CN111763646A - 长形赖氨酸芽孢杆菌、微生物菌剂、生防药剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种长形赖氨酸芽孢杆菌、微生物菌剂、生防药剂及其制备方法和应用，经鉴定为长形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macrolides)，菌株名为C1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18349，保藏日期为2019年07月29日。本发明的长形赖氨酸芽孢杆菌，提供了一株新的长形赖氨酸芽孢杆菌C1，该菌株具有良好的防治植物根结线虫活性，为植物线虫生物防治的研发奠定了基础。并且，该菌株具有良好的促进作物生长的特性，为微生物肥料的应用提供基础。

Description

长形赖氨酸芽孢杆菌、微生物菌剂、生防药剂及其制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别地，涉及一种长形赖氨酸芽孢杆菌。此外，本发明还涉及一种包括上述长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂、生防药剂及其制备方法和应用。

背景技术

植物寄生线虫(Plant-parasitic nematodes)是一类专性植物寄生病原线虫，在全世界普遍发生，对农业经济作物的生产造成巨大的经济损失，每年由植物寄生线虫在世界范围内造成的经济损失约1500亿美元。根结线虫被认为是危害最严重的植物病原线虫，能够在包括蔬菜、粮食作物、经济作物、果树、观赏作物及杂草等在内的3000多种植物体内寄生，该病害发生后一般减产10％左右，严重的高达75％以上。尤其是作物根结线虫发病面积广，能侵染几乎所有栽培植物。近年来，随着我国蔬菜和粮食种植面积不断扩大，蔬菜和水稻根结线虫病的发生逐年加重，已成为严重影响蔬菜产品安全的疑难病害之一。据估算，根结线虫导致我国各类蔬菜粮食和其他经济作物严重减产，仅蔬菜每年达减产30％以上，造成的损失超过5亿美元。随着规模化集约农业的快速发展，根结线虫病害频发，严重威胁蔬菜和粮食作物生产，影响农民增收，成为制约我国蔬菜、粮食和重要经济作物可持续发展的突出问题。

由于缺乏抗性品种、复种指数高等原因，化学防治仍是目前应用最为广泛的根结线虫防治方法，但是化学农药的大量使用也带来了环境、安全等多方面的问题，如农药残留、对人畜和自然环境的危害、长期施用作用效果减弱等。特别是2009年，哥本哈根会议后，对于低碳环保的倡导，许多高毒性的化学杀线虫剂如呋喃丹、溴甲烷、灭线磷等开始被列入淘汰计划甚至禁用。随着绿色农业及可持续发展战略的倡导，人们更加迫切地需要安全环保的防治措施。生物农药以其高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性和原料易得等特性被认为是未来化学农药的理想替代药剂，越来越受到人们的重视。筛选有益微生物菌株，利用微生物及其代谢产物进行根结线虫生物防治是一种高效、环境友好型的防治措施。植物寄生线虫的天敌包括真菌、细菌、放线菌、病毒、捕食性线虫、昆虫和原生动物等。真菌和细菌是自然界土壤中占绝对优势的微生物，是植物线虫生物防控的重要微生物。目前报道的具有杀线虫潜力的生防菌主要包括多种真菌和不同种类的生防细菌，但是关于利用长形赖氨酸芽孢杆菌菌株防治植物线虫病害的研究尚未被报道过。

发明内容

本发明提供了一种长形赖氨酸芽孢杆菌、微生物菌剂、生防药剂及其制备方法和应用，以解决现有的防治植物线虫病害的难度大、成本高的的技术问题。

本发明采用的技术方案如下：

一种长形赖氨酸芽孢杆菌，经鉴定为长形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacrolides)，菌株名为C1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.18349，保藏日期为2019年07月29日。

进一步地，长形赖氨酸芽孢杆菌C1经16S rDNA序列测得序列如SEQ ID No.1所示。

根据本发明的另一方面，还提供了一种包含上述长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂。

根据本发明的另一方面，还提供了一种如上述长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

S1、斜面种子培养：将长形赖氨酸芽孢杆菌C1的菌体划线至斜面培养基上进行培养；

S2、液体种子培养：从步骤S1中的斜面挑取经活化的单菌落接种于液体种子培养基中培养，振荡，获得种子培养液；

S3、发酵培养：将步骤S2中的种子培养液接种于发酵培养基，振荡，获得发酵培养物；

S4、发酵液的制备：收集步骤S3中的发酵培养物中的发酵液，获得长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂；

