CN103589703A

CN103589703A - 一种以鲍鱼内脏为原料制备纤维素酶的方法

Info

Publication number: CN103589703A
Application number: CN201310604744.XA
Authority: CN
Inventors: 曹敏杰; 陶志鹏; 蔡秋凤; 翁凌; 沈建东; 刘光明; 苏文金
Original assignee: Jimei University
Current assignee: Jimei University
Priority date: 2013-11-26
Filing date: 2013-11-26
Publication date: 2014-02-19

Abstract

本发明提出了一种以鲍鱼内脏为原料制备纤维素酶的方法。包括如下步骤：粗酶提取；活性炭处理：所述粗酶液经过活性炭处理后过滤除去活性炭，所得为滤液；阳离子交换柱层析；膜处理；酶制剂制备：将所述浓缩液经喷雾干燥或冷冻干燥，得到高纯度、高活力的纤维素酶制品；本发明采用活性炭脱色脱腥，离子交换柱层析除杂蛋白，膜浓缩及冷冻、喷雾干燥等技术从鲍鱼内脏中获得了纯度高、活力好的纤维素酶，该工艺经放大后可应用于工业化生产，工艺简单、分离效果好。同时节约了生产成本，能够进行技术规模放大，具有良好的应用前景。

Description

一种以鲍鱼内脏为原料制备纤维素酶的方法

技术领域

本发明涉及海洋产品加工领域，更具体涉及一种纤维素酶的制备方法。

背景技术

纤维素酶是能将纤维素水解成寡糖或单糖的一组酶的总称，是多酶组分的一个复杂酶系。细菌及真菌中有纤维酶存在，在少数的动物，如白蚁及反刍动物牛的瘤胃中也有纤维素酶存在。纤维素酶主要应用在能源工业、畜牧业、食品工业、纺织工业、洗涤工业中。在能源工业中，纤维素酶能够直接降解纤维类物质产生葡萄糖，而葡萄糖可以转化为乙醇，作为生物燃料。在畜牧业中，在饲料中添加纤维素酶水解纤维素，释放出天然植物细胞壁内部的养分，可以补充动物体内消化酶不足，激活内源酶的分泌，辅助动物自身消化能力，提高动物对饲料的利用率。在啤酒、葡萄酒酿造中，纤维素酶能够提高麦芽、葡萄的出汁率，降解纤维类物质，产生风味成分；在果蔬榨汁中，可以提高出汁率。在洗涤工业中，碱性纤维素酶能选择性的吸附在棉纤维结晶区，使棉纤维蓬松，水合纤维分解，胶状污垢脱落。在纺织工业中，纤维素可以对纺织物进行整理，除去织物表面的碎纤维，使纺织物表面光洁。

将纤维素酶应用于海洋制品生产已成为一大热点。在海藻加工过程中，如利用纤维素酶对海藻进行破壁，使海藻中的生物活性多糖、多酚、蛋白质等释放出来，可简化海藻活性成分的提取工艺、提高提取率。据中国渔业年鉴统计数据，2011年我国鲍鱼产量为7.68万吨，并呈逐年增加的趋势。鲍鱼以海藻类为食，其消化道内含有丰富的多糖水解酶类，如：纤维素酶、褐藻胶裂解酶、琼胶酶等。鲍鱼加工过程中，内脏作为加工下脚料，常被弃除或制备成鱼粉等低值产品，难以实现高值化利用。因此，以鲍鱼加工后的副产物内脏为原料高效制备纤维素酶，可有效提高鲍鱼加工的附加值，降低因将内脏直接废弃而造成的环境污染。

目前为止文献报道的关于纤维素酶的分离纯化主要采用硫酸铵分级沉淀、离子交换柱层析、疏水层析和亲和层析等方法，分离纯化过程繁琐，操作复杂、耗时长、得率低、成本高，难于实现工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种工艺简单、分离效果好，能够实现工业化生产的鲍鱼内脏纤维素酶的制备方法。

为实现上述目的，本发明提供一种以鲍鱼内脏为原料制备纤维素酶的方法，其特征在于包括如下步骤：

1）粗酶提取：将鲍鱼内脏切碎，加入4倍体积10 mmol/L pH 6.0的PBS，组织捣碎，离心，上清液即为粗酶液；

2）活性炭处理：所述粗酶液经过活性炭处理后过滤除去活性炭，所得为滤液；

3）阳离子交换柱层析：将所得滤液经SP-Sepharose或CM-Sepharose阳离子交换树脂或732型强酸性阳离子交换树脂吸附分离，吸附后的树脂经阶段淋洗解吸，得到高纯度的纤维素酶；

