CN104381011A - 一种冬虫夏草菌种材料的制备及侵染钩蝠蛾幼虫的方法 - Google Patents
一种冬虫夏草菌种材料的制备及侵染钩蝠蛾幼虫的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种冬虫夏草菌种材料的制备及侵染钩蝠蛾幼虫的方法。该方法利用冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢与植物组织形成共生体生活史的原理，将制备的冬虫夏草菌源接种到植物组织上，通过营造适宜条件促进中国被毛孢与植物组织共生，从而激活中国被毛孢对其寄主钩蝠蛾幼虫的侵染活性，被激活后的冬虫夏草菌中国被毛孢与植物组织形成的“菌物-植物共生体”作为对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的菌种材料，通过将制备的菌种材料直接作为饲料喂食钩蝠蛾幼虫的方式进行侵染，其侵染率可达85.6～98.9％。
Description
技术领域
本发明涉及一种冬虫夏草菌种材料的制备及其用于侵染钩蝠蛾幼虫的方法
背景技术
冬虫夏草Ophiocordyceps sinensis(Berk.)Sung，Sung，Hywel-Jones&Spatafora是一种虫生子囊真菌，寄生于鳞翅目Lepidoptera钩蝠蛾科Hepialidae钩蝠蛾属Thitarodes昆虫的幼虫，其无性型为中国被毛孢Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu&Zeng。冬虫夏草寄主钩蝠蛾属Thitarodes昆虫的一个世代包括卵、幼虫、蛹和成虫四个发育阶段，幼虫营地下隧道式穴居生活，杂食性，喜食圆穗蓼、头花蓼、小大黄和珠芽蓼等高寒植物的幼嫩根茎，饲养时也可用胡萝卜等常见肉质地下茎植物作为替代食料。
冬虫夏草分布于青藏高原高海拔区域，其生长范围局限，产量也极为有限。它是青藏高原特色名贵滋补中药材，具有重要的药用和经济价值。由于冬虫夏草的形成过程中仍有许多关键问题尚不清楚，中国被毛孢侵染钩蝠蛾昆虫的侵染活性较弱，原生态冬虫夏草道地药材的产业化迄今仍存在许多障碍难题。
目前采用中国被毛孢侵染寄主钩蝠蛾昆虫幼虫仍存在侵染率低、耗费时间长等问题。中国发明专利申请(公开号：CN102696555A)公开了一种半野生人工培殖冬虫夏草的方法，中国发明专利申请(公开号：CN102405763A)公开了一种冬虫夏草的培育方法，中国发明专利申请(授权号：CN100587057C)公开了一种冬虫夏草的生产方法，中国发明专利申请(授权号：CN100434508C)公开了一种提高青藏高原冬虫夏草产量的方法，上述4个专利申请均直接采用含有中国被毛孢的菌液或子囊孢子液向寄主幼虫体表喷洒的方法进行接种侵染；中国发明专利申请(公开号：CN102696392A)公开了天然冬虫夏草的增产方法，其中采用诱集液诱集蝙钩蝠蛾幼虫后，向幼虫喷洒蝙钩蝠蛾被毛孢和蝙钩蝠蛾拟青霉两种菌种液体种；中国发明专利申请(公开号：CN102106235A)公开了一种全人工培养冬虫夏草的方法，其中采用一端直径小于0.2mm的不锈钢实心针或空心针的针状器具，沾取中国被毛孢菌体和孢子混悬液刺伤寄主幼虫的方法进行接种侵染；中国发明专利申请(公开号：CN102792855A)公开了一种用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料及寄主感染方法，采用冬虫夏草菌皮作为菌种材料灌注、或拌入饲料喂食、或注射、或喷淋侵染寄主幼虫。但上述方法存在侵染活性低、或损伤后存活率低、或耗费时间过长、或菌种材料产量有限等问题，是制约原生态冬虫夏草道地药材产业化的关键问题之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料的制备方法，以及该冬虫夏草菌种材料用于侵染钩蝠蛾幼虫的方法。
发明人研究发现冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢在自然界中与其适生地中的多种高寒植物的根、茎、叶等组织存在共生现象。进一步的研究发现，经高寒植物组织根、茎、叶等组织共生，共生后要比未共生的冬虫夏草菌的侵染活性高数十至数百倍，基于这一原理发明本方法。该方法利用冬虫夏草菌无性阶段中国被毛孢与植物组织形成共生体生活史的原理，采用冬虫夏草菌源与植物共生培育的方法，激活冬虫夏草菌对其寄主钩蝠蛾幼虫的侵染活性，从而获得具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料。
本发明的具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料的制备方法是：首先将冬虫夏草菌源接种到植物组织上，通过冬虫夏草菌源与植物共生培育的方法，使冬虫夏草菌无性菌丝中国被毛孢与共培育的植物组织相互作用发生共生关系，形成菌物-植物共生体，将菌丝检测结果为中国被毛孢的菌物-植物共生体作为对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料。
