CN104726356B - 一株产生磷脂酶的枯草芽孢杆菌诱变菌株 - Google Patents

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Abstract

一株产生磷脂酶的枯草芽孢杆菌诱变菌株。本发明提供了一种分离的表达磷脂酶C的菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8500。利用本发明所提供菌株和制备方法制备所得的磷脂酶C可以用于油脂精炼，脱胶效果良好，可以广泛应用于油脂精炼、添加剂、医药等领域。

Description

一株产生磷脂酶的枯草芽孢杆菌诱变菌株
技术领域
本发明属于酶法脱胶领域，具体说是一株产生磷脂酶的枯草芽孢杆菌诱变菌株。
背景技术
磷脂酶（Phospholipase，PL)是生物体内存在的能水解甘油磷脂的酶，水解产物为各种磷脂酸和氨基醇，如胆胺、胆碱、丝氨酸、乙醇胺等。根据磷脂酶水解甘油磷脂的位点（Sehmiel DH，Miller VL.Bacterial Phospholipases and Pathogenesis[J].Microbesand Infection，1999，1:1103-1112）不同，可将磷脂酶分为磷脂酶A(phospholipase A，PLA)、磷脂酶B(Phospholipase B，PLB)、磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)和磷脂酶D（Phospholipase D，PLD)。磷脂酶C作用于3位磷酸酯键，产物为甘油二酯、磷酸胆碱或磷酸乙醇胺等。
磷脂酶可广泛应用于油脂精练、磷脂改性、饲料改良剂、食品工业和医药等方面。脱胶是植物油精炼过程中的一个重要环节，对提高油的品质至关重要，脱胶主要是脱除磷脂，脱胶若不彻底，会影响油品的深加工和油品的稳定性，减低油品货架期。酶法脱胶可以克服传统脱胶方法脱胶脱除率低，同时中性油损失高等的问题。而在酶法脱胶工艺中，现有文献多报道磷脂酶PLA用于植物油脱胶。磷脂酶PLA(包括PLA1和PLA2)，脱胶后可产生极性溶血磷脂和极性脂肪酸，PLA脱胶工艺仅仅损失油中总的磷脂分子，来减少精炼损耗。而磷脂酶PLC酶通过选择性水解磷酸酯官能团与磷脂反应，生成甘油二酯（DAG）和磷脂酸基团，甘油二酯不需要被除去，所以PLC脱胶工艺通过保留原始的磷脂分子而仅去除磷酸酯官能团来减少精炼损耗，不存在PLA脱胶工艺中产生的能提高脱胶油酸价的极性脂肪酸的问题，PLC用于脱胶优势明显好于PLA。
使用PLC进行脱胶，既可以使用PLC酶，也可以直接使用磷脂酶C产生菌株的发酵液。直接使用高酶活的发酵液，可免除繁杂的纯化步骤，提高酶的利用率，大幅降低生产成本。但现有磷脂酶C产生菌株，大多为致病性菌株，因此无法直接使用现有的磷脂酶C产生菌株对油脂进行脱胶。因此，寻找磷脂酶C酶活高的GRAS（美国FDA评价食品添加剂的安全性指标）菌株成为解决该问题的一个关键因素。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供一种分离的表达磷脂酶C的菌株。
本发明提供的分离的表达磷脂酶C的菌株，命名为WBRD01281-D，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8500。
本发明还有一个目的在于，提供一种生产磷脂酶C的方法。
本发明提供的生产磷脂酶C的方法包括：培养前述的菌株以使所述菌株或细胞生产磷脂酶C，收获磷脂酶C。
在本发明的一个优选实施例中，所述培养为在适宜所述菌株生长和/或适宜所述菌株表达磷脂酶C的条件下培养所述菌株，优选的，所述培养为在适宜所述菌株生长的条件下培养所述菌株，以增加所述菌株数量，然后再于适宜所述菌株表达磷脂酶C的条件下培养所述菌株，以表达所述磷脂酶C。
在本发明的一个优选实施例中，所述培养为在25-40℃、120-250rpm培养所述菌株6-24h。
在本发明的一个优选实施例中，所述收获包括分离和收集含有分泌或释放到胞外的磷脂酶C的培养物上清液，由此获得含有磷脂酶C的磷脂酶C酶液；优选地，所述方法还包括对所述磷脂酶C酶液进行浓缩。
本发明还有一个目的在于，提供一种磷脂酶C。
本发明提供的磷脂酶C为用前述方法制得。
