CN1766083A - 冬虫夏草菌的一种仿生学培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及冬虫夏草菌丝体的一种仿生学培养方法。培养过程包括，单孢子分离及纯培养，液体培养基的配置，菌丝体纯培养菌种的接种，浅层液体静置培养，六个月后收获菌丝体。培养过程中每一个月用机械的方法将菌丝体打碎成单细胞或多细胞菌丝段。本发明的单孢子分离方法得到的纯培养，证明是冬虫夏草菌唯一的无菌型－中国被毛孢。本发明的培养方法，不需要发酵罐、摇床等昂贵设备的投入，极大的降低了成本。与深层液体发酵培养相比，1g干菌丝体的生产成本降低50％以上。

Description

冬虫夏草菌的一种仿生学培养方法

技术领域

本发明涉及冬虫夏草菌的一种仿生学培养方法，属于生物领域的微生物培养方法。

背景技术

冬虫夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.，属子囊菌纲、肉座菌目、麦角菌科、虫草属，别名虫草，是寄生于磷翅目蝙蝠蛾Hepialus spp.幼虫的一种虫生真菌，也是一种名贵的药用真菌。我国古代民间就对冬虫夏草的药用价值有一定的认识。虫草味甘性平，可保肺肾、补精髓、化痰止咳，对治疗肺结核、老人畏寒、咳嗽、衰弱、产妇和老人贫血虚弱、遗精、阳痿、自汗盗汗、腰膝酸痛、神经衰弱、病后久弱、咯血吐血、慢性肾炎等有很好的效果，常食用可调节免疫功能，增强人体免疫力。正是由于冬虫夏草有如此诸多的药用功能和渊源的药用历史，近年来这一野生资源濒临枯竭，使得科研者和开发商都非常关注冬虫夏草的代用资源的研究。

有三种途径可以部分地解决此问题：一是人工栽培子实体，我国花了很大的人力物力，虽已经掌握了人工栽培的基本技术，但至今仍无法商业化生产；二是利用分子生物技术克隆编码这些功能物的基因，在其他生物体内表达这些功能物，但目前对冬虫夏草的大部分功能的物质基础尚未研究清楚，基因克隆也就无从谈起；三是利用无性型菌株进行菌丝体发酵培养，再从菌丝体中提取功能组分，这也许是目前较为现实和简捷的一条开发途径(莫明和等，菌物系统20(4)：482-485，2001)。

冬虫夏草无性型的研究很为活跃，在世界范围内报道的冬虫夏草无性型有10余种，分属于10个属。可以想象冬虫夏草不可能有如此之多的无性型，而且分属于不同的属。尹定华等(中国中药杂志，1995，20(12)：707-710)认为，冬虫夏草的无性阶段系一新种，定名为中国被毛孢H.sinensis。刘作易等(贵州农业科学，2003，31(1)：3-5)也证明了中国被毛孢是冬虫夏草的真正无性型，其他从冬虫夏草上分离的与冬虫夏草有相同或相似化学成分、药理作用和临床疗效的菌株，可作为冬虫夏草的代用品。赵锦等采用分子生物学手段，从基因水平对冬虫夏草的无性阶段进行分子鉴定，进一步证明其无性阶段是中国被毛孢，并且认为之所以会重复分离出某些杂菌，可能是因为C.sinensis在自然界中主要分布于喜玛拉雅山脉附近海拔3000-5000m的高山草地上或较为寒冷的北方地区，分离者按一般的习惯将分离物放在较高温的地方培养，造成C.sinensis菌丝死亡，而培养出那些经常与C.sinensis长在一起的真菌种类，并被误认为是C.sinensis的无性型。

因此，得到冬虫夏草菌的真正无性型——中国被毛孢的无菌纯培养是对其进行人工培养的第一步。通常有三种分离途径，即通过新鲜虫草僵虫组织、子实体及子囊孢子进行分离，其中以单孢子分离最为可靠。由于冬虫夏草生长环境的影响，对采集标本的整体灭菌很难得到其无菌培养物，而对子实体中刚刚弹射出的子囊孢子的分离，其成功率远高于将标本表面消毒后的分离。(莫明和等，菌物系统20(4)：482-485)。在已经证明所分离菌确为中国被毛孢的分离方法中，(莫明和等，菌物系统20(4)：482-485)(刘锡琎等，真菌学报，8(1)：35-40，1989)，仅刘锡琎等的方法是以单孢子进行分离的。其方法是取含子囊孢子待放的子座进行灭菌，在无菌条件下将整个子座的两端使悬于培养皿盖上，然后将此盖盖于盛有培养基的培养皿上，或将子座用细线栓其柄部悬吊于胨PDA斜面试管内。在子囊孢子弹射之后，经镜检，挑取萌发的子囊孢子得到纯培养。但其分离程序存在着烦琐的缺点。

