CN106905318B - 氨基他达那非半抗原、人工抗原及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域,特别涉及氨基他达那非半抗原、人工抗原及其制备方法。本发明半抗原在保留氨基他达那非基本结构的基础上引入连接臂结构和用于偶联大分子的活性基团,这样既有利于其与大分子偶联,又可以在偶联后充分暴露本身分子结构和分子量较小的氨基他达那非基本结构,避免了其被大分子掩蔽而影响动物机体的识别。本发明将氨基他达那非半抗原通过活性酯化法与蛋白质偶联制备人工抗原,偶联比可达18.2,可用于氨基他达那非的免疫检测。

Description

氨基他达那非半抗原、人工抗原及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别涉及氨基他达那非半抗原、人工抗原及其制备方法。
背景技术
氨基他达那非(Amino Tadalafil),其化学式为C21H18N4O4,CAS登录号为385769-84-6,是一种新型5-羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂,为水溶性白色或灰白色粉末,其具有壮阳、延时治疗性功能障碍的功效。氨基他达那非通过抑制5-HT转运体,能有效抑制5-HT再摄取,提高突触间隙5-HT浓度,激活突触后膜5-HT2C和5-HT1A受体,发挥延迟射精作用,从而有效控制男性的早泄症状。但服用氨基他达那非后患者会产生头痛、消化不良、头晕、面色潮红、鼻充血、背部疼痛及肌肉疼痛的不良反应。
近年来,中成药及保健品非法添加化学物质越来越引起人们的关注,不法药商为了谋取非法利益,通过非法加入氨基他达那非,使疗效缓和的中成药或保健品具有了暂时的速效、高效或特效,增加销量,获取非法高额利润。但作为患者,在长期不知情的情况下服用含有氨基他达那非的中成药或保健品会引起严重的副作用。目前,检测中成药或保健品中是否含有氨基他达那非成分,采用的仍是传统的检验方法,须将提取的样品带回实验室进行分析,或是使用大型的试验车,这样都很不方便,而且反应时间长,实验耗资较大。
免疫分析是一种基于抗原抗体特异性识别和结合反应的分析方法,具有灵敏、对仪器要求不高、操作简单、成本低等优点。氨基他达那非属于分子量小于1000的小分子化合物,本身不具备反应性和免疫原性,为了实现氨基他达那非的免疫检测,不仅需要合成具备高效价的氨基他达那非抗原,而且还需要筛选特异性强、敏感度高的氨基他达那非单克隆抗体。但是目前尚没有有关氨基他达那非单克隆抗体的相关报道。对于技术人员来说高效价的氨基他达那非抗原的设计仍是难点。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了氨基他达那非半抗原、人工抗原及其制备方法。本发明半抗原在保留氨基他达那非基本结构的基础上引入连接臂结构和用于偶联大分子的活性基团,这样既有利于其与大分子偶联,又可以在偶联后充分暴露本身分子结构和分子量较小的氨基他达那非基本结构,避免了其被大分子掩蔽而影响动物机体的识别。本发明将氨基他达那非半抗原通过活性酯化法将半抗原与蛋白质偶联制备人工抗原,偶联比可达18.2,可用于氨基他达那非的免疫检测。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种氨基他达那非半抗原,其分子结构式如式I或式II所示:
其中,n为1、2或3,m为1、2或3。
本发明还提供了式I所示氨基他达那非半抗原的制备方法,包括如下步骤:
氨基他达那非与环形酸酐反应,得到氨基他达那非半抗原;
环形酸酐为丁二酸酐、戊二酸酐或己二酸酐。
本发明还提供了式II所示氨基他达那非半抗原的制备方法,包括如下步骤:
氨基他达那非与环形酸酐反应,得到氨基他达那非衍生物;
氨基他达那非衍生物与脂肪类二胺反应,得到氨基他达那非半抗原;