进一步地，步骤S1中的斜面种子培养的温度为25℃～30℃，培养时间为30h～40h；步骤S2中的液体种子培养的温度为25℃～30℃，振荡转速为180r/min～250r/min，培养时间为20h～30h；步骤S3中的发酵培养的温度为25℃～30℃，振荡转速为180r/min～250r/min，培养时间为65h～75h，种子培养液接种量为2％～5％。

根据本发明的另一方面，还提供了一种长形赖氨酸芽孢杆菌生防药剂，将上述长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂进行离心处理，收集上清液，过滤，获得长形赖氨酸芽孢杆菌生防药剂。

根据本发明的另一方面，还提供了一种如上述长形赖氨酸芽孢杆菌、长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂或者长形赖氨酸芽孢杆菌生防药剂在防治植物线虫的应用，防治植物线虫包括秀丽小杆线虫、南方根结线虫、北方根结线虫、爪哇根结线虫、象耳豆根结线虫或禾本科拟根结线虫等。

根据本发明的另一方面，还提供了一种防治植物线虫的产品，其活性成分包括上述长形赖氨酸芽孢杆菌、长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂或者长形赖氨酸芽孢杆菌生防药剂

根据本发明的另一方面，还提供了一种如上述长形赖氨酸芽孢杆菌、长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂或者长形赖氨酸芽孢杆菌生防药剂在促进作物生长的应用。

根据本发明的另一方面，还提供了一种生物肥料，其包括上述长形赖氨酸芽孢杆菌、长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂或者长形赖氨酸芽孢杆菌生防药剂。

本发明具有以下有益效果：

本发明的长形赖氨酸芽孢杆菌，提供了一株新的长形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macrolides)C1，该菌株具有良好的防治植物根结线虫活性，为植物线虫生物防治的研发奠定了基础。并且，该菌株具有良好的促进作物生长的特性，为微生物肥料的应用提供基础。

本发明的长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂，可应用于制备防治植物线虫的产品中，对生态环境及人体健康友好，其制备方法和使用过程均十分简单、方便，在生产过程中没有使用有机溶剂，从而降低了对环境的污染程度。并且，对环境友好、对人畜无毒、对作物无药害、施用简单方便等特点，且不易使病虫害产生耐药性。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明优选实施例的长形赖氨酸芽孢杆菌C1的菌落形态图；

图2是本发明优选实施例的长形赖氨酸芽孢杆菌C1的菌体扫描电镜图；

图3是本发明优选实施例的长形赖氨酸芽孢杆菌C1的菌体透射电镜图；

图4是本发明优选实施例5的盆栽试验中番茄上部分和根部表现图，(其中a为长形赖氨酸芽孢杆菌C1微生物菌剂灌根、b为牛肉膏蛋白胨液体培养基灌根)；以及

图5是本发明优选实施例6的田间试验中黄瓜地上部分和地下部分表现图，(其中a为长形赖氨酸芽孢杆菌C1微生物菌剂处理组、b为阿维菌素处理组、c为水的对照组)；

保藏证明说明：

菌种名称：长形赖氨酸芽孢杆菌

拉丁名：Lysinibacillus macrolides.

菌株编号：C1

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：中国北京(朝阳区北辰西路1号院3号)

保藏日期：2019年07月29日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18349

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

图1是本发明优选实施例的长形赖氨酸芽孢杆菌C1的菌落形态图；图2是本发明优选实施例的长形赖氨酸芽孢杆菌C1的菌体扫描电镜图；图3是本发明优选实施例的长形赖氨酸芽孢杆菌C1的菌体透射电镜图；图4是本发明优选实施例5的盆栽试验中番茄上部分和根部表现图；图5是本发明优选实施例6的田间试验中黄瓜地上部分和地下部分表现图。

图1、图2和图3所示，本发明的优选实施例提供了一种长形赖氨酸芽孢杆菌，经鉴定为长形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macrolides)，菌株名为C1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18349，保藏日期为2019年07月29日。本发明的长形赖氨酸芽孢杆菌，提供了一株新的长形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacrolides)C1，该菌株具有良好的防治植物根结线虫活性，为植物线虫生物防治的研发奠定了基础。并且，该菌株具有良好的促进作物生长的特性，为微生物肥料的应用提供基础。将长形赖氨酸芽孢杆菌C1在牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上划线培养，如图1所示，菌落为圆形，淡黄色、光滑、菌落有光泽、边缘较整齐，如图2和图3所示，电镜镜检发现菌体呈长杆状，上述形态特征表明菌株长形赖氨酸芽孢杆菌C1属于芽孢杆菌属。

