原蛋白寡肽凝胶的制备方法，该方法通过对鱿鱼皮去除杂质和杂蛋白并溶胶，然后在40~60℃下，调节pH值为6.0~8.0通过蛋白酶酶解后真空浓缩脱色，然后低温真空干燥得到胶原蛋白肽；取2～4份卡波姆、14～17份甘油和0.2～0.4份十二烷基磺酸钠混合，与0.2～0.6份对羟基苯甲酸乙酯以及水配制成凝胶基质，将之前得到的胶原蛋白肽与凝胶基质混合得到医用鱿鱼皮胶原蛋白寡肽凝胶。本发明制备的医用鱿鱼皮胶原蛋白寡肽凝胶具有抗菌活性高、综合性能优良的特点，该方法不仅解决了目前市场上鱿鱼脚料利用不当的问题，而且为医药用凝胶提供了良好的来源。

Description

医用鱿鱼皮胶原蛋白寡肽凝胶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种胶原蛋白寡肽凝胶的制备方法，具体涉及一种医用鱿鱼皮胶原蛋白寡肽凝胶的制备方法。

背景技术

随着我国海洋鱿钓业的迅速发展，鱿鱼成为我国主要的水产加工原料。鱿鱼年加工量约为30～40万吨，加工过程中会产生包括头、足、内脏及表皮等废弃物，其中鱿鱼皮占加工量的8％-13％。水产品下脚料的高附加值开发是当前水产加工产业的研究热点。鱿鱼皮中胶原蛋白含量约为其干重的70％-80％，若将抗菌活性强的鱿鱼皮胶原蛋白寡肽提取出来并制备凝胶，将充分提升产品附加值，提高企业的经济效益。

凝胶系指药物与形成凝胶剂的辅料混合制成均一、混悬或乳剂型的乳胶稠厚液体或半固体制剂，药物溶解或均匀分散于凝胶中。一般是利用一些新型的高分子药用辅料如卡波姆、聚乙烯醇、羟甲基纤维素钠等将药物制成凝胶，从而达到提高药物局部浓度、延长药物的释放或扩散过程的目的，现广泛用于缓释、控释系统。目前，卡波姆应用较广，为丙烯酸与烯丙基蔗糖或丙烯基季戊四醇交联的高分子聚合物，以卡波姆为基质的凝胶剂具有释药快、易涂展、无油腻性，对皮肤和黏膜无刺激性、药膜的附着性和均匀性好、干燥快等优点。而目前利用鱿鱼皮制备凝胶尚未见报道。

一个公布日为2011.02.23、公布号为CN 101979654A、名为“一种从鱼皮中提取胶原蛋白的方法”的发明专利公开了一种从鱼皮提取胶原蛋白的方法，主要是通过采用异丙醇脱脂，氯化钠去除非胶原蛋白，醋酸浸提同时加酸性蛋白酶酶解，离心浓缩干燥得到鱼皮胶原蛋白。这种方法只说明了从鱼皮中提取了胶原蛋白，并且并不能对所有海洋生物具有通用性，而对鱿鱼皮的胶原蛋白提取及鱿鱼皮胶原蛋白凝胶的制备并无阐述。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用鱿鱼皮制备胶原蛋白寡肽凝胶的方法，此方法不仅解决了目前市场上鱿鱼脚料的利用不当的问题，而且为医药用凝胶提供了良好的来源。

本发明通过以下方案实行：

一种医用鱿鱼皮胶原蛋白寡肽凝胶的制备方法，制备方法包括以下步骤：

(1)原料处理：

将鱿鱼皮用水洗净并切碎，放入浓度为0.7～1.5wt‰NaOH水溶液中，浸泡3～5次，每次浸泡时间为5～8h；然后将鱿鱼皮用水洗净并放入浓度为0.5～1.3wt‰HAc水溶液中，在40～50℃下浸泡3～5次，每次浸泡时间为5～8h；

