CN109337951A - 一种基于家禽肺部胶原蛋白的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于家禽肺部胶原蛋白的提取方法，首先将家禽肺部脱脂后在乙酸溶液中浸提得到胶原蛋白浸提液，在上清液中加入研磨成粉末的NaCl，使溶液中最终NaCl的浓度为0.8‑0.9mol/L，持续搅拌盐析得到粗胶原蛋白，最后经过复合蛋白酶液酶解，采用去离子水透析后冷冻干燥，最后得到胶原蛋白。本发明制备方法简单，步骤易于操作，能够将家禽肺部的胶原蛋白充分提取出来，能够用于食品、化妆品的原料，增强了家禽副产物的利用率。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于家禽肺部胶原蛋白的提取方法，属于胶原蛋白提取制备技术领域。
背景技术
胶原蛋白是人体组织结构的主要成分之一，它遍及全身的各个组织器官，如：皮肤、骨骼、软骨、韧带、角膜以及各种内膜筋膜等，是维持皮肤和组织器官形态、结构的主要成分，也是修复各损伤组织的重要物质。
随着人们生活水平的逐渐提高，家禽的加工市场前景广阔，但对于家禽的一些内脏基本都是直接遗弃，但若能对这些进行二次利用，则能够充分利用资源，实现废物的再利用，符合当今绿色发展的时代要求。
发明内容
本发明的目的是解决现有的家禽内脏资源利用不合理的现状，提供一种基于家禽肺部胶原蛋白的提取方法。
本发明采用如下技术方案：一种基于家禽肺部胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：
（1）脱脂：取家禽肺部在异丙醇溶液中浸泡20-24 h，冲洗干净后置于NaCl溶液中浸泡20-24 h后冷藏保存；
（2）浸提：将预处理好的脱脂家禽肺部置于0.4-0.5 mol/L的乙酸溶液中，以1∶20~1∶50（m/V）的料液比在10~20℃条件下提取24~72 h得到胶原蛋白浸提液；
（3）对上述胶原蛋白浸提液离心分离，在上清液中加入研磨成粉末的NaCl，使溶液中最终NaCl的浓度为0.8-0.9mol/L，持续搅拌盐析，析出絮状沉淀，在4℃条件下静置6~12h后离心分离得到沉淀物，沉淀物为粗胶原蛋白；
（4）将沉淀物用乙酸溶液溶解后置于透析袋中透析2~4天，直至透析外液中检测不到Cl-为止，然后用去离子水将滤渣进行清洗，水洗至滤渣水溶液pH值为6.6～7；
（5）在滤渣中按1：0.6～1.0的质量比加入复合蛋白酶液，搅拌混匀，离心后得到酶促溶性胶原蛋白，采用去离子水透析后将透析袋中的胶原蛋白冷冻干燥，即可得到酸溶性胶原蛋白粉末。
进一步的，所述步骤（1）中异丙醇溶液的质量分数为8-10%。
进一步的，所述步骤（1）中NaCl溶液的质量分数为3-5%。
进一步的，所述步骤（3）中离心3000~5000 rpm下离心15~30min。
进一步的，所述步骤（4）中的乙酸溶液的浓度为0.03-0.05mol/L。
进一步的，所述步骤（4）和步骤（5）中的透析袋的截留分子量为1.0kD。
进一步的，所述步骤（5）中是在真空冷冻干燥机中于真空度50-100Pa下预干燥10-30min，冷冻干燥于-45~-55 ℃干燥24-48h。
本发明制备方法简单，步骤易于操作，能够将家禽肺部的胶原蛋白充分提取出来，能够用于食品、化妆品的原料，增强了家禽副产物的利用率。
附图说明
图1为本发明中实施例一的紫外吸收光谱图。