本发明所采用的冬虫夏草菌源可以是通过常规分离、纯化、固液相发酵获得的中国被毛孢Hirsutella sinensis的发酵物，配制成发酵物与水质量比为1∶100～1∶1000的悬浮液作为冬虫夏草菌源；或者是将收集的冬虫夏草新鲜子囊孢子，用灭菌的生理盐水配制成每毫升含有100～1000个子囊孢子的悬浮液作为冬虫夏草菌源。
本发明采用的植物种类是可供冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫取食的植物种类，包括青藏高原高寒灌丛及高寒草甸中草本植物，如嵩草科、禾本科、蔷薇科、毛茛科、桔梗科、蓼科、毛茛科、玄参科、菊科、伞形科、十字花科、唇形科、龙胆科、报春花科、百合科、虎耳草科高寒植物；或者是常见的可食用块状根茎植物，包括马铃薯、胡萝卜、萝卜、菊芋、番薯中的一种或多种。可以是上述植物的根、茎、叶、花或果实组织；或者是离体组织培养获得的愈伤组织或胚状体或组培苗。
本发明所述的将冬虫夏草菌源接种到植物组织上的接种方法通常是按每株植物0.1～1ml冬虫夏草菌源喷淋接种到植物组织表面进行共生培育。共培育的条件通常为：气温2～19℃，空气湿度25～100％，空气流动速度不高于10.7米/秒，光照0～104lx，时间为7～30天。
本发明上述方法所制备的菌种材料用于侵染钩蝠蛾幼虫的方法是：将上述共生培育得到的冬虫夏草菌种材料直接作为饲料提供给钩蝠蛾幼虫取食，可以是将钩蝠蛾幼虫投置到已形成菌物-植物共生体的冬虫夏草菌源与植物共生培育区，或者是将所述的菌种材料切段投喂到钩蝠蛾幼虫饲养区，使寄主幼虫直接取食接触菌种材料，寄主幼虫直接取食接触菌种材料的时间为3～15天。
上述冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫是：符合钩蝠蛾属昆虫分类特征，栖息在青藏高原高寒生境的冬虫夏草寄主昆虫的1～9龄幼虫；或者是通过人工方法饲养繁育获得钩蝠蛾属昆虫的1～9龄幼虫。
本发明冬虫夏草菌种材料的制备及其用于侵染钩蝠蛾幼虫的方法的具体实施步骤通常包括：
1.从冬虫夏草适生地产区采集新鲜冬虫夏草或其子囊孢子，采用合适嗜低温菌物的工业微生物方法进行分离纯化，经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，通过常规低温发酵法在13±5℃条件下发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，并进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子按发酵物与水体积比1∶100～1∶1000稀释成的悬浮液作为冬虫夏草菌源，或直接采用洁净的冬虫夏草新鲜子囊孢子稀释制成每毫升含有100～1000个子囊孢子的悬浮液作为冬虫夏草菌源。
2.选择可供冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫取食的青藏高原高寒植物种类，或是常见的可食用块状根茎植物种类作为接种与冬虫夏草菌源共培育对象；所述用于接种的植物可以是生长在青藏高原原生态环境下的活体植物苗；亦可是通过人工干预方法种植的活体植物苗，如通过移栽或种子发芽培育种植的活体植物苗，或是通过常规离体组织培养获得的愈伤组织、胚状体和组培苗中的一种或多种。
3.将制备的冬虫夏草菌源按每株植物0.1～1ml喷淋接种到植物组织表面，通过选择适宜的天气时机或通过人工干预方法，营造气温2～19℃，空气湿度25～100％，空气流动风速低于10.7米/秒，光照0～104lx的适宜条件，促进接种的冬虫夏草菌无性菌丝中国被毛孢与共培育的植物组织相互作用发生共生关系。
4.冬虫夏草菌源与植物在适宜的环境下共生培育7～30天后，通过显微镜观察的方法检测植物组织上的中国被毛孢菌丝共生生长情况，当发现大量中国被毛孢菌丝缠绕在植物组织上形成共生体时，通过常规形态学及DNA测序分子鉴定的方法检测确认菌丝为中国被毛孢，将菌丝检测结果为中国被毛孢的“菌物-植物共生体”作为对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的菌种材料。
5.将上述获得的菌种材料直接作为饲料提供给钩蝠蛾属昆虫的幼虫取食，可以是将钩蝠蛾幼虫投置到上述“菌物-植物共生体”区(即已形成菌物-植物共生体的冬虫夏草菌源与植物共生培育区)；亦可是将上述菌种材料收割后切段(通常为5～20mm)投喂到钩蝠蛾幼虫饲养区，使寄主幼虫可直接取食接触菌种材料，通过钩蝠蛾幼虫的取食活动，促进钩蝠蛾幼虫充分接触菌种材料而被高效侵染；钩蝠蛾幼虫取食接触菌种材料的时间一般为3～15天。
