CN106674345A - 超声酶提制备胶原蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超声酶提制备胶原蛋白的方法,其包括以下步骤:步骤一,取新鲜或冷冻甲鱼裙边按照体积比1:10~30的比例加入质量浓度为0.3~0.6mol/L的酸溶液,按照体积百分比再加入0.25~1.5%的胃蛋白酶制得混合溶液;步骤二,所述混合溶液进行超声处理,其中超声时间为30~50min;其中工作时间2s,停歇时间2~6s,超声功率为50~300W;步骤三,超声结束后,经离心、纯化以及干燥制得螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白。本发明能够制备螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白,操作简单,处理时间短、蛋白得率高、能耗较低。
Description
技术领域
本发明涉及一种胶原蛋白制备方法。更具体地说,本发明涉及一种超声酶提制备胶原蛋白的方法。
背景技术
胶原蛋白是生物体内一种重要的蛋白质,也是结缔组织的主要蛋白成分,具有保护机体和支撑器官的作用,主要存在于动物肌腱、韧带、软骨、血管壁、皮肤及结缔组织中,占哺乳动物体内蛋白质总量的25%~30%。与陆生动物(如猪、牛等)比较,水生动物胶原蛋白具有优良的理化性质和生理活性功能,已引起人们的广泛关注。中华鳖是我国传统的名贵水产品,俗称甲鱼、团鱼、水鱼、王八、神守等。传统医学认为鳖类有活血消淤,滋补强身的功效,可作为重病或手术后身体虚弱者的保健食品。鳖甲周围的结缔软组织通常被称为“裙边”,裙边胶原蛋白含量丰富,是最具滋补的部分,具有极高的药用价值和营养价值。目前对鱼类等水产动物胶原蛋白(如鱼皮、鱼骨、鱼鳞、鱼鳍或鱼翅的研究有很多,目前利用鳖类裙边制备胶原蛋白的方法多采用常规酶辅助提取。但其操作复杂,用时较长,而且制备的胶原蛋白溶解度低。超声辅助酶解反应虽然能够大大缩短反应时间,但是其制备物质多为多肽类,无法保证制备的胶原蛋白的稳定结构。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题,并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种超声酶提制备胶原蛋白的方法,其能够制备稳定的螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白,操作简单,处理时间短、蛋白得率高、能耗较低。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点,提供了一种超声酶提制备胶原蛋白的方法,其包括以下步骤:
步骤一,取新鲜或冷冻甲鱼裙边按照体积比1:10~30的比例加入质量浓度为0.3~0.6mol/L的酸溶液,按照体积百分比再加入0.25~1.5%的胃蛋白酶制得混合溶液;
步骤二,所述混合溶液进行超声处理,其中超声时间为30~50min;其中工作时间2s,停歇时间2~6s,超声功率为50~300W;
步骤三,超声结束后,经离心、纯化以及干燥制得螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白。
优选的是,所述步骤一中,所述酸溶液为柠檬酸溶液、盐酸溶液或乙酸溶液中的一种。
优选的是,所述步骤三中,所述离心具体为:于1000~3000rmp离心3~6min后取上清液。
优选的是,所述步骤三中,离心后纯化具体为:向所述上清液中添加NaCl至盐浓度为0.6~1.2mol/L,静置盐析18~30h后过滤,蛋白沉淀用0.3~0.6mol/L的乙酸复溶后依次对0.1~0.5mol/L的乙酸和蒸馏水透析3~5天,每天更换透析水2~4次。
优选的是,所述步骤三中,纯化后进行冷冻干燥,具体为:于-70~-80℃下预冻,最后在大气压力为10~100Pa、温度为-55~-70℃条件下冷冻干燥24~72h。
优选的是,所述步骤一中,所述新鲜或冷冻甲鱼裙边需先进行预处理,具体为:切碎后除杂,去除脂肪,然后用蒸馏水反复洗涤,充分沥干后备用。
优选的是,所述超声酶提胶原蛋白的方法包括以下步骤:
