CN107663506B

CN107663506B - 一种白首乌根部内生细菌菌株Bacillus subtilis BSW-9及其抗肿瘤活性应用

Info

Publication number: CN107663506B
Application number: CN201710584519.2A
Authority: CN
Inventors: 顾晓洁; 迈克尔·温克; 姚楠; 任可; 董学伟; 吕嘉东; 解卓学; 赵剑飞; 姜兴颖; 廉琦
Original assignee: Dalian Jiaotong University
Current assignee: Dalian Jiaotong University
Priority date: 2017-07-18
Filing date: 2017-07-18
Publication date: 2020-05-05
Anticipated expiration: 2037-07-18
Also published as: CN107663506A

Abstract

本发明公开一种白首乌根部内生细菌菌株及其在制备抗肿瘤药物中的应用，所述内生细菌菌株的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BSW‑9，菌种保藏号为CGMCC.14175。本发明通过实验证明了所分离筛选出的具有抗肿瘤活性的白首乌内生细菌菌株，在医药领域具有潜在的应用前景和研究价值，为其代替原植物提供了科学的依据，进而为传统中药资源的应用及开发提供了一种新的思路，也为开发我国自主创新的新型抗肿瘤药物奠定了有益的理论基础。

Description

一种白首乌根部内生细菌菌株Bacillus subtilis BSW-9及其抗肿瘤活性应用

技术领域

本发明涉及微生物分离与应用技术领域，具体涉及菌株Bacillus subtilis BSW-9及其抗肿瘤活性的应用。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类生命和健康的“第一杀手”。植物来源的抗肿瘤药物作用机制独特，抗癌疗效显著，在临床应用上占据主导地位。传统中药白首乌，被历代医家视为养生防老的珍品。现代研究表明，白首乌具有显著的抗肿瘤功效。然而市场上流通的药材需通过大量采挖天然药用植物的块根而获取，此举受地理、季节和植物生长周期的限制。为保护现有野生药物资源，科研工作者期望能够找到具有再生性，可持续发展，对其研究开发无“来源受限”、“采收过度”等问题的困扰的新药用资源。但新药用资源的开发也存在诸多困难；中药内生细菌是一种新颖的微生物资源。然而迄今为止，国内外关于白首乌的研究均停留在原植物中化学成分的分离，而其植物内生细菌及其代谢产物的研究尚未见报道。

发明内容

本发明以白首乌植物的内生细菌为研究对象，对其进行生物学研究，分离筛选出3株具有抗肿瘤活性的白首乌内生细菌菌株，在医药领域具有潜在的应用前景和研究价值，为其代替原植物提供了科学的依据，进而为传统中药资源的应用及开发提供了一种新的思路，也为开发我国自主创新的新型抗肿瘤药物奠定了有益的理论基础。

本发明的技术方案如下：

首先，本发明公开一种白首乌根部内生细菌菌株，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BSW-9，菌种保藏号为CGMCC.14175，保藏日期为2017年5月19日。

另一方面，本发明公开上述菌株在制备抗肿瘤药物中的应用。

对于上述技术方案中所述的应用，具体的，其包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BSW-9进行发酵，得到发酵培养物，发酵培养物用乙酸乙酯萃取，用旋转蒸发仪于55℃蒸干萃取物，将萃取物用DMEM培养基或1640培养基配制后用于制备抗肿瘤药物。

对于上述技术方案中所述的应用，具体的，所述发酵为使用LB液体培养基，在28℃恒温摇床中以140rpm震荡培养。

对于上述技术方案中所述的应用，具体的，所述的肿瘤药物作用的肿瘤细胞种类为人肝癌细胞SMMC-7721、人肺癌细胞A549或人骨肉瘤细胞143B。

对于上述技术方案中所述的应用，具体的，将萃取物用DMEM培养基或1640培养基配制的混合液，其有效浓度如下：抗人肝癌细胞SMMC-7721的有效浓度为14.92±2.71μgmL^-1，抗人肺癌细胞A549的有效浓度为7.02±1.70μg mL^-1，抗人骨肉瘤细胞143B的有效浓度为3.36±1.01μg mL^-1。

对于上述技术方案中所述的应用，具体的，所述药物为抗人肝癌药物、抗人肺癌药物或抗人骨肉瘤药物。从本发明实施例所列的检测结果可以证明，从12株内生细菌菌株中筛选出的菌株Bacillus subtilis BSW-9对人肝癌细胞SMMC-7721、人肺癌细胞A549、人骨肉瘤细胞143B的增殖均有良好的抑制作用，抑制率具有一定浓度、时间依赖性。因此，菌株Bacillus subtilis BSW-9在制备抗肿瘤药物或其他医药领域具有潜在的应用前景和研究价值。