本实施例中，长形赖氨酸芽孢杆菌C1经16S rDNA序列测得序列如SEQ ID No.1所示。提取长形赖氨酸芽孢杆菌C1菌株的总DNA，采用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增，扩增得到长形赖氨酸芽孢杆菌C1的16S rDNA序列。引物序列如下：27F：5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。对长形赖氨酸芽孢杆菌C1的16S rDNA序列进行测序，测得序列如SEQ ID No.1所示。通过Blast分析，表明长形赖氨酸芽孢杆菌C1与Lysinibacillus macrolides聚在一个分支上，同源性为99.38％。

本实施例中，长形赖氨酸芽孢杆菌C1从黄瓜种植地土壤中分离筛选所得。上述长形赖氨酸芽孢杆菌C1来源于湖南省长沙县春华基地黄瓜地块中。

根据本发明的另一方面，还提供了一种包含上述长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂。本发明的长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂，可应用于制备防治植物线虫的产品中，对生态环境及人体健康友好，其制备方法和使用过程均十分简单、方便，在生产过程中没有使用有机溶剂，从而降低了对环境的污染程度。并且，对环境友好、对人畜无毒、对作物无药害、施用简单方便等特点，且不易使病虫害产生耐药性。

根据本发明的另一方面，还提供了一种如上述长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法，

S1、斜面种子培养：将长形赖氨酸芽孢杆菌C1的菌体划线至斜面培养基上进行培养；

S2、液体种子培养：从步骤S1中的斜面挑取经活化的单菌落接种于液体种子培养基中培养，振荡，获得种子培养液；

S3、发酵培养：将步骤S2中的种子培养液接种于发酵培养基，振荡，获得发酵培养物；

S4、发酵液的制备：收集步骤S3中的发酵培养物中的发酵液，获得长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂；

本实施例中，步骤S1中的斜面种子培养的温度为25℃～30℃，培养时间为30h～40h；步骤S2中的液体种子培养的温度为25℃～30℃，振荡转速为180r/min～250r/min，培养时间为20h～30h；步骤S3中的发酵培养的温度为25℃～30℃，振荡转速为180r/min～250r/min，培养时间为65h～75h，种子培养液接种量为2％～5％。

根据本发明的另一方面，还提供了一种长形赖氨酸芽孢杆菌生防药剂，将上述长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂进行离心处理，收集上清液，过滤，获得长形赖氨酸芽孢杆菌生防药剂。将长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂在8000r/min～10000r/min离心10min，收集上清液，过滤，获得长形赖氨酸芽孢杆菌生防药剂。

根据本发明的另一方面，还提供了一种如上述长形赖氨酸芽孢杆菌、长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂或者长形赖氨酸芽孢杆菌生防药剂在防治植物线虫的应用，防治植物线虫包括秀丽小杆线虫、南方根结线虫、北方根结线虫、爪哇根结线虫、象耳豆根结线虫或禾本科拟根结线虫等。

根据本发明的另一方面，还提供了一种防治植物线虫的产品，其活性成分包括上述长形赖氨酸芽孢杆菌、长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂或者长形赖氨酸芽孢杆菌生防药剂

根据本发明的另一方面，还提供了一种如上述长形赖氨酸芽孢杆菌、长形赖氨酸芽孢杆菌的微生物菌剂或者长形赖氨酸芽孢杆菌生防药剂在促进作物生长的应用。

根据本发明的另一方面，还提供了一种生物肥料，其包括上述长形赖氨酸芽孢杆菌、长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂或者长形赖氨酸芽孢杆菌生防药剂。

实施例

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

长形赖氨酸芽孢杆菌C1

(1)长形赖氨酸芽孢杆菌C1的分离

2018年7月在湖南省长沙县春华基地黄瓜地块，取样器长度为55cm，直径为2cm，用取样器取抗线虫黄瓜根际10cm深的土壤，随机取五点，共取5份土样，将所得土样混匀，装入自封袋内，带回实验室处理。称取土样2g，加入装有18mL无菌水的锥形瓶中，220r/min震荡30min。配成1×10^-2～1×10^-6系列梯度土壤悬液。分别吸取不同梯度土壤悬液200μL，均匀涂到牛肉膏蛋白胨平板上，每个浓度重复3次。放置于28℃培养箱中培养，2d～5d后，根据菌落的颜色、形状、边缘、透明度、光泽度等表面特征，选取单菌落，在牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上划线3次，获得纯培养，待长好后，置于冰箱中保存。