环形酸酐为丁二酸酐、戊二酸酐或己二酸酐;
脂肪类二胺为丙二胺、丁二胺或戊二胺。
在本发明提供的实施例中,氨基他达那非与环形酸酐反应的溶剂为1,4-二氧六环。
作为优选,氨基他达那非与环形酸酐反应的条件为在弱碱性、密闭条件、40~50℃下反应10~12h。
作为优选,弱碱性条件的pH值为7.5。
在本发明提供的实施例中,弱碱性反应条件通过加入三乙胺实现。
作为优选,氨基他达那非与环形酸酐的质量比为1:(5~13)。
在本发明提供的实施例中,氨基他达那非与环形酸酐的质量比为1:10。
在本发明提供的实施例中,氨基他达那非与环形酸酐反应具体为:将氨基他达那非与环形酸酐混合,溶解于1,4-二氧六环中,然后逐滴加入少量三乙胺,40~50℃密闭搅拌反应10~12h。反应结束后,将反应液倾入水中,用乙酸乙酯多次萃取,合并萃取液,以无水Na2SO4进行干燥,浓缩后得到固体,重结晶得到固体产物。
作为优选,氨基他达那非衍生物与脂肪类二胺反应的温度为120~130℃,反应的时间为12~14h。
优选地,氨基他达那非衍生物与脂肪类二胺反应的温度为130℃,反应的时间为12h。
作为优选,氨基他达那非衍生物与脂肪类二胺的质量比为1:(4~10)。
在本发明提供的实施例中,氨基他达那非衍生物与脂肪类二胺的质量比为1:8。
在本发明提供的实施例中,氨基他达那非衍生物与脂肪类二胺反应具体为:氨基他达那非衍生物与脂肪类二胺混合,加热至130℃搅拌反应12h,产物减压浓缩至近干,得油状粗产物;加入纯净水,超声分散洗涤后,抽滤收集固体,干燥得到氨基他达那非半抗原。
本发明还提供了一种氨基他达那非人工抗原,其分子结构式如式III或IV所示:
其中,n为1、2或3,m为1、2或3。
本发明还提供了式III或式IV所示氨基他达那非人工抗原的制备方法,采用活性酯化法制备氨基他达那非人工抗原。
在本发明提供的实施例中,氨基他达那非人工抗原的制备方法包括如下步骤:
将本发明提供的氨基他达那非半抗原、EDC、NHS在有机溶剂中反应,得到一号反应液;
将载体蛋白与磷酸缓冲液混合,得到二号反应液;
一号反应液与二号反应液反应,得到氨基他达那非人工抗原。
作为优选,有机溶剂为DMF。
作为优选,将氨基他达那非半抗原、EDC、NHS在有机溶剂中反应的条件为15~30℃、避光条件下搅拌反应12~14h。
作为优选,一号反应液与二号反应液反应具体为:将一号反应液滴入二号反应液,在15~30℃、避光条件下搅拌反应30~60min,然后在3~5℃、避光条件下搅拌反应46~50h。
作为优选,一号反应液与二号反应液反应与得到氨基他达那非人工抗原之间还包括纯化、干燥的步骤。
作为优选,纯化为:将反应液进行离心处理,并将上清液置于装有pH值为7.0~7.5磷酸盐缓冲液的分子截留为20000~30000的透析袋中,在3~5℃的条件下进行透析46~50小时,每隔6~8小时换一次磷酸盐缓冲液,保留透析袋中所得溶液。
作为优选,氨基他达那非半抗原、EDC、NHS的质量比为1:(5~8):(10~13)。
优选地,氨基他达那非半抗原、EDC、NHS的质量比为1:8:13。
作为优选,以质量比计,1份载体蛋白与10~12份磷酸缓冲液混合。
作为优选,载体蛋白与氨基他达那非半抗原的质量比为1:(15~25)。
作为优选,载体蛋白为牛血清蛋白BSA。
在本发明提供的实施例中,将一号反应液滴入二号反应液为:将一号反应液按每5秒1滴的速度滴入二号反应液。
本发明提供了氨基他达那非半抗原、人工抗原及其制备方法。氨基他达那非半抗原的分子结构式如式I、II所示,人工抗原的分子结构式如式III、IV所示。本发明的有益效果为:
本发明以氨基他达那非为原料,与环形酸酐反应,得到羧基化的氨基他达那非衍生物(半抗原),或者与环形酸酐反应后再与脂肪类二胺反应,得到氨基化的氨基他达那非半抗原。该半抗原在保留氨基他达那非基本结构的基础上引入连接臂(linker)结构和用于偶联大分子的活性基团,这样既有利于其与大分子偶联,又可以在偶联后充分暴露本身分子结构和分子量(390)较小的氨基他达那非基本结构,避免了其被大分子掩蔽而影响动物机体的识别。