本发明还有一个目的在于，提供一种磷脂酶C酶液。
本发明提供的磷脂酶C酶液为用前述方法制得。
本发明还有一个目的在于，提供一种脱胶的方法。
本发明提供的脱胶的方法为使用前述的磷脂酶C或磷脂酶C酶液进行脱胶，优选的，所述脱胶为油脂脱胶。
本发明还有一个目的在于，提供前述的菌株或磷脂酶C或磷脂酶C酶液用于脱胶的用途，优选的，所述脱胶为油脂脱胶。
本发明还有一个目的在于，提供前述的菌株或磷脂酶C或磷脂酶C酶液用于磷脂改性、食品添加剂、饲料改良剂和医药工业的用途。
本发明的产磷脂酶C的细菌——枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WBRD01280及使用该菌株获得的酶液和磷脂酶C可以用于油脂精炼，脱胶效果良好，由于枯草芽孢杆菌是GRAS菌株，因此，可以直接用于食品工业，安全可靠，例如可以安全方便的用于油脂精炼。同样枯草芽孢杆菌来源的磷脂酶C可以安全的用于磷脂改性、食品添加剂、饲料改良剂和医药工业等方面。
菌株WBRD01280已于2013年4月22日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）”(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号是CGMCC No.7506，分类命名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis诱变菌株WBRD01281-D已于2013年11月29日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”（CGMCC），保藏号是CGMCCNo.8500。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
在本发明中，如果没有特别的说明，百分数（％）或者份都指相对于组合物的重量百分数或者重量份。
在本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。
在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的含量之和为100％。
在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的份数之和可以为100重量份。
在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。
在本发明中，除非有其他说明，整数数值范围“a-b”表示a到b之间的任意整数组合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围“1-N”表示1、2……N，其中N是整数。
在本发明中，除非有其他说明，“其组合”表示所述各元件的多组分混合物，例如两种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。
如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种”指“至少一种”。
如果没有特别指出，本发明所述的百分数（包括重量百分数）的基准都是所述组合物的总重量。
本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60－120和80－110的范围，理解为60－110和80－120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1－3、1－4、1－5、2－3、2－4、和2－5。
在本文中，除非另有说明，各组分的比例或者重量都指干重。
在本文中，除非另有说明，各反应都在常温常压下进行。
在本文中，除非另有说明，各个反应步骤可以顺序进行，也可以不按顺序进行。例如，各个反应步骤之间可以包含其他步骤，而且反应步骤之间也可以调换顺序。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。
