CN104472221A - 一种由天然冬虫夏草子实体发酵菌丝的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于发酵技术领域的一种由天然冬虫夏草子实体发酵菌丝的方法。该方法首先采集新鲜野生虫草子实体，用低温水从包裹处沿子实体冲洗过夜，然后浸泡，用无菌水冲洗，取出菌丝，装在有培养基的种子瓶中培养10-14天，然后将冬虫夏草菌的种子瓶进行并瓶扩大培养，最后利用发酵罐进行连续培养，培养5-8天后，取样检测腺苷、虫草素、多糖和菌丝量，各项指标不低于国家标准，镜检无微生物污染，收菌。本发明通过对野生虫草子实体的处理及发酵过程，制备发酵菌丝体，制备的菌丝体腺苷，虫草素，多糖和菌丝量高，并且可以用于蝙蝠蛾幼虫侵染，为全人工培育冬虫夏草之一环。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种由天然冬虫夏草子实体发酵菌丝的方法。
背景技术
冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)，又名虫草，为麦角菌科虫草属真菌寄生在绿蝙蝠蛾幼虫上的子座及幼虫的复合体。冬虫夏草分布在我国西藏、青海、云南、四川及甘肃等省区3000～5000m的高寒草甸区，且对生境要求极其特殊。在自然条件下，其生活史极其复杂，必须经过相对独立的分生孢子阶段和子囊孢子阶段的转变，其寄主蝙蝠蛾需要5～6年才能完成一个世代，其中85％以上的时间营地下生活，全年具有世代重叠现象。冬虫夏草性温而味甘，药用价值极高，具有补肺、益肾、补精髓及诸虚百损、止咳化痰、抗白血病、抗抑郁症、调节免疫系统之功效。
冬虫夏草在目前天然药材中，已经处于濒危灭绝的边缘。产量和产地都非常有限，全世界仅有中国和尼泊尔有野生的冬虫夏草。随着人类对野生冬虫夏草的需求欲越来越大，天然冬虫夏草已不能满足市场需求。因此，人工发酵的菌丝将有很大的利用价值。但用冬虫夏草菌无性世代发酵菌丝，成分含量不能达到天然的均衡，也会因为腺苷含量虚高，而特别容易肝火旺盛，长期服用有损人体机能。
发明内容
本发明的目的在于提出一种由天然冬虫夏草子实体发酵菌丝的方法。针对用无性世代发酵的缺点，利用现代发酵技术，直接用野生冬虫夏草子实体进行扩大发酵，发酵出的菌丝营养均衡，高活性，可用于产品原料，也可以用于人工培育冬虫夏草侵染幼虫。
一种由天然冬虫夏草子实体发酵菌丝的方法，按照如下步骤进行：
(1)采集新鲜野生虫草子实体，在0-4℃条件下运送到实验室，选择子实体粗壮的即将喷发孢子的虫草，用塑胶膜包裹地下部分，用6-18℃的低温水从包裹处沿子实体冲洗过夜；
(2)在超净工作台上切下水冲洗部分，置于有酒精的培养皿中，浸泡0.5-2min，然后用无菌水冲洗；
(3)将消毒处理好的子实体置于灭菌后的平板里，平板里放一张滤纸，待滤纸吸干子实体水分后，用解剖刀切开子实体，用镊子夹取子实体中间菌丝，夹出含有子囊果的有性菌丝，置于另一干净培养皿中；
(4)将菌丝切成小段，装在有培养基的种子瓶中，每个种子瓶1个子实体的菌丝段，用均质机将种子瓶中菌丝段打碎，置于恒温摇床上在100-200r/min，16-20℃条件下培养10-14天；
(5)培养至第6-8天时，进行常规菌落检验，并进行分子检验，确定是否为冬虫夏草菌；
(6)将没有污染的冬虫夏草菌的种子瓶进行并瓶扩大培养，最后利用发酵罐进行连续培养；培养5-8天后，取样检测腺苷、虫草素、多糖和菌丝量，各项指标不低于国家标准，镜检无微生物污染，收菌；干燥后可用于产品原料；
(7)冬虫夏草多余子实体的保存：同步骤(1)-(2)的方法处理子实体，用灭菌后滤纸吸干子实体水分后，一部分置于无菌水中，用于两个月后的发酵，另一部分置于液态石蜡中，用于半年后发酵。
制备的所述发酵菌丝活性高，可用于侵染。
