JP2006347937A

JP2006347937A - 畜肉タンパク質由来の血圧降下ペプチド

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Publication number: JP2006347937A
Application number: JP2005175085A
Authority: JP
Inventors: Keizo Arihara; 圭三有原; Shinichi Ishikawa; 伸一石川; Makoto Ito; 良伊藤; Masanobu Akimoto; 政信秋元; Yasuyoshi Nakajima; 靖好中島; Satoshi Kanai; 聡金井
Original assignee: Prima Meat Packers Ltd
Current assignee: Prima Meat Packers Ltd
Priority date: 2005-06-15
Filing date: 2005-06-15
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2025-06-15
Also published as: JP4790325B2

Abstract

【課題】食品の中で重要な位置づけをされている食肉から血圧降下作用あるいはアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有する新規なペプチド類及びこれらペプチド類を有効成分として含む医薬用組成物を提供すること。
【解決手段】食肉タンパク質あるいは食肉の主要タンパク質であるミオシン又はアクチンをアマノS（商品名）等のプロテアーゼの作用により加水分解し、Ile-Arg-Val-Val-Glu、Val-Trp-Ile、Val-Gly-Arg、 Ile-Lys-Ileの構造をもつペンタペプチド、およびトリペプチドを含むペプチド組成物を得る。これらのペプチドはアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性および血圧降下作用を有し、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤として用いることができ、また、安全性が高く、高血圧症の予防や症状改善用の食品に適用することができる。

Description

本発明は、食肉（畜肉）タンパク質をプロテアーゼで分解することにより生成する、アンジオテンシンI変換酵素の活性を阻害するペプチド、及びそれらペプチド又はその塩を有効成分として含有する、アンジオテンシンI変換酵素に起因する高血圧等の疾患の予防及び／又は症状改善用などの医薬用組成物等に関する。

高血圧症の発症に深く関わっている生体内の系としてレニン−アンジオテンシン系が知られており、この系の重要な構成要素であるアンジオテンシンI変換酵素はアンジオテンシンIに作用し、血圧上昇作用をもつアンジオテンシンIIを生成し、また、アンジオテンシンI変換酵素は降圧作用を有するペプチドであるブラジキニンを分解する作用をも有する。すなわち、アンジオテンシンI変換酵素は昇圧性ペプチドの生成と、降圧性ペプチドの分解という二つの作用により血圧上昇をもたらす。したがって、アンジオテンシンI変換酵素のこのような作用により高血圧症が発症している場合、アンジオテンシンI変換酵素の活性を阻害することにより、血圧上昇を抑制することができる。さらに、近年、アンジオテンシンI変換酵素阻害物質は、心不全の治療薬など、血圧降下剤以外の用途でも注目されている。

アンジオテンシンI変換酵素の阻害物質として、天然物では毒蛇由来のペプチド、化学合成物質ではカプトプリルなどが見い出されている。また近年、医薬品に対する安全性や食品に対する機能性への関心の高まりなどを背景として、食品や食品原料由来のアンジオテンシンI変換酵素阻害物質が注目されている。特に食品タンパク質の分解により生成するペプチド性のアンジオテンシンI変換酵素阻害物質の検索が数多く行われている。このようなものの例として、牛乳カゼイン、大豆タンパク質、トウモロコシタンパク質、鰯肉タンパク質などのプロテアーゼ分解により生成するペプチドを挙げることができる（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５参照）。また、豚肉や牛肉といった畜肉あるいは畜肉に含まれるタンパク質からこのようなペプチドを得た例も知られている（例えば、特許文献６、特許文献７参照）。

特開平８−２８３１７３号公報特開平８−２６９０８７号公報特開平８−９９９９４号公報特開平６−８７８８６号公報特開平７−１８８２８２号公報特許第３６５１８７８号公報特開２００４−２１７５８８号公報

