CN106520878A - 利用白酒丢糟制备活性肽的方法 - Google Patents

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Abstract

利用白酒丢糟制备活性肽的方法，包括原料预处理、丢糟蛋白酶解、活性肽的提纯，利用定向酶解技术、3kDa膜超滤制得低分子量、高活性的活性肽，利用凝胶过滤层析、高效液相色谱两步分离技术对活性肽进行高度纯化,该活性肽的ACE抑制活性IC50为1.14 mg/ml；DPPH·清除能力EC50为1.42 mg/ml，ABTS·清除能力EC50为2.56 mg/ml，还原力（A700nm=0.5）为375.48 μg/ml，纯度达92.1%。本发明原料为大曲酒、小曲酒、麸曲酒等白酒丢糟，能进行产业化生产,可操作性强，目标物的分子量小且纯度高，能促进我国酿酒行业副产物资源的开发与利用，实现对活性肽的高效制备。

Description

利用白酒丢糟制备活性肽的方法
技术领域
本发明涉及利用白酒丢糟制备活性肽的方法，属于白酒酿造副产物的精深加工技术领域。
背景技术
白酒丢糟是以高粱、玉米等原料经固态发酵、蒸馏提取酒精和香味成分后的残留物，全国每年白酒丢糟产量在2500万吨以上（李新社, 陆步诗. 大曲丢糟代替米糠生产小曲的效果研究[J]. 酿酒, 2006, 33(4): 65-66）。白酒丢糟的水分含量及酸度较大，容易腐败而难于贮存，若直接扔弃或焚烧，将造成严重的环境污染。白酒丢糟中粗蛋白含量占14-22%，淀粉含量占10-13%，脂肪含量占17-21%，并含有丰富的氨基酸、维生素、有机酸等有机成分。近年来，关于白酒丢糟的综合化利用主要集中于提取蛋白质、动物饲料、丢糟酒、调味品、纤维素、食用菌培养基、酒精燃料等粗加工方面的研究，而对丢糟进行精深加工仍处于空白状态（王印召, 吴正云, 杨健, 等. 白酒丢糟资源化利用的研究进展[J]. 酿酒科技, 2013, 9: 86-88）。由于丢糟总量的巨大和当今社会经济、环境方面压力的日益增加，探讨更为高效的白酒丢糟利用途径显得十分重要。
高血压是威胁人类健康的主要疾病之一，据统计世界各国高血压平均发病率为10-20%，全球每年因高血压死亡人数达1200万。我国高血压患者已超过1.6亿人。目前，公认的卡托普利、赖诺普利等治疗高血压的合成药物在临床应用过程中会产生低血压、咳嗽、肾脏功能血管性水肿等不同程度的副作用。此外，由于机体内产生的自由基若未及时清除，将导致机体内细胞信号传导异常和DNA氧化损伤，严重危害人体健康。近年来，研究者致力于对天然的、安全有效的生物活性物质进行开发，而来源于食物蛋白降解产物的活性肽以其高效安全、人体易吸收等优点倍受关注。国内外相继从酪蛋白、胶原蛋白、卵清蛋白及鱼肉蛋白等（Jao CL, et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides:inhibition mode, bioavailability and antihypertensive effects-a review.Biomedicine, 2012, 2(4): 130-136）获得ACE抑制肽。检索中国专利文献，关于丢糟再利用的申请有144余件，如CN201110119777.6 传统白酒最大固体废弃物丢糟的资源化和无害化处理方法、CN201210252105.7 蝇蛆资源化处理浓香型白酒丢糟的方法、CN201110119843.X 利用白酒丢糟固液丢糟结合发酵生产食醋用天然香精的方法等，而对丢糟及其酶解产物具有ACE抑制、抗氧化等生物活性的研究未见报道。丢糟作为一种制备活性肽的新资源进行开发利用具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于以丢糟为原料，制备出低分子量、高活性、高纯度的活性肽，提供一种可操作性强、生产周期短、易规模化生产的活性肽制备方法，实现白酒酿酒副产物的高值化利用。
为了实现上述目的，本发明的技术解决方案是：
利用白酒丢糟制备活性肽的方法，包括以下步骤：
1）原料预处理：取丢糟加8倍体积水充分搅拌5 min，用纱布滤去上层悬浮的稻壳，剩余混合物以20～25 KHz每隔2 min超声破碎5～10次，共10～20 min，并组织匀浆20～25 min；
2）丢糟蛋白酶解：将上述匀浆液，用1 mol/L盐酸调pH值至5.5～6.0，50 ℃预热5 min，加入重量比6%木瓜蛋白酶，50～60 ℃恒温酶解4 h，于80 ℃灭酶10～15 min终止反应，将酶解产物进行3kDa膜超滤，收集膜外液冷冻干燥后得活性肽，测定分子量分布比例及生物活性；活性肽收率11-12%；
3）活性肽的提纯：将上述所得活性肽溶于去离子水，上样于Superdex-Peptide凝胶柱，流速为0.3～0.5 ml/min，以去离子水为洗脱液，在检测波长220 nm下收集各组分，冷冻干燥测定ACE抑制率及DPPH·清除率；将活性较高的冻干组分用纯水溶解后，上样于高效液相色谱C18柱，色谱条件为：流速1 ml/min，柱温25 ℃，检测波长220 nm，流动相为乙腈和纯水，流动相的洗脱过程历时35 min；在流动相出口处收集各组分，测定其ACE抑制率和DPPH清除率，将活性最高的组分冷冻干燥，得纯度达92.1%的活性肽。
