CN114480187A - 一种可同时用于降解黄曲霉素b1和纤维素的赖氨酸芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种可同时用于降解黄曲霉素b1和纤维素的赖氨酸芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种可同时用于降解黄曲霉素B1和纤维素的赖氨酸芽孢杆菌及其应用，属于微生物学技术领域，本发明所提供的赖氨酸芽孢杆菌为赖氨酸芽孢杆菌HQ08(Bacillus lysinosus)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.24221，其16S rDNA如SEQ ID NO.1所示。本发明所提供的赖氨酸芽孢杆菌可以有效的降解黄曲霉素B1，从而将被黄曲霉素B1污染的饲料转变为无危害的饲料。

Description

一种可同时用于降解黄曲霉素B1和纤维素的赖氨酸芽孢杆菌 及其应用
技术领域
本发明属于微生物学技术领域，尤其涉及一种可同时用于降解黄曲霉素B1和纤维素的赖氨酸芽孢杆菌及其应用。
背景技术
黄曲霉素B1是黄曲霉菌株所产生的毒素，是污染粮食作物的主要霉菌毒素之一。在日常生活中，农副产品较易感染产黄曲霉毒素的霉菌。发霉变质的花生、玉米、小麦，变质的大米、发苦的坚果、小作坊自榨油、久泡的木耳、未经清洗的砧板等等都会存在不同程度的接触黄曲霉毒素。
对于含有黄曲霉毒素B1的食品和饲料，可通过普通消毒方式对其进行消毒，但是普通的消毒方式无法消灭黄曲霉毒素。因此，黄曲霉毒素B1的微生物降解技术是当前研究的热点。
发明专利申请号201710960078.1，一种降解黄曲霉B1的荚膜红细菌菌株及其应用和一种防霉剂及其应用提供了一种降解黄曲霉毒素B1的荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）菌株ZCU1,保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14603。该发明提供的菌株能够有效的降解黄曲霉B1，降解率能够达到70-80%。
发明专利申请号201710528185.7，一种产黄曲霉素B1降解酶的枯草芽孢杆菌及其应用提供了一种产黄曲霉素B1降解酶的枯草芽孢杆菌HDR-02，保藏与中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016298。该发明提供的菌株能够对黄曲霉毒素B1脱毒能力强，24小时的黄曲霉毒素B1的脱毒率达到了75.7%。
然而，目前在赖氨酸芽孢杆菌中尚未见抑制黄曲霉毒素B1的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可同时用于降解黄曲霉素B1和纤维素的赖氨酸芽孢杆菌及其应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种可同时用于降解黄曲霉素B1和纤维素的赖氨酸芽孢杆菌，所述赖氨酸芽孢杆菌命名为赖氨酸芽孢杆菌HQ08 (Bacillus lysinosus)，所述赖氨酸芽孢杆菌HQ08保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No. 24221，保藏日期为2021年12月30日。
优选地，所述赖氨酸芽孢杆菌HQ08的16S rDNA如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述赖氨酸芽孢杆菌HQ08的活化方法为，将所述赖氨酸芽孢杆菌HQ08接种于LB培养基中25-30℃温度调节下培养8-10h。
其次，本发明提供了一种用于降解饲料中黄曲霉素B1的菌剂，所述菌剂的活性成分为权利要求1中所述赖氨酸芽孢杆菌HQ08。
优选地，每毫升所述菌剂中含有1.0*108cfu-1.0*109cfu的赖氨酸芽孢杆菌HQ08。
其次，本发明提供了赖氨酸芽孢杆菌HQ08在制备降解黄曲霉素B1的菌剂中的应用，所述菌剂中含有1.0*108cfu-1.0*109cfu的赖氨酸芽孢杆菌HQ08。
最后，本发明提供了赖氨酸芽孢杆菌HQ08在制备低黄曲霉素B1饲料中的应用，所述饲料的制备包括如下步骤：
（1）将霉变的饲料和所述赖氨酸芽孢杆菌HQ08按照比例混合，调整发酵条件；
