CN112616557A - 一种高侵染力冬虫夏草菌株的培养方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体地，本发明涉及一种高侵染力冬虫夏草菌株的培养方法及其应用。本发明提供一种提高冬虫夏草菌对蝙蝠蛾幼虫的侵染力的冬虫夏草菌株培养及侵染方法，通过本方法培养的菌株生长性状好、产菌丝和分生孢子能力强；同时对蝙蝠蛾幼虫侵染力强，利用本方法得到的菌悬液侵染蝙蝠蛾幼虫，侵染率可达86.67％，显著高于自然界中的以及现有方法得到的冬虫夏草菌株的侵染力。

Description

一种高侵染力冬虫夏草菌株的培养方法及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地，本发明涉及一种高侵染力冬虫夏草菌株的培养方法及其应用。

背景技术

在冬虫夏草产业化大生产过程中，冬虫夏草菌的侵染力强弱与虫草产量密切相关。目前，野生冬虫夏草菌在自然环境下对蝙蝠蛾幼虫的侵染率较低，一般为10％左右。在人工环境下，冬虫夏草菌侵染力研究中的主要困难是冬虫夏草菌的分离成功率较低以及常规侵染方法(如针刺等)对虫体损伤大，导致接种幼虫死亡率高，分离培养、筛选出具有高侵染力的菌株以及提高有效侵染率成为冬虫夏草菌生物学研究和产业化大生产实际应用中的瓶颈。

因此，亟需培养筛选获得一种高侵染率冬虫夏草菌株。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提供一种高侵染力冬虫夏草菌株的培养及侵染方法，通过本方法培养的菌株生长性状好、产菌丝和分生孢子能力强；同时对蝙蝠蛾幼虫侵染力强，利用本方法得到的菌悬液侵染蝙蝠蛾幼虫，侵染率可达86.67％，显著高于自然界中的以及现有方法得到的冬虫夏草菌株的侵染力。

为此，本发明第一方面提供一种培养冬虫夏草菌株的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：

(1)从冬虫夏草虫体分离初始冬虫夏草菌株；

(2)对所述初始冬虫夏草菌株进行变温培养，以便获得培养后的冬虫夏草菌株，其中，所述变温培养在暗培养条件下进行，所述变温培养包括两个阶段，第一阶段的培养温度1～6℃，培养时间1～2天；第二阶段的培养温度16～19℃，培养时间8～12天，所述第二阶段结束之后依次重复所述第一阶段、第二阶段，所述变温培养的总时长为3～5个月。

针对现有的冬虫夏草菌株对蝙蝠蛾幼虫侵染力普遍不强，导致侵染率普遍偏低的问题，发明人创造性的发现，将菌株从冬虫夏草虫体中分离出来，通过上述特殊的变温培养条件，能够提升冬虫夏草菌株对蝙蝠蛾幼虫的侵染力。相比现有的冬虫夏草菌株，大大提高了侵染率，将其用于冬虫夏草的规模化生产中，能够显著提高产量和生产成本。

根据本发明实施例的培养冬虫夏草菌株的方法，还可以具有以下附加技术特征的至少之一：

根据本发明的一些优选的实施例，所述第一阶段的培养时间为1天。

根据本发明的一些优选的实施例，所述第二阶段的培养时间为10天。

根据本发明的一些优选的实施例，所述变温培养的总时长为4个月。

根据本发明的实施例，进行所述变温培养时所用培养基为PDA固体培养基。

本发明第二方面提供一种冬虫夏草菌株。根据本发明的实施例，所述冬虫夏草菌株通过第一方面所述的方法培养获得。

针对冬虫夏草菌实际应用过程中的侵染力普遍不强导致的侵染率普遍偏低的问题，发明人利用新的分离和培养方法，获得的冬虫夏草菌株针对蝙蝠蛾幼虫的侵染力能够明显提升，分离培养出具有强侵染力的菌株，利用所获得的冬虫夏草菌菌株侵染蝙蝠蛾幼虫，能够提高冬虫夏草产量，可用于冬虫夏草的规模化生产中。

发明人通过特殊的培养方法，获得高侵染力冬虫夏草菌株(在本发明中也称为“冬虫夏草菌株DYG-053B”)，将该菌株接种在固体培养基上，菌落呈隆起的白色绒毛状、菌丝透明，具有分隔和分支，直径为2.0～4.5μm；分生孢子梗多数为单生，少数对生，瓶梗呈锥形，(45～85)μm×(2.5～4.5)μm；瓶梗末端形成数个分生孢子，通常被粘液包被在一起，分生孢子为单细胞，无色、形状呈肾形，大小为(5.5～11)×(4.0～5.5)μm。

