JP2020176086A - 脳神経炎症抑制組成物の製造方法 - Google Patents
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- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
Abstract
Description
さらに、プラズマローゲンのビニルエーテル結合(アルケニル結合)が、特に酸化ストレスに敏感であるため細胞の抗酸化の機能も果たしている。
[1]プラズマローゲンを含む動物組織をプロテアーゼで処理する酵素処理工程と、前記プロテアーゼで処理した動物組織を、エタノールを含む抽出液で抽出するエタノール抽出工程と、を有することを特徴とする脳神経炎症抑制組成物の製造方法。
[2]動物組織が、ホタテ類、ホヤ及び鳥類から選ばれる動物の組織であることを特徴とする[1]記載の脳神経炎症抑制組成物の製造方法。
[3]プロテアーゼが、中性プロテアーゼであることを特徴とする[1]又は[2]記載の脳神経炎症抑制組成物の製造方法。
酵素処理工程は、プラズマローゲンを含む動物組織をプロテアーゼで処理する工程である。
動物組織としては、プラズマローゲンを含む動物組織であれば特に制限されるものではなく、ホタテ類、ホヤ、ナマコ、アワビ、サケ、サンマ、カツオ等の水産動物や鳥類等を挙げることができ、これらの中でも、ホタテ類、ホヤ、鳥類が好ましく、用いる部位としては、食用部位(可食部位)が好ましい。
エタノール抽出工程においては、プロテアーゼで処理した動物組織を、エタノールを含む抽出液で抽出する。
次の手順により、ホタテガイ(学名:Mizuhopecten yessoensis)から本発明の組成物を得た。
2.コクラーゼ(登録商標)・P顆粒(起源Aspergillus oryzae)[三菱ケミカルフーズ株式会社製]1.0gを加えた。
3.ブレンダーで粉砕した(10秒×2回)。
4.攪拌機を使用して50℃で30分反応させた。
5.エタノール800mlを加えた。
6.ブレンダーで粉砕した(10秒×2回)。
7.50℃で20分攪拌した。
8.吸引ろ過した。
9.ろ液をロータリーエバポレーターで乾固した。
11.水250mLを加え混和した。
12.分液ロートに移してよく混和した。
13.10分静置した。
14.下層(水層)を取りN2ガスで乾固した。
→このステップで得られた組成物(アミノ酸+その他水溶性成分)を比較組成物(3)とした。
15.上層(ヘキサン層)を取りN2ガスで乾固した。
→このステップで得られた組成物(pl-PE+その他脂質)を本発明の組成物(1)とした。
1.0.1Mクエン酸溶液(pH4.5)50mLにコクラーゼP0.5gとホスホリパーゼA1(PLA1)0.8gを加え混和した。
2.素材(生ホタテヒモ)200gを解凍し、ハサミで細かく切った。
3.1.を加え混和し、ブレンダーで粉砕した(10秒×3回)。
4.50℃で1時間反応させた(15分おきにガラス棒で混和した)。
5.ヘキサン/イソプロパノール(3:2)1000mLを加えた。
6.室温で10分撹拌した。
7.上澄みを吸引ろ過した。
8.ヘキサン/イソプロパノール(3:2)200mLで洗い、再び吸引ろ過した。
9.ろ液を分液ロートに移した。
11.10分静置した。
12.下層を捨てた。
13.上層をロータリーエバポレーターで乾固した。
14.ヘキサン4mLを加え超音波しよく懸濁し、遠沈管に移した。
15.アセトン(4℃)40mLを加え混和した。
16.−30℃に1時間から1晩放置した。
17.3000rpm,10min,4℃で遠心した。
18.上清を捨て、沈殿を回収した。
19.デシケータで一晩乾燥した。
→このステップで得られた組成物(pl-PE+pl-PC+CAEP+Cholesterol)を比較組成物(2)とした。なお、pl-PCは、コリンプラズマローゲンであり、CAEPは、セラミドアミノエチルホスホン酸である。
炎症時、主にミクログリア細胞において炎症因子NF−kBのサブユニットであるp65タンパク質が核内に移行し、IL−1betaやTNF−alphaなどの炎症性サイトカインを誘導する。リポポリサッカロイド(LPS)は、核内のp65発現を増加させることにより炎症性シグナルを誘発する。本実施例では、マウス由来ミクログリア細胞(MG6及びBV2)におけるLPS誘発性炎症シグナルに対する本発明の組成物の効果を検証した。
具体的なプロトコールは、以下のとおりである。
2.マウス由来ミクログリア細胞(MG6及びBV2)を、組成物が添加又は無添加の状態の2%血清DMEMメディアで一晩培養した。なお、組成物を添加したメディアについては、それぞれ同量(5μg/mL)の活性プラズマローゲンが含まれるように調製した。
3.その後、LPS(1μg/ml)を加え、6時間処理した。
なお、評価対象は、LPS無添加の「コントロールLPS−」、LPSを添加した「コントロールLPS+」、「本発明の組成物(1)LPS+」、「比較組成物(2)LPS+」、「比較組成物(3)LPS+」の5種とした。
5.核抽出物を用いウエスタンブロットを行い、炎症マーカーであるp65タンパク質を検出した。
6.このタンパク発現の確認により、ミクログリア細胞において、組成物(1)〜(3)がLPS誘発性炎症シグナル(核内のp65発現)を軽減するかどうかを検証した。その結果を図1に示す。
2.次の試験溶液を準備した。
a)0.1Mクエン酸溶液(pH4.5)50mLのみ
b)0.1Mクエン酸溶液(pH4.5)50mL+コクラーゼ(登録商標)・P顆粒(起源Aspergillus oryzae)[三菱ケミカルフーズ株式会社製]0.25g
c)10mM Tris−HCl Buffer(pH7.4)50mL+プロテアーゼP「アマノ」3SD(起源Aspergillus 属)[天野エンザイム株式会社製]0.25g
d)10mM Tris−HCl Buffer(pH7.4)50mL+プロチンSD−NY10(起源Bacillus 属)[天野エンザイム株式会社製]1.25g
4.50℃で60分間反応させた(約15分おきにガラス棒で攪拌した)。
5.エタノール250mLを加え、ブレンダーに入れ粉砕した(10秒×2回)。
6.30分放置した(約5分ごとにガラス棒で10回転攪拌した)。
7.吸引ろ過し、ろ液を回収した。
9.残りのろ液をエバポレーターで乾固させ、総脂質重量を測定した。
(1)総脂質重量
上記a)〜d)の試験溶液を用いた抽出物の総脂質重量(g/素材50g当たり)を表1に示す。
上記(1)で求めた総脂質量に、上記(2)で求めたプラズマローゲン(pl-PE+pl-PC)の割合をかけた数値を算出し、「a)プロテアーゼなし」を基準(1.0)として、プラズマローゲン(pl-PE+pl-PC)の量を比較した。その結果を表3に示す。
なお、総脂質全体に占めるリン脂質の割合は、プロテアーゼ処理を施してもほぼ変化はなかった。
Claims (3)
- プラズマローゲンを含む動物組織をプロテアーゼで処理する酵素処理工程と、
前記プロテアーゼで処理した動物組織を、エタノールを含む抽出液で抽出するエタノール抽出工程と、
を有することを特徴とする脳神経炎症抑制組成物の製造方法。 - 動物組織が、ホタテ類、ホヤ及び鳥類から選ばれる動物の組織であることを特徴とする請求項1記載の脳神経炎症抑制組成物の製造方法。
- プロテアーゼが、中性プロテアーゼであることを特徴とする請求項1又は2記載の脳神経炎症抑制組成物の製造方法。
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