CN101161679A - 一种地赛米松人工抗原的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种地赛米松人工抗原的制备方法，属于生物化工领域。本发明以地赛米松为原料，利用丁二酸酐与地赛米松反应生成地赛米松琥珀酸半酯，得到人工半抗原；利用活性酯法使半抗原转变为活性酯中间体，然后使之与牛血清蛋白结合，制备地赛米松的人工抗原即地赛米松-牛血清蛋白。本发明合成了地赛米松的人工抗原，所制备的产品可用于糖皮质激素类免疫方法的研究，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。
Description
技术领域
一种地赛米松人工抗原的制备方法，属于生物化工领域。
背景技术
地赛米松(Dexamethasone)属人工合成类糖皮质激素，化学名称为16α-甲基-11β，17α，21-三羟基-9α-氟孕甾-1，4-二烯-3，20-二酮。具有抗过敏、抗炎和影响糖代谢的作用，常被用于治疗家畜的炎症反应、免疫性疾病、牛的酮病和羊妊娠毒血症等。地赛米松还常被用作生长促进剂，增加家畜的饲料摄入量从而使其达到增重的目的。然而，经毒理学试验证明，该药物具有至突变性、蓄积毒性，ADI值为0.000015mg/kgbw/day。若随意在饲料中添加该药物，蓄积的药物通过食物链进入人体，将造成巨大的危害。为此许多国家将此类药物列入禁用药物名单。当今国际上常用的地赛米松残留的检测方法有：薄层色谱(TLC)、液相色谱(LC)、气相色谱(GC)、气-质联用法(GC-MS)、液-质联用法(LC-MS)等，但这些仪器分析方法不仅需要昂贵的仪器设备，对检材的要求也比较高，需要经过复杂的样品前处理才能进行。国外早已经开展了对地赛米松免疫分析方法的研究，但国内目前在这方面还是一片空白。为了加强对国内肉制品的监督力度和保障人民的身体健康，有必要展开对地赛米松免疫分析方法的研究，有必要提供一种有效的地赛米松人工抗原的制备方法。
发明内容：
本发明的目的是提供一种地赛米松人工抗原的制备方法，所制备的产品可用于糖皮质激素类免疫方法的研究，为今后人们的研究提供了方便的途径。
本发明的技术方案：一种地赛米松人工抗原的制备方法，以地赛米松为原料，利用丁二酸酐与地赛米松反应生成地赛米松琥珀酸半酯，得到人工半抗原；利用活性酯法使半抗原转变为活性酯中间体，然后使之与牛血清蛋白结合，制备地赛米松的人工抗原即地赛米松-牛血清蛋白；其反应方程式为：
地赛米松 地赛米松-21-琥珀酸半酯
地赛米松-牛血清蛋白
工艺步骤为：
(1)人工半抗原的制备：
地赛米松和丁二酸酐配料摩尔比为1∶3，称取地赛米松0.8mmol和丁二酸酐2.4mmol于50mL圆底烧瓶中，加入5mL无水吡啶，混合物在60℃下加热搅拌反应6h，将反应物转入20mL含10％盐酸的4℃冰水中，有白色沉淀析出，离心除去吡啶及过量的丁二酸酐，滤饼用去离子水洗涤数次，离心，干燥箱干燥后得到地赛米松半抗原，置于4℃保存；
硅胶薄层板的制作：称取硅胶12g，溶解在40mL 0.5％质量浓度的羟甲基纤维素钠溶液中，用玻璃棒充分搅拌成糊状，超声波振荡1分钟，均匀涂布在玻璃板上，置于阴凉处自然干燥后，放入105℃的烘箱中活化1h，最后放入干燥箱中备用；
薄层层析法检测：硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μL点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为甲醇∶氯仿∶氨水体积比为21∶78∶1，展开至薄板3.5-4cm处，取板，吹干溶剂，将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.21处观察到显色点作为反应终点；
(2)人工抗原的制备：
制备A液：称取0.09mmol半抗原，0.09mmol N-羟基琥珀酰亚胺，0.099mmolN，N-二环己基碳二亚胺于20mL烧杯中，溶解于1.8mL的二氧六环中，室温下搅拌过夜，离心后弃沉淀，清液为活性酯中间体，为A液；
磷酸盐缓冲液：将0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液94.7mL与0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液5.3mL混合即为pH 8.0的磷酸盐缓冲液；
制备B液：称取120.6mg的牛血清蛋白溶解于9mL的pH 8.0的磷酸盐缓冲液中，4℃低温搅拌半小时，此液为B液；
在4℃低温搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液中，全部滴完后，混合液搅拌1小时恢复至室温，即得到人工抗原混合液；
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的超纯水透析3天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：地赛米松-牛血清蛋白。
(3)地赛米松人工抗原的鉴定
估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的.分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，40，60，80，100，120，160，200μg·mL-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本实验计算得抗原溶液的蛋白浓度为5.12mg·mL-1。
偶联比测定：配制地赛米松浓度为50μg·mL-1的20％乙醇溶液，通过紫外扫描可知地赛米松的最大吸收波长为240nm.
