CN105296382A - 一株连翘内生细菌lq-a及其分离、纯化方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一株连翘内生细菌LQ-A及其分离、纯化方法和应用；所述连翘内生细菌LQ-A，保藏编号为CGMCC？No.10805；该的连翘内生细菌LQ-A的分离与纯化方法，称连翘叶片，水冲洗，依次用乙醇水溶液和HgCl2水溶液对翘叶片的表面进行消毒，无菌水漂洗翘叶片；将叶片剪成正方形，置于研钵中，加无菌水研磨捣碎，取清液进行梯度稀释，用无菌移液管取稀释液涂布于BPA平板上培养；培养后，挑取不同形态的菌落在固体平板上划线纯化，直到分离得到单菌落；挑取镜检时所用的单菌落接种于含有BPA液体培养基的三角瓶中，摇床中培养，蘸取菌悬液接种于斜面培养基上，培养，再转移到冰箱中斜面真空冷冻干燥保存。该菌可用于涂膜保鲜剂的制备，可应用于食品行业和医药行业。
Description
技术领域
本发明涉及一株连翘内生细菌，具体的说是一株连翘内生细菌LQ-A及其分离、纯化方法和应用。
背景技术
连翘出自《神农本草经》，其别名又有旱连子、空翘、落翘、黄奇丹，为木犀科植物连翘Forsythiasuspense的干燥果实，是中国临床常用传统中药之一，具有有抗菌、强心、利尿、镇吐等药理作用，常用其治疗急性风热感冒、淋巴结结核、尿路感染等症，有广谱抗菌作用，是各中药复方（为双黄连口服液、清热解毒口服液、银翘解毒冲剂）中的主要组成药物，国内外已对连翘叶化学成分进行了相关研究，然而对连翘内生菌的研究甚少，对连翘内生菌代谢产物的研究更是微乎其微。
发明内容
本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种连翘内生细菌LQ-A及其分离、纯化方法和应用。
一株连翘内生细菌LQ-A，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年05月13日，保藏编号为CGMCCNo.10805。
所述的连翘内生细菌LQ-A的分离与纯化方法，包括以下步骤：
1、原料及用具的准备
（1）新鲜连翘叶：采新鲜连翘叶,用塑料袋包裹，置于0-4℃冰箱中保存,备用；
（2）研钵和研棒：洗净用报纸包扎好，121℃灭菌30min，备用；
（3）培养皿、锥形瓶和试管：洗净用报纸包扎好，121℃灭菌30min，备用；
（4）10ml和1ml移液管：洗净用报纸包扎好，121℃灭菌30min，备用；
（5）50ml和100ml烧杯：洗净用报纸包扎好，121℃灭菌30min，备用；
2、培养基及化学试剂的配制
（1）培养基:肉汁胨培养基（BPA）:每1000mL培养基中添加牛肉浸膏3.0g、蛋白胨5.0g、酵母膏1.0g、葡萄糖10.0g和琼脂18-20g，余量为蒸馏水；0.1MPa，115℃高温灭菌30min；
肉汁胨液体培养基：每1000mL培养基中添加牛肉浸膏3.0g、蛋白胨5.0g、酵母膏1.0g和葡萄糖10.0g，余量为蒸馏水；0.1MPa，115℃高温灭菌30min；
（2）化学试剂的配制
浓度为1mol/L的NaOH水溶液：称取4gNaOH用80mL水溶解，定容至100mL；
7%Hcl：量取70%Hcl10mL，定容至100mL；质量分数为75%乙醇水溶液：量取99%无水乙醇75mL，用无菌去离子水定容至100mL；质量分数为0.1%HgCl2水溶液：称取0.1gHgCl2用80mL水溶解，加水定容至100mL；质量分数为5%NaClO水溶液：量取10%的NaClO50mL，加入定容至100mL；
3、操作方法
（1）称量并且表面消毒
称连翘叶片5g，用自来水冲洗干净，在无菌操作台上，依次用质量分数为75%乙醇水溶液和质量分数为0.1%HgCl2水溶液对翘叶片的表面进行消毒5分钟，再用无菌水漂洗翘叶片4次；
（2）检验消毒效果
