CN110698540A - 乌鳢蛋白来源的ace抑制肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了乌鳢蛋白来源的ACE抑制肽及其制备方法。本发明通过胃蛋白酶水解乌鳢蛋白，制备了具有高活性的ACE抑制肽的酶解液，利用超滤管粗分，液相色谱进一步分离，鉴定得到三条相应的多肽序列FRVPTPNVS、HVNKDIAPKL和KIKIIAPPERKYS。乌鳢来源广泛且价格便宜，因此本发明不仅降低了制备ACE抑制肽的成本，提升了乌鳢的利用价值，且有望应用于商业化制备降血压药物，促进了淡水鱼资源的深化利用。

Description

乌鳢蛋白来源的ACE抑制肽及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及乌鳢蛋白来源的ACE抑制肽及其制备方法。
背景技术
据世界卫生组织报告，世界上大约30％的死亡是由心血管引起的。到2020年，中风和心脏病疾病将是全世界死亡的主要原因。降血压肽通过抑制血管紧张素转换酶(Angiotensin converting enzyme，ACE)的活性从而降低血压，因此又称为ACE抑制肽。ACE能催化血管紧张素Ι转化为血管紧张素Ⅱ以及使血管扩张剂(缓激肽)失活，因此导致血压升高(Food Chem,2017,228:506–517)。因此，抑制ACE活性已成为治疗高血压的主要目标。尽管一些合成的ACE抑制剂，如依那普利，阿拉西普利或赖诺普利对高血压有疗效，但具有极强的副作用，包括炎症反应、干咳、味觉障碍或血管神经性水肿等。因此，几乎无副作用的食物来源的ACE抑制肽被认为是一种极具潜力的降血压肽。
生物活性多肽是指具有降血压、抗氧化、抗菌和调节免疫等功能的多肽(J FunctFoods,2010,2:1–9)，一般由2-20个氨基酸组成(Food Chemistry,2012,32:1872–1882)。20世纪50年代，美国最先对生物活性多肽进行初步的探索研究，韩国和日本也相继对该领域进行研究。在过去的近30年里，国内外研究者们对于ACE抑制肽的关注度也不断增加。目前许多植物类、动物类以及海洋生物类的食物已经用于制备ACE抑制肽，如大豆、大米、奶酪、牛肉、肌肉、扇贝、金枪鱼等。海洋生物类尤其鱼类蛋白含量高且优质，是一类优质的制备降血压多肽的原料。中国发明专利CN102517364A(公开号)中公布了一种利用海参制备ACE抑制肽的方法，通过膜分离技术得到活性高的小分子ACE抑制肽，药用价值高。中国发明专利CN103571904A(公开号)中公布了一种利用鮰鱼皮制备胶原蛋白肽的方法，利用碱性蛋白酶水解得到ACE抑制肽，效果极好。中国发明专利CN108033995A(申请公开号)中公开了两种来源于大黄鱼肌联蛋白的ACE抑制肽，通过体外验证和分子对接技术证明了两种活性多肽的降血压效果。但目前极少有利用淡水鱼制备ACE抑制肽的研究，对于乌鳢的研究更是少之又少。
发明内容
本发明的目的在于提供由乌鳢蛋白来源的降血压肽及其制备方法。
为了达到以上目的，本发明采用了以下技术方案：
乌鳢蛋白来源的ACE抑制肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料准备：将新鲜的乌鳢仅保留背部肌肉，去刺去皮，冷却水漂洗1-2次，绞碎，冷冻干燥，磨粉，过40目筛，收集过筛的鱼粉冷藏备用；
(2)乌鳢蛋白酶解液制备：称取0.1-2％(w/v)的鱼粉溶于超纯水中，搅拌过夜，离心取上清即得乌鳢蛋白。将乌鳢蛋白调节至pH＝2-4，加入1-7％的胃蛋白酶，36-38℃下水解4-8 h，水解过程中不断搅拌，水解完成后85-95℃水浴8-10min灭酶。将酶解液与未酶解的蛋白进行ACE抑制活性测定。
(3)首先利用超滤管或超滤膜对酶解液进行粗分，得到分子量为1-3KDa的乌鳢蛋白多肽组分。再将该组分利用反相高效液相色谱进一步分离纯化，按照出峰时间收集多肽，即得到ACE抑制肽。
优选地，步骤(3)中，采用反相液相色谱分离，流速为4mL/min，流动相A-乙腈含0.1％三氟乙酸/B-水含0.1％三氟乙酸为：0-5min，5％A；5-30min，5％-75％A；按照出峰时间收集多肽组分，12-15min收集的多肽组分为最佳的ACE抑制肽组分。
优选地，所述步骤(1)中直接用超纯水溶解乌鳢鱼粉，鱼粉质量与水的体积比为1:100；
优选地，所述步骤(2)中将胃蛋白酶用于酶解乌鳢蛋白，加酶量为4％.