在本发明中，利用本发明的培养方法，筛选获得的高侵染力冬虫夏草菌株称为“冬虫夏草菌菌株DYG-053B”或“DYG-053B”。

本发明第三方面提供一种微生物制剂。根据本发明的实施例，所述微生物制剂包括第二方面所述的冬虫夏草菌株。

本发明第四方面提供一种第一方面所述的冬虫夏草菌株的侵染方法。根据本发明的实施例，所述侵染方法包括：

1)培养所述冬虫夏草菌株，以便获取菌体和分生孢子混合培养物；

2)将所述混合培养物配制为菌体悬浮液，并对所述菌体悬浮液进行粉碎处理；

3)利用粉碎处理后的菌体悬浮液向蝙蝠蛾幼虫接种菌体，以便侵染所述蝙蝠蛾幼虫。

根据本发明实施例的冬虫夏草菌株的侵染方法，还可以具有以下附加技术特征的至少之一：

根据本发明的实施例，所述侵染方法进一步包括：

在步骤3)之前，向所述粉碎处理后的菌体悬浮液中加入促进菌丝生长的物质，以便获取待侵染悬浮液，利用所述待侵染悬浮液向蝙蝠蛾幼虫接种菌体。

加入促进菌丝生长的物质，能够提高菌丝的活性和菌丝段在虫体表面的附着和侵染，进一步提高对蝙蝠蛾幼虫的侵染率。

根据本发明的实施例，步骤1)中所述培养条件为：所述培养在暗培养条件下进行，培养温度16～19℃，培养时间3～5个月。

根据本发明的实施例，所述菌体悬浮液为包括5×10⁵～1×10⁶个/mL菌丝段和分生孢子的混合悬浮液。

根据本发明的实施例，所述粉碎处理的时间为10s～60s。

对所述菌体悬浮液进行粉碎处理，能够将菌丝剪切成菌丝段，增加单位体积中菌体的数量；粉碎处理时间过短，则菌丝不能完全剪切成菌丝段，导致菌丝段浓度偏低，影响对蝙蝠蛾幼虫的附着和侵染率，若粉碎时间过长，则会损伤菌体。根据本发明的实施例，所述促进菌丝生长的物质包括蛋白胨和酵母粉。

根据本发明的实施例，所述蛋白胨在所述粉碎处理后的菌体悬浮液中的含量为0.5～2％。

根据本发明的实施例，所述酵母粉在所述粉碎处理后的菌体悬浮液中的含量为0.5～2％。

根据本发明的实施例，所述接种的方式为喷雾接种。

本发明第五方面提供一种冬虫夏草。根据本发明的实施例，所述冬虫夏草包括：

虫体，

菌丝体，所述菌丝体是由第一方面所述的方法培养获得的冬虫夏草菌株或第二方面所述的冬虫夏草菌株形成的，所述菌丝体形成在所述虫体中。

本发明第六方面提供一种制备冬虫夏草的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：

1-1)采用第四方面所述的侵染方法侵染蝙蝠蛾幼虫；

1-2)将侵染后的蝙蝠蛾幼虫在温度13～19℃，相对湿度35～55％的条件下培养，以便获得冬虫夏草。

根据本发明的实施例，所述蝙蝠蛾幼虫虫龄为3～5龄。

本发明第七方面提供第一方面所述的方法培养获得的冬虫夏草菌株或第二方面所述的冬虫夏草菌株或第三方面所述的微生物制剂在提高冬虫夏草产量以及规模化生产冬虫夏草中的用途。

本发明的目的是针对冬虫夏草菌实际应用过程中的侵染力普遍不强导致的侵染率普遍偏低的问题，应用新的分离和培养方法获得具有较高侵染力的菌株，以及通过本发明的方法得到的菌株在利用菌丝体侵染寄主幼虫并最终形成冬虫夏草中的应用，所述的寄主昆虫为蝙蝠蛾幼虫。本发明所获得的冬虫夏草菌菌株可用于冬虫夏草仿生态产业化培植中侵染寄主昆虫，通过常规的固体发酵生产，获得冬虫夏草菌绒毛状菌落，然后加入表面活性剂按一定比例混合后，制备成孢子-菌丝段混合悬浮剂；所述的产业化条件为平原地区、室内环境。