本发明的发明人以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WBRD01280为出发菌株，通过多轮诱变和筛选，获得了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WBRD01280的突变菌株WBRD01281-D，经检测，该突变菌株的磷脂酶C活性比出发菌株WBRD01280提高了87%。由于枯草芽孢杆菌是GRAS菌株，因此，可以用于食品工业，安全可靠，例如可以安全方便的用于油脂精炼。同样，本发明提供的枯草芽孢杆菌来源的磷脂酶C，还可以安全的用于磷脂改性、食品添加剂、饲料改良剂和医药工业等方面。例如，制备磷脂酶改性磷脂，使磷脂在营养价值、乳化性能以及色、味等方面大为改进和提高，从而大大拓展了磷脂在食品、保健品工业中的应用范围和使用价值；在食品添加剂方面，本发明的磷脂酶C可以用于烘焙，可使面团形成胶状复合体，可以减少淀粉回生，调节和改善面团的稳定性，因此在烘焙行业应用也非常广泛；在医药研究方面，将本发明提供的磷脂酶C作为疫苗，可用于防治各种病原菌的感染，用本发明提供的磷脂酶C开发抗血小板聚集类药物，可治疗或预防心脑血管疾病等，本发明提供的磷脂酶C还可被应用于抗肿瘤药物的研制等。
本发明提供了一种分离的表达磷脂酶C的菌株，命名为WBRD01281-D，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8500。
本发明提供了一种生产磷脂酶C的方法。
本发明提供的生产磷脂酶C的方法包括：培养前述的菌株WBRD01281-D以使所述菌株或细胞生产磷脂酶C，收获磷脂酶C。
菌株WBRD01281-D的培养方法可采用枯草芽孢杆菌的常规培养方法，例如使用LB培养基、YPD培养基或土豆培养基进行培养。
菌株WBRD01281-D的培养可以在适宜所述菌株生长和/或适宜所述菌株表达磷脂酶C的条件下培养所述菌株，优选的，所述菌株WBRD01281-D的培养为在适宜所述菌株生长的条件下培养所述菌株，以增加所述菌株数量，然后再于适宜所述菌株表达磷脂酶C的条件下培养所述菌株，以表达所述磷脂酶C。
菌株WBRD01281-D的培养条件可以但不限于为：于25-40℃、120-250rpm培养，培养时间为6-24h，优选的，培养菌株WBRD01281-D至对数生长期。
菌株WBRD01281-D可将生产的磷脂酶C分泌到胞外的培养基中。在本发明的一个优选实施例中，所述收获磷脂酶C包括分离和收集含有分泌或释放到胞外的磷脂酶C的培养物上清液，由此获得含有磷脂酶C的磷脂酶C酶液。
实施方式之一中，对本发明的磷脂酶C酶液进行了浓缩，这样可以提高磷脂酶C酶液的磷脂酶C活性。本发明的酶液可以直接使用。可以采用酶工程领域已知的各种方法从本发明的酶液中进一步分离和纯化磷脂酶C，由此获得本发明的磷脂酶C。
本发明还提供了一种磷脂酶C，本发明提供的磷脂酶C为采用前述方法制得。
本发明还提供了一种磷脂酶C酶液，本发明提供的磷脂酶C酶液为用前述方法制得。在本发明的一个优选实施例中，该酶液为含有分泌或释放到胞外的磷脂酶C的培养物上清液。在本发明的另一个优选实施例中，对本发明的磷脂酶C酶液进行了浓缩，这样可以提高磷脂酶C酶液的磷脂酶C活性。
本发明还提供了一种脱胶的方法。
本发明提供的脱胶的方法为使用前述的磷脂酶C或磷脂酶C酶液进行脱胶，由于枯草芽孢杆菌是GRAS菌株，因此，本发明的磷脂酶C或磷脂酶C酶液可用于油脂，特别是可食用油脂的脱胶。
本发明还提供了前述的菌株或磷脂酶C或磷脂酶C酶液用于脱胶的用途，优选的，所述脱胶为油脂，特别是可食用油脂的脱胶。
本发明还有一个目的在于，提供前述的菌株或磷脂酶C或磷脂酶C酶液用于磷脂改性、食品添加剂、饲料改良剂和医药工业的用途。
在本发明的下述实施例中，使用的培养基：
LB培养基（单位g·L-1）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，pH7.0。
发酵培养基组成（单位wt%）：蔗糖2、蛋白胨0.5、酵母浸出粉1、牛肉膏0.5，玉米浆膏0.5、K2HPO40.3、MgSO40.05、CaCl20.05，一水合硫酸锰0.05，硫酸锌0.05，pH7.0；
LB琼脂平板：LB培养基中加入1.8%琼脂。
卵磷脂琼脂平板：
A：酵母提取粉0.5%，蛋白胨0.5%，K2HPO40.1％，KC10.5％，无水硫酸镁0.05％，L-精氨酸0.5%，琼脂1.8%，pH自然。