6.按照本发明方法，在钩蝠蛾幼虫取食接触菌种材料3～15天后，通过虫菌体检验方法，用注射器抽取1μl钩蝠蛾幼虫的血淋巴，在显微镜下检查中国被毛孢虫菌体的情况，发现其中存在3个以上符合长棒针状形态特征中国被毛孢虫菌体，计算为一个侵染成功的个体。经统计，钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为85.6～98.9％。
本发明方法涉及的采用合适嗜低温菌物的工业微生物方法进行分离纯化所用的冬虫夏草菌种分离、纯化培养基可以是察氏培养基、或马铃薯培养基、或肉汤培养基、或酵母浸出粉胨葡萄糖培养基、或高氏一号培养基中的一种。
本发明涉及的冬虫夏草菌种发酵方法可以是固体发酵，或是液体发酵，或是固液双相发酵。所述固体发酵可以是大麦、小麦、大米、玉米等常规农作谷物中的一种或多种作为固体培养基。所述液体发酵可以是普通肉汤、或蛋白胨水、或酵母提取物等常规底料中的一种或多种作为液体培养基。所述固液双相发酵可采用深层发酵产生菌丝或芽生孢子后，在固体培养基上再继续发酵的方法，其培养基可以是上述固体发酵培养基和液体发酵培养基中的各一种。
本发明涉及的植物苗的获取方法可以是在青藏高原高寒生境原生态环境下通过常规园艺种植方法栽培种植活体高寒植物植物苗和可食用块状根茎植物苗；或是建造常规农业大棚移栽种植活体高寒植物植物苗和可食用块状根茎植物苗；或是建造全人工控制气候、温度、湿度、光照风速的全密封栽培室种植活体高寒植物植物苗和可食用块状根茎植物苗，或在栽培室内通过常规离体组织培养获得的高寒植物植物或可食用块状根茎植物的愈伤组织、胚状体和组培苗。
本发明所述的高寒植物可以是高寒草甸原有植被，亦可是将采集的高寒植物和/或种子移栽在培育园或培育大棚或栽培室内培育的植物；所述高寒植物的种类为嵩草科、禾本科、蔷薇科、毛茛科、桔梗科、蓼科、毛茛科、玄参科、菊科、伞形科、十字花科、唇形科、龙胆科、报春花科、百合科、虎耳草科高寒植物中的一种或多种，包括柔软点地梅(Androsace mollis)、东俄洛紫菀(Aster tongolensis)、川滇苔草(Carex schneideri)、膨囊苔草(C.lehmanii)、青绿苔草(C.breviculmis)、黑褐苔草(C.atrofusca)、一岁苔草(C.heterostachya)、萨嘎苔草(C.sagaensis)、舌叶垂头菊(Cremanthodium linguiatum)、裂叶蓝钟花(Cyananthus lobatus)、丽江蓝钟花(C.lichiangensis)、大萼蓝钟花(C.macrocalyx)、发草(Deschampsia caespitosa)、锡金柳叶菜(Epilobium sikkimense)、高山嵩草(Kobresia pygmaea)、大花嵩草(K.macrantha)、西藏嵩草(K.Schoenoides)、矮生嵩草(K.humilis)、线叶嵩草(K.capollifolia)、林芝橐吾(Ligularia nyingchiensis)、聂拉木厚棱芹(Pachypleurum nyalamense)、西藏厚棱芹(P.xizangense)、斑唇马先蒿(Pedicularis longifora)、昌都马先蒿(P.sherriffii)、草甸马先蒿(P.roylei)、西藏糙苏(Phlomis tibetica)、长果车前(Plantago asiatica)、细茎蓼(Polygonum filicaule)、叉枝蓼(P.tortuonum)、珠芽蓼(P.viviparum)、圆穗蓼(P.macrophyllum)、狭叶圆穗蓼(P.macrophyllum)、头花蓼(P.capitatum)、穆坪耳蕨(Polystichum moupinense)、楔叶委陵菜(Potentilla cuneata)、纤细委陵菜(P.gracillima)、多头委陵菜(P.multiceps)、大萼委陵菜(P.conferta)、多裂委陵菜(P.multifida)、西藏委陵菜(P.xizangensis)、杂色钟报春(Primula alpicola)、高原毛茛(Ranunculus tanguticus)、云生毛茛(R.nephelogens)、西藏大黄(Rheum tibeticum)、小大黄(R.pumilum)、尼泊尔酸模(Rumexnepalensis)、双齿风毛菊(Saussurea lavrenkoana)、禾叶风毛菊(S.graminea)、星状凤毛菊(S.stella)、卵叶风毛菊(S.ovatifolia)、钩柱唐松草(Thalictrum uncatum)、高山唐松草(T.alpinun)和长果婆婆娜(Veronica chayuensis)中的一种或多种。