图2为本发明中实施例一的凝胶电泳实验图。
图3为本发明中实施例一的红外光谱图。
图4为本发明中实施例一的X射线衍射光谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例一：
一种基于家禽肺部胶原蛋白的提取方法，其特征是：包括如下步骤：
（1）脱脂：将新鲜宰杀的鸡的肺部分离取出，于异丙醇溶液中浸泡20 h，冲洗干净后置于NaCl溶液中浸泡24 h后冷藏保存；
（2）浸提：将预处理好的脱脂鸡肺部置于0.4 mol/L的乙酸溶液中，以1∶50（m/V）的料液比在20℃条件下提取24 h得到胶原蛋白浸提液；
（3）对上述胶原蛋白浸提液离心分离，在上清液中加入研磨成粉末的NaCl，使溶液中最终NaCl的浓度为0.9mol/L，持续搅拌盐析，析出絮状沉淀，在4℃条件下静置6h后离心分离得到沉淀物，沉淀物为粗胶原蛋白；
（4）将沉淀物用乙酸溶液溶解后置于透析袋中透析4天，直至透析外液中检测不到Cl-为止，然后用去离子水将滤渣进行清洗，水洗至滤渣水溶液pH值为6.6；
（5）在滤渣中按1：1的质量比加入复合蛋白酶液，搅拌混匀，离心后得到酶促溶性胶原蛋白，采用去离子水透析后将透析袋中的胶原蛋白冷冻干燥，即可得到酸溶性胶原蛋白粉末。
经测定胶原蛋白得率为33.2%（占干重），纯度为85.4%。
实施例二：
一种基于家禽肺部胶原蛋白的提取方法，其特征是：包括如下步骤：
（1）脱脂：将新鲜宰杀的鸭的肺部分离取出，在异丙醇溶液中浸泡22 h，冲洗干净后置于NaCl溶液中浸泡22 h后冷藏保存；
（2）浸提：将预处理好的脱脂鸭肺部置于0.45 mol/L的乙酸溶液中，以1∶30（m/V）的料液比在15℃条件下提取36 h得到胶原蛋白浸提液；
（3）对上述胶原蛋白浸提液离心分离，在上清液中加入研磨成粉末的NaCl，使溶液中最终NaCl的浓度为0.85mol/L，持续搅拌盐析，析出絮状沉淀，在4℃条件下静置8h后离心分离得到沉淀物，沉淀物为粗胶原蛋白；
（4）将沉淀物用乙酸溶液溶解后置于透析袋中透析3天，直至透析外液中检测不到Cl-为止，然后用去离子水将滤渣进行清洗，水洗至滤渣水溶液pH值为7；
（5）在滤渣中按1：0.8的质量比加入复合蛋白酶液，搅拌混匀，离心后得到酶促溶性胶原蛋白，采用去离子水透析后将透析袋中的胶原蛋白冷冻干燥，即可得到酸溶性胶原蛋白粉末。
经测定胶原蛋白得率为40.7%（占干重），纯度为75.4%。
实施例三：
一种基于家禽肺部胶原蛋白的提取方法，其特征是：包括如下步骤：
（1）脱脂：将新鲜宰杀的鹅的肺部分离取出，在异丙醇溶液中浸泡24 h，冲洗干净后置于NaCl溶液中浸泡20 h后冷藏保存；
（2）浸提：将预处理好的脱脂鹅肺部置于0.5 mol/L的乙酸溶液中，以1∶20（m/V）的料液比在10℃条件下提取72 h得到胶原蛋白浸提液；
（3）对上述胶原蛋白浸提液离心分离，在上清液中加入研磨成粉末的NaCl，使溶液中最终NaCl的浓度为0.8mol/L，持续搅拌盐析，析出絮状沉淀，在4℃条件下静置12h后离心分离得到沉淀物，沉淀物为粗胶原蛋白；
（4）将沉淀物用乙酸溶液溶解后置于透析袋中透析2天，直至透析外液中检测不到Cl-为止，然后用去离子水将滤渣进行清洗，水洗至滤渣水溶液pH值为7；
（5）在滤渣中按1：0.6的质量比加入复合蛋白酶液，搅拌混匀，离心后得到酶促溶性胶原蛋白，采用去离子水透析后将透析袋中的胶原蛋白冷冻干燥，即可得到酸溶性胶原蛋白粉末。