对中国被毛孢菌丝体进行人工发酵培养并采用其发酵物代替野生冬虫夏草，国内有30多个单位的科学工作者在进行研究，已取得较为理想的结果。所用方法均为深层液体发酵培养，一般用发酵罐搅拌供氧及摇床供氧的方式进行培养来提高产量(郭宏春等，微生物学杂志，2003，1，23(1)，50-54)。张显耻、何道珍探索出发酵工艺为：原种-摇床培养-一级培养-二级培养-三级培养-四级培养-菌液分离-干燥。(张显耻等，药物分析杂志，1999，7(5)：5-6)。由于中华被毛孢生长环境海拔高，温度低，具有嗜低温、生长极慢的特点，并且生长过程需要氧气。用发酵罐、摇床等设备培养周期长，耗能很大，而且发酵罐、摇床等设备本身投入的造价也很高，因此，用此方法生产出的产品价格昂贵，市场难以接受。很难用于工业化的大规模生产。

发明内容

本发明的目的是用低投入、高产出的方法培养冬虫夏草菌丝体，使生产的产品价格便宜，能够为市场所接受。

本发明的培养方法，是以冬虫夏草菌的菌丝段细胞或组织进行液体静置培养。

本发明通过冬虫夏草菌的菌丝段细胞或组织进行液体静置培养，极大的提高了菌丝段生物量的增长速度，大幅度降低了生产成本，使其更利于大规摸生产。

本发明的培养过程包括以下步骤：培养基配置，菌丝段的接种(接种量为培养基体积百分比的5％-30％)，菌丝段的收获，培养过程中温度为10-20℃，压力为常压，光强为室内自然光。

本发明所用的菌丝段细胞或组织是由无菌的单个子囊孢子萌发所形成的。

本发明的单孢子分离步骤为：

(一)虫草菌种的采集

采挖子实体粗壮饱满、可妊部发育明显的冬虫夏草完整菌虫复合体，放入13-16℃培养箱中养护，保持合适的湿度，以手轻捏泥土后不结块为宜。

(二)子囊孢子的收集和萌发

清除子实体表面杂质，用无菌蒸馏水冲洗，用75％的酒精进行表面消毒，置13-16℃培养箱内培养，待子囊开始弹射子囊孢子时，将开始弹射孢子的子实体伸入灭菌的生理盐水中，充分洗脱子囊孢子，将洗脱的子囊孢子放在13-16℃培养箱中3-5天，以便萌发。

(三)接种针的制备

将最小号缝衣针针尖磨钝，再将头部两边尽量磨薄，形成小铲状，然后套入普通接种棒中固定。

(四)单孢子分离和纯培养

在无菌操作下，将含有子囊孢子的液体摇匀，倒少量于灭菌的分离培养基平板中，静置5-10min，待水被吸入琼脂后，在低倍显微镜下用(三)制备的接种针挑取单个发芽的子囊孢子，接入灭菌的分离培养基平板中，每个平板均匀接入6-8个，将接种部位作好标记，放入13-16℃培养箱中培养2-4天，用消毒手术刀挖取未污染的带有子囊孢子的培养基放入新的分离培养基平板中，每平板一株，用胶带封口防止水分散失，放入13-16℃培养箱中培养，45-55天左右形成肉眼可见的菌落。

本发明单孢子分离时所用的分离培养基为：8-12g/L蛋白胨、14-23g/L葡萄糖、13-16g/L琼脂、180-230g去皮土豆煎水汁/L、pH6。

参照陈月琴等报道的鉴定方法，(Biochemical Systematics and Ecology，2001，29，597-607)，证明由此分离方法分离得到的冬虫夏草菌株是中国被毛孢。