4）膜处理：将有纤维素酶活性部分淋洗液用10-30 kDa 分子量截留的超滤膜浓缩脱盐，得到浓缩液；

任选的，浓缩过程中加入10 mmol/L PBS (pH 6.0)，确保脱盐完全；优选PBS加入量为浓缩酶液体积的5倍；

5）酶制剂制备：将所述浓缩液经喷雾干燥或冷冻干燥，得到高纯度、高活力的纤维素酶制品；

任选的，所述喷雾干燥前在所述浓缩液中加入海藻糖或β-环糊精。

所述步骤1）中，所述离心为12000×g离心20 min。

所述步骤2）中，所述活性炭加入量为0.5-3 %（W/V）（指的是活性炭（w）占粗酶液（v）的比例），处理方式为4℃搅拌处理30-60 min。

所述步骤3）中，所述阶段淋洗解吸为吸附后的树脂经0.1、0.2、0.3 mol/L NaCl盐浓度阶段洗脱。

所述步骤4）中，所述超滤膜为非纤维素材质膜。

所述步骤4）中，所述超滤膜为PVDF膜或陶瓷膜。

所述步骤5）中，所述海藻糖或β-环糊精的加入质量为样品体积的10-30 %（W/V）。本发明通过活性炭吸附去除大量的色素，同时达到脱腥脱色的效果；利用阳离子交换柱层析能将纤维素酶有效吸附，通过改变盐浓度阶段淋洗方式，将纤维素酶和杂蛋白(如：细胞骨架蛋白、组织蛋白酶等含量较高的蛋白) 得到很好的分离。本发明在离子交换柱层析之后，采用非纤维素类膜（如PVDF、陶瓷膜等）对纤维素酶进行浓缩，既避免了纤维素酶对膜的降解作用，又能够将样品浓缩到较小体积，方便了后续喷雾干燥或冷冻干燥过程，节约了能源。喷雾干燥过程中，在酶液中添加海藻糖或β-环糊精等保护剂，保护了酶的活性。

综上所述，本发明采用活性炭脱色脱腥，离子交换柱层析除杂蛋白，膜浓缩及冷冻、喷雾干燥等技术从鲍鱼内脏中获得了纯度高、活力好的纤维素酶，该工艺经放大后可应用于工业化生产。

本发明通过活性炭吸附，去除了部分的色素蛋白、多糖；进而采用离子交换柱层析，运用阶段洗脱方式去除大量的杂蛋白，简化了纯化工艺，获得了高纯度的纤维素酶。本发明避免了现有技术中采用的硫酸铵盐析、多种柱层析结合的方法，简化了工艺流程，节约了生产成本，能够进行技术规模放大，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明纯化纤维素酶的SDS-PAGE电泳图。

图2 为纤维素酶肽质量指纹图谱图。

图3为将制备的纤维素酶对CMC-Na的分解效果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：纤维素酶的制备

1. 酶液提取：取100 g鲍鱼内脏，切碎，加入400 mL体积10 mmol/L PBS (pH 6.0)，组织捣碎，12000×g离心20 min，取上清，得到420 mL粗酶液；

2. 活性炭处理：向420 mL粗酶液中加入5 g活性炭，搅拌均匀，在4 ℃下吸附 30 min。吸附后用滤纸片进行抽滤，得400 mL滤液；

3. 阳离子交换柱层析：经上述经活性炭吸附后的滤液上样于用10 mmol/L PBS (pH 6.0) 平衡好的SP-Sepharose阳离子交换柱（2.5×10 cm），流速1.0 mL/min。上样完成后用10 mmol/L PBS (pH 6.0)充分流洗至流出液在280 nm处的吸光度值到基线。然后用含0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L NaCl 的10 mmol/L PBS (pH 6.0)缓冲液分别进行阶段淋洗，收集0.1 mol/L NaCl淋洗液（5 mL/管）得到较高纯度的纤维素酶，共300 mL；

4. 膜处理：将得到的含有高纯度的纤维素酶洗脱液用10 kDa PVDF超滤膜进行浓缩，得到50 mL浓缩液；

5. 酶制剂制备：将50 mL浓缩液进行冷冻干燥，得到酶制剂。

实施例2：纤维素酶的制备

1. 酶液提取：取500 g鲍鱼内脏，切碎，加入2 L 10 mmol/L PBS (pH 6.0)，组织捣碎，12000×g离心20 min，取上清，得到2.2 L粗酶液；

2. 活性炭处理：向2.2 L粗酶液中加入15 g活性炭，搅拌均匀，在4 ℃下吸附45 min。吸附后用滤纸片进行抽滤，得2.1 L滤液；

3. 阳离子交换柱层析：经上述经活性炭吸附后的滤液上样于用10 mmol/L PBS (pH 6.0) 平衡好的CM-Sepharose阳离子交换柱（5×15 cm），流速4.0 mL/min。上样完成后用10 mmol/L PBS (pH 6.0) 充分流洗至流出液在280 nm处的吸光度值到基线。然后用含0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L NaCl的10 mmol/L PBS (pH 6.0)缓冲液分别进行阶段淋洗，收集0.1 mol/L NaCl淋洗液（30 mL/管）得到高纯度的纤维素酶，共 1.68 L；