优选地，步骤(3)中，利用截留分子量为10KDa、3KDa、1KDa的超滤管对酶解液进行粗分，得到1-3KDa组分。
本发明还提供来源于乌鳢蛋白的ACE抑制肽，所述的ACE抑制肽序列为：FRVPTPNVS或 HVNKDIAPKL或KIKIIAPPERKYS。
本发明还提供所述的ACE抑制肽在制备调节血压的保健食品或药物中的用途。
本发明的有益效果在于：
乌鳢是一种生长速度相当快，且对环境适应能力极强的淡水鱼类，肉质细嫩，口味鲜美，是典型的高蛋白，低脂肪的保健食品。本发明主要利用乌鳢蛋白疏水性氨基酸含量高和胃蛋白酶对疏水性氨基酸末端的广泛特异性的特点，在适宜的条件下对其进行酶解，并根据多肽的分子量和疏水性差异选择两种不同的分离纯化方法对混合多肽组分分离提纯，最终可以得到高活性的ACE抑制肽。
本发明根据乌鳢疏水性氨基酸含量较高的特点，结合胃蛋白酶水解，得到了高ACE抑制活性的酶解液，通过分离鉴定得到三条高活性ACE抑制肽，其氨基酸序列分别为：FRVPTPNVS、 HVNKDIAPKL、KIKIIAPPERKYS。此方法成本低，原料来源广泛，进一步深化了淡水鱼资源的利用，推动了商业化生产降血压药物的进程。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为多肽FRVPTPNVS的二级质谱图。
图2为多肽HVNKDIAPKL的二级质谱图。
图3为多肽KIKIIAPPERKYS的二级质谱图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1：
(1)原料准备：将新鲜的乌鳢仅保留背部肌肉，去刺去皮，冷却水漂洗1-2次，绞碎，冷冻干燥，磨粉，过40目筛，收集过筛的鱼粉于-20℃冷藏备用；
(2)乌鳢蛋白酶解液制备：称取1％(w/v)的鱼粉溶于超纯水中，搅拌过夜，离心取上清即得乌鳢蛋白。将乌鳢蛋白调节至pH＝3，加入4％的胃蛋白酶，37℃下水解6h，水解过程中不断搅拌，水解完成后90℃水浴10min灭酶。将酶解液与未酶解的蛋白进行ACE抑制活性测定，测得未酶解蛋白半抑制浓度(IC50)为38.5mg/mL，酶解液IC50为0.179mg/mL；
(3)分离纯化与多肽序列鉴定：首先利用截留分子量为10KDa、3KDa、1KDa的超滤管对酶解液进行粗分，得到分子量为>10KDa、3-10KDa、1-3KDa、<1KDa的乌鳢蛋白多肽组分。测定ACE抑制率，表明1-3KDa多肽组分ACE抑制效果最好，为76％，是分子量大于10KDa的多肽组分的2倍。
实施例2：
(1)原料准备：将新鲜的乌鳢仅保留背部肌肉，去刺去皮，冷却水漂洗1-2次，绞碎，冷冻干燥，磨粉，过40目筛，收集过筛的鱼粉于-20℃冷藏备用；
(2)乌鳢蛋白酶解液制备：称取1％(w/v)的鱼粉溶于超纯水中，搅拌过夜，离心取上清即得乌鳢蛋白。将乌鳢蛋白调节至pH＝3，加入4％的胃蛋白酶，37℃下水解6h，水解过程中不断搅拌，水解完成后90℃水浴10min灭酶。将酶解液与未酶解的蛋白进行ACE抑制活性测定，测得未酶解蛋白半抑制浓度(IC50)为38.5mg/mL，酶解液IC50为0.179mg/mL；
(3)分离纯化与多肽序列鉴定：首先利用截留分子量为10KDa、3KDa、1KDa的超滤管对酶解液进行粗分，并各段多肽组分ACE抑制率，表明1-3KDa多肽组分ACE抑制效果最好。将1-3KDa多肽组分用半制备型反相液相色谱分离，流速为4mL/min，流动相A(乙腈含0.1％三氟乙酸)/B(水含0.1％三氟乙酸)为：0-5min，5％A；5-30min，5％-75％A。按照出峰时间收集多肽组分，测定ACE抑制活性，表明12-15min收集的多肽组分ACE抑制效果最好，为93％。
