CN114574536A

CN114574536A - 一种胶原三肽及其酶法制备方法

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Publication number: CN114574536A
Application number: CN202210018509.3A
Authority: CN
Inventors: 崔春; 邓秀杰; 汪雪莲
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: Guangzhou Baoyuan Health Food Co.,Ltd.
Priority date: 2022-01-07
Filing date: 2022-01-07
Publication date: 2022-06-03

Abstract

本发明公开了一种胶原三肽及其酶法制备方法，该酶法制备方法包括：以罗非鱼鱼皮为原料，通过添加内切蛋白酶控制酶解，灭酶，再添加解淀粉芽孢杆菌蛋白酶进一步控制酶解处理，灭酶，冷冻干燥制备得到。本发明的优点在于：(1)采用本发明酶法制备方法制备出的罗非鱼鱼皮胶原三肽不具有明显苦味；(2)本发明原料来源于动物蛋白，价格便宜；(3)本发明工艺简单易于产业化生产，成本低。

Description

一种胶原三肽及其酶法制备方法

技术领域

本发明属于鱼类加工副产物的深加工领域，具体涉及一种胶原三肽及其酶法制备方法。

技术背景

鱼皮胶原蛋白属于Ⅰ型胶原蛋白，Ⅰ型胶原蛋白是由一条α1链(G9M6I5)和2条α2链(G9M6I6)三螺旋组成。胶原蛋白分子长约300nm、直径约1.5nm，由3条肽链以平行、右旋的形式缠绕而成，组成胶原蛋白的a肽链自身为左手螺旋结构。每条肽链的序列特征表现为每隔两个其它氨基酸残基即有一个甘氨酸，每条肽链的序列特征为Gly-X-Y的重复序列， X主要为脯氨酸(Pro)，Y一般为羟脯氨酸(Hyp)和丙氨酸(Ala)。

水解制备多肽是水产品高价值全面再利用的一个重要途径，胶原蛋白的提取方法有酸碱提取法、酶提取法和热水提取法，其生产出的多肽具有美容，止血，抑菌以及利于人体吸收等功效。酶解法制备多肽具有专一性、反应时间短，反应条件温和以及操作简单的优点，适用于大规模酶解生产制备小分子胶原蛋白肽。

胶原蛋白通过蛋白酶水解可得到多种胶原蛋白肽。周先艳研究发现经碱性蛋白酶酶解鳕鱼皮胶原蛋白，其酶解液透过Caco-2细胞的寡肽的一级结构中有7条含有GPA序列，5条含有GPS序列，5条含有GPR序列(周先艳.鳕鱼皮胶原蛋白水解液体外模拟消化研究及抗氧化肽的分离纯化[D].昆明理工大学,2016)；同样艾丽奇用碱性蛋白酶处理后也得到GPA肽段，并验证了GPA具有潜在抗光老化的活性(艾丽奇.鳕鱼皮胶原蛋白肽的抗皮肤光老化功效及其作用机制研究[D].华南理工大学)；Wang从猪、牛、罗非鱼、母鸡表皮经木瓜蛋白酶酶解制备的胶原蛋白水解物中鉴别出了多个肽段富含Gly-Pro-Hyp序列，并且可减轻经UVA诱导的人体真皮成纤维细胞损伤(Xiangfeng Wang,Hui Hong,Jianping Wu.Hen collagenhydrolysate alleviates UVA-induced damage in human dermal fibroblasts[J].Journal of Functional Foods,63)。