本发明在菌种-菌丝和分生孢子混悬液中添加促菌丝生长物质的处理以促进侵染力的提升，同时采用连续喷雾法进行接种；所述侵染菌种为冬虫夏草菌菌株DYG-053B的菌悬液或发酵液或代谢产物或由其制备的单一或混合制剂。

本发明的有益效果为：本发明从自然感染的蝙蝠蛾昆虫的僵虫直接分离筛选冬虫夏草菌菌株，并探索新的分离方法、培养方法，所培养菌株生产性状好、产菌丝和分生孢子能力强；同时对蝙蝠蛾幼虫侵染力强，所培养菌株采用连续喷雾法对蝙蝠蛾幼虫的侵染力最高可达86.67％，显著高于现有的冬虫夏草菌菌株。利用该方法获得的菌株生产的侵染虫用菌种制剂，可有效改善冬虫夏草菌株对蝙蝠蛾幼虫的侵染率，提高冬虫夏草仿生态产业化培植的产量。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为本发明提供的黑暗培养的冬虫夏草菌菌株DYG-053B在固体培养基上的菌落正面形态照片；

图2为本发明提供的冬虫夏草菌菌株DYG-053B的菌丝和分生孢子显微形态照片，其中，图中较细的黑色箭头所指为菌丝，图中较粗的空心箭头所指为分生孢子；

图3为本发明提供的冬虫夏草菌菌株DYG-053B在室内侵染蝙蝠蛾幼虫后幼虫血淋巴中菌丝段显微照片；

图4为本发明提供的冬虫夏草菌菌株DYG-053B侵染蝙蝠蛾幼虫虫体组织内菌丝体的扫描电镜图。

具体实施方式

在本发明的一些具体的实施方案中，从冬虫夏草虫体分离初始冬虫夏草菌株的操作如下：

从冬虫夏草产区四川省康定的高原草甸地带采集新鲜冬虫夏草(可孕部膨大但未弹射)，放入4℃培养箱中养护并带回实验室。室内人工剥离僵虫虫体表面覆盖的一层湿泥土层后，再用流水冲洗虫体表面，同时用特制的环保刷(刷头PVC材质、长1cm、刷柄长12cm)清除虫体表面菌膜等杂质，对虫体无直接损伤且清理更干净，用75％浓度酒精进行体表预消毒处理，后用0.1％的升汞溶液进行消毒2min，再用无菌纯化水冲洗在超净台中用无菌解剖刀剖开虫体的内菌核部分(应避开肠道)，冲洗3遍，挑取上、中、下三个部位的组织放在已灭菌的斜面固体培养基上，所述固体培养基是指在PDA培养基，将试管斜面置于16～19℃恒温培养箱中培养。

在本发明中，从冬虫夏草虫体分离初始冬虫夏草菌株的方法并不限于上述操作方法，也可以是本领域常规方法。上述分离方法消毒更到位，与现有技术相比具有更高的分离成功率，为产业化菌种来源提供保证。

在本发明的一些具体的实施方案中，对所述初始冬虫夏草菌株进行变温培养，以便获得初筛冬虫夏草菌株的操作如下：

将由虫体的内菌核获得的分离组织在斜面培养基(例如，PDA固体培养基)上暗培养2周后开始生长，此时转接到液体培养基中，14～20℃，110r/min往复式振荡培养，观察记录。往复式振荡暗培养10天后，菌丝球长满于液体培养基中。吸取少许接种于固体培养基上，16～19℃、暗培养15天后培养基表面长出褐色单菌落，获得野生型冬虫夏草菌菌株，将菌株置于1～6℃条件下暗培养1～2天后，再将其置于16～19℃恒温培养箱中暗培养8～12天，然后再其转入1～6℃条件下暗培养1～2天，如此交替培养直至3～5个月后，菌落长出大量白色绒毛状菌丝体。

在本发明的一些具体的实施方案中，所述冬虫夏草菌株侵染蝙蝠蛾幼虫(蝙蝠蛾3～5龄幼虫)的过程：

将经过变温培养得到的冬虫夏草菌菌株在16～19℃的条件下，暗培养近4个月后，刮取表面菌丝体和分生孢子，以0.02％吐温-80无菌水配制成浓度为1×10⁶个/mL的菌丝段和分生孢子混合悬浮液(匀浆机粉碎10～60s)，加入0.5～2％含量的蛋白胨和0.5～2％含量的酵母粉并摇晃均匀。将菌丝段和分生孢子混悬液倒入经高温灭菌的喉头喷雾器内，将供试蝙蝠蛾适龄幼虫放在经灭菌不锈钢盘里，然后用喉头喷雾器对每个菌株进行喷雾接种(每个重复按喷雾器5下)，每个菌株设4个重复，每个重复300头蝙蝠蛾幼虫。首次喷雾接种后，将幼虫转移至铺有高度为5mm的疏松土层(土壤含水量25％-55％)的塑料盒(长40cm、宽28cm、高5cm)中，幼虫自由钻土爬行2h后，将幼虫取出再次进行喷雾接种，每个重复按喷雾器5下，再将幼虫转移至常规有土和饲料的饲养环境中。