步骤(6)中进行发酵罐连续培养时，向发酵罐中加入小蓟提取物，所述小蓟提取物的提取方法为：将小蓟晒干，磨成粉末，加5-7倍重量份数的70％乙醇水溶液渗漉提取，收集渗漉液，减压回收乙醇，浓缩至原混合液体积的1/20-1/10，2000r/min离心1-3min，沉淀并经氯仿脱脂，制成。
步骤(6)中进行发酵罐连续培养时，向发酵罐中加入马唐提取物，所述马唐提取物的提取方法为：将马唐晒干，磨成粉末，加5-7倍重量份数的70％乙醇水溶液回流提取3次，合并滤液，蒸干制成。
本发明的有益效果：本发明通过对野生虫草子实体的处理及发酵过程，制备发酵菌丝体，制备的菌丝体腺苷，虫草素，多糖和菌丝量高，并且可以用于蝙蝠蛾幼虫侵染，为全人工培育冬虫夏草之一环。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
一种由天然冬虫夏草子实体发酵菌丝的方法，按照如下步骤进行：
(1)采集新鲜野生虫草子实体，在3℃条件下运送到实验室，选择子实体粗壮的即将喷发孢子的虫草，用塑胶膜包裹地下部分，用8℃的低温水从包裹处沿子实体冲洗过夜；
(2)在超净工作台上切下水冲洗部分，置于有酒精的培养皿中，浸泡1min，然后用无菌水冲洗；
(3)将消毒处理好的子实体置于灭菌后的平板里，平板里放一张滤纸，待滤纸吸干子实体水分后，用解剖刀切开子实体，用镊子夹取子实体中间菌丝，夹出含有子囊果的有性菌丝，置于另一干净培养皿中；
(4)将菌丝切成小段，装在有培养基的种子瓶中，每个种子瓶1个子实体的菌丝段，用均质机将种子瓶中菌丝段打碎，置于恒温摇床上在150r/min，18℃条件下培养12天；
(5)培养至第7天时，进行常规菌落检验，并进行分子检验，确定是否为冬虫夏草菌；
(6)将没有污染的冬虫夏草菌的种子瓶进行并瓶扩大培养，最后利用发酵罐进行连续培养；培养6天后，取样检测腺苷、虫草素、多糖和菌丝量，各项指标不低于国家标准，镜检无微生物污染，收菌；干燥后可用于产品原料；
(7)冬虫夏草多余子实体的保存：同步骤(1)-(2)的方法处理子实体，用灭菌后滤纸吸干子实体水分后，一部分置于无菌水中，用于两个月后的发酵，另一部分置于液态石蜡中，用于半年后发酵。
制备的菌丝体腺苷含量为0.021％(药典中规定的含量为大于0.01％)，可以用于蝙蝠蛾幼虫侵染。
实施例2
一种由天然冬虫夏草子实体发酵菌丝的方法，按照如下步骤进行：
(1)采集新鲜野生虫草子实体，在0℃条件下运送到实验室，选择子实体粗壮的即将喷发孢子的虫草，用塑胶膜包裹地下部分，用6℃的低温水从包裹处沿子实体冲洗过夜；
(2)在超净工作台上切下水冲洗部分，置于有酒精的培养皿中，浸泡2min，然后用无菌水冲洗；
(3)将消毒处理好的子实体置于灭菌后的平板里，平板里放一张滤纸，待滤纸吸干子实体水分后，用解剖刀切开子实体，用镊子夹取子实体中间菌丝，夹出含有子囊果的有性菌丝，置于另一干净培养皿中；
(4)将菌丝切成小段，装在有培养基的种子瓶中，每个种子瓶1个子实体的菌丝段，用均质机将种子瓶中菌丝段打碎，置于恒温摇床上在100r/min，20℃条件下培养10天；
(5)培养至第8天时，进行常规菌落检验，并进行分子检验，确定是否为冬虫夏草菌；
(6)将没有污染的冬虫夏草菌的种子瓶进行并瓶扩大培养，最后利用发酵罐进行连续培养；培养8天后，取样检测腺苷、虫草素、多糖和菌丝量，各项指标不低于国家标准，镜检无微生物污染，收菌；干燥后可用于产品原料；
(7)冬虫夏草多余子实体的保存：同步骤(1)-(2)的方法处理子实体，用灭菌后滤纸吸干子实体水分后，一部分置于无菌水中，用于两个月后的发酵，另一部分置于液态石蜡中，用于半年后发酵。
制备的菌丝体腺苷含量为0.019％，可以用于蝙蝠蛾幼虫侵染。
实施例3
一种由天然冬虫夏草子实体发酵菌丝的方法，按照如下步骤进行：
(1)采集新鲜野生虫草子实体，在3℃条件下运送到实验室，选择子实体粗壮的即将喷发孢子的虫草，用塑胶膜包裹地下部分，用8℃的低温水从包裹处沿子实体冲洗过夜；
