CN104293678B - 一种产连翘脂苷a、b和连翘苷的连翘内生真菌及其应用 - Google Patents

一种产连翘脂苷a、b和连翘苷的连翘内生真菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌及其应用，属于生物技术领域。该内生真菌为枝状枝胞菌（Cladosporium cladosporioides）LQ‑1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2014年1月15日，保藏编号：CGMCC No.8728；可以代谢产生与连翘成分相同的成分，具有较强的灭菌、抑菌作用，发酵培养后能够产生对致病性大肠杆菌（E.coli K99，ATCC hb‑8178）、沙门氏菌（Salmonella.Typhimurium，ATCC14028）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus.aureus，ATCC29213）等有抑制作用的活性代谢产物，包括连翘脂苷A、B和连翘苷等，是医药行业重要的微生物资源。

Description

一种产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
从微生物中寻找能应用于农业和医药的天然产物是一个不断变化发展的过程。这些潜在的菌种资源对研究生物多样性、发现新化合物和开发新药都具有重要的意义。内生真菌次生代谢产物的化学结构多样性也蕴藏着其生物活性的多样性，在农业和医药业中具有重要的应用潜力。在过去70多年中，已从微生物中发现了3万～5万种天然产物，其中1万多种有生物活性，8千多种具有抗菌或抗肿瘤活性。从微生物中获得的抗生素、抗肿瘤剂、杀虫剂、以及微生物产生的酶、维生素和氨基酸等都有广泛应用。
植物内生真菌是个巨大的微生物新资源，具有重要的农药和医药应用潜力。从特殊生境植物和传统的药用植物内生真菌次生代谢产物中筛选具有药用价值的活性物质或新型化合物以创制新药，解决自然资源不足，开发紧缺及新型药物，将在很大程度上丰富人类的药物宝库。
连翘出自《神农本草经》，其别名又有旱连子、空翘、落翘、黄奇丹，为植物连翘的干燥果实。其对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、肺炎双球菌、人型结核杆菌、百日咳杆菌，以及流感病毒、真菌、鼻病毒等均有抑制作用。能明显抑制炎性渗出和增强小鼠吞噬炎症细胞能力。水溶液能降压，所含芦丁能增强毛细血管致密度。此外，还有解热、利尿、镇吐、抗肝损伤等作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌。
同时，本发明还提供一种产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌的应用。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌，所述的连翘内生真菌为枝状枝孢(Cladosporium cladosporioides)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年1月15日，保藏编号：CGMCC No.8728。
一种产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌的应用，具体的，连翘内生真菌在生产药物活性成分(连翘脂苷A、B和连翘苷)中的应用，包括以下步骤：取连翘内生真菌(CGMCCNo.8728)发酵培养液，分离药物活性成分即可。更具体的，连翘内生真菌在制备药物中的应用，包括以下步骤：取连翘内生真菌(CGMCC No.8728)发酵培养液，分离药物活性成分，与辅料混合即可。
所述的药物活性成分为连翘脂苷A、连翘脂苷B和连翘苷，经分离、纯化后，可以按照常规方法制备成片剂、颗粒剂、粉剂、注射液、口服液、脂质体等剂型。所述的辅料为医药、农药领域常规辅料。当制备成注射液时，辅料可采用甘露醇、葡萄糖、山梨醇等，片剂时采用淀粉、羧甲基淀粉钠、微晶纤维素等；口服液时采用油性基质如脂肪酸、脂肪酸甘油酯等。
所述发酵培养液的制备方法为：取经活化的连翘内生真菌置于PDB培养基中，在27～29℃下震荡培养4～7天即可。
本发明的有益效果：
本发明中连翘内生真菌为枝孢菌黑霉菌(Cladosporium cladosporioides)，从河南省洛阳市周山风景区的连翘活体中分离得到，属于一种共生微生物，可以代谢产生与连翘成分相同的成分，具有很强的杀灭和抑制细菌的作用，发酵培养后能够产生对致病性大肠杆菌(E.coli K99，ATCC hb-8178))、沙门氏菌(Salmonella.Typhimurium，ATCC14028)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus.aureus，ATCC29213)等有抑制作用的活性代谢产物，包括连翘脂苷A、B和连翘苷等，是医药行业重要的微生物资源。