本发明涉及的钩蝠蛾昆虫的种类可以是曲线钩蝠蛾T.fusconebulosa(De Geer，1778)(Hepialus)comb.n.、赭褐钩蝠蛾T.gallicus(Lederer，1852)(Hepialus)comb.n.、白线钩蝠蛾T.nubifer(Lederer，1853)(Hepialus)comb.n.、德氏钩蝠蛾T.davidi(Poujade，1886)(Hepialus)comb.n.、虫草钩蝠蛾Thitarodes armoricanus(Oberthür，1909)(Hepialus)、斜脉钩蝠蛾T.oblifurcus(Chu et Wang，1985)(Hepialus)、樟木钩蝠蛾T.zhangmoensis(Chu etWang，1985)(Hepialus)、康姬钩蝠蛾T.kangdingroides(Chu et Wang，1985)(Hepialus)、康定钩蝠蛾T.kangdingensis(Chu et Wang，1985)(Hepialus)、德钦钩蝠蛾T.deqingensis(Liang，1988)(Hepialus)、白马钩蝠蛾T.baimaensis(Liang，1988)(Hepialus)、梅里钩蝠蛾T.meiliensis(Liang，1988)(Hepialus)、贡嘎钩蝠蛾T.gonggaensis(Fu et Huang，1991)(Hepialus)、人支钩蝠蛾T.renzhiensis(Yang，1991)(Hepialus)、芒康钩蝠蛾T.markamensis(Yang et al.，1992)(Hepialus)、草地钩蝠蛾T.pratensis(Yang et al.，1992)(Hepialus)、锈色钩蝠蛾T.ferrugineus(Yang et al.，1993)(Hepialus)、金沙钩蝠蛾T.jinshaensis(Yang，1993)(Hepialus)、白纹钩蝠蛾T.albipictus(Yang，1993)(Hepialus)、甲郎钩蝠蛾T.jialangensis(Yang，1994)(Hepialus)、察里钩蝠蛾T.zaliensis(Yang，1994)(Hepialus)、中支钩蝠蛾T.zhongzhiensis(Liang，1995)(Hepialus)、叶日钩蝠蛾T.yeriensis(Liang，1995)(Hepialus)、美丽钩蝠蛾T.callinivalis(Liang，1995)(Hepialus)、里塘钩蝠蛾T.litangensis(Liang，1995)(Hepialus)、循化钩蝠蛾T.xunhuaensis(Yang et Yang，1995)(Hepialus)、白带钩蝠蛾T.cingulatus(Yang et Zhang，1995)(Hepialus)、巴青钩蝠蛾T.baqingensis(Yang et Jiang，1995)(Hepialus)、当雄钩蝠蛾T.damxungensis(Yang，1995)(Hepialus)、玉树钩蝠蛾T.yushuensis(Wang et al.，1995)(Hepialus)、宽兜钩蝠蛾T.latitegumenus(Shen et al.，1997)(Hepialus)comb.n.、双带钩蝠蛾T.bibelteus(Shen et al.，1997)(Hepialus)comb.n.、拉脊蝠蛾T.lagii(Yan，2001)(Hepialus)comb.n.、比如钩蝠蛾T.biruens(Fu，2002)(Hepialus)comb.n.、海南钩蝠蛾T.hainanensis(Chu et Wang，2004)(Hepialus)comb.n.、纳木钩蝠蛾T.namensis(Chu et al.，2004)(Hepialus)comb.n.、日喀则钩蝠蛾T.xigazeensis(Chu etal.，2004)(Hepialus)comb.n.、永胜钩蝠蛾T.yongshengensis(Chu et al.，2004)(Hepialus)comb.n.、定结钩蝠蛾T.dinggyeensis(Chu et al.，2004)(Hepialus)comb.n.、南木林钩蝠蛾T.nanmlinensis(Chu et al.，2004)(Hepialus)comb.n.、亚东钩蝠蛾T.yadongensis(Chu etal.，2004)(Hepialus)comb.n.、蒲氏钩蝠蛾T.pui(Zhang et al.，2007)(Hepialus)comb.n.、小金钩蝠蛾T.xiaojinensis(Tu et al.，2009)(Hepialus)comb.n.、色季拉钩蝠蛾T.sejilaensis(Zou et al.，2011)、加查钩蝠蛾T.jiachaensis(Zou et al.，2011)中的一种或多种。
具体实施方式
实施例一
1.从青海玉树地区的冬虫夏草主产区采集新鲜冬虫夏草，采用常规肉汤培养基分离纯化菌种，经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，进一步经通常普通肉汤液体培养基在13±5℃发酵15天，然后置于小麦为底物的固体培养基上再继续发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，并将发酵获得菌团用搅拌器均匀打碎，按发酵物重量与水体积比1∶1000进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子稀释搅匀成的悬浮液，将用孔径1.5mm的灭菌纱布粗滤去培养基颗粒物后，作为冬虫夏草菌源。