附图说明

图1.LB上分离培养的白首乌根部内生细菌Bacillus subtilis BSW-3；

图2.LB上分离培养的白首乌根部内生细菌Bacillus subtilis BSW-9；

图3.LB上分离培养的白首乌根部内生细菌Bacillus amyloliquefaciens BSW-7；

图4.分离培养的白首乌根部内生细菌Bacillus subtilis BSW-3显微镜下图片；

图5.分离培养的白首乌根部内生细菌Bacillus subtilis BSW-9显微镜下图片；

图6.分离培养的白首乌根部内生细菌Bacillus amyloliquefaciens BSW-7显微镜下图片。

具体实施方式

下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

首先，本发明所述的新型抗肿瘤药物的筛选过程概述如下：

①从新鲜药材白首乌的根中分离得到12株内生细菌；

②对纯化后的12株内生细菌菌株进行抗肿瘤活性的筛选与评价，采用肿瘤细胞株模型(人肺癌A549细胞株，人肝癌SMMC-7721，人骨肉瘤143B细胞)进行MTT染色法测定半抑制浓度(IC₅₀)，经过本发明实施例的试验结果表明，从12株内生细菌菌株中筛选出的菌株Bacillus subtilis BSW-3，Bacillus subtilis BSW-9和Bacillus amyloliquefaciensBSW-7对人肝癌细胞SMMC-7721、人肺癌细胞A549、人骨肉瘤细胞143B的增殖均有良好的抑制作用。

③采用形态学和分子遗传学手段鉴定该3株活性菌株的系统分类学地位。

实施例1 白首乌根部内生细菌的分离

1样品的采集

白首乌(Cynanchum auricμLatum Royle ex Wight)于2016年3月采自在江苏省盐城市滨海县，无其他病虫害。取材部位为根。

2实验试剂

胰蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，琼脂粉，蒸馏水，0.01PBS缓冲液(pH 7.4)、结晶紫、95％乙醇、草酸铵、碘、碘化钾、沙黄(番红)等。

3培养基配制方法(LB培养基)

(1)称量：分别称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，置于烧杯中。

(2)溶化：加入800mL蒸馏水于烧杯中，用玻棒搅拌，使药品全部溶化。

(3)调pH：用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2。

(4)定容：将溶液倒入量筒中，加蒸馏水至1000mL。

(5)加琼脂：加入15g琼脂粉，加热融化，补足失水。

(6)分装、加塞、包扎。

(7)高压蒸汽灭菌121℃灭菌20min。

4菌株的分离

①新鲜的根，自来水冲洗30min，吸水纸吸去植物表面水分。无菌水冲洗3次，每次2min，无菌滤纸吸干表面的水分，放入超净台中；

②以75％乙醇浸泡5min，无菌水冲洗3次；

③用3％NaClO₃浸泡3min，无菌水冲洗5次；

④保留最后一遍的冲洗液，待消毒检验用。

⑤无菌滤纸吸干表面水分，置于无菌培养皿中待用。

5消毒效果检测

①取最后一次表面消毒的无菌水，移取100μL于无菌培养皿中，均匀涂布，28℃培养2-7天，观察是否有菌落生成；

②将表面消毒过的上述材料不做任何剪切，直接压入到分离培养基平板上，倒置于相同条件下培养，检查是否有菌长出。(印记平板对照)

6分离纯化

用无菌解剖刀将白首乌根去皮，将内部的组织切成细小碎块(约5～20g)，置于无菌研钵中，加入10倍体积(约8～10mL)的0.01PBS和灭菌过的石英砂进行研磨；静置，取上清，用无菌枪头依次在无菌离心管中稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4浓度；吸取100μL涂布于LB培养基平板上，倒置，30℃恒温培养箱中培养36h；待平板上长出菌落，用平板划线分离方法，经过分离、纯化的反复过程，直至纯化得到典型菌落。

实施例2 菌株菌落形态及显微形态鉴定方法

1.菌株的形态特征观察

采用划线法菌株接种在LB平板培养基上，30℃培养36h，观察其菌落特征。

具体的参考标准是：①生长和发育的速度。培养一定的天数后，测量菌落的直径：以生长极慢、较快来说明。②菌落的颜色。表面和底部菌丝的颜色及其变化，菌落背面的颜色及其变化。③菌落的表面。平滑或有皱纹，致密或疏松，有无同心环或辐射状沟纹。全部、中心部位、中间部分以及边缘部分等形态。④菌落的质地。菌落的外观似毡状、棉絮状、羊毛状、束状、粉粒状、皮革状等。⑤菌落的边缘。全缘、锯齿状、树枝状、纤毛状等。⑥菌落的高度。菌落扁平，丘状隆起、陷没，菌落中心部分凸起或凹陷。⑦有无渗出物。有些细菌，如青霉，常在菌落表面出现带颜色的滴液，其数量各有不同。⑧培养基颜色变化。颜色变化是否局限于菌丝体所覆盖的部分，或扩大到其他部分。

