CN110845576A - 甲鱼蛋白源具有ace抑制活性肽hdtyyvvah及其用途 - Google Patents

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王伟
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives

Abstract

本发明属于生物技术领域，特别涉及一个来源于中华鳖甲鱼(GenBank:AHE37801.1，cytochrome oxidase subunit 1,partial(mitochondrion)[Pelodiscus sinensis])蛋白，能与血管紧张素转换酶结合，抑制其活性。具体而言，本发明公开了一种甲鱼蛋白源具有ACE抑制活性的肽HDTYYVVAH，其能用于制备ACE抑制剂。

Description

甲鱼蛋白源具有ACE抑制活性肽HDTYYVVAH及其用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一个来源于中华鳖甲鱼(GenBank:AHE37801.1，cytochrome oxidase subunit 1,partial(mitochondrion)[Pelodiscussinensis])蛋白，能与血管紧张素转换酶结合，抑制其活性。
背景技术
血管紧张素转换酶(Angiotensin converting enzyme,ACE,EC3.4.15.1，文献中曾用名有kininaseIl,dipeptidyl carboxypeptidase I等)是一种二羧肽酶，是导致高血压的一个关键酶，它通过水解作用把血管紧张肽Ⅰ转化成血管紧张肽Ⅱ，与此同时，ACE还可钝化血管舒缓激肽，这两种作用均可导致血管收缩，从而引起高血压。因此ACE被认为是引起高血压的一个重要因素。经研究发现血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)，可通过抑制ACE的活性而达到降血压的作用。ACE抑制剂广泛用于治疗心血管、高血压、心力衰竭、肾衰竭等疾病。ACE抑制剂最初是从蛇毒中发现的，随后人们发现从食物原料中提取的ACE抑制肽，如明胶、酪蛋白、鱼、无花果树胶、α-玉米蛋白等都可作为制备ACE抑制肽的原料。
降血压的药物常见的有：
①利尿剂：代表药物有氢氯噬嗓、氨苯蝶吮、螺内酯等。
②片受体阻滞剂：代表药物有普蔡洛尔、美托洛尔、阿替洛尔、纳多洛尔等。
③钙通道阻滞剂：代表药物有硝苯地平、氨氯地平、非洛地平、尼群地平、拉西地平等。
④血管紧张素转换酶抑制剂：代表药物有卡托普利、苯那普利、赖诺普利、依那普利、西拉普利等。
⑤a-受体阻滞剂：代表药物有呱哇嗓、特拉哩嗦等。
⑥血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂：代表药物有洛沙坦、撷沙坦、厄贝沙坦、坎地沙坦、伊贝沙坦、替米沙坦等。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种甲鱼蛋白源具有ACE抑制活性的肽HDTYYVVAH及其用途。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种甲鱼蛋白源具有ACE抑制活性的肽HDTYYVVAH，肽HDTYYVVAH的氨基酸序列为：His-Asp-Thr-Tyr-Tyr-Val-Val-Ala-His。
本发明还同时提供了上述肽HDTYYVVAH在制备ACE抑制剂中的应用。
本发明基于中华鳖甲鱼(GenBank:AHE37801.1，cytochrome oxidase subunit 1,partial(mitochondrion)[Pelodiscus sinensis])蛋白，通过计算机辅助虚拟酶解技术，获得了在胃蛋白酶(pH≦1.3)的作用条件下，所得ACE抑制肽。
本发明的9肽HDTYYVVAH可通过委托吉尔生化(上海)有限公司合成获得。
本发明所报道的9肽是针对ACE靶标均具有抑制活性，从而表现出具有降血压的特性。
本发明中所涉及的各项检测方法具体如下：
ACE抑制活性的检测方法：
ACE在37℃，pH值为8.3的条件下催化分解血管紧张素I的模拟物Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine(HHL)产生马尿酸(HA)，该物质在紫外225nm处具有特征吸收峰；当加入ACE抑制剂时ACE对HHL的催化分解作用受到抑制，马尿酸的生成量减少，通过HPLC方法，测定加入抑制剂前后所生成马尿酸的量的变化即可算出抑制活性的大小。
反应体系为：依次分别加入20μL 0.1U/mL的ACE、50μL ACE抑制肽(即本发明的HDTYYVVAH)在37℃温浴5min，然后加入10μL 5mM的HHL底物启动ACE的催化反应，在37℃振荡水浴30min后加入250μL 1.0moL/L的HCl终止反应，体系溶液过0.45μm滤膜后进行RP-HPLC检测分析马尿酸(HA)的含量。上述同样条件，以50μL 0.1moL/L的硼酸缓冲液中(含0.3moL/L的NaCl，pH＝8.3)代替ACE抑制剂作为空白反应体系。