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明的实施例中所用的冬虫夏草完整菌虫复合体的来源不限于特定区域、特定位置，其他位置获得的菌虫复合体，通过分离以及本发明特殊的培养方法，也能够提高冬虫夏草的侵染力，获得较高侵染力的冬虫夏草菌株。

本发明的实施例中，冬虫夏草菌菌株DYG-053B为利用本发明的特殊培养方法，筛选获得的高侵染力冬虫夏草菌株，冬虫夏草菌菌株DYG-010E为同一时间从相同冬虫夏草虫体(即与菌株DYG-053B的来源相同)上分离得到的并一直置于18℃恒温培养箱中培养的菌株。两种菌株除了一个进行变温培养，一个进行恒温培养的条件不同之外，其他的分离过程、以及对蝙蝠蛾幼虫的侵染过程等完全相同。

实施例1野生冬虫夏草菌菌株的分离、培养

从四川康定海拔4300-4800米的山坡上采挖100株子实体粗壮饱满、虫体粗大的冬虫夏草完整菌虫复合体，寄主昆虫为蝙蝠蛾幼虫，放入4℃培养箱中养护并带回实验室。人工剥离虫体表面覆盖的一层湿泥土层后，再用流水冲洗虫体表面同时用特制刷子特制的环保刷(刷头PVC材质、长1cm、刷柄长12cm)清除虫体表面菌膜等杂质，对虫体无直接损伤且清理更干净，用75％浓度酒精进行体表预消毒处理，后用0.1％的升汞溶液进行消毒2min，再用无菌纯化水冲洗在超净台中用无菌解剖刀剖开虫体的内菌核部分(应避开肠道)，冲洗3遍，挑取上中下三个部位的组织放在已灭菌的斜面固体培养基上，所述固体培养基是指在PDA培养基，将斜面置于18℃恒温培养箱中培养，每天观察记录。分离组织在斜面培养基上暗培养2周后开始生长，此时转接到液体培养基中，18℃，110r/min往复式振荡培养，观察记录。往复式振荡暗培养10天后，菌丝球长满于液体培养基中。吸取少许接种于固体培养基上，18℃、暗培养15天后培养基表面长出褐色单菌落，获得野生型冬虫夏草菌菌株，将菌株置于4℃条件下暗培养1天后，再将其置于18℃恒温培养箱中暗培养10天，再将其转入4℃条件下暗培养1天，如此往复培养直至120天后，菌落长出大量绒毛状菌丝体。获得野生型冬虫夏草菌菌株Ophiocordyceps sinensis DYG-053B，如图1所示。所述冬虫夏草菌属于真菌界，子囊菌门，粪壳菌纲，肉座菌目目，线性虫草科，线性虫草属。

实施例2：冬虫夏草菌DYG-053B的形态学鉴定

对野生型菌体DYG-053B在固体培养基上的生长情况和单菌落形态进行观察，所述固体培养基是指在PDA培养基。并且利用扫描电镜对僵虫体内的菌体微生物进行观察，了解菌体微生物的形态。经鉴定，初期菌丝体雪白色、致密，易挑取，菌落隆起，多褶皱，菌落产少量黑色素到培养基中，随着培养时间的延长，菌丝体背面慢慢呈现黑色，表面不再圆润，雪白色菌丝向外蓬松，如图1所示。显微镜下观察到该菌分生孢子为典型的肾形，如图2所示，菌丝有隔膜、有分支，直径2.0～4.5μm，菌丝体上直接形成瓶型小梗，大小43～85×2.5～4.5μm，从瓶梗末端直接溢缩形成单个分生孢子，分生孢子为单细胞，呈肾形，大小5.5～11×4.0～5.5μm。蝙蝠蛾幼虫被该菌侵染后，血淋巴中观察到菌体呈两头尖、中间粗的纺锤形，菌体增殖方式为顶端出芽，如图3所示。电镜观察虫体内菌丝体形态显示菌丝发育良好，细长，可以观察到菌丝末端形成许多的球形菌体，结果如图4所示。经形态学鉴定，初步判断出此分离物形成的菌落为冬虫夏草菌。