本发明将氨基他达那非半抗原通过活性酯化法将半抗原与蛋白质偶联制备人工抗原,偶联比可达18.2,可用于氨基他达那非的免疫检测。
此方法获得的人工合成抗原可进一步制备抗体,运用到胶体金试纸中,此胶体金试纸可用于食品保健品非法添加氨基他达那非的快速筛查。
附图说明
图1示试验例1中BSA、氨基他达那非(AT)、AT-BSA的紫外全波谱扫描图;
图2示对比例1中BSA、氨基他达那非(AT)、AT-BSA的紫外全波谱扫描图。
具体实施方式
本发明公开了氨基他达那非半抗原、人工抗原及其制备方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明提供的氨基他达那非半抗原、人工抗原及其制备方法的反应机理为:
其中n=1,2,3;m=1,2,3。
在本发明提供的实施例中,式I所示半抗原的制备方法包括步骤:
1)将1份氨基他达那非与5~13份环状酸酐混合后,溶解于30份的1,4-二氧六环中,然后逐滴加入5滴三乙胺(pH为7.5),40-50℃密闭搅拌反应10-12h。反应结束后,将反应液倾入水中,用100份乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液,以无水Na2SO4进行干燥,浓缩后得到固体,75%乙醇重结晶得到固体产物为氨基他达那非衍生物。
2)将1份氨基他达那非衍生物与4~10份脂肪类二胺混合,130℃搅拌反应12h,产物减压浓缩至近干,得油状粗产物;加入50份纯净水,超声分散洗涤后,抽滤收集固体,干燥得到氨基他达那非半抗原。
在本发明提供的实施例中,如式II所示氨基他达那非人工抗原的制备方法包括步骤:
1)将式I所示的半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N,N—二甲基甲酰胺(DMF)平衡至室温;
2)将1份半抗原、5~8份EDC和10~13份NHS混合于圆底烧瓶,加入DMF,待所有物质溶解后,室温避光下搅拌12-14h,生成溶液记为一号反应液;
3)将载体蛋白与磷酸缓冲溶液按照1:1~1.2的比例溶解,此溶液记为二号反应液;
4)将一号反应液按每5秒1滴的速度滴入二号反应液中,滴加完后,需控制载体蛋白与半抗原化合物比例为:1:15~25,然后室温避光搅拌30min,接着3-5℃下避光搅拌直到反应完全(46-50小时),将生成的溶液记为三号反应液;
5)反应结束后,将三号反应液进行离心处理,并将上清液置于分子截留为20000-30000的透析袋中,于pH值为7.0-7.5的磷酸盐缓冲液中,在3-5℃的条件下进行透析46-50小时,每隔6-8小时换一次磷酸盐缓冲液;
6)透析后透析袋中所得溶液,经冷冻干燥得白色固体,即为人工合成抗原。
在本发明提供的实施例中,式III所示半抗原的制备方法包括步骤:
将1份氨基他达那非与5~13份环状酸酐混合后,溶解于30份的1,4-二氧六环中,然后逐滴加入5滴三乙胺(pH为7.5),40-50℃密闭搅拌反应10-12h。反应结束后,将反应液倾入水中,用100份乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液,以无水Na2SO4进行干燥,浓缩后得到固体,75%乙醇重结晶得到固体产物为氨基他达那非半抗原。
在本发明提供的实施例中,如式IV所示氨基他达那非人工抗原的制备方法包括步骤:
1)将式III所示的半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N,N—二甲基甲酰胺(DMF)平衡至室温;
2)将1份半抗原、5~8份EDC和10~13份NHS混合于圆底烧瓶,加入DMF,待所有物质溶解后,室温避光下搅拌12-14h,生成溶液记为一号反应液;