由于鱼皮中胶原纤维分子间和分子内交联的共价键和非共价键的结构很稳定，所以需进行碱处理以打破这种稳定结构，使胶原分子得以释放，同时除去鱼皮中的非胶原杂蛋白，以提高胶原蛋白含量，NaOH溶液用来破坏胶原纤维分子间和分子内交联的共价键和非共价键的稳定结构很，并脱除鱼皮中的杂蛋白，0.7～1.5wt‰这个浓度不仅能够去除杂蛋白，且能保护胶原蛋白不受损失。HAc的目的是为了去除鱿鱼皮上的脂肪并对鱿鱼皮进行溶胶。

(2)胶原蛋白肽制备：

将经步骤(1)处理后的鱿鱼皮放入鱿鱼皮重量3～5倍的水中，调节温度为40～60℃，调节pH值为6.0～8.0，然后向水中加入鱿鱼皮重量3～5％的碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶，恒温5～9h，然后灭酶并离心分离，取上清液，即为酶解液；酶解液通过截留分子量为1000Da的超滤膜进行超滤，接着将酶解液进行真空浓缩脱色和低温真空干燥，得到胶原蛋白肽；

分子量小于1000Da的肽具有更高的抗菌活性，经过截留分子量为1000Da的超滤膜超滤后，得到的肽基本为寡肽。

(3)胶原蛋白寡肽凝胶制备：

按重量份数计，取2～4份卡波姆、14～17份甘油、0.2～0.4份十二烷基磺酸钠、0.2～0.6份对羟基苯甲酸乙酯和50～60份水配置成凝胶基质，然后对凝胶基质进行灭菌，最后将18～22份步骤(2)得到的胶原蛋白肽加入到灭菌后的凝胶基质中，搅拌均匀，即得到胶原蛋白寡肽凝胶。

卡波姆为丙烯类聚合物，含有很多羧基，通过在水中溶胀，配置成凝胶基质，为胶原蛋白肽提供媒介。

作为优选方案，步骤(1)中首先将鱿鱼皮用浓度为3～10wt％的盐水浸泡10～20min。盐水可以去除鱿鱼皮上的油渍等杂质，排出杂质对效果的影响。

作为优选方案，酶解液在进行真空浓缩时的浓度为20～40波美度时，加入酶解液重量0.2～4％的活性碳，40～60℃下脱色0.8～1.2h，并过滤去除活性碳。在浓度为20～40波美度进行脱色，效果会更加显著。40～60℃下进行脱色不会破坏酶解液中酶解物的结构，且有较高的脱色速度。

作为优选方案，所述的凝胶基质，按重量份数计，取2～4份卡波姆并添加1～2份水与14～17份甘油和0.2～0.4份十二烷基磺酸钠混合，研磨至透明得到基础凝胶基质；取0.2～0.6份对羟基苯甲酸乙酯并加入2～10份水在40～50℃下搅拌溶解得到对羟基苯甲酸乙酯溶液，将对羟基苯甲酸乙酯溶液添加到上述基础凝胶基质中，然后加入48～59水混合均匀并调节pH为6.0～7.0，得到凝胶基质。研磨可助于卡波姆分散，40～50℃下能够更快的使对羟基苯甲酸乙酯溶解，pH为6.0～7.0的凝胶基质能够使得生成的凝胶效果更好。

作为优选方案，步骤(2)中离心分离时离心机转速为6000～8000r/min，离心时间10～18min。由于酶解液中酶解物的颗粒较小，高速长效的离心操作可以使酶解物的分离更加彻底。

由于采用上述技术方案，本发明的有益效果是：本发明所述的医用鱿鱼皮胶原蛋白寡肽凝胶的制备方法具有方法简单，操作简便，且制备的胶原蛋白寡肽凝胶抗菌活性好、综合性能优良。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明做进一步的说明。

为了得到最优结果，首先对实验的进行选择优化。

选择例1：

一种医用鱿鱼皮胶原蛋白寡肽凝胶的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)原料处理：

首先将鱿鱼皮用3wt％的盐水浸泡15min，然后将鱿鱼皮用水洗净并切碎，放入1.5wt‰NaOH水溶液中，浸泡3次，每次浸泡时间为6h；最后将鱿鱼皮用水洗净并放入1.3wt‰HAc水溶液中，在40℃下浸泡4次，每次浸泡时间为8h；