取最后一次无菌水冲洗液，涂布到BPA平板上，37℃培养3天，检验灭菌效果；若发现皿中无菌落出现，证明该叶片表面灭菌彻底，否则该分离结果不能使用；
（3）样品处理
用灭过菌的剪刀将叶片剪成10mm的正方形，置于研钵中，加15ml无菌水反复研磨捣碎，静置30min钟后，用无菌移液管取1ml上清液置于10ml试管中，加水梯度稀释到浓度为10-1-10-4，得到不同浓度的稀释液；用无菌移液管分别取0.2ml不同浓度的稀释液涂布于肉汁胨培养基平板上，每浓度涂平皿一个，重复3次，至于37℃温箱中培养；
（4）纯化
培养3-5d后，挑取不同形态的菌落在固体平板上划线纯化，直到分离得到单菌落；
（5）镜检
挑取单菌落固定在载玻片上，用革兰氏染色法进行染色，干燥后，滴加香柏油，在高倍镜下观察菌落形态；
（6）保存
挑取镜检时所用的单菌落接种于含有BPA液体培养基的三角瓶中，在37℃150r/min摇床中培养12h，至细菌长到对数期，蘸取菌悬液接种于斜面培养基上，37℃培养2d，在试管中观察到s型的菌种，再转移到4℃的冰箱中斜面真空冷冻干燥保存，即得到连翘内生细菌LQ-A。
所述革兰氏染色法为，草酸铵结晶紫染色1min，自来水冲洗，碘液染1min，水洗，95%的酒精脱色20s，水洗，番红复染2min，水洗。
所述的连翘内生细菌LQ-A制备涂膜保鲜剂的方法，包括步骤如下：收集连翘内生细菌A发酵上清液，离心收集上清，0.45μm滤膜过滤；然后按照滤液和质量分数为1%的明胶的体积比为2:1，将滤液添加到质量分数为1%的明胶中，混合均匀后，即制备出涂膜保鲜剂。
有益效果是：
本发明采用表面灭菌研磨的方法处理新鲜连翘叶片，分离纯化得到具有潜在研究价值的连翘内生细菌。以此菌株为原材料进行研究。首先进行分离纯化，抑菌试验，采用传统形态学给予初步鉴定，然后进行分子生物学鉴定，提取菌株DNA，运用凝胶电泳检测PCR扩增产物，将产物送去测序中心进行测序并鉴定，确定该株连翘内生细菌属于枯草芽孢杆菌属。将该菌发酵取上清做抑菌试验，发酵上清液仅对金黄色葡萄球菌有抑制作用，而其他的测试菌均无抑制作用，这为该菌株在食品行业和医药行业的应用提供了理论基础。
生物材料的保藏
连翘内生细菌LQ-A，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，保藏日期为2015年05月13日，保藏单位及其简称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCCNo.10805，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
附图说明
图1为本发明实验中连翘内生细菌LQ-A的单菌落镜检图；
图2为本发明实验中连翘内生细菌LQ-A的对金黄色葡萄球菌的抑菌作用图；
图3为本发明连翘内生细菌LQ-A的镜检图；
图4为本发明实验中连翘内生细菌LQ-A的16srDNA电泳图；
图中标记是：M为marker，A为连翘内生细菌LQ-A；
图5为本发明实验中连翘内生细菌LQ-A的的系统发育树图。
具体实施方式
一株连翘内生细菌LQ-A，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年05月13日，保藏编号为CGMCCNo.10805。
所述的连翘内生细菌LQ-A的分离与纯化方法，包括以下步骤：
1、原料及用具的准备
（1）新鲜连翘叶：采新鲜连翘叶（采自河南科技大学周山校区一号教学楼前的花园）,用塑料袋包裹，置于0-4℃冰箱中保存,备用；
（2）研钵和研棒：洗净用报纸包扎好，121℃灭菌30min，备用；
（3）培养皿、锥形瓶和试管：洗净用报纸包扎好，121℃灭菌30min，备用；
（4）10ml和1ml移液管：洗净用报纸包扎好，121℃灭菌30min，备用；
（5）50ml和100ml烧杯：洗净用报纸包扎好，121℃灭菌30min，备用；
2、培养基及化学试剂的配制
