CN102250994A

CN102250994A - 一种利用鱿鱼肝脏蛋白制备血管紧张素转换酶抑制肽的方法

Info

Publication number: CN102250994A
Application number: CN2010101773297A
Authority: CN
Inventors: 谢超; 霍建聪; 丁璞
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2010-05-18
Filing date: 2010-05-18
Publication date: 2011-11-23

Abstract

本发明涉及一种利用鱿鱼肝脏蛋白制备血管紧张素转换酶抑制肽的方法，包括将提取鱼油后的鱿鱼肝脏蛋白用丙酮处理除脂，选用胃蛋白酶在在水解温度35～38℃，pH为1.5～2.5，酶与底物的比为2～3％，底物浓度为1～3％条件下水解鱿鱼肝脏蛋白18～25h；将酶解液进行超滤处理后，跟踪其ACE抑制活性，应用凝胶过滤层析、DEAE阴离胃子交换、RP-HPLC等方法分离纯化ACE抑制肽，制得的ACE抑制肽在温度2～100℃、pH值1～12之间对ACE的抑制活性基本没有变化，比较稳定，而且模拟胃肠消化实验对组分的ACE抑制活性的影响不大，经过胃肠消化后仍具有较高的ACE抑制活性。本方法不仅工艺合理，易操作，而且减少了废物排放，变废为宝，制得的ACE抑制肽可应用于开发具有降血压功能食品及医药领域。

Description

一种利用鱿鱼肝脏蛋白制备血管紧张素转换酶抑制肽的方法

技术领域

本发明涉及鱿鱼肝脏蛋白深加工的方法，尤其涉及一种利用鱿鱼肝脏蛋白制备血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽的方法。

背景技术

鱿鱼加工过程中有约占鱿鱼体重30％的头、足、肝脏及表皮等废弃物产生。对于这些废弃物，一般的处理方法是加工鱼粉，或者掩埋，这不但是对渔业资源的巨大浪费，而且还存在着环境污染的问题。在国外，如西班牙和日本对于鱿鱼肝脏的利用采用自身酶解发酵法生产鱿溶浆、鱿鱼粉等作为鱼类饲料。在国内鱿鱼肝脏的利用和研究还有比较大的发展空间，目前仅有鱿鱼肝脏干粉的加工，并且是用作饲料，技术水平不高。目前，有从鱿鱼皮制备胶原蛋白活性肽，如专利号为200710013140.2，一种鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的制备，将鱿鱼皮用清水洗净，加入NaOH的水溶液浸泡，再用清水反复洗涤至pH中性；加入稀酸水溶液浸泡，再洗涤至pH中性；搅拌下，在热水中抽提胶原蛋白，过滤除去不溶物；在搅拌下，加酶酶解1-6h，酶解温度为40-50℃，在90-100℃下灭酶4-10min；用碱液调pH至中性，酶解液经过滤后，再依次经过截留分子量为8KD的超滤膜超滤、纳滤脱盐，最后真空浓缩，喷雾干燥。产品具有很强的生物活性，可用于制备抗氧化、降血压、抗动脉粥样硬化或美容的保健食品或药品。但是它是从鱿鱼皮来制取。本研究的目的就是从废弃的鱿鱼肝脏中提取蛋白质和生物活性肽，以使宝贵的蛋白质和油脂资源得以综合利用，提高附加值，减少废弃物的排放，净化环境。

鱿鱼肝脏中提取生物活性肽的研究，可提供消化吸收效率更高的蛋白质水解产物，用于食品和饲料行业，而且制备的生物活性肽还可应用于疾病的防治，能为维护人类的健康作贡献。

目前，有许多不同种类的药物应用于高血压的治疗，其中血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽(即降血压活性肽)是一种治疗高血压的主要药物。从1981年第一个口服有效的人工合成ACE抑制剂卡托普利(Captopril)批准使用以来，现在应用于临床上的ACE抑制剂已达18种，但人工合成的ACE抑制剂在临床应用过程中往往会产生副作用，如咳嗽、味觉功能紊乱及皮疹等。因此，寻找天然的ACE抑制剂引起了研究者的极大兴趣。试验表明，天然的ACE抑制肽对自发性高血压大鼠(SHR)及高血压患者具有降压作用，而对正常血压大鼠及人无降压作用。另外，这些肽是经食品级酶在混合条件下处理获得的，其安全性高。ACE抑制肽在开发具有降血压功能的功能食品中具有广阔前景。