2.在青藏高原海拔4500米的铁路运输便利的地区，以20m×20m为一个单位建造自动化控制气候条件的高寒植物栽培室，栽培室内设置4层培养架用于放置植物苗培养瓶；栽培室内安装常规工业冷库用中央空调通风系统调节栽培室内空气温度；安装喷雾式管路与中央空调系统共同调节栽培室内空气湿度；培养架安装日光灯光照系统，对栽培植物提供光照；利用活性炭及微滤膜空气过滤系统，保持栽培室内无尘、清洁状态；栽培室内安装紫外灯，定期消毒，工作人员进入栽培室前，在更衣室更换消毒过的工作服、鞋、帽等。
3.在西藏那曲冬虫夏草主产区海拔4700米的高寒草甸采集细茎蓼(Polygonumfilicaule)、叉枝蓼(P.tortuonum)、珠芽蓼(P.viviparum)、圆穗蓼(P.macrophyllum)、狭叶圆穗蓼(P.macrophyllum)、头花蓼(P.capitatum)、西藏大黄(Rheum tibeticum)、小大黄(R.pumilum)高寒植物的嫩苗或种子，通过常规植物离体组织培养快速繁殖技术，在栽培室内用MS培养基及植物激素NAA(0.02mg/L)、IBA(0.4mg/L)、TDZ(0.2mg/L)和GA3(0.4mg/L)进行组织培养，获得上述高寒植物的愈伤组织、胚状体或组培苗作为冬虫夏草菌源的接种对象。
4.将制备的冬虫夏草菌源用灭菌的注射器按每株植物0.1ml喷淋接种到上述植物组织的培养瓶内，通过栽培室内的温湿度控制设备控制温度在2～17℃昼夜波动，空气湿度保持在65～90％，强度为20～100lx的散射光进行光照，栽培室内空气流动速度低于1.5米/秒，促进接种的冬虫夏草菌无性菌丝中国被毛孢与共培育的植物组织相互作用发生共生关系。
5.冬虫夏草菌源接种植物后共生培育7天，通过显微镜观察的方法检测植物组织上的中国被毛孢菌丝共生生长情况，通过常规形态学及DNA测序分子鉴定的方法检测确认菌丝为中国被毛孢，将菌丝检测结果为中国被毛孢的“菌物-植物组织共生体”作为侵染寄主钩蝠蛾幼虫的菌种材料。
6.将玉树钩蝠蛾(Thitarodes yushuensis)幼虫投置到高寒植物离体组织与冬虫夏草菌种形成共生体的培养瓶内，每瓶投置5～10头，使玉树钩蝠蛾幼虫取食并充分接触高侵染活性的共生体菌种材料。3天后将玉树钩蝠蛾幼虫从瓶中取出，通过虫菌体检验方法，用注射器抽取1μl玉树钩蝠蛾幼虫的血淋巴，在显微镜下检查中国被毛孢虫菌体的情况，发现其中存在3个以上符合长棒针状形态特征中国被毛孢虫菌体，计算为一个侵染成功的个体。经统计，玉树钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率为98.9％。
实施例二
1.从青海玉树地区冬虫夏草主产区采集新鲜冬虫夏草，采用常规察氏培养基分离纯化菌种，经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，经通常蛋白胨水液体培养基在18℃发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，并将发酵获得的菌球用搅拌器均匀打碎，最后按发酵液与水体积比1∶100进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子稀释搅匀成的悬浮液，作为冬虫夏草菌源。
2.在青藏高原海拔3800米的高山草甸区，选取地势排水较好的区域，用农用阳光板材料搭建顶棚及四周可控开关的大棚，将大棚范围内原有草甸植被除去并将土壤平整，在高寒草甸采集高山嵩草(Kobrasiapygmaea)、矮生嵩草(Kobrasia humilis)、苔草(Carex moorcroftii)、风毛菊(Saussurea superba)、圆穗蓼(Polygonum macrophytum)、叉枝蓼(Polygonum tortuonum)、珠芽蓼(Polygonum viviparum)、高山唐松草(Thactriunalpinun)、矮火绒草(Leontopodium alpinum)、委陵菜(Potentilla anserine)、火绒草(Leonlopodium)、斑唇马先蒿(Pedicularis longifora)、黑褐苔草(Carex atrofusca)植株或种子，移栽到大棚内培育获得的植物苗作为冬虫夏草菌源的接种对象。
3.将制备的冬虫夏草菌源按每株植物0.3ml喷淋接种到上述植物组织表面，通过人工或自动化控制大棚四周及顶部阳光板的开关以调节大棚内温度在2～19℃，温度超过18℃时，通过遮阴网和喷雾装置喷水雾通风降温，接种后通过覆盖遮阳网控制共生培育区的光照强度为0～104lx，遮阳网内空气湿度在85～100％，大棚内空气流动速度低于10.7米/秒，促进接种的冬虫夏草菌无性菌丝中国被毛孢与共培育的植物组织相互作用发生共生关系。