经测定胶原蛋白得率为42.7%（占干重），纯度为67.1%。
取实施例一制备得到的酸溶性胶原蛋白粉末依次进行紫外吸收光谱、凝胶电泳实验、红外光谱和XRD分析，实验步骤和实验结果如下：
（1）紫外吸收光谱：
称取适量胶原蛋白样品溶于0.5mol/L乙酸溶液中，浓度为0.5 mg/mL，在13400g下离心20min，保留上清液用于紫外吸收光谱（UV-6100，上海美普达仪器有限公司）的测定。扫描范围：190-400nm，光谱间隔1.0nm。结果如图1所示。
由图1可知，鸡肺胶原蛋白的最大吸收值为235 nm，这与崔凤霞等人从海参体壁中提取的酶促溶性胶原蛋白基本相似。除此，鸡肺胶原蛋白质中的色氨酸和酪氨酸含量较少，所以该样品在280 nm附近有一个较小的吸光度。
（2）凝胶电泳实验：
称取1 mg胶原蛋白样品溶于2 mL 0.5 M乙酸溶液中，静置，5000 g下离心10min，待用。
制备12%的分离胶和5%的浓缩胶，进行电泳。将100 μL样品与200 μL上样缓冲液（pH 8.8的0.06 M Tris-HCl缓冲液、2%SDS、5%β-巯基乙醇、25%甘油、0.1%溴酚蓝）混合，然后沸水浴10min，于10000g离心3min。取5μL处理后的样品上样。采用分子量蛋白Markers（11-135 kDa）作为对照。电泳缓冲液为0.025 M Tris-HCl、0.192 M甘氨酸、0.1%SDS，电泳先在电流为16mA下进行30min；然后在32mA下进行1.5h。电泳结束后，采用考马斯亮蓝R-250染色30min，然后用10%甲醇、10%乙酸和80%蒸馏水的混合溶液进行脱色，直至可以清楚的辨别条带为止。结果如图2所示。
由图2可知，胶原蛋白分子具有三个独特的α链组成，这三个α链本身是α-螺旋结构，然后通过平行和右手螺旋形成特殊的三螺旋结构。至少含有两条α链（α1、α2）。这是因为α1与α3的组分相似，在单向垂直电泳胶中难以辨别，所以α1中可能包含α3。此外，还含有γ链（α链的三聚体），这与Mori报道的结论符合，说明鸡肺胶原蛋白是I型胶原蛋白。
（3）红外光谱：
在红外灯照射下将适量样品和KBr混匀研成粉末状。取样品压片，将样品放入样品室。用傅立叶变换红外光谱仪在500-4000cm-1区间扫描，分辨率设置为2cm-1。结果由图3所示。
由图3可知，傅立叶变换红外光谱(FTIR)技术是研究氢键的强有力手段，它可以在各种环境条件下得到几乎所有生物物质的红外光谱图。一般而言，N-H伸缩振动产生的酰胺A带的吸收通常在3400-3440 cm-1；-CH2的不对称伸缩振动产生的酰胺B带的吸收通常在2920-2944cm-1；C=O的伸缩振动产生的酰胺I带的吸收通常在1652-1653cm-1；酰胺II带、III带的吸收峰通常出现在1549cm-1、1226cm-1。通过观察鸡肺胶原蛋白的图谱，得出样品的酰胺A带的特征吸收为3369.27cm-1处的强吸收，酰胺B的特征吸收为2854.23cm-1处的强吸收，酰胺I带的特征吸收为1675.34cm-1处的强吸收，酰胺II带的特征吸收为1524.61cm-1处的强吸收，1251.22cm-1处为胶原蛋白N-H弯曲引起的酰胺III带的特征频率。通过分析，提取的鸡肺胶原蛋白三股螺旋结构完整，提取过程中未受过破坏。
（4）XRD分析：