近年来，胶原三肽如GPH、GHK、GHA被报道具有多种生理活性，可改善皮肤弹性、预防皮肤光老化、提高皮肤透明质酸含量等多种活性。Kim研究发现70μg/mL GPH作用人体真皮成纤维细胞可以有效促进透明质酸，减少水分流失以及促进I型胶原蛋白的合成(KIM AH,KIM Y S,ZHE P,et al.Cutaneous hydration effect of collagen hydrolysatecontaining collagen tripeptides)；Sontakk等研究发现GPH能跨肠单层细胞进行转运进入血浆并在人体内稳定运输，有利于机体吸收(SONTAKKE S B,JUNG J H,PIAO Z,etal.Orally Available Collagen Tripeptide:Enzymatic Stability,IntestinalPermeability,and Absorption of Gly-Pro-Hyp and Pro-Hyp[J].JournalofAgricultural&Food Chemistry)；AH Kim用含34mg/kg GPH的胶原水解物处理经丙酮诱导的皮肤干燥的小鼠，发现GPH可以有效的维持胶原结构形态有效预防皮肤干燥；满帅报道200μg/mL的GPH可有效防治大鼠地塞米松性骨质疏松；Zhao等研究发现200mg/kg的GPA可通过降低氧化应激，对肠道损伤具有保护作用(满帅.狭鳕鱼皮胶原蛋白肽防治地塞米松致大鼠骨质疏松作用研究[D].青岛大学.)；艾丽奇报道GPA有潜在的抗光老化作用，100μM GPA处理光损伤成纤维细胞，细胞存活率为75.34％，此外GPA还可抑制胶原酶的产生、抑制Ca2+离子内流和改善线粒体膜电位流失(艾丽奇.鳕鱼皮胶原蛋白肽的抗皮肤光老化功效及其作用机制研究[D].华南理工大学.)。

人体肠道存在肽转运体Pep T 1,能特异性转运二肽和三肽，胶原三肽可直接被肠道吸收或者经不完全消化后再被人体吸收。AitoInoue的研究表明Gly-Pro-Hyp虽然不能完整地穿透小肠上皮细胞,但是通常被氨肽酶N水解为甘氨酸和ProHyp运输进入体内(AitoInoue M, Lackeyram D,Fan M Z,et al.Transport of a tripeptide,Gly-Pro-Hyp,across the porcine intestinal brushborder membrane brush-border membrane.)；在大鼠离体小肠翻转实验中,胶原三肽的小肠吸收率明显高于大分子的胶原肽和游离氨基酸(Yamamoto S,Deguchi K,Onuma M,et al. Absorption and urinary excretionofpeptides after collagen tripeptide ingestion in humans)，这些研究都表明胶原三肽相对于大分子的胶原或胶原肽来说,吸收更容易或更快。

胶原三肽的应用广泛，遍布美容、关节和骨骼保健、运动保健和外用品等多个领域。比如可以作为营养补充剂，其氨基酸组成与胶原基本一致，含有7种必须氨基酸和几乎全部非必需氨基酸。根据胶原三肽对皮肤生长具有重要促进作用的特性，可以开发成辅助具有美容功能性的食品，比如方航以胶原三肽、苹果汁等食品原料复配制备胶原三肽美肌饮品(方航，朱学良，刘翔，等.胶原三肽美肌饮品的制备工艺研究)；在减少中年妇女的皮肤水分流失，帮助人们适应气候变化方面也有显著效果(Tak Young Jin，Shin Dae Keun，etal.Effect of Collagen Tripeptide andAdjusting for Climate Change on SkinHydration in Middle-Aged Women: ARandomized,Double-Blind,Placebo-ControlledTrial)；中国专利公开了一种含有胶原三肽的美白抗衰老护肤霜，当胶原三肽被皮肤吸收后，填充在皮肤真皮之间，增加皮肤紧密度，产生皮肤张力，缩小毛孔，使皮肤紧绷而富有弹性，能更有效的将皮肤细胞撑起，结合保湿和抑制皱纹的作用，共同达到舒展粗纹，淡化细纹的功效。利用胶原三肽能够促进骨和软骨生长修复、抑制动脉粥样硬化的特性(TomosugiNaohisa,Yamamoto Shoko,etal.Effect of Collagen Tripeptide onAtherosclerosisin Healthy Humans)，开发特殊功能性食品，比如作为老年食品添加剂，促进钙吸收，提升血钙水平，预防老年骨质疏松。

利用鱼皮或鱼鳞为原料，通过内切蛋白酶酶解生产胶原蛋白肽已有多篇文献报道。但水解产物分子量较大，肽的种类多样，几乎不含有GPH、GPA等三肽。目前公开的发明或专利主要利用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌发酵生产胶原三肽。

发明专利公开了胶原蛋白三肽及其制备工艺，包括以下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养； (3)发酵培养；(4)菌体收集；(5)提取类人胶原蛋白；(6)类人胶原蛋白酶解制备胶原三肽。本发明所述胶原蛋白三肽，制备工艺简单方便，得到具有抗氧化能力和美白功效的类人胶原三肽，无毒副作用，可进一步加工成美白、减肥瘦身功能产品。