（1）培养基:肉汁胨培养基（BPA）:每1000mL培养基中添加牛肉浸膏3.0g、蛋白胨5.0g、酵母膏1.0g、葡萄糖10.0g和琼脂18-20g，余量为蒸馏水；0.1MPa，115℃高温灭菌30min；
肉汁胨液体培养基：每1000mL培养基中添加牛肉浸膏3.0g、蛋白胨5.0g、酵母膏1.0g和葡萄糖10.0g，余量为蒸馏水；0.1MPa，115℃高温灭菌30min；
（2）化学试剂的配制
浓度为1mol/L的NaOH水溶液：称取4gNaOH用80mL水溶解，定容至100mL；
7%Hcl：量取70%Hcl10mL，定容至100mL；质量分数为75%乙醇水溶液：量取99%无水乙醇75mL，用无菌去离子水定容至100mL；质量分数为0.1%HgCl2水溶液：称取0.1gHgCl2用80mL水溶解，加水定容至100mL；质量分数为5%NaClO水溶液：量取10%的NaClO50mL，加入定容至100mL；
3、操作方法
（1）称量并且表面消毒
称连翘叶片5g，用自来水冲洗干净，在无菌操作台上，依次用质量分数为75%乙醇水溶液和质量分数为0.1%HgCl2水溶液对翘叶片的表面进行消毒5分钟，再用无菌水漂洗翘叶片4次；
（2）检验消毒效果
取最后一次无菌水冲洗液，涂布到BPA平板上，37℃培养3天，检验灭菌效果；若发现皿中无菌落出现，证明该叶片表面灭菌彻底，否则该分离结果不能使用；
（3）样品处理
用灭过菌的剪刀将叶片剪成10mm的正方形，置于研钵中，加15ml无菌水反复研磨捣碎，静置30min钟后，用无菌移液管取1ml上清液置于10ml试管中，加水梯度稀释到浓度为10-1-10-4，得到不同浓度的稀释液；用无菌移液管分别取0.2ml不同浓度的稀释液涂布于肉汁胨培养基平板上，每浓度涂平皿一个，重复3次，至于37℃温箱中培养；
（4）纯化
培养3-5d后，挑取不同形态的菌落在固体平板上划线纯化，直到分离得到单菌落；
（5）镜检
挑取单菌落固定在载玻片上，用革兰氏染色法进行染色，干燥后，滴加香柏油，在高倍镜下观察菌落形态；
（6）保存
挑取镜检时所用的单菌落接种于含有BPA液体培养基的三角瓶中，在37℃150r/min摇床中培养12h，至细菌长到对数期，蘸取菌悬液接种于斜面培养基上，37℃培养2d，在试管中观察到s型的菌种，再转移到4℃的冰箱中斜面真空冷冻干燥保存，即得到连翘内生细菌LQ-A。
所述革兰氏染色法为，草酸铵结晶紫染色1min，自来水冲洗，碘液染1min，水洗，95%的酒精脱色20s，水洗，番红复染2min，水洗。
所述的连翘内生细菌LQ-A制备涂膜保鲜剂的方法，包括步骤如下：收集连翘内生细菌A发酵上清液，离心收集上清，0.45μm滤膜过滤；然后按照滤液和质量分数为1%的明胶的体积比为2:1，将滤液添加到质量分数为1%的明胶中，混合均匀后，即制备出涂膜保鲜剂。
所述连翘内生细菌LQ-A的生物学鉴定，具体步骤如下：
1.实验材料
以上实验所分离纯化得到的连翘内生细菌，该菌株编号标记为A
2.培养基及化学试剂的配制
培养基：BPA培养基
配方：牛肉浸膏3g
蛋白胨5g
酵母浸出粉1g
葡萄糖10g
琼脂15-20g
蒸馏水1000mL
化学试剂的配制
（1）0.5mol／LEDTA(pH8.0)
186.1gEDTA—Na2H20
20gNaOH
加水定容至1000mL(分装后高压灭菌备用)。
（2）2xCTABDNA提取液(高压灭菌备用)
2％(w：v)CTAB
50mmol／LTris-HCl
10mmol／LNa2EDTA
0.7mol／LNaCl
（3）lmol／LTris-HC1(PH8.0l)
121.1gTris碱
42mL浓盐酸
加水定容至1000mL(分装后高压灭菌备用)。
（4）3mol/LNaAc(pH5.2)
408.lgNaAc.3H20
加水定容至1000mL(分装后高压灭菌备用)。
（5）TE缓冲液(高压灭菌备用)
10mmol／LTris-HCl