步骤一,取新鲜或冷冻甲鱼裙边,按照体积比1:10~30的比例加入质量浓度为0.3~0.6mol/L的柠檬酸溶液,按照体积百分比再加入0.25~1.5%的胃蛋白酶制得混合溶液;
步骤二,所述混合溶液进行超声处理,其中超声时间为30~50min;其中工作时间2s,停歇时间2~6s,超声功率为50~300W;
步骤三,超声结束后,于1000~3000rmp离心3~6min后取上清液;向所述上清液中添加NaCl至盐浓度为0.6~1.2mol/L,静置盐析18~30h后过滤,蛋白沉淀用0.3~0.6mol/L的乙酸复溶后依次对0.1~0.5mol/L的乙酸和蒸馏水透析3~5天,每天更换透析水2~4次;于-70~-80℃下预冻,最后在大气压力为10~100Pa、温度为-55~-70℃条件下冷冻干燥24~72h,制得螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白。
本发明至少包括以下有益效果:本发明所述超声酶提制备胶原蛋白的方法,利用超声辅助胃蛋白酶进行酶提反应,大大缩短了反应时间,时间仅仅需要30~50min。同时,因为较短的反应时间不仅可以缩短反应时间,同时可以保证后续制备的胶原蛋白螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白,通过验证仅仅对螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的二级结构进行了有益改进,提高了制备的螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的溶解性,改善了制备的胶原蛋白的品质。本发明所述超声酶提制备胶原蛋白的方法具有操作简单,处理时间短、蛋白得率高及能耗较低等优点。
本发明所述超声辅助酶提可适当的对胶原蛋白的高级结构进行改性,所得的胶原蛋白得率提高了15.6~27.2%,同时其溶解性提高了11.5%~15.7%。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现,部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明其中一个实施例和对比例制备的甲鱼裙边胶原蛋白的紫外扫描图谱;
图2为本发明其中一个实施例和对比例制备的甲鱼裙边胶原蛋白的电泳图;
图3为本发明其中一个实施例和对比例制备的甲鱼裙边胶原蛋白的圆二色谱图;
图4为本发明其中一个实施例和对比例制备的甲鱼裙边胶原蛋白的溶解度曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解,本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明所述超声酶提胶原蛋白的方法包括以下步骤:
步骤一,取新鲜或冷冻甲鱼裙边,切碎后除杂,去除脂肪,然后用蒸馏水反复洗涤,充分沥干后备用。
按照体积比1:10~30的比例加入质量浓度为0.3~0.6mol/L的酸溶液,按照体积百分比再加入0.25~1.5%的胃蛋白酶制得混合溶液;所述酸溶液为柠檬酸溶液、盐酸溶液或乙酸溶液中的一种。
步骤二,所述混合溶液进行超声处理,其中超声时间为30~50min;其中工作时间2s,停歇时间2~6s,超声功率为50~300W;
步骤三,超声结束后,于1000~3000rmp离心3~6min后取上清液;向所述上清液中添加NaCl至盐浓度为0.6~1.2mol/L,静置盐析18~30h后过滤,蛋白沉淀用0.3~0.6mol/L的乙酸复溶后依次对0.1~0.5mol/L的乙酸和蒸馏水透析3~5天,每天更换透析水2~4次;于-70~-80℃下预冻,最后在大气压力为10~100Pa、温度为-55~-70℃条件下冷冻干燥24~72h,制得螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白。
实施例1
本发明所述超声酶提胶原蛋白的方法包括以下步骤:
步骤一,取新鲜或冷冻甲鱼裙边,切碎后除杂,去除脂肪,然后用蒸馏水反复洗涤,充分沥干后备用。
按照体积比1:10的比例加入质量浓度为0.3mol/L的柠檬酸溶液,按照体积百分比再加入0.25%的胃蛋白酶制得混合溶液;