(2)长形赖氨酸芽孢杆菌C1的鉴定

A、菌株形态表观鉴定：

通过观察菌体的颜色、大小、形态、边缘、透明度、光泽度、培养基的颜色等观察个体形态特征。将长形赖氨酸芽孢杆菌C1在牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板上划线培养，如图1所示，长形赖氨酸芽孢杆菌C1菌落为圆形，淡黄色、光滑、菌落有光泽、边缘较整齐。如图2和图3所示，电镜镜检发现菌体呈长杆状，上述形态特征表明菌株长形赖氨酸芽孢杆菌C1属于芽孢杆菌属。

牛肉膏蛋白胨固体培养基：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gNaCl，20g琼脂，1000mL蒸馏水。

B、生理生化测定：

测定淀粉水解实验、甲基红试验实验、伏-普试验、菌膜形成实验、H₂O₂酶等生理生化实验。测试结果如表1所示。

表1长形赖氨酸芽孢杆菌C1生理生化实验测定指标

注：“-”表示阴性，“+”表示阳性

C、分子鉴定：

采用试剂盒法提取长形赖氨酸芽孢杆菌C1菌株的基因组DNA。以提取的DNA为模板，进行PCR扩增，引物采用通用引物27F和1492R，引物序列如下：27F：5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃1min，56℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min，4℃保温。PCR反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格后送生工生物工程(北京)有限公司测序。

经测序获得长形赖氨酸芽孢杆菌C1的16S rDNA序列，测得序列如SEQ ID No.1所示，通过Blast分析，表明长形赖氨酸芽孢杆菌C1与Lysinibacillus macrolides聚在一个分支上，同源性为99.38％。结合前述的菌株形态特征和生理生化性能，为长形赖氨酸芽孢杆菌。

长形赖氨酸芽孢杆菌C1微生物菌剂

S1、斜面种子培养：将长形赖氨酸芽孢杆菌C1的菌体无菌划线至牛肉膏蛋白胨琼脂培养基斜面上，28℃下培养36h；

S2、液体种子培养：从步骤S1中的斜面上挑取经活化的单菌落接种于液体种子培养基中培养，振荡转速为200r/min，温度为28℃，培养24h，获得种子培养液；

S3、发酵培养：将步骤S2中的种子培养液按接种量5％接种于发酵培养基，振荡转速为200r/min，温度为28℃，发酵时间为72h，获得OD₆₀₀值为4的发酵培养物，活菌数为5×10⁹CFU/ml；

S4、发酵液的制备：收集步骤S3中的发酵培养物中的发酵液，获得长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂；

牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，1000mL去离子水，pH7.0，121℃灭菌30min。

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、液体种子培养基、发酵培养基与牛肉膏蛋白胨液体培养基主成分相同，各组分配比不同。

实施例1

用实验室保存的大肠杆菌(JM109)培养过夜，收集菌体，涂布于NGM培养基上，用细长柔软的羽毛将秀丽小杆线虫涂布于有大肠杆菌的NGM培养基上，置于20℃～25℃培养箱培养3d～5d。处理前将秀丽小杆线虫用1mg/mL硫酸链霉素消毒15min～20min，无菌去离子水洗3次。

NGM培养基：A.配置以下试剂：1M KPO₄缓冲液：108.3g KH₂PO₄、35.6g K₂HPO₄加水至1升(高压灭菌)、1M MgSO₄(高压灭菌)、1M CaCl₂(高压灭菌)、5mg/ml胆固醇(用无水乙醇配置，配完后，过滤，4℃保存)；B.称取3g NaCl、2.5g蛋白胨20g Agar到锥形瓶中，加入975mlH₂O，高压灭菌，121℃20min；C.待培养基冷却至55℃时，加入25ml 1M KPO₄缓冲液、1ml 1MCaCl₂、1ml 1M MgSO4、1ml 5mg/ml胆固醇，混匀。