1mmol／LEDTA(pH8.0)
（6）5xTBE电泳缓冲液贮液
54gTris碱
27.5g硼酸
20mL0.5mol／LEDTA(pH8.0)
加水定容至1000mL。
（7）上样缓冲液(6x)
0.25％溴酚蓝
0.25％二甲苯青FF
15％聚蔗糖
水溶液室温保存。
（8）氯仿：异戊醇，体积比24：1。
（9）酚：氯仿：异戊醇，体积比25：24：1。
（10）75%乙醇：75mL无水乙醇，用无菌去离子水定容至100mL。
3.内生菌活化
按照配方，配制BPA培养基；
将培养基、平皿、试管进行湿热灭菌；
（3）倒平板，待培养基凝固后，在超净工作台无菌环境下将A用划线法接种于BPA平板上，倒置，放在37℃恒温培养箱中培养，得到单菌落，拍照记录菌落形态；
5.内生菌镜检
取无油迹的干净载玻片，滴一滴无菌蒸馏水，用接种环挑取少许菌体，于水滴边缘轻轻涂几下．自然风干，在火焰上通过几次，固定涂片。用结晶紫初染2min，用水冲洗结晶紫液。然后用碘液媒染1min后用水冲洗，将片上的水甩干。再用95％乙醇脱色，最后用番红液复染2min，镜检。
6.生物学鉴定
引物设计及合成
通用引物：27f：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；
1492r：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’；
由上海英骏生物技术有限公司合成。
提取基因组DNA
本发明采用CTAB法提取连翘内生细菌的16srDNA，具体操作方法如下：
（1）菌体培养：将目的菌接种于5mlBPB培养基中，于37℃，150r/min过夜培养（16h），获得足够的菌体。
（2)取10mL菌液，分装于1.5mL离心管中，12000r/min，2min，收集菌体，倒去上清液，注意吸干培养基。
（3）加950mlTE缓冲液，重悬菌体，并加入100μL10%SDS(使用前于37℃预热)，混匀避免核酸酶和机械振荡对DNA的降解，于37℃温浴1h，在冰上加5μL蛋白酶K（20mg/mL），于37℃温浴1h。
（4）加入150μLCTAB/NaCl溶液，混匀后65℃温浴30min后，再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）。
（5）充分混匀，放置10min，12000r/min离心10min，用枪慢慢吸取离心后的上清，再加入等体积的氯仿/异戊醇（24/1）。
（6）重复步骤5）的操作。
（7）充分混匀，放置10min，12000r/min离心10min。
（8）取出上清，加入0.6~0.8倍体积的异戊醇，混匀，室温静置30min后，12000r/min离心2min。
（9）弃去上清，向沉淀中加入1mL70%乙醇洗涤，12000r/min离心2min，倒掉上清，倒置吸水纸自然晾干，加入50μLTE缓冲液溶解DNA，于-20℃冰箱保存。
连翘内生细菌的16srDNA检测，具体步骤如下：
（1）制胶：在电泳槽模板边缘一侧安置梳子，并使其与模板底部有1cm左右的空隙，称取0.225g琼脂糖粉，加入25mL1xTAE缓冲液，在微波炉中加热使之冷却至不烫手为止(60℃左右)充分混匀后，缓缓倒入胶膜内。检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。
（2）加样：待凝胶完全冷却后(于室温放置30-45min)，小心移去梳子，将凝胶放人电泳槽内，加入1xTAE缓冲液于电泳槽内，淹没胶约1cm深。取10μL基因组DNA溶液与1μL上样缓冲液混匀，用微量移液器加入梳孔内，加入3μLDL15000Marker作为DNA分子量标准。
（3）电泳：插入电极，调至电压于80V，稳压电泳约40min。当指示缓冲液距离前沿1cm时，关闭电源。
（4）照相：在紫外透射仪装置上观察，并照相(图4）。
扩增