附图说明
图1为本发明实施例1中连翘内生真菌在100×油镜下的菌株形态图；
图2为实施例1中连翘内生真菌18s rDNA PCR扩增产物的电泳图；
图3为实施例1中连翘内生真菌的系统发育树图；
图4中实施例2中连翘内生真菌的抑菌效果图；
图5为实施例2中连翘内生真菌发酵上清液的液相色谱图。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
本实施例中产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌，为枝状枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)LQ-1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2014年1月15日，保藏编号：CGMCC No.8728。该菌株是从河南省洛阳市周山风景区连翘活体中分离得到。
所述连翘内生真菌的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)连翘组织预处理：采集新鲜无虫害的连翘茎、叶和花，用无菌水将表面的尘土冲洗干净，放入超净工作台，切成2cm的片段；
(2)连翘组织的表面消毒：将步骤(1)中采集的组织在无菌操作台上进行表面消毒，先用75％的酒精浸泡4min(3～5min均可)，然后用无菌水漂洗4次(3～4次均可)，再在0.1％的升汞中浸泡4min(3～5min均可)，最后用无菌水漂洗5次，阴干待用；
(3)检验消毒效果：取步骤(2)中最后一次无菌水冲洗液，涂布到PDA平板上，37℃培养3天，检验灭菌效果，发现培养皿中无菌落出现，证明组织表面灭菌彻底(否则该分离结果不能使用)；
(4)连翘组织内生菌的培养：检验合格后，将步骤(2)中表面消毒过的叶和花在超净工作台上用灭菌的解剖刀切成0.5cm×0.5cm大小的薄片，茎则用无菌刀片除去外皮层，分内皮层、韧皮部和木质部各切成1cm长的片段，然后从纵切方向剪为4个部分，将小块样品紧贴于PDA培养基平板上，每个平板接种2片(1～2片均可)，做4个重复，置于28℃恒温培养箱中避光培养6天(5～7天均可)；
(5)连翘内生菌的分离纯化：待步骤(4)中材料周围长出菌落时，采用尖端菌丝挑取法对所分离的不同形态的内生真菌于PDA固体培养基平板上用划线分离法进行纯化，28℃恒温培养6天(5～7天均可)，直到分离得到单菌落；
(6)连翘分离菌的镜检：挑取步骤(5)中的单菌落固定在载玻片上，用革兰氏染色法进行染色(草酸铵结晶紫染色1min，自来水冲洗，碘液染1min，水洗，95％的酒精脱色20s，水洗，番红复染2min，水洗)，干燥后，滴加香柏油，在高倍镜下观察菌落形态(图1所示为100×油镜下连翘内生菌菌丝形态)，并根据其菌落特征和菌丝特点，对所分离到的内生真菌进行初步分类鉴定，见图1(图中LQ-1的菌丝在100×油镜下呈长杆状，无隔，有少量分支)；
(7)连翘分离菌的保存：挑取步骤(6)中镜检时所用的菌丝接种于含有PDB培养基的三角瓶中，在37℃、150r/min摇床中培养12h，至细菌长到对数期，蘸取菌悬液接种于PDA斜面培养基上，37℃培养3天(2～4天均可)，再转移到4℃的冰箱中斜面真空冷冻干燥保存备用。
所述连翘内生真菌的分子生物学鉴定方法，包括以下步骤：
(1)连翘内生真菌的活化：将保存的连翘内生真菌菌种用平板划线法接种在PDA平板上，在28℃恒温条件下倒置培养，待菌落生长成熟后，保存待用；
(2)连翘内生真菌基因组DNA的提取，采用CTAB法提取连翘内生真菌的rDNA，具体操作步骤如下：
1)取步骤(1)中活化的少量孢子(约0.2g)置于研钵内，加入1000μL1×CTAB提取液，研磨；
2)将研磨混合液转入1.5mL离心管中，并向离心管中再加入300μL1×CTAB提取液，轻轻摇动，再将管置于65℃水浴中消化1h，在此过程中轻轻摇动3次(2～3次均可)；
3)加入等体积预冷的苯酚-氯仿-异戊醇(体积比25:24:1)，摇匀，12000rpm离心10min，将上清液移至干净的离心管中；
4)在步骤3)上清液中加入等体积预冷的氯仿-异戊醇(体积比24:1)，并剧烈振荡使之形成悬乳状，12000rpm离心10min，将上清液移至干净的离心管中；
5)重复3)、4)步骤，最终收集得到上清液；
6)在步骤5)上清液中加人3mol/L NaAc使溶液终浓度为0.1mol/L，再加入2倍体积预冷的无水乙醇，上下转动混匀，放入-20℃冰箱过夜，沉淀DNA，沉淀完毕于12000rpm离心15min，收集沉淀；
7)弃去上清后，用预冷75％的乙醇洗涤DNA沉淀，然后弃去冷乙醇，共洗涤3次；
8)将管中乙醇倒净后，将管倒置在吸水纸上，使乙醇完全挥发；
9)加入30μL TE缓冲液溶使DNA沉淀，-20℃保存备用；