（2）发酵48-72h后，得到低黄曲霉素B1饲料。
优选地，所述饲料包括对虾饲料或刺参饲料。
优选地，所述比例为赖氨酸芽孢杆菌占比3-8%；所述发酵条件为发酵温度25-35℃。
本发明的有益效果是：
（1）本发明中的赖氨酸芽孢杆菌HQ08可以降解被AFB1污染的饲料原料中的AFB1，降解率高达92%以上，使被污染的饲料原料的AFB1含量降低到较低水平，从而变为对动物没有危害的饲料原料。
（2）本发明中的赖氨酸芽孢杆菌HQ08降解饲料原料中的纤维素，使之转化为可以被动物吸收利用的可溶性多糖，从而进一步提高饲料原料的营养价值。
附图说明
图1赖氨酸芽孢杆菌HQ08的纤维素降解能力
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
实施例1
菌株的筛选
（1）配置筛选培养基1L：硫酸铵 5g，硫酸二氢钾2.5g，硫酸镁1g，磷酸氢二钠0.5g，琼脂粉15-20g，pH调整为7, 120℃灭菌30min，冷却至室温后添加黄曲霉素B1标准品，调节终浓度为1μg/ml；
（2）称取1g土壤，溶解于100ml无菌的蒸馏水中，室温静置5min，取上清用灭菌蒸馏水稀释成不同浓度梯度，取1ml涂布于筛选培养基，37℃培养；
（3）挑取形态不同的单菌落使用LB液体培养基进行扩大培养，使用灭菌蒸馏水稀释，取1ml涂布于筛选培养基中，37℃培养；
（4）挑取单菌落，采用划线方法对菌株进行纯化，挑取生长一致的菌落进行降解率检测；
（5）将降解黄曲霉素B1能力较高的菌株（命名为HQ08）扩大培养后，按照菌液：50%甘油=1:1进行混合，置于-80℃保存。
实施例2
菌株的鉴定
（1）提取菌液的总DNA，作为菌液PCR模板，使用27F和1492R引物进行PCR扩增；
（2）PCR扩增反应体系（10μl）如下：
cDNA 1μl、10×Buffer 1μl、2.5 mM dNTP 0.8μl、10μM正反引物各0.5μl，rTaq酶0.05μl、2H2O 6.15μl；
（3）设计的PCR引物的序列如下
名称 序列(5’-3’)
27F16s AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1492R16s GGTTACCTTGTTACGACTT
M13(-47) CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
M13(-48) AGCGGATAACAATTTCACACAGGA
（4）PCR反应条件为：
94℃ 5min；94℃ 30s，51℃ 30s，72℃ 1min，30个循环，72℃ 10min；
（5）整个反应结束之后，反应产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下将目的条带切回，按照上海生工SanPrep柱式试剂盒说明书进行DNA回收、纯化；
（6）回收产物与PMD18-T克隆载体进行连接，16℃连接过夜，获得目的菌株基因序列PMD18-T重组载体，连接体系如下：回收产物 4.5μl，PMD18-T 0.5μl，
（7）将连接产物全部转入已制备好的大肠杆菌感受态DH5α中，碎冰浴30 min，42℃热激30s，置于冰上；
（8）加入650 μL已经预热至37℃的LB培养基，37℃震荡培养1h，然后5000 rpm离心3 min，弃大部分上清，将剩余约150 μL上清与沉淀吹打混匀，涂布于含有100 mg/mL氨苄青霉素钠（Amp）的LB平板上，37℃正置培养1h后，再倒置培养12-16h；
（9）挑取平板上长势良好的单菌落，37℃培养6h后，用特异引物27F和1492R进行阳性克隆的筛选，将连接正确的菌液送至上海桑尼生物公司测序。最后，将目的菌株的cDNA序列进行Blast比对，确定菌株种属。
实施例3
菌株活化条件
（1）配置LB培养基，LB培养基的配方如下：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L；
（2）将赖氨酸芽孢杆菌菌株HQ08，接种到LB培养基中，在25-30℃的温度条件下培养8-10小时，得到活化后的赖氨酸芽孢杆菌HQ08。
实施例4
赖氨酸芽孢杆菌HQ08对于AFB1的降解作用
（1）在三角烧瓶中加入过60目筛的花生粕98.5g，加入蛋白胨和酵母提取物各1和0.5g，混匀后121℃灭菌30min；