注：上述ACE、HHL底物均是以0.1moL/L的硼酸缓冲液(含0.3moL/L的NaCl，pH＝8.3)为溶剂。
ACE抑制肽(HDTYYVVAH)，以不同浓度溶解在0.1moL/L的硼酸缓冲液中(含0.3moL/L的NaCl，pH＝8.3)中而得。
RP-HPLC检测：溶剂Ⅰ为0.05％(V/V)三氟乙酸(TFA)和0.05％(v/v)的三乙胺(TTA)溶于去离子水中，溶剂Ⅱ为100％的色谱纯乙睛。溶剂Ⅰ与溶剂Ⅱ的比例为70％：30％(体积比)，流速为0.5mL/min，检测波长为225nm,检测柱温为30℃。
ACE抑制活性根据下式计算：
I％＝(A-B)/A×100％
A：不加入短肽抑制剂时的马尿酸的峰面积；
B：加入短肽抑制剂时的马尿酸的峰面积；
ACE：1U单位定义为，在标准检测条件下，在37℃，1min时间内催化底物(Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine,HHL)，产生1μM马尿酸所消耗ACE的量。即，为ACE的活性单位。
本发明的优点和积极效果：该9肽可以抑制血管紧张素转换酶的活性。
依据本发明所述的氨基酸序列，可委托吉尔生化(上海)有限公司合成，从而获得本发明所述的ACE抑制肽(或简称为肽HDTYYVVAH)。
本发明的ACE抑制肽的用法和用量如下：本发明的9肽为口服型，用量为口服，每次2.0g，每日2～3次。
综上所述，本发明特别涉及一个来源于中华鳖甲鱼(GenBank:AHE37801.1，cytochrome oxidase subunit 1,partial(mitochondrion)[Pelodiscus sinensis])蛋白，能与血管紧张素转换酶结合，抑制其活性。该9肽结构序列为HDTYYVVAH，所述肽HDTYYVVAH的氨基酸序列为：His-Asp-Thr-Tyr-Tyr-Val-Val-Ala-His。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、
肽HDTYYVVAH在1.0mg/mL的浓度下的ACE抑制活性：
色谱条件：溶剂Ⅰ为0.05％三氟乙酸(TFA)和0.05％的三乙胺(TTA)溶于去离子水中(即每升溶剂Ⅰ中含有0.5mL的三氟乙酸和0.5mL的三乙胺)，溶剂Ⅱ为100％的色谱纯乙睛。溶剂Ⅰ与溶剂Ⅱ的比例为70％：30％(体积比)，ultimate3000戴安液相色谱仪，色谱柱为waters Symmetry C18 5μm 4.6×250mm，流速为0.5mL/min，进样量10μL，检测波长为225nm，检测柱温为30℃。
检测方法：将通过化学合成法获得此肽HDTYYVVAH结构，进行活性检测(检测方法同上)。此时肽HDTYYVVAH浓度为1.0mg/mL。
结果：肽HDTYYVVAH在1.0mg/mL时的ACE抑制活性为69.28％。
实施例2、
肽HDTYYVVAH在2.0mg/mL的浓度下的ACE抑制活性：
色谱条件：溶剂Ⅰ为0.05％三氟乙酸(TFA)和0.05％的三乙胺(TTA)溶于去离子水中；溶剂Ⅱ为100％的色谱纯乙睛。溶剂Ⅰ与溶剂Ⅱ的比例为70％：30％，ultimate3000戴安液相色谱仪，色谱柱为waters Symmetry C18 5μm 4.6×250mm，流速为0.5mL/min，进样量10μL，检测波长为225nm,检测柱温为30℃。
检测方法：将通过化学合成法获得此9肽结构，进行活性检测(检测方法同上)。此时肽HDTYYVVAH浓度为2.0mg/mL。
结果：肽HDTYYVVAH在2.0mg/mL时的ACE抑制活性为78.34％。
通过实施例1和实施例2中的抑制浓度和活性数据，说明此肽结构的活性与浓度存在量效关系，此肽HDTYYVVAH结构具有ACE抑制活性未见报道，属于新的具ACE抑制活性功能肽。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形，比如不同蛋白质来源降解分离所得的肽HDTYYVVAH结构及其衍生化结构。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江树人学院（浙江树人大学）
<120> 甲鱼蛋白源具有ACE抑制活性肽HDTYYVVAH及其用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
His Asp Thr Tyr Tyr Val Val Ala His
1 5

Claims (2)

1.甲鱼蛋白源具有ACE抑制活性的肽HDTYYVVAH，其特征是：所述肽HDTYYVVAH的氨基酸序列为：His-Asp-Thr-Tyr-Tyr-Val-Val-Ala-His。
2.如权利要求1所述的肽HDTYYVVAH在制备ACE抑制剂中的应用。
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