采用提取基因组做模板，借助引物进行PCR扩增，并用0.9%的琼脂糖凝胶电泳分析，从图4中可以看出提取的基因组DNA的PCR产物的条带，证明了成功的扩增出了含有目的基因的片段。
PCR反应在PCR仪上完成，本实验以细菌通用引物进行PCR扩增。
基因扩增反应体系（50μL）如下：
| 体系成分 | 体积 |
| dNTPs mixture | 4 μL |
| PCR buffer | 5 μL |
| 上游引物27f | 1μL |
| 下游引物1492r | 1 μL |
| 模板DNA | 2 μL |
| Taq酶 | 0.2 μL |
| ddH2O | 37 μL |
PCR反应条件按照以下程序进行：94℃预变性5min，94℃变性1.5min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，然后进行35个循环，循环结束后72℃延伸10min，4℃保存。
PCR产物的电泳检测，具体操作步骤如下：
（1）凝胶的制备：称取0.225g琼脂糖，置于三角瓶中，加入25mLTAE缓冲液，放入微波炉中加热至琼脂糖全部溶解，取出摇匀。混匀后倒入插好梳子的电泳板中。室温静置约30min，使凝固完全。将电泳板放入电泳槽中，小心拔去梳子，准备上样。
（2）加样：10μLPCR反应液加lμLDNA上样缓冲液和1μL核酸染料，混匀后上样，加入3μLDL2000Marker作为DNA分子量标准。
（3）电泳：电压80V，40min。
（4）成像：将凝胶置于凝胶成像仪中拍照。
测序
将PCR扩增产物送去测序公司测序，获得未知菌株16srDNA的基因序列。LQ-A菌株16srDNA基因序列如SEQIDNO:3。
NCBIblast序列检索，并构建系统发育树，具体步骤：
（1）登陆Blast主页：http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/；
（2）填写表单信息，提交任务；
（3）查找与目的菌相似度高的基因序列；
（4）采用Mega5.0软件邻位连接法进行聚类分析，进行1000次的相似度重复计算，构建内生细菌系统发育树进行种属归类，结果其属于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；
相关实验
一、连翘内生细菌LQ-A的抑菌作用试验，具体步骤如下：
1.试验材料
（1）试验菌种：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌。本实验所用菌种大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌均由河南科技大学食品与生物工程学院实验中心提供。
（2）抑制菌：以上分离纯化得到的连翘内生细菌。
（3）培养基：肉汁胨培养基（BPA）:牛肉浸膏3.0g、蛋白胨5.0g、酵母膏1.0g、葡萄糖10.0g、琼脂20g、蒸馏水1000ml。以上不加琼脂即为肉汁胨液体培养基。0.1MPa，115℃高温灭菌30min
2.实验准备
（1）在超净工作台中，用接种环挑取适量的分离纯化得到的连翘内生细菌，然后接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37℃恒温振荡培养箱中培养60小时使菌体达到平稳期的生长状态。用移液管吸1ml在离心机中，12000rpm下离心5min。
（2）在超净工作台中，用接种环挑取适量大肠杆菌，枯草杆菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌等细菌培养物，然后接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37℃恒温振荡培养箱中培养12小时使菌体达到对数生长期。然后用无菌水将原始菌液稀释到不同的倍数，再用722S型分光光度计在420nm处测其稀释后的吸光值，使每种菌液的吸光值都达到0.006，涂布后菌落致密均匀分布。