3)将载体蛋白与磷酸缓冲溶液按照1:1~1.2的比例溶解,此溶液记为二号反应液;
4)将一号反应液按每5秒1滴的速度滴入二号反应液中,滴加完后,需控制载体蛋白与半抗原化合物比例为:1:15~25,然后室温避光搅拌30min,接着3-5℃下避光搅拌直到反应完全(46-50小时),将生成的溶液记为三号反应液;
5)反应结束后,将三号反应液进行离心处理,并将上清液置于分子截留为20000-30000的透析袋中,于pH值为7.0-7.5的磷酸盐缓冲液中,在3-5℃的条件下进行透析46-50小时,每隔6-8小时换一次磷酸盐缓冲液;
6)透析后透析袋中所得溶液,经冷冻干燥得白色固体,即为人工合成抗原。
本发明提供的氨基他达那非半抗原、人工抗原及其制备方法中所用原料药或试剂均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1氨基他达那非半抗原的制备(方案一:n=1)
将1份氨基他达那非与10份丁二酸酐混合后,溶解于30份的1,4-二氧六环中,然后逐滴加入5滴三乙胺,40℃密闭搅拌反应12h。反应结束后,将反应液倾入水中,用100份乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液,以无水Na2SO4进行干燥,浓缩后得到固体,75%乙醇重结晶得到固体产物为氨基他达那非衍生物(半抗原)。
所得产物的结构表征为:1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.72(d,J=7.5Hz,2H),7.51(t,J=7.8Hz,1H),6.98(s,J=7.9Hz,1H),6.91(d,J=7.9Hz,1H),6.86(t,J=7.3Hz,1H),6.79(d,J=7.9Hz,1H),6.21(s,1H),5.94(s,2H),4.83(t,J=28.1Hz,1H),3.98(s,2H),3.07–2.95(m,2H),2.63(t,2H),2.50(t,2H)。
实施例2氨基他达那非半抗原的制备(方案一:n=2)
将1份氨基他达那非与10份戊二酸酐混合后,后续步骤与实施例1相同。
所得产物的结构表征为:1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.85(d,J=7.8Hz,2H),7.41(t,J=7.7Hz,1H),7.01(s,J=7.3Hz,1H),6.91–6.87(m,J=8.3Hz,2H),6.80(t,J=7.3Hz,1H),6.19(s,J=8.3Hz,1H),5.94(s,J=7.6Hz,2H),4.82(t,J=8.8Hz,1H),4.06(s,J=4.9Hz,2H),3.03(d,2H),2.39–2.33(m,4H),2.10(m,J=4.2Hz,2H)。
实施例3氨基他达那非半抗原的制备(方案一:n=3)
将1份氨基他达那非与10份己二酸酐混合后,后续步骤与实施例1相同。
所得产物的结构表征为:1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.78(d,J=7.5Hz,2H),7.39(t,J=7.8Hz,1H),7.04(s,J=7.2Hz,1H),6.92(d,J=8.2Hz,1H),6.86(d,J=7.9Hz,1H),6.78(t,J=7.9Hz,1H),6.29(s,1H),5.89(s,2H),4.71–4.64(m,1H),4.12(s,J=3.9Hz,1H),3.52(t,J=16.4Hz,2H),3.07(d,2H),2.58(t,2H),2.47(t,J=3.9Hz,2H),2.23(t,J=3.6Hz,2H),2.00–1.93(m,2H),1.74(m,J=3.5Hz,4H)。
实施例4氨基他达那非半抗原的制备(方案二:n=1,m=1)