配制200μg·mL-1牛血清蛋白的水溶液，将偶联产物用去离子水稀释到约200μg·mL-1，在240nm处测吸光值，以去离子水为空白，测出吸光值。将DEX，DEX-BSA，BAS的质量浓度根据其相对分子质量转换为摩尔浓度，然后根据公
式(1)算出各自的摩尔消光系数：
其中，A为吸光度，C为摩尔浓度。
再根据公式(2)估算交联率：
MDEX∶MBAS＝(εDEX-BSA-εBAS)/εDEX (2)
本发明计算得交联率约为11。
本发明的有益效果：本发明合成了地赛米松的人工抗原，所制备的产品可用于糖皮质激素类免疫方法的研究，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。
附图说明
图1地赛米松人工半抗原的液相色谱图。
图2地赛米松人工半抗原的质谱图。
图3地赛米松人工半抗原的紫外图。
图4地赛米松人工抗原制备前后的紫外扫描图。
具体实施方式
(1)人工半抗原的制备：
称取0.32g地赛米松和0.24g丁二酸酐于50mL圆底烧瓶中，加入5mL无水吡啶，混合物在60℃下加热搅拌反应6h，将反应物转入含10％盐酸(v/v)的冰水(4℃)中，有白色沉淀析出，离心出去吡啶及过量的丁二酸酐，去离子水洗涤数次，离心，干燥箱干燥后保存。
反应终点监测：硅胶薄层板的制作，称取硅胶12g，溶解在40mL 0.5％质量浓度的羟甲基纤维素钠溶液中，用玻璃棒充分搅拌成糊状，超声波振荡1分钟，均匀涂布在玻璃板上，置于阴凉处自然干燥后，放入105℃的烘箱中活化1h，最后放入干燥箱中备用。
薄层层析法检测：硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μL点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为甲醇∶氯仿∶氨水，体积比为21∶78∶1，展开至薄板3.5-4cm处，取板，吹干溶剂。将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.21处观察到显色点作为反应终点。
(2)人工抗原的制备：
制备A液：称取44.31mg(0.09mmol)半抗原，10.35mg(0.09mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，20.4mg(0.099mmol)N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)于20mL烧杯中，溶解于1.8mL的二氧六环中，室温下搅拌过夜，离心后弃沉淀，清液为活性酯中间体，为A液；
磷酸盐(PBS)缓冲液：0.2mol/L磷酸氢二钠：磷酸氢二钠71.64g加水至1000mL。0.2mol/L的磷酸二氢钠：磷酸二氢钠35.61g加水至1000mL。将94.7mL的磷酸氢二钠与5.3mL的磷酸二氢钠混合即为pH 8.0的磷酸盐缓冲液。
制备B液：称取120.6mg的BSA溶解于9mL的pH 8.0的磷酸盐缓冲液中，4℃低温搅拌半小时，此液为B液。
在低温(4℃)搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液中，全部滴完后，混合液搅拌1小时恢复至室温，即得到人工抗原混合液。
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的超纯水透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：地赛米松-牛血清蛋白。
(3)地赛米松人工抗原的鉴定
估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的.分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，40，60，80，100，120，160，200μg·mL1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本发明计算得抗原溶液的蛋白浓度为5.12mg·mL-1。
偶联比测定：配制地赛米松浓度为50μg·mL-1的20％乙醇溶液，通过紫外扫描可知地赛米松的最大吸收波长为240nm.
配制200μg·mL-1牛血清蛋白的水溶液，将偶联产物用去离子水稀释到约200μg·mL-1，在240.nm处测吸光值，以去离子水为空白，测出吸光值。将DEX，DEX-BSA，BAS的质量浓度根据其相对分子质量转换为摩尔浓度，然后根据公式(1)算出各自的摩尔消光系数：
其中，A为吸光度，C为摩尔浓度。
再根据公式(2)估算交联率：
MDEX∶MBAS＝(εDEX-BSA-εBAS)/εDEX (2)
本发明计算得交联率约为11。
Claims (1)
1.一种地赛米松人工抗原的制备方法，其特征是以地赛米松为原料，利用丁二酸酐与地赛米松反应生成地赛米松琥珀酸半酯，得到人工半抗原；利用活性酯法使半抗原转变为活性酯中间体，然后使之与牛血清蛋白结合，制备地赛米松的人工抗原即地赛米松-牛血清蛋白；步骤为：
(1)人工半抗原的制备：
地赛米松和丁二酸酐配料摩尔比为1∶3，称取地赛米松0.8mmol和丁二酸酐2.4mmol于50mL圆底烧瓶中，加入5mL无水吡啶，混合物在60℃下加热搅拌反应6h，将反应物转入20mL含10％盐酸的4℃冰水中，有白色沉淀析出，离心除去吡啶及过量的丁二酸酐，滤饼用去离子水洗涤数次，离心，干燥箱干燥后得到地赛米松半抗原，置于4℃保存；
硅胶薄层板的制作：称取硅胶12g，溶解在40mL 0.5％质量浓度的羟甲基纤维素钠溶液中，用玻璃棒充分搅拌成糊状，超声波振荡1分钟，均匀涂布在玻璃板上，置于阴凉处自然干燥后，放入105℃的烘箱中活化1h，最后放入干燥箱中备用；
薄层层析法检测：硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μL点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为甲醇∶氯仿∶氨水体积比为21∶78∶1，展开至薄板3.5-4cm处，取板，吹干溶剂，将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.21处观察到显色点作为反应终点；
(2)人工抗原的制备：
制备A液：称取0.09mmol半抗原，0.09mmol N-羟基琥珀酰亚胺，0.099mmolN，N-二环己基碳二亚胺于20mL烧杯中，溶解于1.8mL的二氧六环中，室温下搅拌过夜，离心后弃沉淀，清液为活性酯中间体，为A液；
磷酸盐缓冲液：将0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液94.7mL与0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液5.3mL混合即为pH 8.0的磷酸盐缓冲液；
制备B液：称取120.6mg的牛血清蛋白溶解于9mL的pH 8.0的磷酸盐缓冲液中，4℃低温搅拌半小时，此液为B液；
在4℃低温搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液中，全部滴完后，混合液搅拌1小时恢复至室温，即得到人工抗原混合液；
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的超纯水透析3天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：地赛米松-牛血清蛋白。
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