以幼虫期秀丽小杆线虫为初筛靶标线虫，用长形赖氨酸芽孢杆菌C1生防药剂进行室内触杀测定实验。在24孔板上的每孔中加入0.9mL待测长形赖氨酸芽孢杆菌C1生防药剂和0.lmL秀丽小杆线虫悬浮液(约100条线虫)，放入28℃恒温箱中孵化，为处理组。同时，设置牛肉膏蛋白胨液体培养基为对照组，试验重复3次。分别在24h和48h后在倒置显微镜下观察，以针刺法判定线虫的死活，根据以下公式计算其死亡率和校正死亡率。下述公式中秀丽小杆线虫简称为线虫。

死亡率(％)＝死亡的线虫数÷观察的线虫总数×100

校正死亡率(％)＝(处理组线虫死亡率－对照组线虫死亡率)÷(100－对照组线虫死亡率)×100

如表2所示，以牛肉膏蛋白胨液体培养基为对照组在3d内秀丽小杆线虫致死率仅为7.05％，而经过长形赖氨酸芽孢杆菌C1生防药剂处理的秀丽小杆线虫致死率达到95.39％，校正死亡率可达95.04％，说明长形赖氨酸芽孢杆菌C1生防药剂对幼虫期秀丽小杆线虫具有显著杀虫活性。

表2对秀丽小杆线虫的影响

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 18.0检验，P≤0.05)

实施例2

将长形赖氨酸芽孢杆菌C1生防药剂加入24孔板中，每孔加入900μl，然后取100个南方根结线虫虫卵与长形赖氨酸芽孢杆菌C1生防药剂均匀混合，重复三次，设置牛肉膏蛋白胨液体培养基为对照；将24孔板放置在25℃恒温箱中，5天后于体式显微镜下观察计数，并计算南方根结线虫卵孵化率和相对抑制率。下述公式中南方根结线虫简称为线虫。

虫卵孵化率(％)＝孵化线虫的平均数÷虫卵的平均数×100

相对抑制率(％)＝(对照组孵化线虫平均数－处理组孵化线虫平均数)÷对照组孵化线虫平均数×100

长形赖氨酸芽孢杆菌C1生防药剂对南方根结线虫虫卵孵化情况如表2所示，以牛肉膏蛋白胨液体培养基为对照组在5d后虫卵的孵化率达到92.3％，但是经过长形赖氨酸芽孢杆菌C1生防药剂处理的虫卵孵化率仅为24.1％，显著抑制了南方根结线虫虫卵的孵化，相对抑制率可达到74.5％，说明长形赖氨酸芽孢杆菌C1生防药剂能够有效的抑制南方根结线虫虫卵的孵化。

表3对南方根结线虫的影响

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 18.0检验，P≤0.05)

实施例3

将长形赖氨酸芽孢杆菌C1生防药剂加入24孔板培养板的穴孔内，每孔加900μL；取新鲜饱满的南方根结线虫雌虫，大小基本一致，0.5％次氯酸钠溶液表面消毒2min，无菌水冲洗3次，放入装有待测的长形赖氨酸芽孢杆菌C1生防药剂穴孔内，每个穴孔放2个雌虫。每个处理重复3次，25℃下孵化。5d后观察统计孵化出的南方根结线虫的数量。计算南方根结线虫雌虫孵化的相对抑制率。设置牛肉膏蛋白胨液体培养基为对照组。下述公式中南方根结线虫简称为线虫。

相对抑制率(％)＝100×(对照组孵化线虫平均数－处理组孵化线虫平均数)÷对照组孵化线虫平均数。

长形赖氨酸芽孢杆菌C1生防药剂对南方根结线虫雌虫孵化情况如表4所示，经过长形赖氨酸芽孢杆菌C1生防药剂处理的南方根结线虫雌虫孵化的相对抑制率达到95.33％，显著抑制了南方根结线虫雌虫的孵化，显示出其良好的应用开发前景。

表4对南方根结线虫雌虫孵化的影响

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 18.0检验，P≤0.05)

实施例4

(1)根结线虫二龄幼虫的获得

南方根结线虫、北方根结线虫、爪哇根结线虫、象耳豆根结线虫及禾本科拟根结线虫用感病品种室内盆栽接种方式保存。接种40d～50d后，在根系有大量雌虫出现，将根系用水轻轻冲洗，小心取下雌虫，放在0.5％次氯酸钠溶液中消毒3min，再用无菌水冲洗3次，放在盛有少量无菌水的培养皿内，25℃培养4d，每隔24h收集一次新孵化的根结线虫二龄幼虫，室温保存备用。