(2)胶原蛋白肽制备：

将经步骤(1)处理后的鱿鱼皮放入重量为鱿鱼皮重量3倍的水中，调节温度为50℃，调节pH值为8.0，然后向水中加入重量为鱿鱼皮重量3％的碱性蛋白酶，恒温6h；然后在100℃下灭酶5后离心分离，离心机转速为7000r/min，离心时间18min，取上清液，即为酶解液；然后将酶解液在30℃进行真空浓缩，在其浓度为30波美度时，加入重量为酶解液重量4％的活性碳，在40℃下脱色1h。最后对脱色后的酶解液在温度为-55℃、压强为500Pa下进行低温真空干燥，得到胶原蛋白肽。

选择例2：

一种医用鱿鱼皮胶原蛋白寡肽凝胶的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)原料处理：

将鱿鱼皮用5wt％的盐水浸泡20min；然后将鱿鱼皮用水洗净并切碎，放入0.7wt‰NaOH水溶液中，浸泡4次，每次浸泡时间为8h；然后将鱿鱼皮用水洗净并放入0.5wt‰HAc水溶液中，在45℃下浸泡5次，每次浸泡时间为5h；

(2)胶原蛋白肽制备：

将经步骤(1)处理后的鱿鱼皮放入重量为鱿鱼皮重量4倍的水中，调节温度为60℃，调节pH值为6.0，然后向水中加入重量为鱿鱼皮重量4％的木瓜蛋白酶，恒温9h；然后在95℃下灭酶10min后离心分离，取上清液，即为酶解液；然后将酶解液在40℃进行真空浓缩，在其浓度为20波美度时，加入重量为酶解液重量2％的活性碳，在60℃下脱色0.8h。最后对脱色后的酶解液在温度为-58℃、压强为1000Pa下进行低温真空干燥，得到胶原蛋白肽。

选择例3：

一种医用鱿鱼皮胶原蛋白寡肽凝胶的制备方法，具体包括以下步骤：(1)原料处理：

将鱿鱼皮用10wt％的盐水浸泡10min；然后将鱿鱼皮用水洗净并切碎，放入1wt‰NaOH水溶液中，浸泡5次，每次浸泡时间为5h；然后将鱿鱼皮用水洗净并放入0.8wt‰HAc水溶液中，在50℃下浸泡3次，每次浸泡时间为6h；

(2)胶原蛋白肽制备：

将经步骤(1)处理后的鱿鱼皮放入重量为鱿鱼皮重量5倍的水中，调节温度为40℃，调节pH值为7.0，然后向水中加入重量为鱿鱼皮重量5％的碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶，恒温5h；然后在97℃下灭酶15min后离心分离，离心机转速为7000r/min，离心时间18min，取上清液，即为酶解液；然后将酶解液在30℃进行真空浓缩，在其浓度为40波美度时，加入重量为酶解液重量4％的活性碳，在40℃下脱色1.2h。最后对脱色后的酶解液在温度为-60℃、压强为800Pa下进行低温真空干燥，得到胶原蛋白肽。

抗菌实验

将金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌分别接种于营养琼脂斜面培养基、TCBS培养基上进行活化，置37℃恒温箱中培养18～24h，然后每种菌种分别挑取单个菌落分别接种于新鲜营养肉汤培养基中，37℃培养18～24h，采用平板菌落计数法，用肉汤稀释菌悬液浓度至含菌体约1×105～1×106CFU/mL，备用。

选用滤纸用打孔器打成6mm直径的圆形纸片，121℃高压灭菌30min，再经80℃烘干，置于干燥器中保存备用。将制备好的纸片放入酶解物试液中浸泡24h，取出挥干多余滤液，保存备用。

用滤纸片法。在超净工作台上将熔化的固体培养基倒入平板，待冷却凝固后用微量移液枪移取上述活化的供试菌悬液各0.1mL，用灭菌的涂布棒分别均匀涂布于平板上，制成含菌平板，待平皿稍干，用无菌镊子将制备好的药敏纸片均匀间隔贴于含菌平板表面，并轻压纸片，使其与培养基接触良好，将贴好的平板倒置，于37℃恒温培养箱中培养18～24h，取出，观察抑菌圈大小，用游标卡尺测定并记录结果，试验重复三次，取其平均值。