4.冬虫夏草菌种接种后共生培育15天，通过显微镜观察的方法检测植物组织上的中国被毛孢菌丝共生生长情况，通过常规形态学及DNA测序分子鉴定的方法检测确认菌丝为中国被毛孢，将菌丝检测结果为中国被毛孢的“菌物-植物共生体”作为侵染寄主钩蝠蛾幼虫的菌种材料。
5.将获得菌种材料收割后切段5～20mm投喂到钩蝠蛾幼虫饲养区，每头幼虫投置3～5g，使寄主幼虫可直接取食接触菌种材料，通过钩蝠蛾幼虫的取食活动，促进钩蝠蛾幼虫充分接触制备的菌种材料而被高效侵染。
6.侵染7天后将幼虫取出，通过虫菌体检验方法，用注射器抽取1μl色季拉钩蝠蛾幼虫的血淋巴，在显微镜下检查中国被毛孢虫菌体的情况，发现其中存在3个以上符合长棒针状形态特征中国被毛孢虫菌体，计算为一个侵染成功的个体。经统计，色季拉钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为91.4％。
实施例三
1.在西藏那曲冬虫夏草产区采集新鲜冬虫夏草，采用常规马铃薯培养基分离纯化菌种，经分子生物学方法及形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，进一步经大麦固态培养基在8℃发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，将发酵获得的菌团用搅拌器均匀打碎，并按发酵物重量与水体积比1∶600进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子稀释搅匀成的悬浮液，将培养基颗粒物用孔径2mm的纱布粗过滤后，作为冬虫夏草菌源。
2.在青藏高原海拔4300米的冬虫夏草适生地区域的高寒灌丛草甸区，选取地势排水较好的区域，利用原有珠芽蓼(Polygonum viviparum)、大萼委陵菜(Potentilla conferta)、杂色钟报春(Primula alpicola)、大萼蓝钟花(Cyananthus macrocalyx)、舌叶垂头菊(Cremanthodium linguiatum)、锡金柳叶菜(Epilobium sikkimense)等植物苗作为冬虫夏草菌源的接种对象。
3.将制备的冬虫夏草菌源按每株植物0.8ml喷淋接种到上述植物组织表面，通过选择当地白天温度不超过18℃，晚上温度不低于2℃的适宜的阴云天气时机进行接种，接种后通过覆盖遮阳网控制共生培育区的光照强度为0～1000lx，遮阳网内空气湿度在75％左右，空气流动速度低于10.7米/秒，促进接种的冬虫夏草菌无性菌丝中国被毛孢与共培育的植物组织相互作用发生共生关系。
4.冬虫夏草菌源接种后共生培育25天，通过显微镜观察的方法检测植物组织上的中国被毛孢菌丝共生生长情况，通过常规形态学及DNA测序分子鉴定的方法检测确认菌丝为中国被毛孢，将菌丝检测结果为中国被毛孢的“菌物-植物共生体”作为侵染寄主钩蝠蛾幼虫的菌种材料。
5.将在青藏高原高寒草甸采集的色季拉钩蝠蛾(Thitarodes sejilaensis)的幼虫投置到已形成的“菌物-植物共生体”的培育区，每株植物投置幼虫2～5头，使寄主幼虫可直接取食接触菌种材料，通过钩蝠蛾幼虫的取食活动，促进钩蝠蛾幼虫充分接触制备的菌种材料而被高效侵染。
6.侵染15天后将幼虫取出，通过虫菌体检验方法，用注射器抽取1μl色季拉钩蝠蛾幼虫的血淋巴，在显微镜下检查中国被毛孢虫菌体的情况，发现其中存在3个以上符合长棒针状形态特征中国被毛孢虫菌体，计算为一个侵染成功的个体。经统计，色季拉钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为89.7％。
实施例四
1.每年6～8月在西藏山南地区冬虫夏草产区，用灭菌过的小袋套袋法收集新鲜冬虫夏草喷发的子囊孢子，用无菌生理盐水稀释制成子囊孢子悬浮液，通过显微镜计数使每毫升悬浮液中含有1000个子囊孢子，作为冬虫夏草菌源。
2.在青藏高原海拔2500米的高山草甸区，选取地势排水较好的区域，将原有植被除去并开垦平整成常规种植地，利用人工栽培的胡萝卜Daucus carota和菊芋Helianthustuberosus植物苗作为冬虫夏草菌源的接种共培育对象。
3.将制备的冬虫夏草菌源按每株植物1ml喷淋接种到上述植物组织表面，通过选择当地白天温度不超过19℃，晚上温度不低于4℃的适宜的阴云天气时机进行接种，接种后通过覆盖遮阳网控制共生培育区的光照强度为200～300lx，遮阳网内空气湿度在25～85％，空气流动速度低于7.9米/秒，促进接种的冬虫夏草菌无性菌丝中国被毛孢与共培育的植物组织相互作用发生共生关系。
4.冬虫夏草菌源接种到植物组织后共生培育30天，通过显微镜观察的方法检测植物组织上的中国被毛孢菌丝共生生长情况，通过常规形态学及DNA测序分子鉴定的方法检测确认菌丝为中国被毛孢，将菌丝检测结果为中国被毛孢的“菌物-植物共生体”作为侵染寄主钩蝠蛾幼虫的菌种材料。