本発明の課題は、食品の中で重要な位置づけをされている食肉から血圧降下作用あるいはアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有する新規なペプチド類及びこれらペプチド類を有効成分として含む医薬用組成物を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、食肉タンパク質であるミオシン又はアクチンから、プロテアーゼの作用により生成するペンタペプチドである配列番号１で示される（Ile-Arg-Val-Val-Glu）やトリペプチドである配列番号２で示される（Val-Trp-Ile）、配列番号３で示される（Val-Gly-Arg）、配列番号４で示される（Ile-Lys-Ile）が、アンジオテンシンI変換酵素阻害活性や血圧降下作用を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、（１）Ile-Arg-Val-Val-Glu、Val-Trp-Ile、Val-Gly-Arg、Ile-Lys-Ileのいずれかで表されるアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有するペプチド又はその塩や、（２）ミオシン又はアクチンあるいはミオシン又はアクチンを含む原料をプロテアーゼ処理することを特徴とする、Ile-Arg-Val-Val-Glu、Val-Trp-Ile、Val-Gly-Arg、Ile-Lys-Ileのいずれかで表されるアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有するペプチドの製造方法や、（３）ミオシン又はアクチンを含む原料が、畜肉の筋原繊維構成タンパク質であることを特徴とする前記（２）記載のペプチドの製造方法や、（４）プロテアーゼが、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ（商品名）、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ（商品名）、ブロメラインＦ（商品名）、パパインＷ−４０（商品名）、ニューラーゼＦ３Ｇ（商品名）、プロレザーＦＧ−Ｆ（商品名）、パンクレアチンＦ（商品名）、ペプチダーゼＲ（商品名）、プロテアーゼＰ「アマノ」３Ｇ（商品名）、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ（商品名）、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ（商品名）及びウマミザイムＧ（商品名）から選ばれる１種又は２種以上のプロテアーゼであることを特徴とする前記（２）又は（３）記載のペプチドの製造方法に関する。

また本発明は、（５）Ile-Arg-Val-Val-Glu、Val-Trp-Ile、Val-Gly-Arg、Ile-Lys-Ileのいずれかで表されるアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有するペプチドまたはその塩を有効成分とする医薬用組成物や、（６）アンジオテンシンI変換酵素に起因する疾患の予防及び／又は症状改善剤であることを特徴とする前記（５）記載の医薬用組成物や、（７）Ile-Arg-Val-Val-Glu、Val-Trp-Ile、Val-Gly-Arg、Ile-Lys-Ileのいずれかで表されるアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有するペプチドまたはその塩からなるアンジオテンシンI変換酵素阻害剤や、（８）Ile-Arg-Val-Val-Glu、Val-Trp-Ile、Val-Gly-Arg、Ile-Lys-Ileのいずれかで表されるアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有するペプチドまたはその塩を有効成分として含有するアンジオテンシンI変換酵素に起因する疾患の予防及び／又は症状改善用食品に関する。

本発明によると、食肉を原料とすることにより、血圧降下作用等の機能性を有するペプチドを低コストで得ることができる。また本発明のペプチドは、食肉由来のペプチドであることから、安全性が高く、医薬用組成物として利用しうるばかりでなく、血圧降下作用等を有する付加価値の高い機能性食品を作る素材としても有用である。

本発明のアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有するペプチドとしては、配列表の配列番号１（Ile-Arg-Val-Val-Glu）、配列番号２（Val-Trp-Ile）、配列番号３（Val-Gly-Arg）、配列番号４（Ile-Lys-Ile）に示されるアミノ酸配列からなり、かつアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有する、常温において白色等の粉末であるペプチドを具体的に例示することができる。

本発明においてペプチドの塩としては、薬理学上許容される塩であれば特に制限されるものではなく、本発明のアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有するペプチドの塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、クエン酸塩などの塩類を例示することができる。また、かかる本発明のアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有するペプチドの製法としては、食肉あるいは食肉タンパク質のプロテアーゼ分解物から分離・精製する方法と、アミノ酸の配列情報に基づき、化学的に合成する方法を挙げることができる。