（3）配制牛肉膏蛋白胨培养基（固体和液体）
（4）洗净各种试验器皿，干燥，放入灭菌锅中灭菌（121℃,30min
3.试验方法
（1）将实验所用器材在高压杀菌锅内灭菌（121℃，30min）
（2）打开超净工作台的紫外灯开关，杀菌十五分钟后，在低风速鼓风条件下进行实验。
（3）用定量移液枪吸取150μl已稀释好的菌液，在已倒好的平板上用涂布棒涂布到均匀致密。
（4）用无菌操作将灭菌的胶头吸管（外径为8毫米、孔径与孔距均为7毫米，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合（以防菌液渗漏，影响结果）
（5）加样：用移液枪吸20ul垂直加入孔中，使样品加至满而不溢为止。
（6）将平皿培养基置于37℃温箱中培养6小时后，观察抑菌圈效果。
4.试验结果
经过几次重复试验，并没有观察到该菌株对枯草芽孢杆菌，沙门氏菌和大肠杆菌的抑制现象，只观察到它们对金黄色葡萄球菌有明显的抑制现象。
二、连翘内生细菌发酵上清液的防腐应用实验
1、涂膜保鲜剂制备
收集连翘内生细菌A发酵上清液，离心收集上清，0.45μm滤膜过滤，滤液添加1%明胶制成涂膜保鲜剂，同时用nisin作为阳性对照，配制成0.2g/Lnisin、1%明胶的涂膜保鲜剂，含1%明胶的PBS作为阴性对照。
2、试验分组
购买新鲜蛋品，分为LQ-A组，Nisin组和PBS组，每组样品选用大小均匀的鸡蛋30颗，分别在沸水中煮沸5s，，再分别用不同的涂膜保鲜剂涂膜处理后，常温下贮藏60天，分别在第10天、20天、30天、40天，50天，60天观察蛋品的新鲜度。
3、试验结果
结果发现，在第10天和20天，LQ-A组和Nisin组都保持较高的新鲜度，蛋黄完整，PBS对照组蛋黄出现小白点；到第40天，LQ-A组蛋黄出现小白点，Nisin组蛋黄保持完整，PBS对照组蛋黄散开；第60天，三组蛋黄均散开，说明LQ-A发酵上清液具有较好的防腐保鲜效果。
序列表
SEQUENCELISTING
<110>河南科技大学
<120>一株连翘内生细菌LQ-A及其分离、纯化方法和应用
<130>1
<160>3
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
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<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tacggytaccttgttacgactt22
<210>3
<211>1419
<212>DNA
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)
<400>3
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Claims (4)
1.一株连翘内生细菌LQ-A，其特征在于：分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年05月13日，保藏编号为CGMCCNo.10805。
2.如权利要求1所述的连翘内生细菌LQ-A的分离与纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
1、原料及用具的准备
（1）新鲜连翘叶：采新鲜连翘叶,用塑料袋包裹，置于0-4℃冰箱中保存,备用；
（2）研钵和研棒：洗净用报纸包扎好，121℃灭菌30min，备用；
（3）培养皿、锥形瓶和试管：洗净用报纸包扎好，121℃灭菌30min，备用；
（4）10ml和1ml移液管：洗净用报纸包扎好，121℃灭菌30min，备用；
