CN108220373A - 一种鱿鱼皮小分子胶原蛋白粉制备方法 - Google Patents

一种鱿鱼皮小分子胶原蛋白粉制备方法 Download PDF

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綦宇轩
符志杨
夏亚男
刘炳禹
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Abstract

一种鱿鱼皮小分子胶原蛋白粉制备方法,包括以下步骤:a)清洗鱿鱼皮,沥干水分,匀浆后按一定的料液比加入去离子水,搅拌均匀,并调节pH值到7.5~8.5;b)加入鱿鱼皮质量0.4~0.6%的蛋白酶,混匀后在50~60℃条件下水解80~100min,得到鱼皮酶解液;c)超滤:将鱼皮酶解液加入超滤系统,用10KD、5KD、3KD的超滤膜进行超滤,收集>10KD、10‑5KD、5‑3KD和<3KD分子量的酶解液;d)将酶解液用葡聚糖凝胶Sephadex G25进行凝胶柱层析和缓冲液洗脱,收集各峰后,取有生物活性的峰再用反相高效液相色谱(RT‑HPLC)纯化;e)经过反相高效液相色谱(RT‑HPLC)纯化及氨基酸序列检测,获得小分子胶原低聚十肽的胶原蛋白粉产品。

Description

一种鱿鱼皮小分子胶原蛋白粉制备方法
技术领域
本发明涉及的是一种鱿鱼皮小分子胶原蛋白粉制备方法,属于生物技术中的蛋白质材料领域。
背景技术
胶原蛋白是一种糖蛋白,分子含糖及大量甘氨酸、脯氨酸、轻脯氨酸等,是体内含量最多的一类蛋白质,也是结缔组织极其重要的结构蛋白质,细胞间质最重要的功能蛋白。生物活性多肽在人体内含量极少,但生物活性极高,具有多种重要的生物学效应和生理功能,被称为“皮肤软黄金”,可见其在化妆品中所起到的重要作用。鱿鱼皮胶原蛋白多肽不仅有抗衰老作用,而且它的高度可溶性、亲水性、乳化性以及组织相容性等性质,使得它对皮肤有很好的滋润和修复作用,能促进人皮肤成纤维细胞胶原和透明质酸的生成、改善皮肤弹性的作用,成为美容界流行和推崇的护肤品原料。
随着我国远洋鱿钓业的迅速发展,鱿鱼产量迅猛增加,成为我国重要的海洋经济头足类动物和主要的水产品加工原料。鱿鱼年加工量为30~40万t,其中鱿鱼皮占加工量的8%~10%,浙江省是产鱿鱼的大省。鱿鱼皮中胶原蛋白含量较高,约占干重的80%,如果不对其进行进一步加工处理利用,不仅造成资源的极大浪费,更严重的是直接导致环境的污染。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足,而提供一种制备工艺简单,成本低,制备效率高,能够有效节约渔业资源,减少环境污染的鱿鱼皮小分子胶原蛋白粉制备方法。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的,一种鱿鱼皮小分子胶原蛋白粉制备方法,包括以下步骤:
a) 清洗鱿鱼皮,沥干水分,匀浆后按一定的料液比加入去离子水,搅拌均匀,并调节pH值到7.5~8.5 ;
b) 加入鱿鱼皮质量0.4~0.6%的蛋白酶,混匀后在50~60℃条件下水解80 ~100min,得到鱼皮酶解液;
c)超滤:将鱼皮酶解液加入超滤系统,用10KD、5KD、3KD的超滤膜进行超滤,收集>10KD、10-5KD、5-3KD和<3KD分子量的酶解液;
d)将酶解液用葡聚糖凝胶Sephadex G25进行凝胶柱层析和缓冲液洗脱,收集各峰后,取有生物活性的峰再用反相高效液相色谱(RT- HPLC)纯化;
e)经过反相高效液相色谱(RT- HPLC)纯化及氨基酸序列检测,获得小分子胶原低聚十肽的胶原蛋白粉产品。
作为优选:所述的步骤d)中,所述的凝胶柱层析和缓冲液洗脱是:PH8.5Tris-HC1缓冲液,0 ~ 0.03mol/NaCl 梯度洗脱,收集有活性的各峰,冻干后,凝胶柱脱盐;
所述的步骤e)中,所述反相高效液相色谱(RT- HPLC):即用RT-HPLC进行纯化,色谱条件:
1)样品前处理:将样品用0.06%TFA的水溶解到0.6ml,离心(12000-14000RPM,离心10分钟)取上清;
2)系统: Agilent 1260 HPLC;
3)柱子:ZorbaxSB-C18 4.6X250 5um;
4)进样体积:80-100ul;
5)缓冲液、平衡缓冲液: 0.06%TFA洗脱缓冲液: 0.05%TFA的乙腈;
6) 梯度:0%–0 % B洗脱4分钟,0%–8% B洗脱25分钟,8%-100%B洗脱1分钟,100% -100%B洗脱5分钟;
7)流速:1.0 ml/min;
8)检测:280nm/214nm。
本发明主要是针对鱿鱼加工过程中产生大量的下脚料——鱿鱼皮,没有得到充分利用,且造成环境污染等问题;以鱿鱼皮为原料,采用生物酶解技术、现代分离纯化技术、分析测试手段以及氨基酸检测手段,得到具有抗衰老、保湿、修复功能的小分子胶原低聚——十肽。本发明力求克服传统由于疯牛病、口蹄疫、禽流感等疾病不断出现,陆生动物来源的胶原蛋白在应用上受到了极大限制弊端,降低生产成本。本发明制备的小分子胶原蛋白粉,供人体口服,对皮肤具有抗衰老、保湿、修复功能。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作详细的介绍:本发明所述的一种鱿鱼皮小分子胶原蛋白粉制备方法,包括以下步骤:
a) 清洗鱿鱼皮,沥干水分,匀浆后按一定的料液比加入去离子水,搅拌均匀,并调节pH值到7.5~8.5 ;
b) 加入鱿鱼皮质量0.4~0.6%的蛋白酶,混匀后在50~60℃条件下水解80 ~100min,得到鱼皮酶解液;
c)超滤:将鱼皮酶解液加入超滤系统,用10KD、5KD、3KD的超滤膜进行超滤,收集>10KD、10-5KD、5-3KD和<3KD分子量的酶解液;
d)将酶解液用葡聚糖凝胶Sephadex G25进行凝胶柱层析和缓冲液洗脱,收集各峰后,取有生物活性的峰再用反相高效液相色谱(RT- HPLC)纯化;
e)经过反相高效液相色谱(RT- HPLC)纯化及氨基酸序列检测,获得小分子胶原低聚十肽的胶原蛋白粉产品。
作为一种最佳实施例:本发明所述的一种鱿鱼皮小分子胶原蛋白粉制备方法,包括以下步骤:
a) 清洗鱿鱼皮,沥干水分,匀浆后按一定的料液比加入去离子水,搅拌均匀,并调节pH值到7.5~8.5 ;
b) 加入鱿鱼皮质量0.4~0.6%的蛋白酶,混匀后在50~60℃条件下水解80 ~100min,得到鱼皮酶解液;
c)超滤:将鱼皮酶解液加入超滤系统,用10KD、5KD、3KD的超滤膜进行超滤,收集>10KD、10-5KD、5-3KD和<3KD分子量的酶解液;
d)将酶解液用葡聚糖凝胶Sephadex G25进行凝胶柱层析和缓冲液洗脱,收集各峰后,取有生物活性的峰再用反相高效液相色谱(RT- HPLC)纯化;所述的凝胶柱层析和缓冲液洗脱是:PH8.5Tris-HC1 缓冲液,0 ~ 0.03mol/NaCl 梯度洗脱,收集有活性的各峰,冻干后,凝胶柱脱盐;
e)经过反相高效液相色谱(RT- HPLC)纯化及氨基酸序列检测,获得小分子胶原低聚十肽的胶原蛋白粉产品。
所述反相高效液相色谱(RT- HPLC):即用RT-HPLC进行纯化,色谱条件:
1)样品前处理:将样品用0.06%TFA的水溶解到0.6ml,离心(12000-14000RPM,离心10分钟)取上清;
2)系统: Agilent 1260 HPLC;
3)柱子:ZorbaxSB-C18 4.6X250 5um;
4)进样体积:80-100ul;
5)缓冲液、平衡缓冲液: 0.06%TFA洗脱缓冲液: 0.05%TFA的乙腈;
6) 梯度:0%–0 % B洗脱4分钟,0%–8% B洗脱25分钟,8%-100%B洗脱1分钟,100% -100%B洗脱5分钟;
7)流速:1.0 ml/min;
8)检测:280nm/214nm。
本发明采用酶工程技术和现代分离纯化手段,定向可控酶切制备寡聚肽,研究功能寡聚肽基本片段;应用现代膜分离、凝胶过滤、离子交换、反相高效液相色谱和气相色谱等技术分离纯化寡肽,结合氨基酸含量的测定手段,确定功能小分子肽结构特点;小分子胶原低聚肽蛋白粉制备技术研究:采用现代科技手段对分离的胶原低聚肽制备成适合口服的生物制品,便于口服抗衰老。