（2）冷却至室温后，加入50ml灭菌蒸馏水，2ml目标菌株子液（细菌含量为1.0*109cfu/ml）和AFB1标准品50μg，对照组加入2ml灭菌蒸馏水和50μg AFB1标准品；
（3）混合均匀后，保持30℃发酵5天，然后分析花生粕中AFB1含量以计算降解率。
表1 HQ08对花生粕中AFB1的降解率
Figure RE-RE-DEST_PATH_IMAGE001
实验结果发现，随时间延长，AFB1含量逐渐降低，表明降解率随时间延长逐渐增大，到第三天时接近最大，而时间继续延长，其降解率也没有明显提高，因此实验以3天为发酵时间;
发酵3天后AFB1含量仅为3.82μg，降解率达到92.35%。而对照中AFB1的含量仍为50μg，没有变化，说明本发明所提供的赖氨酸芽孢杆菌HQ08可以有效降解AFB1。
实施例5
赖氨酸芽孢杆菌HQ08对于纤维素的降解作用
（1）配置CMC-刚果红培养基（1L），培养基成分如下：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）15g，KH2PO4 2g，MgSO4 0.2g，NaCl 5g，刚果红 0.2g，蛋白胨 5g，琼脂粉 15-20g；
（2）将活化的菌种用灭菌的牙签点种到CMC-刚果红培养基上，35℃培养48h，观察水解圈直径的大小，并测量水解圈和菌落的直径，计算两者直径比；
实验结果发现，HQ08菌株的直径比为2.1，该结果说明HQ08菌株具有较强的降解纤维素能力。
实施例6
赖氨酸芽孢杆菌HQ08处理后的AFB1污染饲料对于南美白对虾生长的影响
（1）实验组：将含1500μg/kg AFB1的花生粕（过80目筛，含量10%）经过赖氨酸芽孢杆菌HQ08发酵处理后，与过80目筛的白鱼粉、虾壳粉、豆粕、高筋面粉和鱼油等，按照如下比例混合，制成团；
表2 南美白对虾饲料配方
成分 用量/kg
白鱼粉 28
虾壳粉 4
豆粕 10
花生粕 20
高筋面粉 34
鱼油 1
添加剂 3
合计 100
（2）用F-26型双螺杆挤条机制成条状（直径1mm），55-60℃烘干，切碎成0.5cm的饲料颗粒，密封，干燥保存，待用；
（3）对照组1：饲料中花生粕不加入AFB1和赖氨酸芽孢杆菌HQ08发酵；对照组2：花生粕加入AFB1后，不经过赖氨酸芽孢杆菌HQ08发酵，其他步骤与发酵处理的相同；
（4）选取初始体重5g的南美白对虾，经过60天的饲喂，结束后记录对虾的体重，计算对虾的增重率，计算公式如下：
增重率（WG，%）=（Wt- W0）/W0×100；
Wt：终末体重（g），W0：初始体重（g）；
（5）实验中，每个处理设置3个重复；
（6）实验结果如表3所示：
表3 饲喂不同饲料后南美白对虾的增重率
实验分组 初始体重/g 终末体重/g 增重率/% 发酵前AFB1含量/μg/kg 发酵后AFB1含量/μg/kg
对照组1 5.0 18.6±0.79 272.0±15.7 0 0
对照组2 5.0 14.46±0.57 189.2±11.5 300 300
实验组 5.0 18.25±0.71 265.0±14.3 300 25
从实验结果中，可以看出，对照组1的终末体重分别为17.9g、19.7g和18.2g，平均为18.6g。增重率为258%、294%和264%，平均272.0%；对照组2的终末体重分别为13.8g、14.4g和15.2g，平均为14.5g，增重率为176%、188%和204%，平均189.3%；实验组的终末体重分别为18.5g、17.3g和19.0g，平均为18.3g，增重率为270%、246%和280%，平均265.3%。相较于对照组1，对照组2的增重率降低30.2%，实验组中对虾的增重率和对照组无显著差异，说明使用赖氨酸芽孢杆菌HQ08发酵饲料后，可以使被AFB1污染的对虾饲料恢复为正常水平。
实施例7
赖氨酸芽孢杆菌HQ08处理后的AFB1污染饲料对于刺参生长的影响
（1）实验组：将含3000μg/kg AFB1的豆粕（过80目筛，含量10%）经过赖氨酸芽孢杆菌HQ08发酵处理后，与过80目筛的扇贝边粉和马尾藻等，按照比例混合，制成团；
表4刺参饲料配方
成分 用量/kg
马尾藻粉 65
扇贝边粉 22
豆粕 10
添加剂 3
合计 100
（2）用F-26型双螺杆挤条机制成条状（直径1mm），55-60℃烘干，粉碎成100目的饲料颗粒，密封，干燥保存，待用；