实施例3：冬虫夏草菌DYG-053B对蝙蝠蛾幼虫的室内侵染力测定

菌株侵染能力直接关系着菌株的侵染和被侵染幼虫的化僵效果，是衡量冬虫夏草菌菌株优良性状的极为重要指标。

供试试虫：6月初在四川康定海拔4300-4800米的山坡上采集越冬存活蝙蝠蛾蛹，在室内羽化交尾、产卵、孵化发育至3-5龄，进行冬虫夏草菌株室内侵染试验；挑选大小相近、健康活跃活虫作为供试试虫。

将实施例1中获得的冬虫夏草菌菌株DYG-053B接种到固体培养基上，所述固体培养基是指在PDA培养基。在18℃、相对湿度为95％的条件下，暗培养近4个月后，刮取培养基表面菌丝体和分生孢子，以0.02％吐温-80无菌水配制成浓度为1×10⁶个/mL的菌丝段和分生孢子混合悬浮液(匀浆机粉碎30s后血球计数板计数)，再加入1％含量的蛋白胨粉和0.5％含量的酵母粉并摇晃均匀使其充分溶解。将含有蛋白胨粉和酵母粉的菌丝段和分生孢子混悬液倒入经高温灭菌的喉头喷雾器内，将供试蝙蝠蛾适龄幼虫放在经灭菌不锈钢盘里，然后用喉头喷雾器对每个菌株进行喷雾接种(每个重复按喷雾器5下)，每个菌株设4个重复，每个重复300头蝙蝠蛾幼虫。首次喷雾接种后，将幼虫转移至铺有高度为5mm的疏松土层(土壤含水量80％-90％)的塑料盒(长40cm、宽28cm、高5cm)中，幼虫自由钻土爬行2h后，将幼虫取出再次进行喷雾接种，每个重复按喷雾器5下，再将幼虫转移至常规有土和饲料的饲养环境中；将蝠蛾对照组用等量的0.02％吐温-80无菌水同样喷雾接种，转移至常规有土和饲料的饲养环境中。将实验组(DYG-053B菌株)和对比例组均置于温度为14℃、相对湿度为55％的条件下培养。定期检查更换添加饲料，最后统计侵染化僵率，经DPS软件统计分析得LT90值。继续维护饲养环境培养直至僵虫长出子实体，累计调查180天。

对比例1：试验采用从相同虫体上分离得到的并一直置于18℃恒温培养箱中培养的菌株DYG-010E作为对照(CK)菌株，其他处理方式相同。

对比例2：冬虫夏草菌菌株DYG-053B菌丝段和分生孢子混合悬浮液中不添加1％含量的蛋白胨粉和0.5％含量的酵母粉，其他处理方式相同。

冬虫夏草菌菌株对蝙蝠蛾幼虫的侵染力见表1。

表1 冬虫夏草菌菌株对蝙蝠蛾幼虫的侵染力

实验结果如表1所示，从表1中可以看出，由对比例1中菌株和实验组DYG-053B对蝙蝠蛾幼虫的侵染力对比结果可知，经变温培养的冬虫夏草菌菌株DYG-053B菌丝段对蝙蝠蛾幼虫的侵染力较强，接种后180天正常侵染率为86.67％，且高于恒温培养(CK)菌株DYG-010E对蝠蛾幼虫的侵染效果(60.83％)，两种菌株对蝙蝠蛾幼虫的侵染率差异显著。实验组LT90值为125d，低于恒温培养的CK菌株DYG-010E(141d)，且差异显著，可见，冬虫夏草菌经过变温培养对蝙蝠蛾幼虫有很好的感染效果且幼虫被侵染后化僵时间提前。从表1中还可以看出，由对比例2和实验组对蝙蝠蛾幼虫的侵染力对比结果可知，冬虫夏草菌菌株DYG-053B菌丝段和分生孢子混悬液中加入1％含量的蛋白胨粉和0.5％含量的酵母粉后对蝙蝠蛾幼虫的侵染力较强，接种后180天正常侵染率为86.67％，高于不加蛋白胨粉和酵母粉的菌株DYG-053B对蝠蛾幼虫的侵染效果(为71.92％)，两者侵染率差异显著。可见，加入1％含量的蛋白胨粉和0.5％含量的酵母粉能够促进冬虫夏草菌菌株DYG-053B对蝙蝠蛾幼虫的侵染效果。