丢糟为大曲酒、小曲酒、麸曲酒类白酒的蒸馏副产物；
步骤3)中流动相分别为含0.03～0.04%三氟乙酸的乙腈溶液、含0.04～0.05%三氟乙酸的纯水溶液；洗脱过程前5 min用100%纯水进行等度洗脱，后30 min用0～15%乙腈进行线性洗脱。
获得的活性肽，纯度达92.1%，ACE抑制活性IC50为1.14 mg/ml；DPPH·清除能力EC50为1.42 mg/ml，ABTS·清除能力EC50为2.56 mg/ml，还原力（A700nm=0.5）为375.48 μg/ml。
本发明由于采用定向酶解技术、凝胶层析及高效液相色谱生物技术，所制备的活性肽来源于天然植物蛋白，纯度高且分子量小，同时具备较强的ACE抑制及抗氧化活性，拥有稳定、安全、人体易吸收等优势，可作为药物或功能性食品进行开发；本发明的工艺简单，仅采用Superdex-Peptide、RP-HPLC两步分离法实现对目标物的高效纯化，能进行产业化生产；本发明所采用的原料为大曲酒、小曲酒、麸曲酒等白酒丢糟，能促进我国酿酒行业副产物资源的开发与利用，由原料优势转化为产品优势，进而转化为经济优势，加快白酒丢糟高值化利用的进程。
附图说明
图1是本发明制备工艺示意图；
图2是活性肽的高效液相色谱分离纯化图；
图3活性肽的纯度分析图。
具体实施方式
下面给出的实施例拟对本发明作进一步说明，但不能理解为是对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员根据上述本发明的内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1：
1）原料预处理：取丢糟加8倍体积水充分搅拌5 min，用纱布滤去上层悬浮的稻壳，剩余混合物每隔2 min超声破碎（20 KHz）5次，共10 min，并组织匀浆20 min。
2）丢糟蛋白酶解：将步骤（1）匀浆液，用1 mol/L盐酸调pH值至5.5，50 ℃预热5min， 加入6%（w/w）木瓜蛋白酶，50 ℃恒温酶解4 h，于80 ℃灭酶10 min终止反应，将最终的酶解产物进行3 kDa膜超滤，收集膜外液冷冻干燥后得活性肽，测定分子量分布比例及生物活性；活性肽收率11-12%；
3）活性肽的提纯：将上述活性肽溶于去离子水，上样于Superdex-Peptide凝胶柱，流速为0.3 ml/min，以去离子水为洗脱液，在检测波长220 nm下收集各组分，冷冻干燥测定ACE抑制率及DPPH·清除率。将活性较高的冻干组分用纯水溶解后，上样于高效液相色谱C18柱，色谱条件为：流速1 ml/min，柱温25 ℃，检测波长220 nm，流动相分别为含0.04%(V/V)三氟乙酸的乙腈溶液、含0.04%(V/V)三氟乙酸的纯水溶液；流动相的洗脱过程历时35 min，前5min用100%纯水进行等度洗脱，后30 min用0～15%乙腈进行线性洗脱。根据峰形和保留时间，在流动相出口处收集各组分，测定其ACE抑制率和DPPH清除率，将活性最高的组分冷冻干燥，即得高纯度的活性肽，纯度达92.1%。
实施例2：
1）原料预处理：取丢糟加8倍体积水充分搅拌5 min，用纱布滤去上层悬浮的稻壳，剩余混合物每隔2 min超声破碎（25 KHz）10次，共20 min，并组织匀浆25 min。
2）丢糟蛋白酶解：将匀浆液用1 mol/L盐酸调pH值至6.0，50 ℃预热5 min， 加入6%（w/w）木瓜蛋白酶，60 ℃恒温酶解4 h，于80 ℃灭酶15 min终止反应，将最终的酶解产物进行3 kDa膜超滤，收集膜外液冷冻干燥后得活性肽，测定分子量分布比例及生物活性；活性肽收率11-12%；
3）活性肽的提纯：将上述活性肽溶于去离子水，上样于Superdex-Peptide凝胶柱，流速为0.5 ml/min，以去离子水为洗脱液，在检测波长220 nm下收集各组分，冷冻干燥测定ACE抑制率及DPPH·清除率。将活性较高的冻干组分用纯水溶解后，上样于高效液相色谱C18柱，色谱条件为：流速1 ml/min，柱温25 ℃，检测波长220 nm，流动相分别为含0.04%三氟乙酸的乙腈、含0.04%三氟乙酸的纯水；流动相的洗脱过程历时35 min，前5 min用100%纯水进行等度洗脱，后30 min用0～15%乙腈进行线性洗脱。根据峰形和保留时间，在流动相出口处收集各组分，测定其ACE抑制率和DPPH清除率，将活性最高的组分冷冻干燥，即得纯度为92.1%的活性肽。
本发明技术方案有益效果数据分析
1、由图2可知，高效液相色谱C18柱能对组分进行有效分离，共收集获得10个主峰（peak-1～10），测得peak-6的ACE抑制活性最高且具有较强的DPPH清除能力，A220检测信号最强，说明该组分得率较高。
2、图3中出现的单峰peak-6即为纯化获得的活性肽，纯度达92.1%。