プロテアーゼを用いるアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有するペプチドの製法における原料としては、本発明の配列番号１〜４で示される１種のペンタペプチド及び３種のトリペプチドが筋原線維を構成するタンパク質であるミオシン又はアクチンのアミノ酸配列の一部であることからして、ミオシン又はアクチンあるいはミオシン又はアクチンを含む原料が用いられる。かかるミオシン又はアクチンとしては、精製品の他、未精製のミオシンやアクチン、アクトミオシンを例示することができ、また、かかるミオシン又はアクチンを含む原料としては、肉塊、挽肉、残肉、屑肉、筋肉等のミオシンを４〜５％、アクチンを１〜２％含む食肉（畜肉）や、かかる食肉から得られる筋肉由来の水不溶性タンパク質等のミオシンを４５〜６０％、アクチンを１５〜２２％含む筋原繊維構成タンパク質などを例示することができ、これらミオシンやアクチン、食肉の種類・由来等は特に制限されるものではない。また、プロテアーゼとしては、アンジオテンシンI変換酵素阻害活性の強いペプチド溶液を得ることができるものであれば特に制限されるものではないが、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）やプロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）、ブロメラインＦ（天野エンザイム社製）、パパインＷ−４０（天野エンザイム社製）、ニューラーゼＦ３Ｇ（天野エンザイム社製）、プロレザーＦＧ−Ｆ（天野エンザイム社製）、パンクレアチンＦ、ペプチダーゼＲ（天野エンザイム社製）、プロテアーゼＰ「アマノ」３Ｇ（天野エンザイム社製）、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）、ウマミザイムＧ（天野エンザイム社製）として例示することができる。

プロテアーゼによるミオシン又はアクチンを含むタンパク質の分解は、例えば、ミオシン又はアクチンあるいはミオシン又はアクチンを含む原料を水あるいは適当な緩衝液（例えばリン酸緩衝液）に、ミオシン又はアクチン濃度が０．０１〜１０％、好ましくは０．１〜３．０％程度の濃度になるよう懸濁し、この溶液にプロテアーゼを０．０１〜１０ｇ／Ｌ、好ましくは０．０５〜２ｇ／Ｌ程度の濃度で添加することにより行われ、酵素反応条件としてはプロテアーゼが作用しうる条件であれば特に制限されないが、例えば用いるプロテアーゼの至適ｐＨ付近で、３７℃で１２〜１８時間程度の酵素処理条件を例示することができる。また、プロテアーゼによる分解反応は、加熱、無機酸や有機酸の添加、限外濾過によるプロテアーゼ除去など、一般によく知られている方法のいずれかにより停止することができる。反応停止後の分解液は、濾過あるいは遠心分離により不溶物を除去し、得られた濾液（タンパク質分解溶液）は、ミオシン又はアクチンの分解により生成したペプチドを含み、この溶液から目的とするペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィー等により精製することができる。また、濾液は必要に応じて、凍結乾燥や減圧乾燥により濃縮することができる。

他方、化学的合成法によるペプチドの製法は液相法と固相法に大別され、最近のペプチドシンセサイザーの普及により固相法による合成が一般化しつつあるものの、いずれの方法においても常法により本発明のアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有するペプチドを調製することができる。固相法によるペプチドの製造は、例えばアプライドバイオシステムズ社製ペプチド合成装置モデル４３０Ａ装置を用い、ポリマー性の固相支持体へ合成しようとするペプチドのカルボキシル末端側からＬ体アミノ酸を順次ペプチド結合により延長させて目的とするペプチド鎖を合成した後、トリフルオロメタンスルホン酸などを用いて固相支持体から切り出し、次いで、アミノ酸側鎖の保護基を取り除き、逆相高速クロマトグラフィーなどの方法で精製し、目的とするペプチドを得ることにより行うことができる。