中国专利公开了制备胶原酶的方法以及利用其制备胶原三肽的方法。制备胶原酶的方法包括：第1步骤：离心分离枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株；第2步骤：浓缩经离心分离的上清液；第3步骤：利用离子交换色谱法纯化所述上清液。制备胶原三肽的方法包括：第 1步骤：将预处理过的鱼鳞和水以2∶8的重量比混合；第2步骤：将所述混合物在90℃下热处理5小时；第3步骤：加入通过上述方法制备的胶原酶,随后在35℃下降解12小时；第4 步骤：通过离心法从第3步骤的成分中去除杂物；第5步骤：通过离子交换色谱法纯化所述成分；第6步骤：浓缩所述经纯化的成分；第7步骤：利用活性炭纯化所述经浓缩的成分；以及第8步骤：利用过滤器对所述成分进行除菌。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种胶原三肽及其酶法制备方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种无明显苦味的胶原三肽的酶法制备方法，所述酶法制备方法是以罗非鱼鱼皮为原料，通过添加内切蛋白酶来控制酶解，灭酶，再添加解淀粉芽孢杆菌蛋白酶进一步控制酶解处理，灭酶，浓缩，冷冻干燥制备得到。

进一步地，所述一种胶原三肽的酶法制备方法，包括以下步骤：

(1)将罗非鱼鱼皮与水混合，升温至100℃-110℃保持30min-40min，待鱼皮胶原蛋白解聚后，添加内切蛋白酶水解至水解度为7.0％-9.5％，升温至80℃-90℃保持20min-40min灭酶，得罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液；

(2)将罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液降温至40-60℃，添加所述罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液质量1％-5％(W/W)的解淀粉芽孢杆菌蛋白酶，酶解9-15h；

(3)在解淀粉芽孢杆菌蛋白酶处理后的罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液水解至水解度达到14.21％-18.80％后，升温至80℃-90℃保持20min-40min灭酶；

(4)离心祛除残渣，浓缩，冷冻干燥，得罗非鱼鱼皮胶原三肽。

进一步地，步骤(1)所述水解度是指蛋白质分子中由于水解而断裂的肽键占蛋白质分子中总肽键的比例，本发明采用甲醛滴定法测定。

进一步地，步骤(1)所述添加内切蛋白酶水解至水解度为7.5％-9.5％。

进一步地，步骤(1)所述内切蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶中任意一种。

进一步地，步骤(1)所述内切蛋白酶与罗非鱼鱼皮的质量比为0.1％-0.5％。

进一步地，步骤(2)所述解淀粉芽孢杆菌蛋白酶为解淀粉芽孢杆菌接种于含有1％(W/W) 罗非鱼鱼皮和0.5％(W/W)麸皮的液体培养基的三角瓶中，在30℃，180r/min条件下培养 48h后,过滤得到的上清液作为粗酶液。

进一步地，所述解淀粉芽孢杆菌蛋白酶来源于中国南海海泥中筛选出的菌种，该菌种命名为解淀粉芽孢杆菌SWJS22(Bacillus amyloliquefaciens SWJS22)，保藏编号为CGMCC No.8425，于2013年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所。

进一步地，步骤(4)所述离心的转速为6000r/min-8000r/min，步骤(4)所述离心的时间为10-15min。

进一步地，步骤(4)所述冷冻干燥的冷阱温度为-40至-60℃。

进一步地，步骤(4)所述冷冻干燥的时间为24-48h。

本发明还提供所述酶法制备方法制得的罗非鱼鱼皮胶原三肽。

进一步地，所述酶法制备方法制得的胶原三肽粉末在40℃可饮用水中溶解添加5wt％-10wt％，胶原三肽水溶液无明显苦味。

本发明采用上述酶法制备方法，相对于现有技术具备如下优点和显著技术效果：

(1)发明人利用内切蛋白酶初步水解胶原蛋白，再利用解淀粉芽孢杆菌蛋白酶进行酶解作用，酶解成具有特征结构的胶原三肽Gly-Pro-X(甘氨酸-脯氨酸-X，其中X代表一种氨基酸)，采用本发明酶法制备方法制备出的罗非鱼鱼皮胶原三肽不具有明显苦味。