目前生产ACE抑制肽的方法大体有三种：一是提取存在于生物体中的各类天然ACE抑制肽；二是通过化学法或酶法水解蛋白质，化学法常采用加热和酸处理的方法，而体外蛋白酶水解包括直接酶解和利用微生物间接酶解两类；三是用重组DNA技术、酶法、化学法合成活性肽。其中，酶解蛋白质生产ACE抑制肽因其安全性高、能在温和的条件下进行定位水解分裂产生特定的肽段，而且水解过程易受控制，价廉易推广，引起人们的极大兴趣。因而近几年报道的ACE抑制肽的制备方法皆为酶解法，酶的选择是酶解法生产活性肽的关键，应根据酶的专一性从众多的蛋白酶中筛选出能水解所需肽段，目前广泛使用的蛋白酶有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。

由于ACE抑制肽的氨基酸组成和结构差别均较大，没有一个固定或较特殊的氨基酸组成，并且蛋白酶解产物成分相当复杂，这就增加了它的分离提取难度。因此，建立一套适宜的分离提取技术工艺是将ACE抑制肽推向商业化生产的必要条件。ACE抑制肽的分离提取甚至结构鉴定是一项最复杂，也是最有意义的工作。所用的分离纯化的方法主要有：离子交换树脂、超滤、凝胶过滤色谱、高效液相色谱、聚丙稀酰胺凝较电泳等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是根据上述技术现状提供一种从废弃的鱿鱼肝脏中提取蛋白质进而制备血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽的方法，提取分离工艺合理，易控制易操作，制得的活性肽具有较高的活性。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种利用鱿鱼肝脏蛋白制备血管紧张素转换酶抑制肽的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)采取丙酮浸提法提取鱿鱼肝脏蛋白：将鱿鱼肝脏与水按质量比1∶1～1∶1.5混合，充入氮气10～20分钟，加入占鱿鱼肝脏重量0.1～0.5％的L-抗坏血酸-6-棕榈酸酯抗氧剂，放入高压锅中处理20～30min，离心处理，除去上层鱼油，用丙酮洗涤数次，将组织脱水制成丙酮粉，真空干燥即得脱脂鱿鱼肝脏蛋白；

2)用胃蛋白酶酶解鱿鱼肝脏蛋白：以脱脂鱿鱼肝脏蛋白为底物，在水解温度35～38℃，pH为1.5-2.5，酶与底物的比为2～3％，底物浓度为1～3％条件下水解鱿鱼肝脏蛋白18～25h，其中百分比为质量百分比；

3)将得到的鱿鱼肝脏蛋白酶解液进行超滤处理；

4)将超滤后的产物用Sephadex G-50凝胶柱初步分离，得到粗分物的ACE抑制肽；

5)在粗分物的ACE抑制肽中选取活性高的组分用DEAE阴离子交换柱进行分离纯化；

6)将纯化后得到的活性高的组分用Sephadex LH-20继续分离纯化；

7)最后检测纯度，得到血管紧张素转换酶抑制肽。

所述步骤3的超滤处理的过程为：

1)采用超滤装置将鱿鱼肝脏蛋白酶解液进行超滤，滤膜为截留分子量1kDa～30kDa。

2)将截留液用蒸馏水稀释后继续超滤，合并收集的超滤液并进行冷冻干燥。所述步骤1中离心处理工艺为4000～10000rpm/min处理20～40min。

所述步骤4的凝胶柱初步分离的工艺为：将超滤后冻干样品溶解，用蒸馏水进行洗脱，流速为20～40mL/h，优选30mL/h，紫外检测仪HD₂-CA，检测波长280nm；并测定各肽峰抑制ACE的活性，其半抑制浓度(IC₅₀)达到2.10～5.08mg/mL。将得到的对ACE抑制活性高的粗分物组分进行稳定性及抑制模式分析。

所述的凝胶柱中凝胶采用葡萄糖凝胶，分离的分子量为1000Da-10000Da。

所述步骤5的分离纯化具体过程为：选取活性高的组分用DEAE阴离子交换柱分离，上样先用水洗脱，再用0～1mol/LNaCl溶液进行线性洗脱，流速为20～28mL/h，优选24mL/h，并测定各肽峰抑制ACE的活性，其半抑制浓度(IC₅₀)达到1.80～2.10mg/mL。

所述步骤6的分离纯化工艺条件为：洗脱液为25～35％(wt)的甲醇溶液，优选30％的甲醇溶液，流速为20～28mL/h，优选24mL/h，并测定各肽峰抑制ACE的活性。其半抑制浓度(IC₅₀)达到1.50～1.80mg/mL。