2.菌株染色

采用革兰氏染色法对菌株染色，采用显微镜进行形态学观察。微生物菌种移接的所有操作，均应在无菌环境下进行严格的无菌操作。

其中，革兰氏染色观察实验器材如下：

(1)活材料：菌液。

(2)染色液和试剂：结晶紫、碘液、95％酒精、番红溶液、蒸馏水、乙醚-乙醇混合液(或二甲苯)、香柏油。

(3)器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、显微镜。

革兰氏染液配制方法如下：

(1)结晶紫液：结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2g溶于20mL 95％乙醇中)20mL，1％草酸铵水溶液80mL将两液混匀置24h后过滤即成。

(2)革兰氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300mL。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加蒸馏水至100mL即成。配成后贮于棕色瓶内备用，如变为黄色即不能使用。

(3)95％乙醇：用于脱色，脱色后可选用番红溶液进行复染即可。

(4)番红溶液：番红(又称沙黄)2.5g，95％乙醇100mL，溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中，用时取20mL与80mL蒸馏水混匀即可。

革兰氏染色观察步骤如下：

革兰氏染色步骤是涂片、干燥、固定、染色、水洗、晾干、镜检，具体如下：

(1)涂片：取干净载玻片(无油迹)一块，在载玻片中央加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌液涂片，调匀并涂成薄膜，注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀，做成浓菌液，注意取菌不要太多。

(2)晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。

(3)固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定(以不烫手为宜)，使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏。

(4)结晶紫染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量(以盖满细菌涂面)的结晶紫染色液染色1-2min；水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。

(5)媒染：碘液，媒染1min；水洗：用水洗去碘液。

(6)脱色：将玻片倾斜，连续滴加95％乙醇脱色20-25s至流出液无色，立即水洗。

(7)复染：滴加复红复染2-3min；水洗：用水洗去涂片上的复红染色液。

(8)晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。

(9)镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。

3.菌株的形态特征观察及染色结果

利用LB培养基分离白首乌根部内生细菌，共得到包括沙雷氏菌、芽孢杆菌、假单胞菌等12株内生细菌，由于只有3株细菌在后续试验中，被证明有好的抗肿瘤效果，所以受篇幅所限，此处仅列举了菌株Bacillus subtilis BSW-3，Bacillus subtilis BSW-9和Bacillus amyloliquefaciens BSW-7的鉴定结果，对其菌落进行形态特征观察和革兰氏染色，形态描述及显微鉴定结果见表1。

表1 各菌株的形态特征及显微鉴定结果

菌株16S rRNA的扩增和测序，均以SEQ Forward、SEQ Internal和SEQ Reverse为引物进行DNA测序。

①变性：在培养基中挑取菌体于50μL TaKaRa Lysis Buffer for Microorganismto Direct PCR(Code No.9164)中变性后离心取上清作为模板。反应条件：80℃，15min。

②PCR扩增：使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(CodeNo.RR176)，进行PCR扩增目的片段。

反应体系组成如下：

PCR反应条件如下：

③测序：PCR扩增产物委托大连宝生物有限公司测序。

④菌株鉴定结果：将待筛选的12株内生细菌分别编号；其中编号分别为3、9和7的菌株在后续的实验中被证明有良好的抗肿瘤活性，所述3株菌株测得的16S rDNA序列，同时进行BLAST相似性检索，与数据库中已知菌株的序列比对，表明3株菌株均属于芽孢杆菌属，分别鉴定并命名为Bacillus subtilis BSW-3，Bacillus subtilis BSW-9和Bacillusamyloliquefaciens BSW-7，序列相似度分别为100％、99％、100％。3株菌株均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。Bacillus subtilis BSW-3的菌种保藏号为CGMCC.14174，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，菌株名称为BSW-3。Bacillus amyloliquefaciens BSW-7的菌种保藏号为CGMCC.14176，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，菌株名称为BSW-7。Bacillus subtilis BSW-9的菌种保藏号为CGMCC.14175，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，菌株名称为BSW-9。

实施例3 白首乌根部3株内生细菌的抗肿瘤活性实验

(1)细胞株

人肺癌A549细胞株，人肝癌SMMC-7721，人骨肉瘤143B细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