(2)罗非鱼鱼皮价格便宜，水解制备罗非鱼鱼皮胶原三肽简便易得。

(3)本发明酶法制备方法简单，易于产业化生产，且成本低。

附图说明

图1为实施例1制备的罗非鱼鱼皮胶原三肽1的液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。

实施例1

(1)将罗非鱼鱼皮与等质量的水混合，升温至100℃保持30min，添加碱性蛋白酶搅拌水解至水解度为7.50％，所述碱性蛋白酶与罗非鱼鱼皮的质量比为0.1％，升温至80℃保持20 min灭酶，得罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液；

(2)将罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液降温至60℃，添加所述罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液质量5％的解淀粉芽孢杆菌蛋白酶粗酶液，酶解12小时；

(3)在解淀粉芽孢杆菌蛋白酶处理后的罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液水解至水解度达到18.40％后，升温至90℃保持20min灭酶；

(4)8000r/min离心10min祛除残渣，浓缩，冷阱温度-60℃冷冻干燥24h，得罗非鱼鱼皮胶原三肽1。

图1为实施例1制备的罗非鱼鱼皮胶原三肽1的液相色谱图，由图1可知三肽保留时间为 12.2min，四肽保留时间为11.3min，五肽保留时间为10.5min。

对比例1

(1)将罗非鱼鱼皮与水等质量混合，升温至100℃保持30min，添加胰蛋白酶搅拌水解至水解度为7.50％，所述胰蛋白酶与罗非鱼鱼皮的质量比为0.1％，升温至80℃保持20min灭酶，得罗非鱼鱼皮胶原蛋白胰蛋白酶水解液。

(2)8000r/min离心10min祛除残渣，浓缩，冷阱温度-60冷冻干燥24h，得胰蛋白酶蛋白肽。

在40℃饮用水中加入实施例1得到的冻干的罗非鱼鱼皮胶原三肽1粉末，搅拌溶解，冷却至室温，得到质量百分浓度为5％的罗非鱼鱼皮胶原三肽1水溶液。由10名具有感官评价经验的感官评价鉴定者品尝。

感官评价实验由20-45岁的有感官评价经验的5位男性和5位女性组成。感官评价结果表明：5wt％罗非鱼鱼皮胶原三肽1水溶液无明显苦味，而5wt％胰蛋白酶蛋白肽水溶液苦味明显。

实施例2

(1)将罗非鱼鱼皮与水按照质量比为1:5进行混合，升温至110℃保持35min，添加木瓜蛋白酶搅拌水解至水解度为9.5％，所述木瓜蛋白酶与罗非鱼鱼皮的质量比为0.5％，升温至85℃保持30min灭酶，得罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液；

(2)将罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液降温至50℃，添加所述罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液质量1％的解淀粉芽孢杆菌蛋白酶粗酶液，液酶解9h；

(3)在解淀粉芽孢杆菌蛋白酶处理后的罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液水解至水解度达到14.21％后，升温至80℃保持30min灭酶；

(4)6000r/min离心15min祛除残渣，浓缩，冷阱温度-40℃冷冻干燥48h，得罗非鱼鱼皮胶原三肽2。5wt％罗非鱼鱼皮胶原三肽2水溶液苦味值与5wt％罗非鱼鱼皮胶原三肽1水溶液接近。

采用UPLC-MS/MS(超高效液相色谱-串联质谱)分别对上述实施例1和实施例2的酶解产物进行半定量分析，以比较不同蛋白酶组合对胶原蛋白肽种类和含量的影响，结果见表1，其中BaqPro+Alcalase指实施例1的解淀粉芽孢杆菌蛋白酶+碱性蛋白酶酶，Baq Pro+Papain指实施例2的解淀粉芽孢杆菌蛋白酶+木瓜蛋白酶。

表1UPLC-MS/MS鉴定结果 Tab.1The identified results ofUPLC-MS/MS

由表1可见，酶解产物中鉴定出多种胶原三肽，包括GPH、GPA、HAG、LPG、GPV、 PGR以及GPT等，其中以GPA、GPH和HAG的离子强度最大。从离子强度来看，实施例1 的解淀粉芽孢杆菌蛋白酶+碱性蛋白酶组合酶解产物中GPA和GPH的离子强度明显高于实施例2的解淀粉芽孢杆菌蛋白酶+木瓜蛋白酶组合。采用HPLC法对解淀粉芽孢杆菌蛋白酶+碱性蛋白酶组合酶解产物中GPH含量进行测定，结果表明该酶组合酶解产物中GPH质量百分含量达到1.46％。