所述步骤7的检测纯度是采用反相高效液相色谱C18柱检测纯度，洗脱液甲为含0.01％～0.03％TFA的水，洗脱液乙为含0.01％～0.03％TFA的乙腈溶液，先用5％～10％的甲液洗脱，再用洗脱梯度为95％～98％乙液洗脱，流速为20～24mL/h。

所述步骤2中胃蛋白酶酶解鱿鱼肝脏蛋白的工艺参数优选为底物浓度2.5％，酶与底物比2％，在36℃条件下酶解20h。

所述高压锅采用115～125℃。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明是对鱿鱼肝脏废弃物的综合利用研究，将提取鱼油后的鱿鱼肝脏蛋白用丙酮处理除脂，用胃蛋白酶进行酶解，并对其酶解条件进行优化，并将酶解液进行超滤处理、凝胶过滤层析、DEAE阴离胃子交换、RP-HPLC等方法分离纯化ACE抑制肽，制得的ACE抑制肽在温度2～100℃、pH值1～12之间对ACE的抑制活性基本没有变化，比较稳定，而且模拟胃肠消化实验对组分的ACE抑制活性的影响不大，经过胃肠消化后仍具有较高的ACE抑制活性。本方法不仅工艺合理，易控制易操作，而且减少了废物排放，变废为宝，制得的ACE抑制肽可应用于开发具有降血压功能食品及医药领域。

附图说明

图1是底物浓度对酶解液水解度和ACE抑制活性的影响曲线图；

图2是酶解时间对酶解液水解度和ACE抑制活性的影响曲线图；

图3是酶与底物比对酶解液水解度和ACE抑制活性的影响曲线图；

图4是胃蛋白酶酶解液在Sephadex G-50上的洗脱图；

图5是温度对组分B抑制活性影响曲线图；

图6是pH对组分B的抑制活性影响曲线图；

图7是组分B在DEAE阴离子交换柱上的洗脱图；

图8是F组分在Sephadex LH-20上的洗脱图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一种利用鱿鱼肝脏蛋白制备血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽的方法，具体包括以下步骤：

1、采取丙酮浸提法提取鱿鱼肝脏蛋白：

按1∶1.5比例加水，充入氮气10min，并加入占油量0.2％的L-抗坏血酸-6-棕榈酸酯防止氧化，放入高压锅中，高温高压(121℃，0.5Mpa)处理20min，然后在8000rpm/min条件下离心30min，最上层为鱼油层，离心鱼油后，用丙酮洗涤数次，将组织迅速脱水制成丙酮粉，真空干燥即得脱脂鱿鱼肝脏蛋白；

2、用胃蛋白酶酶解鱿鱼肝脏蛋白：在水解温度36℃，pH为1.5-2.5，酶与底物的比为2％，底物浓度为2.5％条件下水解鱿鱼肝脏蛋白20h；

3、将得到的鱿鱼肝脏蛋白酶解液采用超滤装置将鱿鱼肝脏蛋白酶解液进行超滤，滤膜为截留分子量小于等于10000Da；将截留液用蒸馏水稀释后继续超滤，合并收集的超滤液并进行冷冻干燥；

4、将超滤后的产物用Sephadex G-50凝胶柱初步分离，用蒸馏水进行洗脱，流速为0.5mL/min，紫外检测仪HD2-CA，检测波长280nm；并测定各肽峰抑制ACE的活性。

5、选取活性高的组分用DEAE阴离子交换柱进行分离纯化，用水洗脱，再用0～1mol/L NaCl溶液进行线性洗脱，流速为24mL/h，并测定各肽峰抑制ACE的活性。

6、将纯化后得到的活性高的组分用Sephadex LH-20继续分离纯化，洗脱液为30％的甲醇溶液，流速为24mL/h，并测定各肽峰抑制ACE的活性。

7、采用反相高效液相色谱C18柱检测纯度，洗脱液甲为含0.01％TFA的水，洗脱液乙为含0.01％TFA的乙腈溶液，先用5％的甲液洗脱，再用洗脱梯度为95％乙液洗脱，流速为24mL/h，及制得ACE抑制肽。

以下对胃蛋白酶酶解鱿鱼肝脏蛋白酶解条件的优化及ACE抑制活性分析做详细说明。

一、胃蛋白酶酶解鱿鱼肝脏蛋白酶解条件的优化

1、底物浓度的优化

水解温度为36℃，pH为2.0，酶与底物的比为2％，分别在底物浓度为1％、2.5％、5.0％、7.5％、10％条件下水解鱿鱼肝脏蛋白24h，检测酶解液的水解度和对ACE的抑制活性。