步骤二,所述混合溶液进行超声处理,其中超声时间为30min;其中工作时间2s,停歇时间2s,超声功率为100W;
步骤三,超声结束后,于1000rmp离心3min后取上清液;向所述上清液中添加NaCl至盐浓度为0.6mol/L,静置盐析18h后过滤,蛋白沉淀用0.3mol/L的乙酸复溶后依次对0.1mol/L的乙酸和蒸馏水透析3天,每天更换透析水2次;于-70℃下预冻,最后在大气压力为50Pa、温度为-55℃条件下冷冻干燥24h,制得螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白。
实施例2
本发明所述超声酶提胶原蛋白的方法包括以下步骤:
步骤一,取新鲜或冷冻甲鱼裙边,切碎后除杂,去除脂肪,然后用蒸馏水反复洗涤,充分沥干后备用。
按照体积比1:30的比例加入质量浓度为0.6mol/L的乙酸溶液,按照体积百分比再加入1.5%的胃蛋白酶制得混合溶液;
步骤二,所述混合溶液进行超声处理,其中超声时间为50min;其中工作时间2s,停歇时间6s,超声功率为300W;
步骤三,超声结束后,于3000rmp离心6min后取上清液;向所述上清液中添加NaCl至盐浓度为1.2mol/L,静置盐析30h后过滤,蛋白沉淀用0.6mol/L的乙酸复溶后依次对0.5mol/L的乙酸和蒸馏水透析5天,每天更换透析水4次;于-80℃下预冻,最后在大气压力为100Pa、温度为-70℃条件下冷冻干燥72h,制得螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白。
实施例3
本发明所述超声酶提胶原蛋白的方法包括以下步骤:
步骤一,取新鲜或冷冻甲鱼裙边,切碎后除杂,去除脂肪,然后用蒸馏水反复洗涤,充分沥干后备用。
按照体积比1:20的比例加入质量浓度为0.5mol/L的柠檬酸溶液,按照体积百分比再加入1.0%的胃蛋白酶制得混合溶液;
步骤二,所述混合溶液进行超声处理,其中超声时间为40min;其中工作时间2s,停歇时间4s,超声功率为200W;
步骤三,超声结束后,于2000rmp离心5min后取上清液;向所述上清液中添加NaCl至盐浓度为1.0mol/L,静置盐析25h后过滤,蛋白沉淀用0.5mol/L的乙酸复溶后依次对0.3mol/L的乙酸和蒸馏水透析4天,每天更换透析水3次;于-80℃下预冻,最后在大气压力为80Pa、温度为-60℃条件下冷冻干燥48h,制得螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白。
对比例
按照常规酶解提取甲鱼胶原蛋白。
将实施例和对比例制备的胶原蛋白,进行下述实验。
(1)得率
胶原蛋白得率(%)=(冻干后的样品/甲鱼裙边湿重)×100
(2)胶原蛋白的紫外扫描
纯化的胶原蛋白样品溶液采用紫外分光光度计(UV-6100全波段紫外扫描分光光度计,美普达分析仪器有限公司,上海)进行扫描,波长间隔1nm,波长范围为190~400nm。
(3)胶原蛋白的凝胶电泳(SDS-PAGE)
分离胶浓度为10%,浓缩胶浓度为4%,加入纯化后的胶原蛋白于电泳仪200V电泳30min(PowerPacTM Basic,BIU RAD,Singapore),用考马司亮蓝R-250染色液(考马斯亮蓝R-250 1.0g,甲醇450mL,蒸馏水450mL,冰醋酸100mL)染色15min,脱色液(甲醇100mL,冰醋酸100mL,蒸馏水800mL)脱色并拍照。
(4)溶解性(氮溶解指数NSI)的测定
将胶原蛋白样品0.4000g均匀分散于20mL蒸馏水中,室温下放置30min,用0.1mol/LHCL或0.1mol/L NaOH溶液调节溶液pH值,用均质机在13400rpm下均质1min,定容至25mL,分散液以4000rpm的速度离心15min,取上清液及胶原蛋白样品用凯氏定氮法测含氮量,公式如下:
NSI(%)=(上清液中的含氮量/样品中总氮量)×100
结果见图1、图2、图3和图4。
与常规酶提相比,本发明所述超声辅助酶提所制备的胶原蛋白得率提高了15.6~27.2%。