（5）50ml和100ml烧杯：洗净用报纸包扎好，121℃灭菌30min，备用；
2、培养基及化学试剂的配制
（1）培养基:肉汁胨培养基:每1000mL培养基中添加牛肉浸膏3.0g、蛋白胨5.0g、酵母膏1.0g、葡萄糖10.0g和琼脂18-20g，余量为蒸馏水；0.1MPa，115℃高温灭菌30min；
肉汁胨液体培养基：每1000mL培养基中添加牛肉浸膏3.0g、蛋白胨5.0g、酵母膏1.0g和葡萄糖10.0g，余量为蒸馏水；0.1MPa，115℃高温灭菌30min；
（2）化学试剂的配制
浓度为1mol/L的NaOH水溶液：称取4gNaOH用80mL水溶解，定容至100mL；
7%Hcl：量取70%Hcl10mL，定容至100mL；质量分数为75%乙醇水溶液：量取99%无水乙醇75mL，用无菌去离子水定容至100mL；质量分数为0.1%HgCl2水溶液：称取0.1gHgCl2用80mL水溶解，加水定容至100mL；质量分数为5%NaClO水溶液：量取10%的NaClO50mL，加入定容至100mL；
3、操作方法
（1）称量并且表面消毒
称连翘叶片5g，用自来水冲洗干净，在无菌操作台上，依次用质量分数为75%乙醇水溶液和质量分数为0.1%HgCl2水溶液对翘叶片的表面进行消毒5分钟，再用无菌水漂洗翘叶片4次；
（2）检验消毒效果
取最后一次无菌水冲洗液，涂布到肉汁胨培养基平板上，37℃培养3天，检验灭菌效果；若发现皿中无菌落出现，证明该叶片表面灭菌彻底，否则该分离结果不能使用；
（3）样品处理
用灭过菌的剪刀将叶片剪成10mm的正方形，置于研钵中，加15ml无菌水反复研磨捣碎，静置30min钟后，用无菌移液管取1ml上清液置于10ml试管中，加水梯度稀释到浓度为10-1-10-4，得到不同浓度的稀释液；用无菌移液管分别取0.2ml不同浓度的稀释液涂布于肉汁胨培养基平板上，每浓度涂平皿一个，重复3次，至于37℃温箱中培养；
（4）纯化
培养3-5d后，挑取不同形态的菌落在固体平板上划线纯化，直到分离得到单菌落；
（5）镜检
挑取单菌落固定在载玻片上，用革兰氏染色法进行染色，干燥后，滴加香柏油，在高倍镜下观察菌落形态；
（6）保存
挑取镜检时所用的单菌落接种于含有肉汁胨液体培养基的三角瓶中，在37℃150r/min摇床中培养12h，至细菌长到对数期，蘸取菌悬液接种于斜面培养基上，37℃培养2d，在试管中观察到s型的菌种，再转移到4℃的冰箱中斜面真空冷冻干燥保存，即得到连翘内生细菌LQ-A。
3.如权利要求2所述的连翘内生细菌LQ-A的分离与纯化方法，其特征在于：所述革兰氏染色法为，草酸铵结晶紫染色1min，自来水冲洗，碘液染1min，水洗，95%的酒精脱色20s，水洗，番红复染2min，水洗。
4.利用权利要求1所述的连翘内生细菌LQ-A制备涂膜保鲜剂的方法，其特征在于：包括步骤如下：收集连翘内生细菌A发酵上清液，离心收集上清，0.45μm滤膜过滤；然后按照滤液和质量分数为1%的明胶的体积比为2:1，将滤液添加到质量分数为1%的明胶中，混合均匀后，即制备出涂膜保鲜剂。
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| DAVID J. GONZALEZ ET AL.: "Microbial competition between Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus monitored by imaging mass spectrometry", 《MICROBIOLOGY》 * |
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| 肖付刚等: "《食品生产及保藏技术研究》", 30 April 2015 * |
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