采用滤纸片扩散法分别测定碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶三种酶解物在40mg/mL浓度下对金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌的抑菌活性

将碱性蛋白酶酶解液通过截留分子量为10000Da，5000Da，3000Da，1000Da的超滤膜，收集膜上膜下各两部分，获得截流分子量范围为：5000Da＜Mw＜10000Da、3000Da＜Mw＜5000Da、1000Da＜Mw＜3000Da和Mw＜1000Da四种组分，并采用滤纸片扩散法分别测定四种组分肽在40mg/mL浓度下对金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌的抑菌活性。

对三个选择例中的酶解液做抗菌试验，结果见表1。

表1鱿鱼皮不同蛋白酶酶解物对细菌的体外抑菌活性

与阴性对照相比：鱿鱼皮三种不同蛋白酶的酶解物对2种供试菌均表现出极显著的抑菌活性。三种不同蛋白酶酶解物之间比较：碱性蛋白酶酶解物的抑菌活性显著强于胰蛋白酶酶解物和木瓜蛋白酶酶解物，胰蛋白酶酶解物的抑菌效果优于木瓜蛋白酶酶解物。

将碱性蛋白酶酶解液通过截留分子量为10000Da，5000Da，3000Da，1000Da的超滤膜，收集膜上膜下各两部分，获得截流分子量范围为：a：5000Da＜Mw＜10000Da、b：3000Da＜Mw＜5000Da、c：1000Da＜Mw＜3000Da和d：Mw＜1000Da四种组分，并采用滤纸片扩散法分别测定四种组分肽在40mg/mL浓度下对金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌的抑菌活性。结果见表2。

表2不同组分肽对细菌的体外抑菌活性

与阴性对照相比：四种不同组分多肽对2种供试菌均表现出极显著的抑菌活性。四种不同组分多肽之间比较：d＞c＞b＞a。后续实施例选用抗菌性最好的d所用的组分来制备凝胶，以期获得最大功效。

以下实验采用碱性蛋白酶进行酶解，并对酶解液超滤选取分子量Mw＜1000Da的组分。

实施例1

(1)原料处理：

将鱿鱼皮用3wt％的盐水浸泡15min；然后将鱿鱼皮用水洗净并切碎，放入1.5wt‰NaOH水溶液中，浸泡3次，每次浸泡时间为7h；然后将鱿鱼皮用水洗净并放入1.3wt‰HAc水溶液中，在40℃下浸泡4次，每次浸泡时间为8h；

(2)胶原蛋白肽制备：

将经步骤(1)处理后的鱿鱼皮放入重量为鱿鱼皮重量3倍的水中，调节温度为50℃，调节pH值为8.0，然后向水中加入重量为鱿鱼皮重量3％的碱性蛋白酶，恒温6h；然后在100℃下灭酶5后离心分离，离心机转速为7000r/min，离心时间18min，取上清液，即为酶解液；然后将酶解液在30℃进行真空浓缩，在其浓度为30波美度时，加入重量为酶解液重量4％的活性碳，在40℃下脱色1h，然后通过截留分子量为1000Da的超滤膜过滤，取滤液，最后此滤液在温度为-55℃、压强为500Pa下进行低温真空干燥，得到胶原蛋白肽；

(3)胶原蛋白寡肽凝胶制备：

按重量份数计，取2份卡波姆并添加1份水与16份甘油和0.4份十二烷基磺酸钠混合，研磨至透明得到基础凝胶基质；取0.2份对羟基苯甲酸乙酯并加入2份水在40℃下搅拌溶解得到对羟基苯甲酸乙酯溶液，将对羟基苯甲酸乙酯溶液添加到上述基础凝胶基质中，然后加入50份水混合均匀并调节pH为6.5，得到凝胶基质。将凝胶基质在121℃下灭菌10min，然后将20份步骤(2)所述的胶原蛋白肽加入到灭菌后的凝胶基质中，搅拌均匀，即得到胶原蛋白寡肽凝胶。