本発明の医薬用組成物としては、上記本発明のアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有するペプチド又はその塩を有効成分として含有するものであれば特に制限されるものではなく、本発明のペプチド又はその塩の有する薬理作用の対象となる疾病、例えば高血圧症、心不全等のアンジオテンシンI変換酵素に起因する疾病に対する予防及び／又は症状改善剤を例示することができる。かかる本発明のペプチド及び／又はその塩と他の成分又は素材との混合物からなる薬理用組成物として、より具体的には、本発明のペプチド又はその塩に賦形剤を配合した高血圧症治療薬を例示することができる。

本発明のアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有するペプチド又はその塩は、アンジオテンシンI変換酵素阻害剤として用いることができるほか、アンジオテンシンI変換酵素に起因する疾患の予防及び／又は症状改善用食品として用いることができる。ここで、「アンジオテンシンI変換酵素に起因する疾患の予防及び／又は症状改善用食品」とは、アンジオテンシンI変換酵素に起因する疾患、例えば高血圧症の予防及び／又は症状改善に用いることができる旨の表示等の特定用途が明らかにされている食品や食品素材をいう。

このような本発明のペプチド又はその塩を含有する食品（素材）は、肉塊や残肉・屑肉を原料として安価かつ大量に調製することができる。例えば、肉塊を原料とする場合、肉塊より脂肪組織及び結合組織を除去したものをグラインドし、得られた挽肉にほぼ４倍量の水と適量のプロテアーゼを添加し、サイレントカッター等で攪拌し、５０℃で２４時間反応させて本発明のペプチドを生成せしめた後、９８℃で１０分間加熱して、プロテアーゼを失活させ、次いで必要に応じて濾過・精製することにより、本発明のペプチドを含有する食品素材を調製することができる。また、残肉・屑肉を原料とする場合、まずこれら残肉・屑肉をグラインドし、得られた挽肉に塩溶液（例えば０．５ＭＮａＣｌ溶液）を加え、サイレントカッター等で攪拌して、ミオシン、アクチン等の塩溶性タンパク質を抽出した後、遠心分離あるいは濾過により不溶物を除去し、抽出溶液に４〜５倍量の水を加えて塩濃度を低下せしめることにより、ミオシン、アクチン等の塩溶性タンパク質を析出させ、遠心分離あるいは濾過により不溶物として回収した不溶性のタンパク質に対して、以下上記肉塊の場合と同様に、プロテアーゼ処理等を行うことにより、本発明のペプチドを含有する食品素材を調製することができる。

このように調製した食品素材を直接食品として食してもよいが、他の食品に添加混合することもできる。かかる食品としては、コーヒー、紅茶、煎茶、ヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、スポーツ飲料等の各種飲料や、パン、ケーキ、ゼリー、饅頭、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、豆腐、こんにゃく、その他の各種総菜を例示することができる。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。なお、特に断らない限り、実施例中に示された“％”は重量％を表す。

［アンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有するペプチドの単離］
（豚骨格筋からのペプチドの生成）
豚骨格筋（大腿二頭筋）を細切し、脂肪や結合組織をできるだけ取り除いたもの１００ｇに蒸留水４００ｍＬを加え、ほぼ均一になるまでホモジナイズした。プロテアーゼとしては１２種類（天野エンザイム社製）、すなわちプロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ、ブロメラインＦ、パパインＷ−４０、ニューラーゼＦ３Ｇ、プロレザーＦＧ−Ｆ、パンクレアチンＦ、ペプチダーゼＲ、プロテアーゼＰ「アマノ」３Ｇ、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ及びウマミザイムＧをそれぞれ単独に用いた。上記豚骨格筋ホモジネートに上記プロテアーゼの１種を１ｇ添加して溶解させた後、５０℃で２４時間反応させ、ペプチドを生成させた。反応終了後、溶液を９８℃で１０分間加熱して、プロテアーゼを失活させた。遠心分離により大部分の不溶物を取り除き、さらにメンブランフィルターを通し、微細な粒子を除去し、１２種類のペプチド溶液を得た。アンジオテンシンI変換酵素阻害活性の測定には、かかるペプチド溶液を蒸留水で１０倍希釈した１２種類の試料溶液を用いた。