(2)待测样品制备

将上述待筛选的12株内生细菌菌株均接种于装有LB液体培养基的250mL锥形瓶中培养，在28℃恒温摇床(140rpm)培养2d，得到细菌发酵液。

发酵液用乙酸乙酯萃取，用旋转蒸发仪于55℃蒸干萃取物，用时将萃取物分别用DMEM培养基(购自南京凯基，KGM 31600-500)和1640培养基(南京凯基，KGT 525250)配制成浓度分别为200μg mL^-1、150μg mL^-1、100μg mL^-1、80μg mL^-1、75μg mL^-1、60μg mL^-1、50μg mL^-1、40μμg mL^-1、25μg mL^-1、20μg mL^-1、10μg mL^-1的发酵液萃取物，备用。

(3)细胞培养

细胞分别用含10％小牛血清的DMED和1640培养基，于37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养，细胞呈单层生长，达80％左右融合时传代，细胞消化传代采用0.25％的胰酶。

(4)细胞增殖抑制率的测定

取对数生长期的人肺癌A549细胞、人肝癌SMMC-7721细胞和人骨肉瘤143B细胞，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的DMEM培养基调整细胞密度2×10⁴个/mL，接种至96孔培养板中，每孔200μL细胞悬液，继续培养24h后，吸弃培养液，选取其中一孔加入含0.1％DMSO的DMEM培养液作为人肺癌A549细胞和人骨肉瘤143B细胞的溶剂对照，选取另一孔加入含0.1％DMSO的1640培养液作为人肝癌SMMC-7721细胞的溶剂对照，其他孔分别加入不同浓度的内生菌发酵液萃取物，每个浓度设6个复孔，并设空白调零孔。

分别继续培养24，48和72h后，每孔加入20μL MTT(5g L^-1)，继续培养4h，吸弃上清，每孔加入150μL DMSO，振荡10min，溶解结晶，用酶标免疫检测仪测定570nm波长处的吸光度(A)，630nm为参考波长。实验重复3次，取平均值。以溶剂处理为对照组，由A计算抑制率，并通过SPSS软件求出半数抑制浓度(IC₅₀)。

细胞生长抑制率(％)＝(A对照-A用药)/A对照×100％

(5)统计学方法

各组数据以x±s表示，采用SPSS软件计算对细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)

(6)对人肝癌SMMC-7721细胞株增殖的影响

将不同浓度的待筛选的12株内生菌株发酵液萃取物分别作用于肝癌SMMC-7721细胞24，48和72h后，用MTT法检测细胞的存活情况，IC₅₀见下表。

表2.3个样品对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用(μg mL^-1,n＝3)

时间	B.subtilis BSW-3	B.subtilis BSW-9	B.amyloliquefaciens BSW-7	其余9株内生细菌
					24h	22.28±3.68	46.42±4.65	42.52±3.73	>200
48h	21.92±8.30	22.68±2.27	33.47±8.37	>200
					72h	19.91±6.15	14.92±2.71	24.82±7.50	>200

(7)对人肺癌A549细胞株增殖的影响

将不同浓度的待筛选的12株内生菌株发酵液萃取物分别作用于肺癌A549细胞24，48和72h后，用MTT法检测细胞的存活情况，IC₅₀见下表。

表3.3个样品对A549细胞增殖的抑制作用(μg mL^-1,n＝3)

时间	B.subtilis BSW-3	B.subtilis BSW-9	B.amyloliquefaciens BSW-7	其余9株内生细菌
					24h	20.46±2.69	54.72±10.83	59.90±9.92	>200
48h	16.85±4.13	12.71±2.44	37.07±7.41	>200
					72h	14.08±2.23	7.02±1.70	27.22±1.09	>200

(8)对人骨肉瘤143B细胞株增殖的影响

将不同浓度的待筛选的12株内生菌株发酵液萃取物分别作用于人骨肉瘤143B细胞24，48和72h后，用MTT法检测细胞的存活情况，IC₅₀见下表。

表4.3个样品对143B细胞增殖的抑制作用(μg mL^-1,n＝3)

时间	B.subtilis BSW-3	B.subtilis BSW-9	B.amyloliquefaciens BSW-7	其余9株内生细菌
					24h	20.86±2.99	18.85±3.98	45.06±7.13	>200
48h	16.29±3.60	11.47±2.40	10.69±1.94	>200
					72h	5.89±0.52	3.36±1.01	9.27±3.87	>200