实施例3

(1)将罗非鱼鱼皮与水按照质量比为1:3进行混合，升温至105℃保持40min，添加中性蛋白酶搅拌水解至水解度为8.5％，所述中性蛋白酶与罗非鱼鱼皮的质量比为0.25％，升温至 85℃保持40min灭酶，得罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液；

(2)将罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液降温至40℃，添加所述罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液质量3％的解淀粉芽孢杆菌蛋白酶粗酶液，酶解15h；

(3)在解淀粉芽孢杆菌蛋白酶处理后的罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液水解至水解度达到14.64％后，升温至85℃保持40min灭酶；

(4)7000r/min离心13min祛除残渣，浓缩，冷阱温度-50℃冷冻干燥36h，得罗非鱼鱼皮胶原三肽3。5wt％罗非鱼鱼皮胶原三肽3水溶液苦味值与5wt％罗非鱼鱼皮胶原三肽1水溶液接近。

实施例4

(1)将罗非鱼鱼皮与等质量的水混合，升温至100℃保持30min，添加碱性蛋白酶搅拌水解至水解度为7.50％，所述碱性蛋白酶与罗非鱼鱼皮的质量比为0.1％，升温至90℃保持20 min灭酶，得罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液；

(2)将罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液降温至40℃，添加所述罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液质量5％的解淀粉芽孢杆菌蛋白酶粗酶液，酶解15h；

(3)在解淀粉芽孢杆菌蛋白酶处理后的罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液水解至水解度达到18.80％后，升温至90℃保持20min灭酶；

(4)7500r/min离心12min祛除残渣，浓缩，冷阱温度-50℃冷冻干燥36h，得罗非鱼鱼皮胶原三肽4。5wt％罗非鱼鱼皮胶原三肽4水溶液苦味值与5wt％罗非鱼鱼皮胶原三肽1水溶液接近。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种胶原三肽及其酶法制备方法

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3

<212> PRT

<213> 甘氨酸-脯氨酸-羟脯胺酸(Gly-Pro-Hyp)

<400> 1

Gly Pro His

1

<210> 2

<211> 3

<212> PRT

<213> 甘氨酸-脯氨酸-丙氨酸(Gly-Pro-Ala)

<400> 2

Gly Pro Ala

1

<210> 3

<211> 3

<212> PRT

<213> 羟脯氨酸-丙氨酸-甘氨酸(Hyp-Ala-Gly)

<400> 3

His Ala Gly

1

<210> 4

<211> 3

<212> PRT

<213> 亮氨酸-脯氨酸-甘氨酸(Leu- Pro-Gly)

<400> 4

Leu Pro Gly

1

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 甘氨酸-脯氨酸-缬氨酸(Gly-Pro-Val)

<400> 5

Gly Pro Val

1

<210> 6

<211> 3

<212> PRT

<213> 脯氨酸-甘氨酸-精氨酸(Pro-Gly-Arg)

<400> 6

Pro Gly Arg

1

<210> 7

<211> 3

<212> PRT

<213> 甘氨酸-脯氨酸-苏氨酸(Gly-Pro-Thr)

<400> 7

Gly Pro Thr

1

<210> 8

<211> 3

<212> PRT

<213> 谷氨酰胺-羟脯氨酸-脯氨酸(Gln-Hyp-Pro)

<400> 8

Gln Glx Pro

1

<210> 9

<211> 3

<212> PRT

<213> 谷氨酰胺-谷氨酸-脯氨酸(Gln-Gly-Pro)

<400> 9

Gln Gly Pro

1

<210> 10

<211> 3

<212> PRT

<213> 谷氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸(Gly-Pro-Met)

<400> 10

Gly Pro Met

1

<210> 11

<211> 3

<212> PRT

<213> 甘氨酸-丙氨酸-精氨酸(Gly-Ala-Arg)