（アンジオテンシンI変換酵素阻害活性の測定方法）
アンジオテンシンI変換酵素阻害活性の測定は、合成基質である馬尿酸−Ｌ−ヒスチジル−ロイシン（SIGMA社製）を用いてアンジオテンシンI変換酵素が基質の末端ジペプチドのＬ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシンを選択的に切断することを利用して、遊離する馬尿酸を抽出し、比色する方法で実施した。試験管に測定しようとする試料溶液（ペプチド溶液）を０．０１５ｍＬ入れ、これに０．１２５ｍＬの基質溶液（６０８ｍＭ食塩を含む０．１Ｍホウ酸緩衝液ｐＨ８．３を用いて７．６ｍＭになるように馬尿酸−Ｌ−ヒスチジル−ロイシンを溶解させたもの）を添加し、３７℃で５分間保温した。その後、０．０５ｍＬの酵素溶液（SIGMA社製アンジオテンシンI変換酵素を蒸留水に５０単位／ｍＬになるように溶解させたもの）を添加し、３７℃で３０分間反応させた。１Ｎ塩酸０．１２５ｍＬを添加して反応を停止させた後、酢酸エチル０．７５ｍＬを加え、酢酸エチル中に抽出された馬尿酸を２２８ｎｍの吸光度を測定することにより定量した。かかる試料溶液の吸光度を“Ｓ”、試料溶液に代えて同量の蒸留水を用いた対照の吸光度を“Ｂ”、反応開始前の吸光度を“Ｃ”とし、アンジオテンシンI変換酵素阻害率を次式により算出した。
阻害率（％）＝（Ｂ−Ｓ）÷（Ｂ−Ｃ）×１００

（アンジオテンシンI変換酵素阻害活性の測定結果）
豚骨格筋を各種プロテアーゼで分解して調製した前記１２種類の試料溶液のアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を表１に示す。豚骨格筋にプロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ、ブロメラインＦ、パパインＷ−４０を作用させた試料溶液が７０％以上の阻害活性を有していた。

（アンジオテンシンI変換酵素阻害ペプチドの精製）
上記豚骨格筋のプロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ分解物５０ｇに８０％エタノール１Ｌを加えて撹拌し、ろ過により得られたろ液を減圧濃縮後、凍結乾燥した。凍結乾燥物を蒸留水１００ｍＬに溶解し、Ｗａｋｏｓｉｌ４０Ｃ１８樹脂（和光純薬工業社製）２００ｍＬを加えて撹拌した。ろ過により樹脂を回収し、５０％メタノールを用いて樹脂に吸着しているペプチドを溶出した。この時、得られたペプチドは３．５９ｇだった。このペプチドからのアンジオテンシンI変換酵素阻害ペプチドの精製はカラムに資生堂製ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫＣ１８ＵＧ１２０４．６×１５０ｍｍを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより行った。

（ペプチドの構造決定）
精製したペプチドのアミノ酸配列は、自動エドマン分解法（気相法）によるＮ末端アミノ酸分析により決定した。自動分析装置としてアブライドバイオシステムズ社製プロテインシークエンサーモデル４７０Ａを利用した。操作は製品マニュアルの記載に従って行い、試薬類はすべてアブライドバイオシステムズ社指定のものを用いた。豚骨格筋のプロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ分解物を試料として溶出液Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸を含む蒸留水）から溶出液Ｂ（０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル）への直線濃度勾配系による酸性溶出液を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーを行った際に得られたクロマトグラムを図１に示す。溶出液を１０分間隔で採取し、アンジオテンシンI変換酵素阻害活性を測定した結果、２０〜３０分の画分に最も高い活性が認められた。