本发明中国被毛孢菌丝体的液体静置培养方法是指液体深度为1-5cm的浅层液体静置培养。

本发明采用的浅层液体静置培养的培养基是适合中国被毛孢生长的培养基。

本发明采用的适合中国被毛孢生长的培养基是大豆粉4-7g/L、蛋白胨2-5g/L、葡萄糖90-120g/L、酵母膏0.2-0.6g/L、K₂HPO₄0.7-1.1g/L、MgSO₄0.3-0.8g/L，pH6，培养温度是10-20℃，压力为常压，光强为室内自然光。

本发明菌丝段细胞或组织每培养一段时间在无菌条件下用机械的方法捣碎一次。

本发明所述的一段时间是指一个月。

本发明菌丝段细胞或组织机械捣碎的程度是单细胞或多细胞菌丝段。

本发明的培养方法包括以下步骤：单孢子分离及纯培养，培养基配置，菌丝体纯培养菌种的接种，每培养一个月在无菌条件下用机械的方法将菌丝体打碎成单细胞或多细胞菌丝段，培养六个月后收获，培养过程中温度为15-18℃，压力为常压，光强为室内自然光。

本发明的优点在于：

1.冬虫夏草菌具有两型现象，寄生在幼虫体内时呈酵母型，虫菌体是以出芽或断裂的方式进行增殖。(李泉森等，冬虫夏草菌世代交替的初步研究，中国中药杂志1998，23(4)，210-212)。其丝状真菌每个细胞都有分化成同样菌株的生物学特点。寄主死后腐生时呈菌丝型，以正常的菌丝形态生长。由于丝状真菌的生长只能通过顶端延长的方式进行，不能象其在幼虫体内的菌丝段是通过分生组织的分裂而形成，生长速度相对较慢。如果在菌丝体的体外培养中模仿虫菌体寄生幼虫体内的增殖方式，人工促使中国被毛孢菌丝型向酵母型转变，以增加菌株数和生长点，将会大幅度提高生长极慢的中国被毛孢的生长速度。本发明在菌丝段液体静置培养中，采用仿生学的方法，每培养一段时间通过人工的方法将菌丝打碎成小片段，甚至单细胞，以充分增加菌株数和生长点，提高了菌丝段的生长速度，使菌丝产量大大提高。本工艺对普通真菌--生长速度快的真菌的培养价值不大，但对冬虫夏草这类生长极慢的真菌来说，效果极为显著。单纯从生产量来讲，用摇床100ml液体培养基培养一个月可得2克左右干菌丝体，按本发明方法，100ml液体培养基可得5.7克干菌丝体。

2.本发明通过冬虫夏草菌的单孢子对其进行分离，所得到的纯培养最为可靠。分离方法的步骤简单，摆脱了污染率高，筛选过程烦琐、周期长的困境。通过本发明的分离方法分离得到的冬虫夏草菌株已经证明是其唯一的无性型--中国被毛孢。

3.本发明液体薄层培养的液体深度不超过5cm，因此可以自然给氧，获氧较充足，不需动力搅拌，不需要发酵罐、摇床等昂贵设备的投入。同时培养基的用量相对较少。在培养的六个月中，只接种一次，省去了发酵罐培养的反复接种、放大培养的人力，减少了污染的机会。极大的降低了成本。只需定做无毒、耐高温的薄层塑料容器或玻璃容器及常用的高压灭菌设备、投资10余万元即可进行生产，经济效益极为显著。

具体实施方式

在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。

实施例一

将无菌的冬虫夏草菌丝体按15％的体积百分比接种于大豆粉6g/L、蛋白胨4g/L、葡萄糖100g/L、酵母膏0.4g/L、K₂HPO₄ 0.8g/L、MgSO₄0.4g/L，pH6的无菌液体培养基中，静置于培养架上，培养温度为18℃，压力为常压，光强为室内自然光。

六个月后收获菌丝体。

实施例二

培养程序均按实施例一进行，所不同之处在于培养期间每个月将培养容器放在磁力搅拌器上搅拌0.5小时(摄氏18℃)，使菌丝体打碎。

实施例三

1.冬虫夏草菌中国被毛孢的分离

(一)采集虫草菌种

2002年7月在四川康定由当地药农帮助从雅家埂采挖多株子实体粗壮饱满、可妊部发育明显的冬虫夏草完整菌虫复合体，放入15℃培养箱中养护，特别注意保持合适的湿度，泥土以手轻捏后不结块为宜。