Claims (4)

1.利用白酒丢糟制备活性肽的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）原料预处理：取丢糟加8倍体积水充分搅拌5 min，用纱布滤去上层悬浮的稻壳，剩余混合物以20～25 KHz每隔2 min超声破碎5～10次，共10～20 min，并组织匀浆20～25 min；
2）丢糟蛋白酶解：将上述匀浆液，用1 mol/L盐酸调pH值至5.5～6.0，50 ℃预热5 min，加入重量比6%木瓜蛋白酶，50～60 ℃恒温酶解4 h，于80 ℃灭酶10～15 min终止反应，将酶解产物进行3kDa膜超滤，收集膜外液冷冻干燥后得活性肽，测定分子量分布比例及生物活性；活性肽收率11-12%；
3）活性肽的提纯：将上述所得活性肽溶于去离子水，上样于Superdex-Peptide凝胶柱，流速为0.3～0.5 ml/min，以去离子水为洗脱液，在检测波长220 nm下收集各组分，冷冻干燥测定ACE抑制率及DPPH·清除率；将活性较高的冻干组分用纯水溶解后，上样于高效液相色谱C18柱，色谱条件为：流速1 ml/min，柱温25 ℃，检测波长220 nm，流动相为乙腈和纯水，流动相的洗脱过程历时35 min；在流动相出口处收集各组分，测定其ACE抑制率和DPPH清除率，将活性最高的组分冷冻干燥，得纯度达92.1%的活性肽。
2.如权利要求1所述利用白酒丢糟制备活性肽的方法，其特征是：丢糟为大曲酒、小曲酒、麸曲酒类白酒的蒸馏副产物。
3.如权利要求1所述利用白酒丢糟制备活性肽的方法，其特征是：步骤3)中流动相分别为含0.03～0.04%三氟乙酸的乙腈溶液，含0.04～0.05%三氟乙酸的纯水溶液；洗脱过程前5min用100%纯水进行等度洗脱，后30 min用0～15%乙腈进行线性洗脱。
4.如权利要求1所述利用白酒丢糟制备活性肽的方法，其特征是：获得的活性肽纯度达90%以上，ACE抑制活性IC50为1.14 mg/ml；DPPH·清除能力EC50为1.42 mg/ml，ABTS·清除能力EC50为2.56 mg/ml，还原力(A700nm=0.5)为375.48 μg/ml。
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