如图1所示,对比例1和实施例1制备的裙边胶原蛋白(PSC和UPSC)样品溶液经紫外波谱扫描,均在220~240nm之间有强烈的吸收,符合胶原蛋白通常的紫外吸收特性,即存在胶原蛋白的特征吸收峰,且在230nm处有最大吸收峰,即为螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白。
如图2所示。从凝胶电泳图谱上一次可清晰地看到在分子量130kD附近有有染色较深的2条带(从左到右一次为Marker,常规酶提和超声辅助酶提胶原蛋白样品),对比例和实施例2制备的胶原蛋白均含有[(α1)2(α2)1],表明两种方法所提裙边胶原蛋白均为螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白,即甲鱼裙边胶原蛋白经超声处理后的螺旋结构并未改变。
由图3可知,对比例1和实施例制备的两种胶原蛋白在198nm处有负的吸收峰和220nm处有正的吸收峰。经超声辅助提取的胶原蛋白在200~260nm的吸收强度低于常规酶提的胶原蛋白,表明超声对胶原蛋白的二级结构产生了有一定的影响。
由图4可知,本发明制备的胶原蛋白相较于对比例其溶解性提高了11.5%~15.7%。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (7)
1.一种超声酶提制备胶原蛋白的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一,取新鲜或冷冻甲鱼裙边按照体积比1:10~30的比例加入质量浓度为0.3~0.6mol/L的酸溶液,按照体积百分比再加入0.25~1.5%的胃蛋白酶制得混合溶液;
步骤二,所述混合溶液进行超声处理,其中超声时间为30~50min;其中工作时间2s,停歇时间2~6s,超声功率为50~300W;
步骤三,超声结束后,经离心、纯化以及干燥制得螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白。
2.如权利要求1所述的超声酶提胶原蛋白的方法,其特征在于,所述步骤一中,所述酸溶液为柠檬酸溶液、盐酸溶液或乙酸溶液中的一种。
3.如权利要求1所述的超声酶提胶原蛋白的方法,其特征在于,所述步骤三中,所述离心具体为:于1000~3000rmp离心3~6min后取上清液。
4.如权利要求3所述的超声酶提胶原蛋白的方法,其特征在于,所述步骤三中,离心后纯化具体为:向所述上清液中添加NaCl至盐浓度为0.6~1.2mol/L,静置盐析18~30h后过滤,蛋白沉淀用0.3~0.6mol/L的乙酸复溶后依次对0.1~0.5mol/L的乙酸和蒸馏水透析3~5天,每天更换透析水2~4次。
5.如权利要求4所述的超声酶提胶原蛋白的方法,其特征在于,所述步骤三中,纯化后进行冷冻干燥,具体为:于-70~-80℃下预冻,最后在大气压力为10~100Pa、温度为-55~-70℃条件下冷冻干燥24~72h。
6.如权利要求1所述的超声酶提胶原蛋白的方法,其特征在于,所述步骤一中,所述新鲜或冷冻甲鱼裙边需先进行预处理,具体为:切碎后除杂,去除脂肪,然后用蒸馏水反复洗涤,充分沥干后备用。
7.如权利要求1所述的超声酶提胶原蛋白的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一,取新鲜或冷冻甲鱼裙边,按照体积比1:10~30的比例加入质量浓度为0.3~0.6mol/L的柠檬酸溶液,按照体积百分比再加入0.25~1.5%的胃蛋白酶制得混合溶液;
步骤二,所述混合溶液进行超声处理,其中超声时间为30~50min;其中工作时间2s,停歇时间2~6s,超声功率为50~300W;
步骤三,超声结束后,于1000~3000rmp离心3~6min后取上清液;向所述上清液中添加NaCl至盐浓度为0.6~1.2mol/L,静置盐析18~30h后过滤,蛋白沉淀用0.3~0.6mol/L的乙酸复溶后依次对0.1~0.5mol/L的乙酸和蒸馏水透析3~5天,每天更换透析水2~4次;于-70~-80℃下预冻,最后在大气压力为10~100Pa、温度为-55~-70℃条件下冷冻干燥24~72h,制得螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白。
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