4. 膜处理：将上述得到的纤维素酶洗脱液用30 kDa PVDF膜进行浓缩，同时加入10 mmol/L PBS (pH 6.0)实现脱盐，得到280 mL浓缩液；

5. 酶制剂制备：在浓缩液中加入56 g β-环糊精进行喷雾干燥，得到酶制剂。

实施例3：纤维素酶的制备

1. 酶液提取：取2 kg鲍鱼内脏，切碎，加入8 L 10 mmol/L PBS (pH 6.0)，组织捣碎，12000×g离心20 min，取上清，得到9.1 L粗酶液；

2. 活性炭吸附：向9.1 L粗酶液中加入200 g活性炭，搅拌均匀，在4 ℃下吸附 60 min。吸附后用滤布过滤，得8.9 L滤液；

3. 阳离子柱层析：经上述经活性炭吸附后的滤液上样于用10 mmol/L PBS (pH 6.0) 平衡好的国产732型强酸性阳离子交换树脂(10×50 cm)，经吸附解吸后，再次上样于用相同缓冲液平衡好的 SP-Sepharose 阳离子交换柱（5×30 cm），流速20.0 mL/min。上样完成后用10 mmol/L PBS (pH 6.0) 充分流洗至流出液在280 nm处的吸光度值到基线。然后用含0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L NaCl 的10 mmol/L PBS (pH 6.0)缓冲液进行阶段淋洗，收集0.1 mol/L NaCl淋洗液得到高纯度的纤维素酶，共 5.6 L；

4. 膜处理：将上述得到的含纤维素酶洗脱液用30 kDa PVDF膜进行浓缩，同时加入10 mmol/L PBS (pH 6.0)实现脱盐，得到1 L浓缩液；

5. 酶制剂制备：在浓缩液中加入200 g海藻糖进行喷雾干燥，得到205 g酶制剂。

实施例4：纤维素酶的验证试验

为了验证纯化的蛋白分子量，将酶液与4×SDS上样缓冲液以1:3比例混匀后，然后上样于SDS-PAGE 胶。在恒流10 mA下电泳结束后，卸下玻璃板，取出凝胶，用考马斯亮蓝染色脱色后，用凝胶成像仪拍照。结果见附图1，其中泳道M为蛋白分子量标准；泳道1为非还原状态纤维素酶；泳道2为还原状态纤维素酶。纤维素酶在非还原状态下分子量为45 kDa，还原状态下为50 kDa左右。

为了验证纯化的蛋白为纤维素酶，将纯化的蛋白电泳染色后切胶回收，通过胶内酶解抽提酶解片段，脱盐后进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析，得到肽指纹图谱，用Mascot 软件将得到肽指纹图谱数据在NCBInr数据库有中进行肽段序列比对。比对结果见附图2，该纤维素酶与日本北海道大学学者Kenichi Suzuki等从皱纹盘鲍中克隆得到的纤维素酶序列一致性为100%。表明制备的蛋白为一种纤维素酶。

为了验证纯化的蛋白为纤维素酶，将纯化的蛋白含量为0.01 mg/mL 的纤维素酶液 1 mL 加入到 50 mL 1% (W/V) CMC-Na，10 mmol/L PBS (pH 6.0)中, 运用DNS法测定产物还原糖含量，A₅₄₀值越高，还原糖含量越高。结果见图3，反应不同时间的还原糖含量。从图中看出随反应时间的延长，还原糖含量不断增加，证明制备的蛋白具有分解 CMC-Na的能力，为一种纤维素酶。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种以鲍鱼内脏为原料制备纤维素酶的方法，其特征在于包括如下步骤：

1）粗酶提取：将鲍鱼内脏切碎，加入4倍体积10 mmol/L pH 6.0 的PBS，组织捣碎，离心，上清液即为粗酶液；

任选的，浓缩过程中加入10 mmol/L PBS pH 6.0，确保脱盐完全；优选PBS加入量为浓缩酶液体积的5倍；

5）酶制剂制备：将所述浓缩液经喷雾干燥或冷冻干燥，得到高活力的纤维素酶制品；

2.权利要求1所述纤维素酶的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中，所述离心为12000g离心20 min。

3.权利要求1所述纤维素酶的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中，所述活性炭加入质量为样品体积的0.5-3%，处理方式为4℃搅拌处理30-60 min。

4.权利要求1所述纤维素酶的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中，所述阶段淋洗解吸为吸附后的树脂经0.1、0.2、0.3 mol/L NaCl盐浓度阶段洗脱。

5.权利要求1所述纤维素酶的制备方法，其特征在于，所述步骤4）中，所述超滤膜为非纤维素材质膜。

6.权利要求5所述纤维素酶的制备方法，其特征在于，所述步骤4）中，所述超滤膜为PVDF膜或陶瓷膜。

7.权利要求1所述纤维素酶的制备方法，其特征在于，所述步骤5）中，所述海藻糖或β-环糊精的加入质量为样品体积的10-30%。