1、将1份氨基他达那非与10份丁二酸酐混合后,后续步骤与实施例1相同。
2、将1份氨基他达那非衍生物与8份丙二胺混合,130℃搅拌反应12h,产物减压浓缩至近干,得油状粗产物;加入50份纯净水,超声分散洗涤后,抽滤收集固体,干燥得到氨基他达那非半抗原。
所得产物的结构表征为:1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.79(d,J=7.8Hz,2H),7.49(t,J=7.7Hz,1H),6.98(s,J=7.3Hz,1H),6.89(d,J=8.2Hz,1H),6.85(t,J=8.6Hz,1H),6.80(d,J=7.9Hz,1H),δ6.13(s,1H),5.90(s,2H),4.89(t,J=8.5Hz,1H),4.03(s,2H),3.45(t,J=7.9Hz,2H),3.07–2.95(m,2H),2.60(m,4H),2.52(t,2H),1.90(m,2H)。
实施例5氨基他达那非半抗原的制备(方案二:n=3,m=1)
1、将1份氨基他达那非与10份己二酸酐混合后,后续步骤与实例1相同。
2、将1份氨基他达那非衍生物与8份丙二胺混合,后续步骤与实例4的步骤2相同。
所得产物的结构表征为:1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.78(d,J=7.5Hz,2H),7.39(t,J=7.8Hz,1H),7.04(s,J=7.2Hz,1H),6.92(d,J=8.2 Hz,1H),6.86(d,J=7.9Hz,1H),6.78(t,J=7.9Hz,1H),6.29(s,1H),5.89(s,2H),4.71–4.64(m,1H),4.12(s,J=3.9Hz,1H),3.52(t,J=16.4Hz,2H),3.07(d,2H),2.58(t,2H),2.47(t,J=3.9Hz,2H),2.23(t,J=3.6Hz,2H),2.00–1.93(m,2H),1.74(m,J=3.5Hz,4H)。
实施例6氨基他达那非半抗原的制备(方案二:n=3,m=2)
1、将1份氨基他达那非与10份己二酸酐混合后,后续步骤与实例1相同。
2、将1份氨基他达那非衍生物与8份丁二胺混合,后续步骤与实例4的步骤2相同。
所得产物的结构表征为:1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.81(d,J=8.6Hz,2H),7.43(t,J=7.3Hz,1H),7.01(s,J=7.7Hz,1H),6.87(d,J=8.6Hz,1H),6.83(d,J=8.3Hz,1H),6.79(t,J=7.9Hz,1H),6.19(s,1H),5.95(s,2H),4.78(m,1H),4.08(s,J=6.8Hz,1H),3.15(d,J=5.8Hz,2H),3.05(t,J=6.4Hz,2H),2.75(t,J=7.2Hz,2H),2.47(t,2H),2.17(t,J=3.3Hz,2H),1.58–1.50(m,8H)。
实施例7氨基他达那非半抗原的制备(方案二:n=2,m=3)
1、将1份氨基他达那非与10份戊二酸酐混合后,后续步骤与实施例1相同。
2、将1份氨基他达那非衍生物与8份戊二胺混合,后续步骤与实例4的步骤2相同。
所得产物的结构表征为:1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.83(d,J=8.2Hz,2H),7.40(t,J=7.9Hz,1H),6.99(s,J=8.1Hz,1H),6.92–6.85(m,J=8.8Hz,2H),6.78(t,J=7.5Hz,1H),6.14(s,J=6.9Hz,1H),6.01(s,J=8.6Hz,2H),4.88(t,J=8.3Hz,1H),4.08(s,J=5.3Hz,2H),3.09–3.03(m,4H),2.73(t,J=8.6Hz,2H),2.38–2.33(m,4H),2.09(m,J=4.3Hz,2H),1.49(m,J=5.1Hz,4H),1.30(m,J=4.5Hz,2H)。