5.将上述菌种材料收割后切段5～20mm投喂到虫草钩蝠蛾(Thitarodes armoricanus)幼虫饲养区，使寄主幼虫可直接取食接触菌种材料，通过虫草钩蝠蛾幼虫的取食活动，促进虫草钩蝠蛾幼虫充分接触制备的菌种材料而被高效侵染。
6.侵染10天后将寄主幼虫取出，通过虫菌体检验方法，用注射器抽取1μl虫草钩蝠蛾幼虫的血淋巴，在显微镜下检查中国被毛孢虫菌体的情况，发现其中存在3个以上符合长棒针状形态特征中国被毛孢虫菌体，计算为一个侵染成功的个体。经统计，虫草钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为85.6％。
实施例五
1.每年5～7月在青海果洛地区冬虫夏草产区，用灭菌过的小袋套袋法收集新鲜冬虫夏草喷发的子囊孢子，用无菌生理盐水稀释制成子囊孢子悬浮液，通过显微镜计数使每毫升悬浮液中含有100个子囊孢子，作为冬虫夏草菌源。
2.在青藏高原海拔3900米的高寒草甸区，选取地势排水较好的区域，利用原有珠芽蓼(Polygonum viviparum)、禾叶风毛菊(Saussurea graminea)、多裂委陵菜(Potentillamultifida)、高山唐松草(Thalictrum alpinum)、火绒草(Leontopodium hastioides)、头花蓼(Polygonum macrophytum)植物苗作为冬虫夏草菌源的接种共培育对象。
3.将制备的冬虫夏草菌源按每株植物0.5ml喷淋接种到上述植物组织表面，通过选择当地白天温度不超过18℃，晚上温度不低于2℃的适宜的阴云天气时机进行接种，接种后通过覆盖遮阳网控制共生培育区的光照强度为0～5000lx，遮阳网内空气湿度在55～85％，空气流动速度不高于5.4米/秒，促进接种的冬虫夏草菌无性菌丝中国被毛孢与共培育的植物组织相互作用发生共生关系。
4.冬虫夏草菌源接种到植物组织后共生培育20天，通过显微镜观察的方法检测植物组织上的中国被毛孢菌丝共生生长情况通过常规形态学及DNA测序分子鉴定的方法检测确认菌丝为中国被毛孢，将菌丝检测结果为中国被毛孢的“菌物-植物共生体”作为侵染寄主钩蝠蛾幼虫的菌种材料。
5.将上述菌种材料收割后切段5～20mm投喂到循化钩蝠蛾(Thitarodes xunhuaensis)幼虫饲养区，使寄主幼虫可直接取食接触菌种材料，通过循化钩蝠蛾幼虫的取食活动，促进循化钩蝠蛾幼虫充分接触制备的菌种材料而被高效侵染。
6.侵染5天后将寄主幼虫取出，通过虫菌体检验方法，用注射器抽取1μl循化钩蝠蛾幼虫的血淋巴，在显微镜下检查中国被毛孢虫菌体的情况，发现其中存在3个以上符合长棒针状形态特征中国被毛孢虫菌体，计算为一个侵染成功的个体。经统计，循化钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为90.8％。
实施例六(反向例)
1.从青海玉树地区冬虫夏草主产区采集新鲜冬虫夏草，采用常规察氏培养基分离纯化菌种，经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，经通常蛋白胨水液体培养基在13±5℃发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，并将发酵获得的菌球用搅拌器均匀打碎，最后按发酵液与水体积比1∶100进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子稀释搅匀成的悬浮液，作为冬虫夏草菌源。
2.在青藏高原海拔3800米的高寒草甸区，选取地势排水较好的区域建设培育大棚，采集高山嵩草(Kobresia pygmaea)、一岁苔草(Carex heterostachya)、珠芽蓼(Polygonumviviparum)、禾叶风毛菊(Saussurea graminea)、多裂委陵菜(Potentilla multifida)、高山唐松草(Thalictrum alpinum)、火绒草(Leontopodium hastioides)、头花蓼(Polygonum macrophytum)等植物及种子移栽至培育大棚中，通过人工或自动化控制大棚四周及顶部的开关以调节大棚内温度在5～15℃，温度超过18℃时，通过喷雾装置喷水雾通风降温，并使之旺盛生长获得高寒植物苗。
3.将获得的高寒植物苗地上及地下部分组织切成5～20mm小段作为钩蝠蛾幼虫的饲料，同时将冬虫夏草菌源喷淋到高寒植物饲料表面或喷淋到替代饲料如胡萝卜表面，直接投喂冬虫夏草寄主玉树钩蝠蛾Thitarodes yushuensi幼虫，每头幼虫投放5～10克，使寄主幼虫取食并充分接触菌种，10天后采用显微镜检查及分子生物方法检测玉树钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，玉树钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率只有23.4％。