B：卵磷脂混合物3g/45ml，115℃15min灭菌。
灭菌后，取A110ml和B90ml混合而后制作平板。
脱脂牛乳琼脂平板：
甲组份：K2HPO40.1％，KC10.5％，七水硫酸镁0.05％，琼脂粉2%，pH7.5，113℃灭菌30分钟
乙组份：20%的脱脂奶粉，pH自然，115℃灭菌15分钟
灭菌后，甲组份150ml和乙组份50ml趁热混匀，而后制作平板。
甘油三丁酸酯平板
甲组份：硫酸铵0.1％，酵母提取粉0.5%，蛋白胨0.5%，K2HPO40.1％，KC10.5％，七水硫酸镁0.05％，琼脂1.8%，pH自然。
乙组份：1.25g阿拉伯胶溶于88ml水中，边加热边搅拌，直至完全溶解，滤纸过滤，取一半，加入6ml甘油三丁酸酯，乳化。
无菌条件并在60℃保温情况下取乙组份4.3ml加入到100ml甲组份混合完全，而后制作板。
在本发明的下述实施例中，使用的菌株WBRD01280已于2013年4月22日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）”(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号是CGMCC No.7506，分类命名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
在本发明的下述实施例中，磷脂酶C的酶活采用P-硝基苯基磷酸胆碱（p-NPPC）法检测（Birch M.,Robson G.,Law D.,et al.Evidence of Multiple ExtracellularPhospholipase Activities of Aspergillus fumigates.Infect.Immun.1996,64(3):751–755.），该方法以p-硝基苯基磷酸胆碱为反应底物，通过磷脂酶C的催化水解底物的磷酸酯键而产生有色产物对硝基苯酚（p-NP），该产物在405-410nm波长下具有强烈吸收。酶活力单位定义为：1个单位的PLC酶活力即指每分钟催化释放1μmol的p-NP所需的酶量。该方法是国内外测定磷脂酶C活力的常用方法，操作简便，反应快且灵敏度高，是一种精确而高效的活力测定方法。
实施例1、菌株的诱变选育
将枯草芽孢杆菌WBRD01280（保藏号：CGMCC No.7506）接种至含有50ml LB液体培养基的摇瓶中，180rpm，28℃培养16h，至对数生长期，获得枯草芽孢杆菌WBRD01280菌液。
取枯草芽孢杆菌WBRD01280菌液1ml，12000rpm离心2分钟，弃上清液，用1ml无菌水稀释溶解并清洗离心沉淀两次，12000rpm离心2分钟，收集清洗后的菌泥，再用无菌水稀释菌泥，使菌悬液的OD600nm的值在0.5-0.9之间。取1ml菌悬液加入带玻璃珠的三角摇瓶中，而后加入30μL的50wt%的硫酸二乙酯溶液，28℃振荡处理17min后，立即加入0.4ml的25wt%的硫代硫酸钠溶液。取1ml的菌悬液逐级稀释103、104、105和106倍，再将各稀释度的菌悬液0.1ml分别涂布于LB琼脂平板、卵磷脂琼脂平板、三丁酸甘油酯琼脂平板和脱脂牛乳琼脂平板，于28℃恒温培养至长出菌落。
从各个平板上挑选出所有外观、透明圈或浑浊圈明显不同于大部分菌落的菌落，加入发酵培养基中，于28℃进行培养，将发酵液于12000rpm离心2分钟，获得发酵上清液。
测定发酵上清液中的PLC酶活，选择酶活相对来说较高的菌落进行再次平板稀释涂布，于28℃恒温培养至长出菌落，再从各个平板上挑选出所有外观、透明圈或浑浊圈明显不同于大部分菌落的菌落。
经过连续三次的传代和选育，得到高产磷脂酶C的枯草芽孢杆菌诱变株WBRD01281-D。
观察LB平板上的诱变株和原始出发菌株，结果显示，该菌株同出发菌株相比，在外观上的一个明显不同的是WBRD01281-D的菌落更干燥些，单菌落相比稍微大些,圆形凸起更凸出些。
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis诱变菌株WBRD01281-D已于2013年11月29日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”（CGMCC）保藏，保藏号是CGMCCNo.8500。