(2)长形赖氨酸芽孢杆菌C1对根结线虫二龄幼虫的活性检测

每一种根结线虫二龄幼虫分别设置以下2个处理，五种线虫共计10个处理：

将长形赖氨酸芽孢杆菌C1生防药剂加入24孔板培养板的穴孔内，每孔加900μL，加入100μL的根结线虫二龄幼虫溶液(约100条/μL)，每个处理重复4次。在25℃培养箱中培养24h后，在体视显微镜下观察并记录线虫死亡数，计算校正死亡率。该实验操作在无菌环境下进行。设置牛肉膏蛋白胨液体培养基为对照组。死亡率计算公式与实施例1相同。

长形赖氨酸芽孢杆菌C1生防药剂对根结线虫二龄幼虫的影响如表5所示，对南方根结线虫、北方根结线虫、爪哇根结线虫、象耳豆根结线虫和禾本科拟根结线虫的二龄幼虫校正死亡率分别为95.96％、95.20％、94.86％、95.02％和93.14％。综上分析，长形赖氨酸芽孢杆菌C1发酵培养产物对多种根结线虫都具有显著的毒杀效果，具有比较好的防治广谱性。

表5对线虫雌虫孵化的影响

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 18.0检验，P≤0.05)

实施例5

(1)供试材料：供试番茄品种钻红一号(市售)，1.8％阿维菌素水乳剂(日本株式会社)接种根结线虫为南方根结线虫。

(2)试验设计：采用灌根处理法，试验前30天，在育苗盘中经消毒处理的土壤中培育番茄苗。番茄苗长至四片真叶时，挑选长势一致的番茄苗，然后移栽至装满经110℃热力消毒10h的沙土壤的花盆中，置于恒温恒湿温室中，定期浇水施肥，保持土壤肥力和湿度。移栽一个星期后，供试番茄生长稳定后，沿番茄基部松土接根结线虫，每株接种1000条5d～10d，第一次用的长形赖氨酸芽孢杆菌C1微生物菌剂50倍稀释液(标记为处理A)灌根，1.8％阿维菌素水乳剂500倍稀释液(标记为处理B)灌根及牛肉膏蛋白胨液体培养基(标记为处理C)灌根，每个处理20株番茄，每株50mL处理液，设3次重复。15天后第二次处理，方法与第一次处理相同。处理A、处理B和处理C的对照组为各组未经过任何处理的，简称为对照。

(3)调查方法：在第二次处理后30天进行调查，每盆取10株番茄的全部根系，进行根结线虫危害分级，按照以下方法进行根结分级：0级：根系无根结；l级：10％及以下的根系有根结；3级：11～25％根系有根结；5级：26～50％根系有根结；7级：51～75％根系有根结；9级：75％以上根系有根结，计算病情指数和防治效果；同时测定番茄的株高、根长，按照下面的公式计算增长率、病情指数和防治效果。

株高增长率＝[(处理株高－对照株高)÷对照株高]×100％

根长增长率＝[(处理根长－对照根长)÷对照根长]×100％

病情指数＝[Σ(每各病级植株数×该级代表数值)÷(总株数×最高级别数)]×100％

防治效果＝[(对照病情指数－处理病情指数)÷对照病情指数]×100％

病情指数数据分析如表5所示，经长形赖氨酸芽孢杆菌C1生防药剂处理的番茄南方根结线虫效果极显著，病情指数显著低于对照组，防效可达到73.24％。比阿维菌素效果67.79％更佳。

如图4所示的是盆栽试验各处理组的上部分生长情况和根部防治效果，经长形赖氨酸芽孢杆菌C1微生物菌剂处理的番茄根结较少，根系发达，且植株健壮，同时番茄上部分株高、根长增长率呈现极显著的效果。而牛肉膏蛋白胨液体培养基根结成瘤且上部分萎蔫瘦弱。

表5对番茄南方根结线虫活性及促生作用

实施例6

(1)供试材料：供试黄瓜品种为供试黄瓜品种为鄂黄三号根结线虫感病品种(市售)，1.8％阿维菌素水乳剂(日本株式会社)，试验根结线虫为南方根结线虫。

(2)试验地概况：试验在湖南省长沙县春华镇蔬菜基地简易大棚内进行，面积约120m²，土壤为沙壤土，肥力中等，常年种植蔬菜灌溉条件良好，历年均有根结线虫病发生，发病程度中等。