(二)子囊孢子的收集和萌发

清除子实体表面杂质，用无菌蒸馏水冲洗，用75％的酒精进行表面消毒，置15℃培养箱内培养，每天记录观察。待子囊开始弹射子囊孢子时，将开始弹射孢子的子实体伸入盛有灭菌生理盐水的青霉素小瓶中，充分洗脱子囊孢子，将洗脱的子囊孢子放在15℃培养箱中4天，以便萌发。

(三)接种针的制备

用磨刀石将最小号缝衣针针尖磨钝，再将头部两边尽量磨薄，形成小铲状，然后套入普通接种针中固定。

(四)单孢子分离和纯培养

将低倍显微镜放入超净工作台内紫外照射1小时，无菌操作将(二)处理的青霉素小瓶摇匀，倒少量于灭菌的分离培养基(11g/L蛋白胨、22g/L葡萄糖、14g/L琼脂、190g去皮土豆煎水汁/L、pH6)平板中，静置8min，待水被吸入琼脂后，在低倍显微镜下用(三)制备的接种针挑取单个发芽的子囊孢子，接入灭菌的分离培养基平板中，每个平板均匀接入6个，将接种部位作好标记，放入15℃培养箱中培养3天，用消毒手术刀挖取未污染的带有子囊孢子的培养基放入新的分离培养基平板中，每平板一株，用胶带封口防止水分散失，放入15℃培养箱中培养，镜下观察生长状况。50天形成肉眼可见的菌落，90天左右形成的菌落直径可达1.5-2.5cm，菌落由致密的菌丝体组成，坚硬；菌落表面不平，象蚯蚓粪状；菌落周围有一圈该菌分泌的棕褐色物质，背面也呈棕褐色。菌丝半透明状，不易挑取。后期菌丝深入培养基中，将培养基吸收，形成中空的突起，培养5个月，气生菌丝发达。

2.菌丝大规模培养的培养基的制备

大豆粉6g/L、蛋白胨4g/L、葡萄糖105g/L、酵母膏0.5g/L、K₂HPO₄ 0.9g/L、MgSO₄ 0.7g/L，pH6，115℃高压30min。

3.中国被毛孢的浅层液体静置培养

将上述纯化的菌种剔除琼脂部分，在无菌条件下研磨成单细胞或多细胞菌丝段(肉眼可见为段棒状)，加适量灭菌水，按5％的体积百分比接种到培养容器中冷却到18℃以下的培养液中，培养液深度为4cm，18℃下静置培养，光强为室内自然光，培养期间，每个月无菌操作取出培养器皿中的菌丝体置于灭菌的匀浆机中匀浆两分钟，再将混合物重新放会原培养器皿中，6个月收获。

实施例四

培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于在无菌操作下将待接种的冬虫夏草菌丝和灭菌的磁力棒放入培养容器中，封好口后，放在磁力搅拌器上，18℃搅拌10小时，将菌丝搅成单细胞或多细胞菌丝段(肉眼可见为段棒状)，接种到培养容器中冷却到18℃以下的培养液中，培养液深度为4cm，18℃下静置培养，光强为室内自然光，培养期间每个月将培养容器放在磁力搅拌器上搅拌0.5-1小时(摄氏18度)，六个月收获菌丝体。

实施例五

培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于

单孢子分离培养基为：9g/L蛋白胨、18g/L葡萄糖、15g/L琼脂、230g去皮土豆煎水汁/L、pH6。

菌丝体大规摸培养的液体培养基为：大豆粉4g/L、蛋白胨3g/L、葡萄糖90g/L、酵母膏0.2g/L、K₂HPO₄ 0.7g/L、MgSO₄ 0.4g/L，pH6，培养温度是17℃，

实施例六

培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于

单孢子分离培养基为：10g/L蛋白胨、14g/L葡萄糖、16g/L琼脂、180g去皮土豆煎水汁/L、pH6。

菌丝体大规摸培养的液体培养基为：大豆粉5g/L、蛋白胨4g/L、葡萄糖120g/L、酵母膏0.3g/L、K₂HPO₄ 0.9g/L、MgSO₄ 0.3g/L，pH6，培养温度是16℃，