(3)PCR扩增连翘内生真菌rDNA，采用真菌通用引物ITS1和ITS4在PCR仪上完成PCR扩增，基因扩增反应体系(50μL)如下：
PCR反应程序为：先94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，然后进行35个循环，循环结束后再72℃保持10min，于4℃冷却
(4)PCR产物的电泳检测，具体操作步骤如下：
1)凝胶的制备：称取0.25g琼脂糖，置于三角瓶中，加入25mL TAE缓冲液，微波炉中加热至琼脂糖全部溶解，摇匀后倒入插好梳子的电泳板中，室温静置约30min，使凝固完全，再将电泳板放入电泳槽中，小心拔去梳子，准备上样；
2)加样：5μL PCR产物加1μL DNA上样缓冲液和1μL核酸染料，混匀后上样，5μLDL2000DNA分子量标准；
3)电泳：电压80V，40min；
4)成像：将凝胶置于紫外透射仪中拍照，见图2(图中M为DL2000Marker DNA，1-3分别为内生真菌的18s rDNA)；
(5)PCR产物的测序：将PCR扩增产物送去测序公司测序，以确定未知菌株的基因序列，得到扩增的连翘内生真菌ITS基因SEQ-1片段长510bp，序列如SEQ ID NO:1所示；
(6)NCBI blast序列检索，并建立系统发育树，具体操作步骤如下：
1)登陆Blast主页：http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/；
2)填写表单信息，提交任务；
3)查找与目的菌相似度高的基因序列；
4)采用Mega软件邻位连接法进行聚类分析，进行1000次的相似度重复计算，构建内生真菌系统发育树进行种属归类，系统发育树见图3。由图3可知，LQ-1的SEQ-1序列与Cladosporium cladosporioides位于同一分支上，亲缘关系较近，确定LQ-1为枝孢菌属黑霉菌(Cladosporium cladosporioides)。
实施例2
本实施例中产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌枝状枝孢菌黑霉菌(Cladosporium cladosporioides)LQ-1(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2014年1月15日，保藏编号：CGMCC No.8728)在制备药物中的应用，包括以下步骤：取枝孢菌黑霉菌LQ-1(CGMCC No.8728)发酵培养液，分离连翘脂苷A、连翘脂苷B和连翘苷，与辅料甘露醇混合得到注射液。
所述连翘内生真菌发酵产物抑菌活性的测定方法，包括以下步骤：
(1)连翘内生真菌的活化：将保存的连翘内生真菌菌种用平板划线法接种在PDA平板上，在28℃恒温条件下倒置培养，待菌落生长成熟后，保存待用；
(2)连翘内生真菌液态发酵及发酵液处理：在无菌条件下直接将步骤(1)中带菌培养基分别装入加有定量PDB培养基的三角瓶中(250mL的容量瓶装液量为100mL)，置28℃，150r/min的条件下摇床振荡培养6天(5～7天均可)，然后用无菌吸管从锥形瓶中吸取5mL的发酵液，发酵液在12000r/min下离心10min，收集上清液，蛋白沉淀过滤备用；
(3)指示菌的培养：从4℃冰箱中取出保存的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、和沙门氏菌，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养，然后挑取单个菌落接种到5mL新的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，150r/min，37℃恒温过夜培养；
(4)含指示菌平板的制备：在无菌条件下，从步骤(3)中取20μL指示菌培养液加入到牛肉膏蛋白胨培养基平板，涂布，制成含菌平板；
(5)连翘内生真菌的抑菌试验：在步骤(4)中含有指示菌的平板上，用无菌的塑料吸管打出7个直径为0.7cm左右的小孔，每个小孔滴加100μL步骤(2)中发酵上清液，37℃培养12h后，采用十字交叉法测其抑菌圈直径，取其平均值为抑菌圈大小，见图4(图4中A、B、C分别为沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)。其中，内生真菌对沙门氏菌抑菌圈的平均直径为15.1mm，对金黄色葡萄球菌抑菌圈的平均直径为18.5mm，对大肠杆菌抑菌圈的平均直径为20.8mm。
所述连翘内生真菌次级代谢产物的检测，包括以下步骤：
(1)连翘内生真菌的活化：将保存的连翘内生真菌菌种用平板划线法接种在PDA平板上，在28℃恒温条件下倒置培养，待菌落生长成熟后，保存待用；
(2)连翘内生真菌的液体培养：用接种环挑取步骤(1)所活化的内生真菌放入盛有液体培养基的三角瓶(250mL)中，即把菌丝转移到装有200ml PDB培养基的三角瓶中，在温度为28℃、转速为150r/min的条件下培养5天(4～7天均可)；