次に、この画分を溶出液Ｃ（０．０１５％アンモニアを含む蒸留水）から溶出液Ｄ（０．０１５％アンモニアを含むアセトニトリル）への直線濃度勾配系によるアルカリ性溶出液を用いた逆相高速クロマトグラフィーにより分画した。溶出液を４分間隔で採取し、アンジオテンシンI変換酵素阻害活性を測定した結果、１２〜１６分の画分に最も高い活性が認められた。この画分を再度、同条件で高速液体クロマトグラフィーに供した際のクロマトグラムを図２に示す。２０分付近（Ａ）及び３５分付近（Ｂ）の矢印をつけた２本のピークの部分に高いアンジオテンシンI変換酵素阻害活性が検出された。それぞれの画分を再び酸性条件で高速液体クロマトグラフィーに供したところ、矢印を付けた４本の単一のピーク (１)〜（４）が得られた（図３及び４）。上記酸性及びアルカリ性溶出液を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより、それぞれのペプチドは単一成分に精製された。

精製した４種のペプチドの構造解析を行ったところ、１種のペンタペプチド及び３種のトリペプチドであった。これらの構造は以下のとおりである。
（１） Val-Trp-Ile （図３のピーク(１)由来）
（２） Ile-Arg-Val-Val-Glu （図４のピーク(２)由来）
（３） Val-Gly-Arg （図４のピーク(３)由来）
（４） Ile-Lys-Ile （図４のピーク(４)由来）
これらのアミノ酸配列をデータベース（UniProt）を利用して検索したところ、いずれも筋肉の速筋型ミオシン重鎖又はα−アクチン内に存在する配列に一致するものであった。Val-Trp-Ileは豚α−アクチン（３４１〜３４３残基目）、Ile-Arg-Val-Val-Gluは豚ミオシン重鎖（１５９３〜１５９７残基目）、Val-Gly-Argは豚α−アクチン（３７〜３９残基目）、Ile-Lys-Ileは豚α−アクチン（３２９〜３３１残基目）にそれぞれ一致した。なお、アミノ酸残基の数字はいずれもＮ末端側からのものである。

［ペンタペプチド等の化学合成］
（化学合成法）
１種のペンタペプチド（Ile-Arg-Val-Val-Glu）及び３種のトリペプチド（Val-Trp-Ile、Val-Gly-Arg、Ile-Lys-Ile）の化学合成はアブライドバイオシステムズ社製ペプチド合成装置モデル４３０Ａを用い、製品マニュアルの記載に従って行った。試薬類はすべてアブライドバイオシステムズ社指定のものを使用した。ペプチド鎖を合成した後、トリフルオロメタンスルホン酸により、固相支持体から切り出した。次いで、アミノ酸側鎖の保護基を取り除き、逆相高速クロマトグラフィーにより、目的とする１種のペンタペプチドと３種のトリペプチドを精製した。なお、高速液体クロマトグラフィーは、前記実施例１の酸性溶出液を利用した条件で行った。

（化学合成ペプチドのアンジオテンシンI変換酵素阻害活性の測定）
アンジオテンシンI変換酵素阻害活性の測定は、前記実施例１記載の方法と同様にして行った。また、阻害率５０％のときのペプチド濃度をＩＣ₅₀値とした。化学合成により調製した１種のペンタペプチドと３種のトリペプチドの分子量とアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を表２に示す。合成したペプチドの質量分析計（ＦＡＢ−ＭＡＳ）により測定した分子量の値は、化学構造から算出した値にほぼ一致しており、目的ペプチドの合成が問題なく行われたものと判断した。アンジオテンシンI変換酵素阻害活性は、トリペプチドVal-Trp-Ileで最も高かった。