（3）对照组1：饲料中不加入AFB1和赖氨酸芽孢杆菌HQ08发酵；对照组2：豆粕加入AFB1后，不经过赖氨酸芽孢杆菌HQ08发酵，其他步骤与发酵处理的相同；
（4）选取初始体重8g的刺参，经过60天的饲喂，结束后记录对虾的体重，计算刺参的增重率，计算公式如下：
增重率（WG，%）=（Wt- W0）/W0×100；
Wt：终末体重（g），W0：初始体重（g）；
（5）实验中每个处理设置3个重复；
（6）实验结果如表5所示。
表5 饲喂不同饲料后刺参的增重率
实验分组 初始体重/g 终末体重/g 增重率/% 发酵前AFB1含量/μg/kg 发酵后AFB1含量/μg/kg
对照组1 8.0 20.3±0.85 153.75±10.7 0 0
对照组2 8.0 15.8±0.70 97.50±8.72 300 300
实验组 8.0 21.1±0.78 163.75±9.74 300 24
从实验结果中，可以看出，对照组1的终末体重分别为19.6g、19.8g和21.5g，平均为20.3g。增重率为145.0%、147.5%和168.8%，平均153.8%；对照组2的终末体重分别为14.9g、19.9g和16.6g，平均为15.8g，增重率为86.3%、98.8%和107.5%，平均97.5%；实验组的终末体重分别为20.1g、21.2g和22.0g，平均为21.1g，增重率为151.3%、165.0%和175.0%，平均163.8%。相较于对照组1，对照组2的增重率降低了36.6%，而实验组的增重率则与对照组1没有明显差异，说明使用赖氨酸芽孢杆菌HQ08发酵饲料后，可以使被AFB1污染的刺参饲料恢复为正常水平。
本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述，当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种可同时用于降解黄曲霉素B1和纤维素的赖氨酸芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1570
<212> DNA
<213> Bacillus lysinosus
<400> 1
cttgctgcct gcaggtcgac gattggttac cttgttacga cttcacccca gtcatgaatc 60
acaaagtggt aagcgccctc ccgaaggtta agctacctac ttcttttgca acccactccc 120
atggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc atgctgatcc 180
gcgattacta gcgattccgg cttcatgtag gcgagttgca gcctacaatc cgaactgaga 240
acgactttat cggattagct ccctctcgcg agttggcaac cgtttgtatc gtccattgta 300
gcacgtgtgt agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc 360
cggtttgtca ccggcagtca ccttagagtg cccaactaaa tgatggcaac taagatcaag 420
ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg 480
caccacctgt caccgttgcc cccgaagggg aaactatatc tctacagtgg tcaacgggat 540
gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg 600
tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc agtcttgcga ccgtactccc caggcggagt 660
gcttaatgcg ttagctgcag cactaagggg cggaaacccc ctaacactta gcactcatcg 720
tttacggcgt ggactaccag ggtatctaat cctgtttgct ccccacgctt tcgcgcctca 780