Claims (2)

1.一种鱿鱼皮小分子胶原蛋白粉制备方法,其特征在于包括以下步骤:
a) 清洗鱿鱼皮,沥干水分,匀浆后按一定的料液比加入去离子水,搅拌均匀,并调节pH值到7.5~8.5 ;
b) 加入鱿鱼皮质量0.4~0.6%的蛋白酶,混匀后在50~60℃条件下水解80 ~100min,得到鱼皮酶解液;
c)超滤:将鱼皮酶解液加入超滤系统,用10KD、5KD、3KD的超滤膜进行超滤,收集>10KD、10-5KD、5-3KD和<3KD分子量的酶解液;
d)将酶解液用葡聚糖凝胶Sephadex G25进行凝胶柱层析和缓冲液洗脱,收集各峰后,取有生物活性的峰再用反相高效液相色谱(RT- HPLC)纯化;
e)经过反相高效液相色谱(RT- HPLC)纯化及氨基酸序列检测,获得小分子胶原低聚十肽的胶原蛋白粉产品。
2.根据权利要求1所述的鱿鱼皮小分子胶原蛋白粉制备方法,其特征在于:
所述的步骤d)中,所述的凝胶柱层析和缓冲液洗脱是:PH8.5Tris-HC1 缓冲液,0 ~0.03mol/NaCl 梯度洗脱,收集有活性的各峰,冻干后,凝胶柱脱盐;
所述的步骤e)中,所述反相高效液相色谱(RT- HPLC):即用RT-HPLC进行纯化,色谱条件:
1)样品前处理:将样品用0.06%TFA的水溶解到0.6ml,离心(12000-14000RPM,离心10分钟)取上清;
2)系统: Agilent 1260 HPLC;
3)柱子:ZorbaxSB-C18 4.6X250 5um;
4)进样体积:80-100ul;
5)缓冲液、平衡缓冲液: 0.06%TFA洗脱缓冲液: 0.05%TFA的乙腈;
6) 梯度:0%–0 % B洗脱4分钟,0%–8% B洗脱25分钟,8%-100%B洗脱1分钟,100% -100%B洗脱5分钟;
7)流速:1.0 ml/min;
8)检测:280nm/214nm。
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