实施例七(反向例)
1.从西藏那曲冬虫夏草产区采集新鲜冬虫夏草，采用常规马铃薯培养基分离纯化菌种，经分子生物学方法及形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，进一步经通常的大麦固态培养基在13±5℃发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，将发酵获得的菌球用搅拌器均匀打碎，并按发酵物重量与水体积比1∶100进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子稀释搅匀成的悬浮液，将培养基颗粒物用孔径2mm的纱布粗过滤后，作为冬虫夏草菌源；
2.将制备的冬虫夏草菌源直接喷淋到冬虫夏草寄主比如钩蝠蛾Thitarodes biruens幼虫，使寄主幼虫充分接触菌种，10天后采用显微镜检查及分子生物方法检测玉树钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，中国被毛孢侵染比如钩蝠蛾幼虫的侵染率只有18.7％。
实施例八(反向例)
1.在每年的6～8月在青海玉树的冬虫夏草产区采集新鲜冬虫夏草子囊孢子，直接稀释制成子囊孢子悬浮液，通过显微镜计数使每毫升悬浮液中含有1000个子囊孢子，作为冬虫夏草菌源。
2.将冬虫夏草菌源直接喷淋到冬虫夏草寄主玉树钩蝠蛾Thitarodes yushuensi幼虫，使寄主幼虫充分接触菌种，10天后采用显微镜检查及分子生物方法检测玉树钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，玉树钩蝠蛾幼虫被冬虫夏草子囊孢子的侵染率只有10.8％。
Claims (10)
1.一种具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料的制备方法，其特征在于首先将冬虫夏草菌源接种到植物组织上，通过冬虫夏草菌种与植物共生培育的方法，使冬虫夏草菌无性菌丝中国被毛孢与共培育的植物组织相互作用发生共生关系，形成菌物-植物共生体，将菌丝检测结果为中国被毛孢的菌物-植物共生体作为侵染寄主钩蝠蛾幼虫的冬虫夏草菌种材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的冬虫夏草菌源是通过常规分离、纯化、固液相发酵获得的中国被毛孢Hirsutella sinensis的发酵物，配制成发酵物与水质量比为1∶100～1∶1000的悬浮液作为冬虫夏草菌源；或者是将收集的冬虫夏草新鲜子囊孢子，用灭菌的生理盐水配制成每毫升含有100～1000个子囊孢子的悬浮液作为冬虫夏草菌源。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述植物的种类是可供冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫取食的植物种类，包括青藏高原高寒灌丛及高寒草甸中草本植物中的一种或多种；或者是常见的可食用块状根茎植物，包括马铃薯、胡萝卜、萝卜、菊芋、番薯中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的植物组织是植物的根、茎、叶、花或果实组织；或者是离体组织培养获得的愈伤组织或胚状体或组培苗。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是所述的将冬虫夏草菌源接种到植物组织上的接种方法是按每株植物0.1～1ml冬虫夏草菌源喷淋接种到植物组织表面。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的冬虫夏草菌源与植物共生培育的条件是：气温2～19℃，空气湿度25～100％，空气流动风速不高于10.7米/秒，光照0～104lx，时间为7～30天。
7.一种使冬虫夏草菌高效侵染寄主钩蝠蛾幼虫的方法，其特征是将按照权利要求1～6之一所述方法得到的冬虫夏草菌种材料直接作为饲料提供给钩蝠蛾幼虫取食。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征是将钩蝠蛾幼虫投置到已形成菌物-植物共生体的冬虫夏草菌种与植物共生培育区，或者是将所述的菌种材料切段投喂到钩蝠蛾幼虫饲养区，使寄主幼虫直接取食接触菌种材料。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征是使寄主幼虫直接取食接触菌种材料的时间为3～15天。
10.根据权利要求7～9之一所述的方法，其特征是所述的钩蝠蛾幼虫是；符合钩蝠蛾属昆虫分类特征，栖息在青藏高原高寒生境的冬虫夏草寄主昆虫的1～9龄幼虫；或者 是通过人工方法饲养繁育获得钩蝠蛾属昆虫的1～9龄幼虫。
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