gcgtcagtta cagaccagaa agtcgccttc gccactggtg ttcctccaaa tctctacgca 840
tttcaccgct acacttggaa ttccactttc ctcttctgca ctcaagtccc ccagtttcca 900
atgaccctcc acggttgagc cgtgggcttt cacatcagac ttaaaggacc gcctgcgcgc 960
gctttacgcc caataattcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc 1020
acgtagttag ccgtggcttt ctaataaggt accgtcaagg tacagccagt tactactgta 1080
cttgttcttc ccttacaaca gagttttacg atccgaaaac cttcttcact cacgcggcgt 1140
tgctccatca ggctttcgcc cattgtggaa gattccctac tgctgcctcc cgtaggagtc 1200
tgggccgtgt ctcagtccca gtgtggccga tcaccctctc aggtcggcta cgcatcgtcg 1260
ccttggtgag ccgttacctc accaactagc taatgcgccg cgggcccatc ctatagcgac 1320
agccgaaacc gtctttcagt ctttcaccat gaagcaaaag agattattcg gtattagccc 1380
cggtttcccg gagttatccc aaactatagg gtaggttgcc cacgtgttac tcacccgtcc 1440
gccgctaacg tcaaaggagc aagctccttt tctgttcgct cgacttgcat gtattaggca 1500
cgccgccagc gttcgtcctg agccaggatc aaactctaat ctctagagga tccccgggta 1560
ccgagctcga 1570

Claims (9)

1.一种可同时用于降解黄曲霉素B1和纤维素的赖氨酸芽孢杆菌，其特征在于，所述赖氨酸芽孢杆菌命名为赖氨酸芽孢杆菌HQ08 (Bacillus lysinosus)，所述赖氨酸芽孢杆菌HQ08保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No. 24221，保藏日期为2021年12月30日。
2.根据权利要求1所述的赖氨酸芽孢杆菌，其特征在于，所述赖氨酸芽孢杆菌HQ08的16S rDNA如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的赖氨酸芽孢杆菌，其特征在于，所述赖氨酸芽孢杆菌HQ08的活化方法为，将赖氨酸芽孢杆菌HQ08接种于LB培养基中25-30℃温度调节下培养8-10h。
4.一种用于降解饲料中黄曲霉素B1的菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分为权利要求1中所述赖氨酸芽孢杆菌HQ08。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，每毫升所述菌剂中含有1.0*108cfu-1.0*109cfu的赖氨酸芽孢杆菌HQ08。
6.赖氨酸芽孢杆菌HQ08在制备降解黄曲霉素B1的菌剂中的应用，其特征在于，所述菌剂中含有1.0*108cfu-1.0*109cfu的赖氨酸芽孢杆菌HQ08。
7.赖氨酸芽孢杆菌HQ08在制备低黄曲霉素B1饲料中的应用，其特征在于，所述饲料的制备包括如下步骤：
（1）将霉变的饲料和所述赖氨酸芽孢杆菌HQ08按照比例混合，调整发酵条件；
（2）发酵48-72h后，得到低黄曲霉素B1饲料。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述饲料包括对虾饲料或刺参饲料。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述比例为赖氨酸芽孢杆菌HQ08占比3-8%；所述发酵条件为发酵温度25-35℃。
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