(2)在超净工作台上切下水冲洗部分，置于有酒精的培养皿中，浸泡1min，然后用无菌水冲洗；
(3)将消毒处理好的子实体置于灭菌后的平板里，平板里放一张滤纸，待滤纸吸干子实体水分后，用解剖刀切开子实体，用镊子夹取子实体中间菌丝，夹出含有子囊果的有性菌丝，置于另一干净培养皿中；
(4)将菌丝切成小段，装在有培养基的种子瓶中，每个种子瓶1个子实体的菌丝段，用均质机将种子瓶中菌丝段打碎，置于恒温摇床上在150r/min，18℃条件下培养12天；
(5)培养至第7天时，进行常规菌落检验，并进行分子检验，确定是否为冬虫夏草菌；
(6)将没有污染的冬虫夏草菌的种子瓶进行并瓶扩大培养，最后利用发酵罐进行连续培养；培养6天后，取样检测腺苷、虫草素、多糖和菌丝量，各项指标不低于国家标准，镜检无微生物污染，收菌；干燥后可用于产品原料；
进行发酵罐连续培养时，向发酵罐中加入小蓟提取物，加入量为发酵罐内培养基质量的2％，所述小蓟提取物的提取方法为：将小蓟晒干，磨成粉末，加5-7倍重量份数的70％乙醇水溶液渗漉提取，收集渗漉液，减压回收乙醇，浓缩至原混合液体积的1/20-1/10，2000r/min离心1-3min，沉淀并经氯仿脱脂，制成；
(7)冬虫夏草多余子实体的保存：同步骤(1)-(2)的方法处理子实体，用灭菌后滤纸吸干子实体水分后，一部分置于无菌水中，用于两个月后的发酵，另一部分置于液态石蜡中，用于半年后发酵。
制备的菌丝体腺苷含量为0.030％，可以用于蝙蝠蛾幼虫侵染。
实施例4
一种由天然冬虫夏草子实体发酵菌丝的方法，按照如下步骤进行：
(1)采集新鲜野生虫草子实体，在3℃条件下运送到实验室，选择子实体粗壮的即将喷发孢子的虫草，用塑胶膜包裹地下部分，用8℃的低温水从包裹处沿子实体冲洗过夜；
(2)在超净工作台上切下水冲洗部分，置于有酒精的培养皿中，浸泡1min，然后用无菌水冲洗；
(3)将消毒处理好的子实体置于灭菌后的平板里，平板里放一张滤纸，待滤纸吸干子实体水分后，用解剖刀切开子实体，用镊子夹取子实体中间菌丝，夹出含有子囊果的有性菌丝，置于另一干净培养皿中；
(4)将菌丝切成小段，装在有培养基的种子瓶中，每个种子瓶1个子实体的菌丝段，用均质机将种子瓶中菌丝段打碎，置于恒温摇床上在150r/min，18℃条件下培养12天；
(5)培养至第7天时，进行常规菌落检验，并进行分子检验，确定是否为冬虫夏草菌；
(6)将没有污染的冬虫夏草菌的种子瓶进行并瓶扩大培养，最后利用发酵罐进行连续培养；培养6天后，取样检测腺苷、虫草素、多糖和菌丝量，各项指标不低于国家标准，镜检无微生物污染，收菌；干燥后可用于产品原料；
行发酵罐连续培养时，向发酵罐中加入马唐提取物，加入量为发酵罐内培养基质量的2％，所述马唐提取物的提取方法为：将马唐晒干，磨成粉末，加5-7倍重量份数的70％乙醇水溶液回流提取3次，合并滤液，蒸干制成；
(7)冬虫夏草多余子实体的保存：同步骤(1)-(2)的方法处理子实体，用灭菌后滤纸吸干子实体水分后，一部分置于无菌水中，用于两个月后的发酵，另一部分置于液态石蜡中，用于半年后发酵。
制备的菌丝体腺苷含量为0.029％，可以用于蝙蝠蛾幼虫侵染。
实施例5
一种由天然冬虫夏草子实体发酵菌丝的方法，按照如下步骤进行：
(1)采集新鲜野生虫草子实体，在3℃条件下运送到实验室，选择子实体粗壮的即将喷发孢子的虫草，用塑胶膜包裹地下部分，用8℃的低温水从包裹处沿子实体冲洗过夜；
(2)在超净工作台上切下水冲洗部分，置于有酒精的培养皿中，浸泡1min，然后用无菌水冲洗；
(3)将消毒处理好的子实体置于灭菌后的平板里，平板里放一张滤纸，待滤纸吸干子实体水分后，用解剖刀切开子实体，用镊子夹取子实体中间菌丝，夹出含有子囊果的有性菌丝，置于另一干净培养皿中；