<400> 11

Gly Ala Arg

1

<210> 12

<211> 3

<212> PRT

<213> 甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸(Gly-Pro-Pro)

<400> 12

Gly Pro Pro

1

<210> 13

<211> 3

<212> PRT

<213> 甘氨酸-赖氨酸-羟脯胺酸(Gly-Lys-Hyp)

<400> 13

Gly Lys His

1

<210> 14

<211> 3

<212> PRT

<213> 甘氨酸-脯氨酸-精氨酸(Gly- Pro-Arg)

<400> 14

Gly Pro Arg

1

<210> 15

<211> 3

<212> PRT

<213> 甘氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺(Gly-Pro-Gln)

<400> 15

Gly Pro Gln

1

<210> 16

<211> 3

<212> PRT

<213> 甘氨酸-脯氨酸-赖氨酸(Gly-Pro-Lys)

<400> 16

Gly Pro Lys

1

<210> 17

<211> 4

<212> PRT

<213> 羟脯胺酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸(Hyp-Ala-Gly-Ala)

<400> 17

His Ala Gly Ala

1

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> 甘氨酸-谷氨酸-甘氨酸-脯氨酸-赖氨酸(Gly-Glu-Gly-Pro-Lys)

<400> 18

Gly Glu Gly Pro Lys

1 5

<210> 19

<211> 4

<212> PRT

<213> 羟脯胺酸-丙氨酸-甘氨酸-脯氨酸(Hyp-Ala-Gly-Pro)

<400> 19

His Ala Gly Pro

1

Claims

1.一种胶原三肽的酶法制备方法，其特征在于，所述酶法制备方法是以罗非鱼鱼皮为原料，通过添加内切蛋白酶来控制酶解，灭酶，再添加解淀粉芽孢杆菌蛋白酶进一步控制酶解处理，灭酶，浓缩，冷冻干燥制备得到。

2.根据权利要求1所述一种胶原三肽的酶法制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将罗非鱼鱼皮与水混合，升温至100℃-110℃保持30min-40min，待鱼皮胶原蛋白解聚后，添加内切蛋白酶水解至水解度为7.5％-9.5％，升温至80-90℃保持20-40min灭酶，得罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液；

(2)将罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液降温至40-60℃，添加罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液质量1％-5％的解淀粉芽孢杆菌蛋白酶，酶解9-15h；

(3)在解淀粉芽孢杆菌蛋白酶处理后的罗非鱼鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶水解液水解至水解度达到14.21％-18.80％后，升温至80-90℃，保持20-40min灭酶；

3.根据权利要求2所述一种胶原三肽的酶法制备方法，其特征在于，步骤(1)所述内切蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶中任意一种。

4.根据权利要求2所述一种胶原三肽的酶法制备方法，其特征在于，步骤(1)所述内切蛋白酶与罗非鱼鱼皮的质量比为0.1％-0.5％。

5.根据权利要求2所述一种胶原三肽的酶法制备方法，其特征在于，步骤(2)所述解淀粉芽孢杆菌蛋白酶为解淀粉芽孢杆菌接种于含有质量百分浓度1％罗非鱼鱼皮和质量百分浓度0.5％麸皮的液体培养基的三角瓶中，在30℃，180r/min条件下培养48h后,过滤得到的上清液作为粗酶液。

6.根据权利要求2所述一种胶原三肽的酶法制备方法，其特征在于，步骤(2)所述解淀粉芽孢杆菌蛋白酶来源于中国南海海泥中筛选出的菌种，该菌种命名为解淀粉芽孢杆菌SWJS22(Bacillus amyloliquefaciens SWJS22)，保藏编号为CGMCC No.8425，于2013年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所。

7.根据权利要求2所述一种胶原三肽的酶法制备方法，其特征在于，步骤(4)所述离心的转速为6000r/min-8000r/min，步骤(4)所述离心的时间为10min-15min。

8.根据权利要求2所述一种胶原三肽的酶法制备方法，其特征在于，步骤(4)所述冷冻干燥的冷阱温度为-40℃至-60℃。

9.根据权利要求2所述一种胶原三肽的酶法制备方法，其特征在于，步骤(4)所述冷冻干燥的时间为24h-48h。

10.权利要求2-9任一项所述一种胶原三肽的酶法制备方法制得的罗非鱼鱼皮胶原三肽。