如图1所示，当底物浓度较低(1％～2.5％)时，酶与底物结合几率较少，反应速度较低，导致水解度较低。适当增加底物浓度有利于反应速度的升高即水解度的升高。但底物浓度达2.5％以后，随着浓度的进一步升高，水解度反而呈下降趋势。这是因为底物浓度较大时在不断受热情况下，蛋白分子易于产生交联聚合现象。使蛋白酶分子与底物蛋白分子之间的接触机会减少，且溶解性差，黏度增大，反而影响反应速度，从而导致水解度下降。而且从图1可以看出底物浓度的变化对抑制ACE活性的影响不大，因此实验中选择2.5％为酶解反应的底物浓度。

2、酶解时间的优化

水解温度为36℃，pH为2.0，以酶与底物的比为2％，底物浓度为2.5％的条件酶解鱿鱼肝脏蛋白，分别酶解2、4、8、12、20、24、32h，检测酶解液的水解度和对ACE的抑制活性。

如图2所示，在前20h水解度随着时间的延长而显著增加，但在20h后，水解度随时间的延长几乎没有变化。而且时间的延长对抑制ACE活性的影响也不大，因此实验中选用酶解时间为20h。

3、酶与底物比的优化

水解温度为36℃，pH为2.0，底物浓度为2.5％，分别在酶与底物的比0％、0.5％、1.0％、2％、2.5％、5％条件下水解鱿鱼肝脏蛋白20h，检测酶解液的水解度和对ACE的抑制活性。

酶解液的水解度随着酶与底物比的增加而增加。当底物浓度一定时，底物的水解度取决于酶的浓度，理论上讲，酶分子越多，水解度就会越来越大，但图3显示，酶浓度较低时，水解度增长很快，当酶与底物比达2％时，水解度变化很小，这是因为酶浓度较高，与蛋白质分子肽链的接触机率越多，则底物转化为产物可溶性肽也就相应地增加。但当酶与底物比较高时，蛋白质的相对浓度较低，酶分子已过饱和，有一部分酶分子将不能与蛋白质结合，导致水解度随着酶与底物比的升高而缓慢上升。同样，随着酶与底物比的变化对抑制ACE活性的影响也不大，因此实验中选择2％为酶与底物的比。用胃蛋白酶酶解鱿鱼肝脏蛋白的酶解条件最终确定为：底物浓度2.5％，酶与底物比为2％，在36℃条件下酶解20h。

二、ACE抑制肽的初步分离及其ACE抑制活性分析

1、用Sephadex G-50初步分离ACE抑制肽

采用凝较过滤分离法分离鱿鱼肝脏蛋白酶解的产物。凝较过滤是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析方法，此类层析的固相载体是具有分子筛作用的凝胶。本实验中使用的是葡聚糖凝胶。葡聚糖凝胶是由一定平均分子量的葡聚糖和甘油基相互交联形成的三维空洞网状结构。网眼的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。Sephadex G-50的分离范围是1000Da～30000Da分子量。用Sephadex G-50初步分离鱿鱼肝脏蛋白酶解液，用30％的甲醇作为洗脱液，以24mL/h的恒速进行洗脱，如图4所示，有5个主要的峰(A，B，C，D，F)被检测到，对每个峰分别收集、真空浓缩、冷冻干燥后测定其对ACE的抑制活性。

如表1所示，第A，B，C区洗脱下来的蛋白具有ACE抑制活性，其IC₅₀分别为：2.26mg/mL、1.80mg/mL、5.08mg/mL。结果表明分子量较大的多肽具有较好的ACE抑制活性。选取粗分物中活性最高的组分B，对ACE抑制活性相关参数进行分析。

表1Sephadex G-50初步分离各片断ACE抑制活性和回收率

2、粗分物组分B的ACE抑制活性相关参数分析

对鱿鱼肝脏蛋白用Sephadex G-50洗脱后得到的粗分物组分B的理化稳定性进行考察。图5、图6分别为不同温度和不同pH对组分B的ACE抑制活性的影响。结果显示，组分B的溶液在温度2～100℃、pH值1～12之间对ACE的抑制活性基本没有变化，比较稳定。