(3)对内生真菌发酵上清液进行处理，具体操作步骤如下：
1)液体培养结束后5000r/min离心10min，取上清液于100mL的三角瓶中；
2)取10mL上清液进行12000r/min离心10min，取上清液；
3)取1mL步骤2)的上清液与9mL甲醇混合，于-20℃的冰箱里放置过夜；
4)12000r/min离心10min，取上清液，0.22μm滤膜过滤，滤液作为液相色谱的测试液；
(4)内生真菌代谢产物的分析，具体操作步骤如下：
1)对照品制备：准确称取连翘苷5mg置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，用抽滤器和微孔滤膜过滤，作为对照品母液，连翘酯苷A和连翘酯苷B用同样方法制备，各取0.1mL对照品母液混合均匀后加入2.2mL甲醇配成20g/L的混合对照品母液；
2)连翘酯苷A色谱条件：
①色谱柱：ODS-C18(4.6mm×150mm，5μm)，
②流动相：A为纯水，B为甲醇(A:B＝3:2)，
③流速：1.0mL/min，
④柱温：室温(25℃)，
⑤进样量：10μL，
⑥样品信息：500g/L，
⑦检测器：紫外吸收检测器(检测波长：330nm)；
3)连翘酯苷B色谱条件：
①色谱柱：ODS-C18(4.6mm×150mm，5μm)，
②流动相：A为纯水，B为甲醇(A:B＝3:2)，
③流速：1.0mL/min，
④柱温：室温(25℃)，
⑤进样量：10μL，
⑥样品信息：500g/L，
⑦检测器：紫外吸收检测器(检测波长：332nm)；
4)连翘苷色谱条件：
①色谱柱：ODS-C18(4.6mm×150mm，5μm)，
②流动相：A为纯水，B为乙腈(A:B＝1:4)，
③流速：1.0mL/min，
④柱温：室温(25℃)，
⑤进样量：10μL，
⑥样品信息：500g/L，
⑦检测器：紫外吸收检测器(检测波长：277nm)；
5)混合标准品色谱条件：
①色谱柱：ODS-C18(4.6mm×150mm，5μm)，
②流动相：A为纯水，B为甲醇(0-5分钟为A:B＝42:58；5-10分钟为A:B＝20:80；10分钟以后为A:B＝20:80)
③流速：1.0mL/min，
④柱温：室温(25℃)，
⑤进样量：10μL，
⑥检测器：紫外吸收检测器(检测波长：前10分钟为330nm，10分钟以后为277nm)；
6)发酵上清液色谱条件：
①色谱柱：ODS-C18(4.6mm×150mm，5μm)，
②流动相：A为纯水，B为甲醇(0-5分钟为A:B＝42:58；5-10分钟为A:B＝20:80；10分钟以后为A:B＝20:80)
③流速：1.0mL/min，
④柱温：室温(25℃)，
⑤进样量：10μL，
⑥检测器：紫外吸收检测器(检测波长：前10分钟为330nm，10分钟以后为277nm)；
(5)分析发酵上清液的色谱图(见图5，图5a、5b标有连翘酯苷A、B和连翘苷的峰)，根据相对保留时间和相对峰面积对代谢产物分析并计算发酵上清液中连翘酯苷A、连翘酯苷B和连翘苷的浓度，其中连翘酯苷A的浓度为12.1μg/mL，连翘酯苷B的浓度为7.5μg/mL，连翘苷的浓度为126.9μg/mL。

Claims (5)

1.一种产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌，其特征在于：所述的连翘内生真菌为枝状枝胞(Cladosporium cladosporioides)LQ-1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2014年1月15日，保藏编号：CGMCC No.8728。
2.一种如权利要求1所述的产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌的应用，其特征在于：所述的连翘内生真菌在生产药物活性成分中的应用，包括以下步骤：取连翘内生真菌发酵培养液，分离药物活性成分即可。
3.根据权利要求2所述的产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌的应用，其特征在于：所述的连翘内生真菌在制备药物中的应用，包括以下步骤：取连翘内生真菌发酵培养液，分离药物活性成分，与辅料混合即可。
4.根据权利要求2或3所述的产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌的应用，其特征在于：所述的药物活性成分为连翘脂苷A、连翘脂苷B和连翘苷。
5.根据权利要求2或3所述的产连翘脂苷A、B和连翘苷的连翘内生真菌的应用，其特征在于：所述发酵培养液的制备方法为：取经活化的连翘内生真菌置于PDB培养基中，在27～29℃下震荡培养4～7天即可。
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