(3)试验设计：田间试验共设5个处理，

A、5×10⁹CFU/mL长形赖氨酸芽孢杆菌C1微生物菌剂50倍稀释液；

B、5×10⁹CFU/mL长形赖氨酸芽孢杆菌C1微生物菌剂100倍稀释液；

C、5×10⁹CFU/mL长形赖氨酸芽孢杆菌C1微生物菌剂200倍稀释液；

D、1.8％阿维菌素水乳剂800倍液；

E、水为对照组。

按每穴500mL处理液灌穴处理，每一处理重复4次，每个小区10m²，22株黄瓜，各处理按完全随机区组排列，其他水肥管理按常规。4月25日施药，施药后2d定植。

(4)调查方法：

①、根围土壤中根结线虫二龄幼虫数量调查

调查土壤中根结线虫二龄幼虫虫口基数及施药后黄瓜根围土壤中根结线虫二龄幼虫数量。各小区分别于黄瓜施药前、施药后30d(5月25日)、75d(7月9日，黄瓜拉秧)每小区5点取土样，带回实验室混匀后取100mL土壤，采用浅盆法分离土壤内的根结线虫二龄幼虫，24h后收集根结线虫液计数，并计算虫口减退率。

虫口减退率(％)＝[(施药前根结线虫二龄幼虫数－施药后根结线虫二龄幼虫数)÷药前根结线虫二龄幼虫数]×100％。

②、防治效果调查

在黄瓜拉秧时每小区随机取10株进行根结情况调查。病情指数计算采用0～4级的分级标准进行病情分级，统计病情指数，并计算防效效果。

病情分级标准如下：0级，无根结；1级，有根结的根系占全根系的1％～25％；2级，有根结的根系占全根系的26％～50％；3级，有根结的根系占全根系的51％～75％；4级，有根结的根系占全根系的76％～100％。

防治效果(％)＝[(对照组病情指数－药剂处理后病情指数)÷对照组病情指数]×100％。

③、黄瓜长势及产量调查分别在黄瓜苗期(5月10日)与坐果期(5月30日)每小区随机选取10株黄瓜进行调查，测量黄瓜株高，观察黄瓜长势。记录每小区采收的黄瓜产量，计算增产率。

增产率(％)＝(药剂处理后黄瓜产量－对照组产量)÷对照组产量×100

如表6所示，对黄瓜根围土壤中根结线虫二龄幼虫种群数量进行调查表明，与对照组相比，3种不同浓度的长形赖氨酸芽孢杆菌C1微生物菌剂都能显著降低黄瓜根围土壤中根结线虫二龄幼虫的种群数量，尤其是50倍液时30d虫口减退率达78.57％。但是，长形赖氨酸芽孢杆菌C1微生物菌剂对根结线虫二龄幼虫的作用比阿维菌素稍差，持效期也相对较短，到75d时虫口减退率明显降低。

表6对番茄南方根结线虫活性及促生作用

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 18.0检验，P≤0.05)

如表7所示，各浓度的长形赖氨酸芽孢杆菌C1微生物菌剂对黄瓜根结线虫病都有一定的防治效果，50倍稀释液的防效可达到82.76％，与阿维菌素(86.22％)防效没有显著性差异。图5是田间试验各处理组的地上部分生长情况和根部防治效果图。施用后分别于苗期(施药后15d)和坐果期(施药后35d)对黄瓜株高进行测量，结果表明，3种不同浓度的长形赖氨酸芽孢杆菌C1微生物菌剂稀释液对黄瓜生长都具有一定的促进作用，与对照组达到显著性差异。特别50倍稀释液对黄瓜生长的刺激作用最明显，苗期及坐果期株高分别比对照组增长了3.3cm和24.6cm。同时，与对照组相比，各处理产量与对照组相比均有显著增长(P<0.05)。其中以50倍稀释液对黄瓜增产作用最为明显，与对照组相比，增产率达到21.97％，显著优于对照药剂阿维菌素处理(增产率为11.31％)对黄瓜的增产作用。从上述结果看出，长形赖氨酸芽孢杆菌C1微生物菌剂不仅对根结线虫具有良好的防治效果，同时能促进作物生长，提高作物产量，具有有较好的应用前景。

表7对黄瓜南方根结线虫防治及增产效果

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 18.0检验，P≤0.05)

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖南植物保护研究所

<120> 长形赖氨酸芽孢杆菌、微生物菌剂、生防药剂及其制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1450