实施例2

(1)原料处理：

将鱿鱼皮用5wt％的盐水浸泡20min；然后将鱿鱼皮用水洗净并切碎，放入0.7wt‰NaOH水溶液中，浸泡4次，每次浸泡时间为8h；然后将鱿鱼皮用水洗净并放入0.5wt‰HAc水溶液中，在45℃下浸泡5次，每次浸泡时间为5h；

(2)胶原蛋白肽制备：

将经步骤(1)处理后的鱿鱼皮放入重量为鱿鱼皮重量4倍的水中，调节温度为60℃，调节pH值为6.0，然后向水中加入重量为鱿鱼皮重量4％的木瓜蛋白酶，恒温9h；然后在95℃下灭酶10min后离心分离，取上清液，即为酶解液；然后将酶解液在40℃进行真空浓缩，在其浓度为20波美度时，加入重量为酶解液重量2％的活性碳，在60℃下脱色0.8h，然后通过截留分子量为1000Da的超滤膜过滤，取滤液，最后此滤液在温度为-58℃、压强为1000Pa下进行低温真空干燥，得到胶原蛋白肽；

(3)胶原蛋白寡肽凝胶制备：

按重量份数计，取3份卡波姆并添加2份水与17份甘油和0.2份十二烷基磺酸钠混合，研磨至透明得到基础凝胶基质；取0.5份对羟基苯甲酸乙酯并加入10份水在45℃下搅拌溶解得到对羟基苯甲酸乙酯溶液，将对羟基苯甲酸乙酯溶液添加到上述基础凝胶基质中，然后加入48水混合均匀并调节pH为7.0，得到凝胶基质。将凝胶基质在110℃下灭菌15min，然后将22份步骤(2)所述的胶原蛋白肽加入到灭菌后的凝胶基质中，搅拌均匀，即得到胶原蛋白寡肽凝胶。

实施例3

(1)原料处理：

将鱿鱼皮用10wt％的盐水浸泡10min；然后将鱿鱼皮用水洗净并切碎，放入1wt‰NaOH水溶液中，浸泡5次，每次浸泡时间为5h；然后将鱿鱼皮用水洗净并放入0.8wt‰HAc水溶液中，在50℃下浸泡3次，每次浸泡时间为6h；

(2)胶原蛋白肽制备：

将经步骤(1)处理后的鱿鱼皮放入重量为鱿鱼皮重量5倍的水中，调节温度为40℃，调节pH值为7.0，然后向水中加入重量为鱿鱼皮重量5％的碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶，恒温5h；然后在97℃下灭酶15min后离心分离，离心机转速为7000r/min，离心时间18min，取上清液，即为酶解液；然后将酶解液在30℃进行真空浓缩，在其浓度为40波美度时，加入重量为酶解液重量4％的活性碳，在40℃下脱色1.2h，然后通过截留分子量为1000Da的超滤膜过滤，取滤液，最后此滤液在温度为-60℃、压强为800Pa下进行低温真空干燥，得到胶原蛋白肽；

(3)胶原蛋白寡肽凝胶制备：

按重量份数计，取4份卡波姆并添加1.5份水与14份甘油和0.3份十二烷基磺酸钠混合，研磨至透明得到基础凝胶基质；取0.6份对羟基苯甲酸乙酯并加入6份水在50℃下搅拌溶解得到对羟基苯甲酸乙酯溶液，将对羟基苯甲酸乙酯溶液添加到上述基础凝胶基质中，然后加入59水混合均匀并调节pH为6.0，得到凝胶基质。将凝胶基质在115℃下灭菌20min，然后将18份步骤(2)所述的胶原蛋白肽加入到灭菌后的凝胶基质中，搅拌均匀，即得到胶原蛋白寡肽凝胶。