上述试验结果表明：在12个样品中，除了菌株Bacillus subtilis BSW-3，Bacillus subtilis BSW-9和Bacillus amyloliquefaciens BSW-7之外的其余9株内生细菌样品对各种瘤株的增殖抑制均不明显；由此证明，对于本领域技术人员而言，获得对多种瘤株的增殖均有较好抑制作用的内生细菌，并不是容易获得的。

只有菌株Bacillus subtilis BSW-3，Bacillus subtilis BSW-9和Bacillusamyloliquefaciens BSW-7对三种瘤株的增殖有较好的抑制作用，并且抑制率具有一定浓度、时间依赖性。因此，菌株Bacillus subtilis BSW-3，Bacillus subtilis BSW-9和Bacillus amyloliquefaciens BSW-7在医药领域具有潜在的应用前景和研究价值。

序列表

<110> 大连交通大学

<120> 一种白首乌根部内生细菌菌株BSW-9及其抗肿瘤活性应用

<141> 2017-06-27

<160> 3

<170> SIPO Sequence Listing 1.0

<210> 1

<211> 1462

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis BSW-3

<400> 1

acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga 60

tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc 120

cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga cataaaaggt 180

ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg 240

ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag 300

acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc 360

tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg 420

gaagaacaag tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg 480

gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt 540

gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg 600

gggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg 660

tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct 720

gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc 780

cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta 840

acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac 900

gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac 960

caggtcttga catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg ggcagagtga 1020

caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080

agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt 1140

gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1200

cacacgtgct acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa gccaatccca 1260

caaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct 1320

agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1380

tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aaccttttag gagccagccg 1440

ccgaaggtgg gacagatgat gg 1462

<210> 2

<211> 1475

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis BSW-9

<400> 2

acgctgtgcg gcgtgcctaa gacatggcaa gtccctgcgg gcagatggga gcttgctccc 60

tgatgttagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag actgggataa 120

ctccgggaaa ccggggctaa taccggatgg ttgtttgaac cgcatggttc agacataaaa 180

ggtggcttcg gctaccactt acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa 240

cggctcacca aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact 300

gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa 360

gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgtt 420

agggaagaac aagtgccgtt caaatagggc ggcaccttga cggtacctaa ccagaaagcc 480

acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt 540

attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa 600

ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt ggaattccac 660

gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc gactctctgg 720

tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta 780

gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag 840

ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt 900

gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct 960

taccaggtct tgacatcctc tgacaatcct agagatagga cgtccccttc gggggcagag 1020

tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1080

acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag cattcagttg ggcactctaa ggtgactgcc 1140

ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg 1200

ctacacacgt gctacaatgg acagaacaaa gggcagcgaa accgcgaggt taagccaatc 1260

ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga agctggaatc 1320

gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1380

ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga ggtaaccttg tagggagata 1440

agcctttcga caggtggggc gagtatgtac tgggg 1475

<210> 3

<211> 1463

<212> DNA

<213> Bacillus amyloliquefaciens BSW-7

<400> 3

acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga 60

tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc 120

cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga cataaaaggt 180

ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg 240

ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag 300

acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc 360

tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg 420

gaagaacaag tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg 480

gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt 540

gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg 600

gggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg 660

tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct 720

gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc 780

cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta 840

acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac 900

gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac 960

caggtcttga catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg ggcagagtga 1020

caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080

agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt 1140

gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1200

cacacgtgct acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa gccaatccca 1260

caaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct 1320

agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1380

tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aaccttttag gagccagccg 1440

ccgaaggtgg gacagatgat tgg 1463

Claims

1.一种白首乌根部内生细菌菌株，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BSW-9，菌种保藏号为CGMCC.14175。

2.如权利要求1所述的菌株在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌BSW-9进行发酵，得到发酵培养物，发酵培养物用乙酸乙酯萃取，用旋转蒸发仪于55℃蒸干萃取物，将萃取物用DMEM 培养基或1640培养基配制后用于制备抗肿瘤药物；所述的肿瘤药物作用的肿瘤细胞种类为人肝癌细胞SMMC-7721、人肺癌细胞A549或人骨肉瘤细胞143B。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发酵为使用LB液体培养基，在28 ℃恒温摇床中以140 rpm震荡培养。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将萃取物用DMEM 培养基或1640培养基配制的混合液，其有效浓度如下：抗人肝癌细胞SMMC-7721的有效浓度为14.92±2.71 μg mL^-1，抗人肺癌细胞A549的有效浓度为7.02±1.70 μg mL^-1，抗人骨肉瘤细胞143B的有效浓度为3.36±1.01 μg mL^-1。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物为抗人肝癌药物、抗人肺癌药物或抗人骨肉瘤药物。