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgcctaggc gtgctataca tgcaagtcga gcgaacagaa aaggagcttg ctcctttgac 60

gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gcaacctacc ctatagtttg ggataactcc 120

gggaaaccgg ggctaatacc gaataatctc ttttacttca tggtgaaaga ctgaaagacg 180

gtttcggctg tcgctatagg atgggcccgc ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc 240

tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga 300

cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg gcgaaagcct 360

gatggagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg ttttcggatc gtaaaactct gttgtaaggg 420

aagaacaagt acagtagtaa ctggctgtac cttgacggta ccttattaga aagccacggc 480

taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg 540

gcgtaaagcg cgcgcaggcg gtcctttaag tctgatgtga aagcccacgg ctcaaccgtg 600

gagggtcatt ggaaactggg ggacttgagt gcgaagagaa gtgaattcca agtgtagcgg 660

tgaaatgcgt agagatttgg aggaacacca gtggcgaagg cgactttctg gtctgtaact 720

gacgctgagg cgcgggaaag ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 780

taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt 840

aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc 900

cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct 960

tgacatcccg ttgaccactg tagagatata gtttcccctt cgggggcaac ggtgacaggt 1020

ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080

aacccttgat cttagttgcc atcatttagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa 1140

accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200

gtgctacaat ggacgataca aacggttgcc aactcgcgag agggagctaa tccgataaag 1260

tcgttctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagccggaa tcgctagtaa 1320

tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380

ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct ttggagccag ccgccgaagt 1440

gcatcgaggg 1450

Claims (10)

1.一种长形赖氨酸芽孢杆菌，其特征在于，经鉴定为长形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macrolides)，菌株名为C1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18349，保藏日期为2019年07月29日。

2.根据权利要求1所述的长形赖氨酸芽孢杆菌，其特征在于，

长形赖氨酸芽孢杆菌C1经16S rDNA序列测得序列如SEQ ID No.1所示。

3.一种包含权利要求1或2所述的长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂。

4.一种如权利要求3所述的长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法，其特征在于，

S1、斜面种子培养：将长形赖氨酸芽孢杆菌C1的菌体划线至斜面培养基上进行培养；

S2、液体种子培养：从步骤S1中的斜面挑取经活化的单菌落接种于液体种子培养基中培养，振荡，获得种子培养液；

S3、发酵培养：将步骤S2中的种子培养液接种于发酵培养基，振荡，获得发酵培养物；

S4、发酵液的制备：收集步骤S3中的发酵培养物中的发酵液，获得长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂。

5.根据权利要求4所述的长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法，其特征在于，

所述步骤S1中的斜面种子培养的温度为25℃～30℃，培养时间为30h～40h；和/或

所述步骤S2中的液体种子培养的温度为25℃～30℃，振荡转速为180r/min～250r/min，培养时间为20h～30h；和/或

所述步骤S3中的发酵培养的温度为25℃～30℃，振荡转速为180r/min～250r/min，培养时间为65h～75h，所述种子培养液接种量为2％～5％。

6.一种长形赖氨酸芽孢杆菌生防药剂，其特征在于，将权利要求3所述的长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂进行离心处理，收集上清液，过滤，获得所述长形赖氨酸芽孢杆菌生防药剂。

7.一种如权利要求1所述的长形赖氨酸芽孢杆菌、权利要求3所述的长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂或者权利要求6所述的长形赖氨酸芽孢杆菌生防药剂在防治植物线虫的应用，其特征在于，

所述防治植物线虫包括秀丽小杆线虫、南方根结线虫、北方根结线虫、爪哇根结线虫、象耳豆根结线虫或禾本科拟根结线虫。

8.一种防治植物线虫的产品，其特征在于，其活性成分包括权利要求1所述的长形赖氨酸芽孢杆菌、权利要求3所述的长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂或者权利要求6所述的长形赖氨酸芽孢杆菌生防药剂。

9.一种如权利要求1所述的长形赖氨酸芽孢杆菌、权利要求3所述的长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂或者权利要求6所述的长形赖氨酸芽孢杆菌生防药剂在促进作物生长的应用。

10.一种生物肥料，其特征在于，其包括权利要求1所述的长形赖氨酸芽孢杆菌、权利要求3所述的长形赖氨酸芽孢杆菌微生物菌剂或者权利要求6所述的长形赖氨酸芽孢杆菌生防药剂。

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