实施例4：冬虫夏草菌产分生孢子含量的测定

分生孢子计数方法参照李玉玲(2002)中的方法，用接种针直接挑取冬虫夏草菌菌株DYG-053B不同部位的固体发酵菌丝块，并记下重量，用0.02％吐温-80无菌水洗下分生孢子，离心15min收集分生孢子，转速1000r/min，再用血球计数板在显微镜下计数，计算平均每克固体培养基所含的冬虫夏草菌分生孢子数量。重复计数3次，采用同一时间从相同虫体上分离得到的并一直置于18℃恒温培养箱中培养的菌株DYG-010E作为对照(CK)菌株。

表2 冬虫夏草固体发酵产分生孢子的数量

注：数据后的不同小写字母表示0.05水平上的差异显著。

实验结果如表2所示，由表2可以看出，冬虫夏草菌菌株DYG-053B产分生孢子量较高，且显著高于对照菌株DYG-010E，而较高的产孢量更有利于真菌在野外环境中的传播，并提升侵染机率。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (12)

1.一种培养冬虫夏草菌株的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)从冬虫夏草虫体分离初始冬虫夏草菌株；

(2)对所述初始冬虫夏草菌株进行变温培养，以便获得培养后的冬虫夏草菌株，其中，所述变温培养在暗培养条件下进行，所述变温培养包括两个阶段，第一阶段的培养温度1～6℃，培养时间1～2天；第二阶段的培养温度16～19℃，培养时间8～12天，所述第二阶段结束之后依次重复所述第一阶段、第二阶段，所述变温培养的总时长为3～5个月。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一阶段的培养时间为1天；

任选地，所述第二阶段的培养时间为10天；

任选地，所述变温培养的总时长为4个月。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述变温培养时所用培养基为PDA固体培养基。

4.一种冬虫夏草菌株，其特征在于，所述冬虫夏草菌株通过权利要求1～3中任一项所述的方法培养获得。

5.一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂包括权利要求4所述的冬虫夏草菌株。

6.一种权利要求4所述的冬虫夏草菌株的侵染方法，其特征在于，所述侵染方法包括：

1)培养所述冬虫夏草菌株，以便获取菌体和分生孢子混合培养物；

2)将所述混合培养物配制为菌体悬浮液，并对所述菌体悬浮液进行粉碎处理；

3)利用粉碎处理后的菌体悬浮液向蝙蝠蛾幼虫接种菌体，以便侵染所述蝙蝠蛾幼虫。

7.根据权利要求6所述的侵染方法，其特征在于，所述侵染方法进一步包括：

在步骤3)之前，向粉碎处理后的所述菌体悬浮液中加入促进菌丝生长的物质，以便获取待侵染悬浮液，利用所述待侵染悬浮液向蝙蝠蛾幼虫接种菌体。

8.根据权利要求6或7所述的侵染方法，其特征在于，步骤1)中所述培养条件为：

所述培养在暗培养条件下进行，培养温度16～19℃，培养时间3～5个月，

任选地，所述菌体悬浮液为包括5×10⁵～1×10⁶个/mL菌丝段和分生孢子的混合悬浮液；

任选地，所述粉碎处理的时间为10s～60s；

任选地，所述促进菌丝生长的物质包括蛋白胨和酵母粉；

任选地，所述蛋白胨在所述粉碎处理后的菌体悬浮液中的含量为0.5～2％；

任选地，所述酵母粉在所述粉碎处理后的菌体悬浮液中的含量为0.5～2％；

任选地，所述接种的方式为喷雾接种。

9.一种冬虫夏草，其特征在于，包括：

虫体，

菌丝体，所述菌丝体是由权利要求1～3中任一项所述的方法培养获得的冬虫夏草菌株或权利要求4所述的冬虫夏草菌株形成的，所述菌丝体形成在所述虫体中。

10.一种制备冬虫夏草的方法，其特征在于，所述方法包括：

1-1)采用权利要求6～8中任一项所述的侵染方法侵染蝙蝠蛾幼虫；

1-2)将侵染后的蝙蝠蛾幼虫在温度13～19℃，相对湿度35～55％的条件下培养，以便获得冬虫夏草。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述蝙蝠蛾幼虫虫龄为3～5龄。

12.权利要求1～3中任一项所述的方法培养获得的冬虫夏草菌株或权利要求4所述的冬虫夏草菌株或权利要求5所述的微生物制剂在提高冬虫夏草产量以及规模化生产冬虫夏草中的用途。

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