胶原蛋白寡肽凝胶制备好后，对胶原蛋白寡肽凝胶进行性能测试：

低速离心实验

称取胶原蛋白寡肽凝胶5g，置于10mL离心管中，以4000r/min离心60min，观察凝胶剂的外观和涂展性。

高速离心实验

称取凝胶1g，置于1.5mL离心管中，以12000r/min离心60min，观察凝胶剂的外观和涂展性。

光照实验

将三份不同批号的凝胶置于透明的玻璃瓶中，密封后置于2500LX的光照仪中连续照射10d，分别于第0d、5d和10d取样，观察其性状。

高温实验

将三份不同批号的凝胶置于玻璃瓶中，密封后置于(65±3)℃的恒温水浴锅中，分别于第0、5和10d取样，恢复室温，观察其性状。

低温实验

将三份不同批号的凝胶置于玻璃瓶中，密封后置于(-18±2)℃的冰箱中，分别于第0、5和10d取样，恢复室温，观察其性状。

对制备得到胶原蛋白寡肽凝胶进行低速离心实验均未见分层现象，进行高速离心实验，均未见分层现象，光照实验结果见表3，进行高温实验结果见表4，进行低温实验结果见表5，

表3光照实验结果

表4高温实验结果

表5低温实验结果

经过实验表明，通过本发明的方法制备的医用鱿鱼皮胶原蛋白寡肽凝胶具有良好的性能，解决了目前市场上鱿鱼脚料的利用不当的问题，并且为医药凝胶提供了良好的来源。

Claims (5)

1.一种医用鱿鱼皮胶原蛋白寡肽凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（1）原料处理：

将鱿鱼皮用水洗净并切碎，放入浓度为0.7~1.5wt‰NaOH水溶液中，浸泡3~5次，每次浸泡时间为5~8h；然后将鱿鱼皮用水洗净并放入浓度为0.5~1.3wt‰HAc水溶液中，在40~50℃下浸泡3~5次，每次浸泡时间为5~8h；

（2）胶原蛋白肽制备：

将经步骤（1）处理后的鱿鱼皮放入鱿鱼皮重量3~5倍的水中，调节温度为40~60℃，调节pH值为6.0~8.0，然后向水中加入鱿鱼皮重量3~5%的碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶，恒温5~9h，然后灭酶并离心分离，取上清液，即为酶解液；酶解液通过截留分子量为1000Da的超滤膜进行超滤，接着将酶解液进行真空浓缩脱色和低温真空干燥，得到胶原蛋白肽；

（3）胶原蛋白寡肽凝胶制备：

按重量份数计，取2～4份卡波姆、14～17份甘油、0.2～0.4份十二烷基磺酸钠、0.2～0.6份对羟基苯甲酸乙酯和50~60份水配置成凝胶基质，然后对凝胶基质进行灭菌，最后将18~22份步骤（2）得到的胶原蛋白肽加入到灭菌后的凝胶基质中，搅拌均匀，即得到胶原蛋白寡肽凝胶。

2.根据权利要求1所述的医用鱿鱼皮胶原蛋白寡肽凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中首先将鱿鱼皮用浓度为3~10wt%的盐水浸泡10~20min。

3.根据权利要求1或2所述的医用鱿鱼皮胶原蛋白寡肽凝胶的制备方法，其特征在于，酶解液在进行真空浓缩时的浓度为20~40波美度时，加入酶解液重量0.2~4%的活性碳，40~60℃下脱色0.8~1.2h，并过滤去除活性碳。

4.根据权利要求1或2所述的医用鱿鱼皮胶原蛋白寡肽凝胶的制备方法，其特征在于，所述的凝胶基质，按重量份数计，取2～4份卡波姆并添加1~2份水与14～17份甘油和0.2～0.4份十二烷基磺酸钠混合，研磨至透明得到基础凝胶基质；取0.2～0.6份对羟基苯甲酸乙酯并加入2~10份水在40~50℃下搅拌溶解得到对羟基苯甲酸乙酯溶液，将对羟基苯甲酸乙酯溶液添加到上述基础凝胶基质中，然后加入48~59水混合均匀并调节pH为6.0～7.0，得到凝胶基质。

5.根据权利要求1或2所述的医用鱿鱼皮胶原蛋白寡肽凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中离心分离时离心机转速为6000~8000r/min，离心时间10~18min。