（化学合成ペプチド等の血圧降下作用）
上記１種のペンタペプチド及び３種のトリペプチドの血圧降下作用について、自然発症高血圧ラットを用いて調べた。これら合成ペプチドをそれぞれ自然発症高血圧ラット（日本チャールズリバー社、１群６匹、９〜１２週齢、雄）に胃ゾンデを用いて強制投与した。ペプチド投与量はラット体重１ｋｇあたり１ｍｇとし、投与容量は１匹あたり１ｍＬとした。なお、蒸留水を経口投与したものを対照とした。胃ゾンデによる投与を行ってから６時間後の尾動脈における最高血圧値を測定し、投与直前の最高血圧値を減じた値を算出し、変動値（血圧降下値）とした。血圧測定は非観血式血圧測定装置（ソフトロン社製、ＢＰ−９８Ａ）を用い、テイル・カフ（tail-cuff）法により行った。結果を表３に示す。いずれの試料においても、投与６時間後に血圧降下が測定されたが、これらのうち、２種のトリペプチド（Val-Trp-Ile、Val-Gly-Arg）は有意（Ｐ＜０．０５、又はＰ＜０．０１）な血圧降下が認められた。また、同様に５匹の自然発症高血圧ラットに、豚骨格筋のプロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）分解物をラット体重１ｋｇあたり８ｍｇ投与した。結果を表４に示す。表４に示すように、有意（Ｐ＜０．０５）な血圧降下が認められた。

豚骨格筋のプロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ分解物を試料として酸性溶出液を用いて逆相高速液体クロマトグラフィーを行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。図１に示される活性画分をアルカリ性溶出液を用いて逆相高速液体クロマトグラフィーを行った際のクロマトグラムを示す図である。図２に示される活性画分（Ａ）を酸性溶出液を用いて逆相高速液体クロマトグラフィーを行った際のクロマトグラムを示す図である。図２に示される活性画分（Ｂ）を酸性溶出液を用いて逆相高速液体クロマトグラフィーを行った際のクロマトグラムを示す図である。

Claims

下記（１）〜（４）のいずれかで表されるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド又はその塩。
（１） Ile-Arg-Val-Val-Glu
（２） Val-Trp-Ile
（３） Val-Gly-Arg
（４） Ile-Lys-Ile
ミオシン又はアクチンあるいはミオシン又はアクチンを含む原料をプロテアーゼ処理することを特徴とする、下記（１）〜（４）のいずれかで表されるアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有するペプチドの製造方法。
（１） Ile-Arg-Val-Val-Glu
（２） Val-Trp-Ile
（３） Val-Gly-Arg
（４） Ile-Lys-Ile
ミオシン又はアクチンを含む原料が、畜肉の筋原繊維構成タンパク質であることを特徴とする請求項２記載のペプチドの製造方法。
プロテアーゼが、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ（商品名）、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ（商品名）、ブロメラインＦ（商品名）、パパインＷ−４０（商品名）、ニューラーゼＦ３Ｇ（商品名）、プロレザーＦＧ−Ｆ（商品名）、パンクレアチンＦ（商品名）、ペプチダーゼＲ（商品名）、プロテアーゼＰ「アマノ」３Ｇ（商品名）、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ（商品名）、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ（商品名）及びウマミザイムＧ（商品名）から選ばれる１種又は２種以上のプロテアーゼであることを特徴とする請求項２又は３記載のペプチドの製造方法。
下記（１）〜（４）のいずれかで表されるアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有するペプチド又はその塩を有効成分とする医薬用組成物。
（１） Ile-Arg-Val-Val-Glu
（２） Val-Trp-Ile
（３） Val-Gly-Arg
（４） Ile-Lys-Ile
アンジオテンシンI変換酵素に起因する疾患の予防及び／又は症状改善用剤であることを特徴とする請求項５記載の医薬用組成物。
下記（１）〜（４）のいずれかで表されるＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド又はその塩からなるアンジオテンシンI変換酵素阻害剤。
（１） Ile-Arg-Val-Val-Glu
（２） Val-Trp-Ile
（３） Val-Gly-Arg
（４） Ile-Lys-Ile
下記（１）〜（４）のいずれかで表されるアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有するペプチド又はその塩を有効成分として含有するアンジオテンシンI変換酵素に起因する疾患の予防及び／又は症状改善用食品。
（１） Ile-Arg-Val-Val-Glu
（２） Val-Trp-Ile
（３） Val-Gly-Arg
（４） Ile-Lys-Ile