实施例3：
(1)原料准备：将新鲜的乌鳢仅保留背部肌肉，去刺去皮，冷却水漂洗1-2次，绞碎，冷冻干燥，磨粉，过40目筛，收集过筛的鱼粉于-20℃冷藏备用；
(2)乌鳢蛋白酶解液制备：称取1％(w/v)的鱼粉溶于超纯水中，搅拌过夜，离心取上清即得乌鳢蛋白。将乌鳢蛋白调节至pH＝3，加入4％的胃蛋白酶，37℃下水解6h，水解过程中不断搅拌，水解完成后90℃水浴10min灭酶。将酶解液与未酶解的蛋白进行ACE抑制活性测定，测得未酶解蛋白半抑制浓度(IC50)为38.5mg/mL，酶解液IC50为0.179mg/mL；
(3)分离纯化与多肽序列鉴定：首先利用截留分子量为10KDa、3KDa、1KDa的超滤管对酶解液进行粗分，并各段多肽组分ACE抑制率，表明1-3KDa多肽组分ACE抑制效果最好。将1-3KDa多肽组分用半制备型反相液相色谱分离，测定ACE抑制活性，表明12-15min 收集的多肽组分ACE抑制效果最好。将该部分多肽进行液质联用测定多肽氨基酸序列，确定三条多肽氨基酸序列为：FRVPTPNVS、HVNKDIAPKL、KIKIIAPPERKYS。
以上详细所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (7)

1.乌鳢蛋白来源的ACE抑制肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料准备：将新鲜的乌鳢仅保留背部肌肉，去刺去皮，冷却水漂洗1-2次，绞碎，冷冻干燥，磨粉，过40目筛，收集过筛的鱼粉冷藏备用；
(2)乌鳢蛋白酶解液制备：按重量体积比，称取0.1-2％的鱼粉溶于超纯水中，搅拌过夜，离心取上清即得乌鳢蛋白；将乌鳢蛋白调节至pH＝2-4，加入1-7％的胃蛋白酶，36-38℃下水解4-8h，水解过程中不断搅拌，水解完成后85-95℃水浴8-10min灭酶；
(3)首先利用超滤管或超滤膜对酶解液进行粗分，得到1-3KDa组分，再将该组分利用反相高效液相色谱进一步分离纯化，按照出峰时间收集多肽，得到ACE抑制肽。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，采用反相液相色谱分离，流速为4mL/min，流动相A-乙腈含0.1％三氟乙酸/B-水含0.1％三氟乙酸为：0-5min，5％A；5-30min，5％-75％A；按照出峰时间收集多肽组分，12-15min收集的多肽组分为最佳的ACE抑制肽组分。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中直接用超纯水溶解乌鳢鱼粉，鱼粉质量与水的体积比为1:100。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中将胃蛋白酶用于酶解乌鳢蛋白，加酶量为4％。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，利用截留分子量为10KDa、3KDa、1KDa的超滤管对酶解液进行粗分，得到1-3KDa组分。
6.ACE抑制肽，其特征在于：所述的ACE抑制肽序列为：FRVPTPNVS或HVNKDIAPKL或KIKIIAPPERKYS。
7.如权利要求6所述的ACE抑制肽在制备调节血压的保健食品或药物中的用途。
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