使用shimadzu射线衍射仪测定冻干胶原样品的晶体结构。 X-射线源为CuKα，管电压为30kV，管电流为10mA，扫描范围为5-35°（2θ），扫描速度为0.06°/s。结果如图4所示。
由图4可知，鸡肺胶原蛋白的X-射线衍射（XRD）如图所示。 ASC的衍射峰出现在7.6°，22.3°和31.5°。鸡肺胶原蛋白的分子链之间的距离为1.16nm。第二衍射峰为约20°。这能反映出胶原纤维的许多结构层引起的漫射散射，第三衍射峰在30°附近，并表明胶原三股螺旋的特征链间间隔。这一结果也在FTIR分析中得到了证实，其中1542 cm-1谱带指示鸡肺胶原蛋白中Ⅱ型的三螺旋结构。
Claims (7)
1.一种基于家禽肺部胶原蛋白的提取方法，其特征是：包括如下步骤：
（1）脱脂：取家禽肺部在异丙醇溶液中浸泡20-24 h，冲洗干净后置于NaCl溶液中浸泡20-24 h后冷藏保存；
（2）浸提：将预处理好的脱脂家禽肺部置于0.4-0.5 mol/L的乙酸溶液中，以1∶20~1∶50（m/V）的料液比在10~20℃条件下提取24~72 h得到胶原蛋白浸提液；
（3）对上述胶原蛋白浸提液离心分离，在上清液中加入研磨成粉末的NaCl，使溶液中最终NaCl的浓度为0.8-0.9mol/L，持续搅拌盐析，析出絮状沉淀，在4℃条件下静置6~12h后离心分离得到沉淀物，沉淀物为粗胶原蛋白；
（4）将沉淀物用乙酸溶液溶解后置于透析袋中透析2~4天，直至透析外液中检测不到Cl-为止，然后用去离子水将滤渣进行清洗，水洗至滤渣水溶液pH值为6.6～7；
（5）在滤渣中按1：0.6～1.0的质量比加入复合蛋白酶液，搅拌混匀，离心后得到酶促溶性胶原蛋白，采用去离子水透析后将透析袋中的胶原蛋白冷冻干燥，即可得到酸溶性胶原蛋白粉末。
2.如权利要求1所述的基于家禽肺部胶原蛋白的提取方法，其特征是：所述步骤（1）中异丙醇溶液的质量分数为8-10%。
3.如权利要求1所述的基于家禽肺部胶原蛋白的提取方法，其特征是：所述步骤（1）中NaCl溶液的质量分数为3-5%。
4.如权利要求1所述的基于家禽肺部胶原蛋白的提取方法，其特征是：所述步骤（3）中离心3000~5000 rpm下离心15~30min。
5.如权利要求1所述的基于家禽肺部胶原蛋白的提取方法，其特征是：所述步骤（4）中的乙酸溶液的浓度为0.03-0.05mol/L。
6.如权利要求1所述的基于家禽肺部胶原蛋白的提取方法，其特征是：所述步骤（4）和步骤（5）中的透析袋的截留分子量为1.0kD。
7.如权利要求1所述的基于家禽肺部胶原蛋白的提取方法，其特征是：所述步骤（5）中是在真空冷冻干燥机中于真空度50-100Pa下预干燥10-30 min，冷冻干燥于-45~-55 ℃干燥24-48h。
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| CN109811027A (zh) * | 2019-03-22 | 2019-05-28 | 江苏省农业科学院 | 以鸡肺为原料的明胶制备方法 |
| CN111057733A (zh) * | 2020-01-31 | 2020-04-24 | 桂林理工大学 | 一种从生物质石灰废渣中提取胶原蛋白的方法 |
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2018
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