三、模拟胃肠环境消化实验

ACE抑制肽在被人体摄入以后要经过胃肠消化道才能被吸收，因此有必要研究模拟胃肠消化对组分B的ACE抑制活性的影响。在本实验中，选择组分B的样品浓度为1.80mg/mL，模拟消化实验，检测各酶解反应后酶解液的ACE抑制活性，结果如表2所示。

表2模拟胃肠消化对组分B的ACE抑制活性的影响

从表2中可以看出，粗分物组分B的ACE抑制活性在经过胃蛋白酶消化2h后，ACE抑制活性有一些提高，但总体来说，模拟胃肠消化对ACE抑制活性的影响不大，粗分物组分B经过胃肠消化后仍具有较高的ACE抑制活性。

四、ACE抑制肽分离纯化

鱿鱼肝脏蛋白经过Sephadex G-50洗脱得到5个组分(图7)，其中组分B具有较强的抑制ACE活性，其IC₅₀为1.80mg/mL，回收率为18.53％。收集组分B进一步通过DEAE阴离子交换柱分离纯化后，洗脱得到了1个峰F，见图7。将F组分通过SephadexLH-20继续分离，由图8可见，洗脱得到2个峰，标记为G和H组分，检测这两部分的ACE抑制活性，抑制ACE的活性结果大致相同。

最后用反相高效液相色谱C18柱检测G和H组分的纯度，洗脱液甲为含0.01％TFA的水，洗脱液乙为含0.01％TFA的乙腈溶液。先用5％甲液洗脱，再用洗脱梯度为95％～0％乙液洗脱，流速为24mL/h。

五、结论

本方法是对鱿鱼肝脏废弃物的综合利用研究，将提取鱼油后的鱿鱼肝脏蛋白用丙酮处理除脂，选择蛋白酶进行酶解，并对其酶解条件进行优化。将酶解液进行超滤处理后，跟踪其ACE抑制活性，应用凝胶过滤层析、DEAE阴离胃子交换、RP-HPLC等方法分离纯化ACE抑制肽。主要结论如下：

将提取鱼油后的鱿鱼肝脏蛋白用丙酮处理三次除脂，选择胃蛋白酶来酶解鱿鱼肝脏蛋白。

根据胃蛋白酶酶解液的ACE抑制活性和水解度来优化酶解条件，最终确定为：底物浓度2.5％，酶与底物比2％，在36℃条件下酶解20h。

将鱿鱼肝脏蛋白的酶解液经过截留分子量为10000Da的滤膜经过超滤处理后，用Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱初步分离，洗脱得到5个洗脱峰，其中粗分物组分B的ACE抑制活性较高，其IC₅₀为1.80mg/mL。

对粗分物组分B的ACE抑制活性相关参数分析，结果表明：组分B的溶液在温度2～100℃、pH值1～12之间对ACE的抑制活性基本没有变化，比较稳定。而且模拟胃肠消化实验对粗分物组分B的ACE抑制活性的影响不大，经过胃肠消化后仍具有较高的ACE抑制活性。

Claims

1.一种利用鱿鱼肝脏蛋白制备血管紧张素转换酶抑制肽的方法，其特征在于包括以下步骤：

3)将得到的鱿鱼肝脏蛋白酶解液进行超滤处理；

6)将纯化后得到的活性高的组分用Sephadex LH-20继续分离纯化；

7)最后检测纯度，得到血管紧张素转换酶抑制肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1中离心处理工艺为4000～10000rpm/min处理20～40min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤3的超滤处理的过程为：

2)将截留液用蒸馏水稀释后继续超滤，合并收集的超滤液并进行冷冻干燥。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤4的凝胶柱初步分离的工艺为：用蒸馏水进行洗脱，流速为20～40mL/h，并测定各肽峰抑制ACE的活性。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的凝胶柱中凝胶采用葡萄糖凝胶，分离的分子量为1kDa～10kDa。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤5的分离纯化具体过程为：选取活性高的组分上样先用水洗脱，再用0～1mol/L NaCl溶液进行线性洗脱，流速为20～28mL/h，并测定各肽峰抑制ACE的活性。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤6的分离纯化工艺条件为：洗脱液为25～35％(wt)的甲醇溶液，流速为20～28mL/h，并测定各肽峰抑制ACE的活性。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤7的检测纯度是采用反相高效液相色谱C18柱检测纯度，洗脱液甲为含0.01％～0.03％TFA的水，洗脱液乙为含0.01％～0.03％TFA的乙腈溶液，先用5％～10％的甲液洗脱，再用洗脱梯度为95％～98％乙液洗脱，流速为20～24mL/h，采用体积浓度。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述高压锅采用115～125℃。