(4)将菌丝切成小段，装在有培养基的种子瓶中，每个种子瓶1个子实体的菌丝段，用均质机将种子瓶中菌丝段打碎，置于恒温摇床上在150r/min，18℃条件下培养12天；
(5)培养至第7天时，进行常规菌落检验，并进行分子检验，确定是否为冬虫夏草菌；
(6)将没有污染的冬虫夏草菌的种子瓶进行并瓶扩大培养，最后利用发酵罐进行连续培养；培养6天后，取样检测腺苷、虫草素、多糖和菌丝量，各项指标不低于国家标准，镜检无微生物污染，收菌；干燥后可用于产品原料；
进行发酵罐连续培养时，向发酵罐中加入马唐提取物，加入量为发酵罐内培养基质量的1％，所述马唐提取物的提取方法为：将马唐晒干，磨成粉末，加5-7倍重量份数的70％乙醇水溶液回流提取3次，合并滤液，蒸干制成；
进行发酵罐连续培养时，还向发酵罐中加入小蓟提取物，加入量为发酵罐内培养基质量的1％，所述小蓟提取物的提取方法为：将小蓟晒干，磨成粉末，加5-7倍重量份数的70％乙醇水溶液渗漉提取，收集渗漉液，减压回收乙醇，浓缩至原混合液体积的1/20-1/10，2000r/min离心1-3min，沉淀并经氯仿脱脂，制成；
(7)冬虫夏草多余子实体的保存：同步骤(1)-(2)的方法处理子实体，用灭菌后滤纸吸干子实体水分后，一部分置于无菌水中，用于两个月后的发酵，另一部分置于液态石蜡中，用于半年后发酵。
制备的菌丝体腺苷含量为0.035％，可以用于蝙蝠蛾幼虫侵染。
Claims (4)
1.一种由天然冬虫夏草子实体发酵菌丝的方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)采集新鲜野生虫草子实体，在0-4℃条件下运送到实验室，选择子实体粗壮的即将喷发孢子的虫草，用塑胶膜包裹地下部分，用6-18℃的低温水从包裹处沿子实体冲洗过夜；
(2)在超净工作台上切下水冲洗部分，置于有酒精的培养皿中，浸泡0.5-2min，然后用无菌水冲洗；
(3)将消毒处理好的子实体置于灭菌后的平板里，平板里放一张滤纸，待滤纸吸干子实体水分后，用解剖刀切开子实体，用镊子夹取子实体中间菌丝，夹出含有子囊果的有性菌丝，置于另一干净培养皿中；
(4)将菌丝切成小段，装在有培养基的种子瓶中，每个种子瓶1个子实体的菌丝段，用均质机将种子瓶中菌丝段打碎，置于恒温摇床上在100-200r/min，16-20℃条件下培养10-14天；
(5)培养至第6-8天时，进行常规菌落检验，并进行分子检验，确定是否为冬虫夏草菌；
(6)将没有污染的冬虫夏草菌的种子瓶进行并瓶扩大培养，最后利用发酵罐进行连续培养；培养5-8天后，取样检测腺苷、虫草素、多糖和菌丝量，各项指标不低于国家标准，镜检无微生物污染，收菌；干燥后可用于产品原料；
(7)冬虫夏草多余子实体的保存：同步骤(1)-(2)的方法处理子实体，用灭菌后滤纸吸干子实体水分后，一部分置于无菌水中，用于两个月后的发酵，另一部分置于液态石蜡中，用于半年后发酵。
2.根据权利要求1所述一种由天然冬虫夏草子实体发酵菌丝的方法，其特征在于，制备的所述发酵菌丝活性高，可用于侵染。
3.根据权利要求1所述一种由天然冬虫夏草子实体发酵菌丝的方法，其特征在于，步骤(6)中进行发酵罐连续培养时，向发酵罐中加入小蓟提取物，所述小蓟提取物的提取方法为：将小蓟晒干，磨成粉末，加5-7倍重量份数的70％乙醇水溶液渗漉提取，收集渗漉液，减压回收乙醇，浓缩至原混合液体积的1/20-1/10，2000r/min离心1-3min，沉淀并经氯仿脱脂，制成。
4.根据权利要求1所述一种由天然冬虫夏草子实体发酵菌丝的方法，其特征在于，步骤(6)中进行发酵罐连续培养时，向发酵罐中加入马唐提取物，所述马唐提取物的提取方法为：将马唐晒干，磨成粉末，加5-7倍重量份数的70％乙醇水溶液回流提取3次，合并滤液，蒸干制成。
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