实施例七

培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于

单孢子分离培养基为：11g/L蛋白胨、16g/L葡萄糖、15g/L琼脂、220g去皮土豆煎水汁/L、pH6。

菌丝体大规摸培养的液体培养基为：大豆粉7g/L、蛋白胨2g/L、葡萄糖100g/L、酵母膏0.6g/L、K₂HPO₄ 1.1g/L、MgSO₄ 0.7g/L，pH6，培养温度是18℃。

Claims (13)

1.一种冬虫夏草菌的仿生学培养方法，其特征在于以所述菌的菌丝段细胞或组织进行液体静置培养。

2.按照权利要求1所述的培养方法，其特征在于培养过程包括以下步骤：培养基配置，菌丝段的接种，菌丝段的收获，培养过程中温度为10-20℃，压力为常压，光强为室内自然光。

3.按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述的菌丝段细胞或组织是由无菌的单个子囊孢子萌发所形成的。

4.按照权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述的单孢子分离步骤为：

(一)采集虫草菌种

采挖子实体粗壮饱满、可妊部发育明显的冬虫夏草完整菌虫复合体，

放入13-16℃培养箱中养护，保持合适的湿度，

(二)子囊孢子的收集和萌发

清除子实体表面杂质，用无菌蒸馏水冲洗，用75％的酒精进行表面消毒，置13-16℃培养箱内培养，待子囊开始弹射子囊孢子时，将开始弹射孢子的子实体伸入灭菌的生理盐水中，充分洗脱子囊孢子，将洗脱的子囊孢子放在13-16℃培养箱中3-5天，以便萌发，

(三)接种针的制备

用磨刀石将最小号缝衣针针尖磨钝，再将头部两边尽量磨薄，形成小铲状，然后套入普通接种棒中固定，

(四)单孢子分离和纯培养

在无菌操作下，将含有子囊孢子的液体摇匀，倒少量于灭菌的分离培养基平板中，静置5-10min，待水被吸入琼脂后，在低倍显微镜下用(三)制备的接种针挑取单个发芽的子囊孢子，接入灭菌的分离培养基平板中，每个平板均匀接入6-8个，将接种部位作好标记，放入13-16℃培养箱中培养2-4天，用消毒手术刀挖取未污染的带有子囊孢子的培养基放入新的分离培养基平板中，每平板一株，用胶带封口防止水分散失，放入13-16℃培养箱中培养，45-55天形成肉眼可见的菌落。

5.按照权利要求4所述的培养方法，其特征在于分离培养基为：8-12g/L蛋白胨、14-23g/L葡萄糖、13-16g/L琼脂、180-230g去皮土豆煎水汁/L、pH6。

6.按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述的冬虫夏草菌是中国被毛孢。

7.按照权利要求6所述的培养方法，其特征在于所述液体静置培养是指液体深度为1-5cm的浅层液体静置培养。

8.按照权利要求7所述的培养方法，其特征在于所述浅层液体静置培养的培养基是适合中国被毛孢生长的培养基。

9.按照权利要求8所述的培养方法，其特征在于所述适合中国被毛孢生长的培养基是大豆粉4-7g/L、蛋白胨2-5g/L、葡萄糖90-120g/L、酵母膏0.2-0.6g/L、K₂HPO₄0.7-1.1g/L、MgSO₄0.3-0.8g/L，pH6，培养温度是10-20℃，压力为常压，光强为室内自然光。

10.按照权利要求9所述的培养方法，其特征在于所述的菌丝段细胞或组织每培养一段时间在无菌条件下用机械的方法捣碎一次。

11.按照权利要求10所述的培养方法，其特征在于所述的一段时间是指一个月。

12.按照权利要求11所述的培养方法，其特征在于所述菌丝段细胞或组织机械捣碎的程度是单细胞或多细胞菌丝段。

13.按照权利要求12所述的培养方法，其特征在于所述的培养方法包括以下步骤：单孢子分离及纯培养，培养基配置，菌丝体纯培养菌种的接种，每培养一个月在无菌条件下用机械的方法将菌丝体打碎成单细胞或多细胞菌丝段，培养六个月后收获，培养过程中温度为15-18℃，压力为常压，光强为室内自然光。