实施例2、枯草芽孢杆菌诱变株WBRD01281-D胞外磷脂酶C的制备
将枯草芽孢杆菌诱变株WBRD01281-D和枯草芽孢杆菌WBRD01280分别接种至LB培养基中，于28℃、180rpm，培养24h，获得WBRD01281-D种子液和枯草芽孢杆菌WBRD01280种子液。
将WBRD01281-D种子液和枯草芽孢杆菌WBRD01280种子液分别以2%的接种量接种至发酵培养基中，于28℃、180rpm培养24h，获得WBRD01281-D发酵液和枯草芽孢杆菌WBRD01280发酵液。
将发酵液于12000rpm离心2分钟，分别获得WBRD01281-D离心上清和WBRD01280离心上清。
分别检测WBRD01281-D离心上清和枯草芽孢杆菌WBRD01280离心上清的磷脂酶C酶活。
结果显示，WBRD01281-D离心上清的磷脂酶C的酶活为2.43u/ml，较原始菌株WBRD01280离心上清的磷脂酶C的酶活（1.30u/ml）提高了87%。
根据上述结果，本发明提供的枯草芽孢杆菌WBRD01281-D具有更高的酶活，可以达到比较好的脱胶效果，由于枯草芽孢杆菌是GRAS菌株，因此，可以用于食品工业，安全可靠，例如可以安全方便的用于油脂精炼。同样枯草芽孢杆菌来源的磷脂酶C可以安全的用于磷脂改性、食品添加剂、饲料改良剂和医药工业等方面。磷脂酶改性磷脂，使磷脂在营养价值、乳化性能以及色、味等方面大为改进和提高，从而大大拓展了磷脂在食品、保健品工业中的应用范围和使用价值。在食品添加剂方面，磷脂酶可以用于烘焙，磷脂酶可使面团形成胶状复合体，可以减少淀粉回生，调节和改善面团的稳定性。因此在烘焙行业应用也非常广泛。在医药研究方面，将微生物磷脂酶作为疫苗，用于防治各种病原菌的感染；用磷脂酶开发抗血小板聚集类药物，治疗或预防心脑血管疾病等，如PLC被应用于抗肿瘤药物的研制等。

Claims (14)

1.一种分离的产磷脂酶C的枯草芽孢杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8500，分类命名为：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
2.一种生产磷脂酶C的方法，包括：培养权利要求1所述的菌株以使所述菌株生产磷脂酶C，收获磷脂酶C。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养为在适宜所述菌株生长和/或适宜所述菌株产磷脂酶C的条件下培养所述菌株。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养为在适宜所述菌株生长的条件下培养所述菌株，以增加所述菌株数量，然后再于适宜所述菌株产磷脂酶C的条件下培养所述菌株，以产所述磷脂酶C。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养为在25-40℃、120-250rpm培养所述菌株6-24h。
6.如权利要求2-5中任一项所述的方法，所述收获包括分离和收集含有分泌或释放到胞外的磷脂酶C的培养物上清液，由此获得含有磷脂酶C的磷脂酶C酶液.
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对所述磷脂酶C酶液进行浓缩。
8.一种磷脂酶C，用权利要求2-7中任一项所述方法制得。
9.一种磷脂酶C酶液，用权利要求6或7所述方法制得。
10.一种脱胶的方法，使用权利要求8的磷脂酶C或权利要求9的磷脂酶C酶液进行脱胶.
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述脱胶为油脂脱胶。
12.权利要求1所述的菌株或权利要求8的磷脂酶C或权利要求9的磷脂酶C酶液用于脱胶的用途.
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述脱胶为油脂脱胶。
14.权利要求1所述的菌株或权利要求8的磷脂酶C或权利要求9的磷脂酶C酶液用于磷脂改性、食品添加剂、饲料改良剂和医药工业的用途。
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