实施例8氨基他达那非人工合成抗原的制备
1、将上述实施例4制得的半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N,N—二甲基甲酰胺(DMF)平衡至室温;
2、将1份上述的半抗原、8份EDC和13份NHS混合于圆底烧瓶,加入DMF,待所有物质溶解后,室温避光下搅拌12h,生成溶液记为一号反应液;
3、将载体蛋白与磷酸缓冲溶液按照1:1.2的比例溶解,此溶液记为二号反应液;
4、将一号反应液按每5秒1滴的速度滴入二号反应液中,滴加完后,需控制载体蛋白与半抗原化合物比例为:1:20,然后室温避光搅拌30min,接着4℃下避光搅拌直到反应完全(48小时),将生成的溶液记为三号反应液;
5、反应结束后,将三号反应液进行离心处理,并将上清液置于分子截留为30000的透析袋中,于pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中,在4℃的条件下进行透析48小时,每隔6-8小时换一次磷酸盐缓冲液;
6、透析后透析袋中所得溶液,经冷冻干燥得白色固体,即为人工合成抗原。
试验例1人工合成抗原的性能测定
1、牛血清蛋白BSA的摩尔吸光系数测定
配制一系列浓度牛血清蛋白BSA的PBS溶液(磷酸缓冲溶液,pH为7.4),通过紫外扫描BSA溶液,可知其最大吸收波长为278nm,选取278nm处测定吸光值,每个浓度做平行样。根据摩尔吸光系数计算公式可求出平均摩尔吸光系数:
ε=A/CL
其中A为吸光度,C为溶液浓度,L为液层厚度。
以下为一系列浓度BSA的PBS溶液及其所测出的吸光值:
C(μg/ml) 10 20 30 40 50
A(278nm) 0.070 0.016 0.025 0.034 0.045
其中液层厚度L为1cm,结合以上公式计算,求出平均摩尔吸光系数为53083.33L/(mol.cm)。
2、抗原浓度的测定(实施例8制得的人工抗原,其中n=1,m=1)
(1)标准曲线的绘制
配制系列已知浓度梯度BSA的PBS溶液,与考马斯染料以体积比为1:50的比例混合,并在595nm处测量吸光度,如下为系列浓度的BSA溶液及其所测出的吸光值:
浓度mg/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
A(595nm) 0.062 0.296 0.512 0.721 1.051 1.205
根据测量值可绘制出吸光度与抗原浓度的线性关系,得出:y=1.1699x+0.0562,R2=0.9943
(2)抗原浓度的测定
把实施例8所合成的抗原化合物稀释100倍后,和上进行同样的处理测出吸光度并进一步算出其浓度为2.898mg/mL。
3、偶联比的测定(实施例8制得的人工抗原,其中n=1,m=1)
把BSA和上述已测出浓度的抗原化合物均配制成200μg/mL的PBS溶液,在278nm处测量出吸光值,吸光值A1、A2分别为0.061和3.035,根据公式可以算出化合物的偶联比。
偶联比的计算公式:
其中:ε为平均摩尔吸光系数L/(mol.cm),65000为BSA的摩尔质量g/mol,200×10-3为BSA的质量浓度g/L。
根据以上公式,并把数据代进去,算得偶联比为18.2。BSA、氨基他达那非AT、AT-BSA的紫外全波谱扫描图见图1。
试验例2人工合成抗原的性能测定
参照实施例8的试验方法,将实施例1-3、5-7制得的半抗原合成人工抗原,参照试验例1中的方法检测人工合成抗原的偶联比,检测结果见表1:
表1人工抗原的偶联比检测结果
人工合成抗原 偶联比
实施例1合成的人工抗原 13.3
实施例2合成的人工抗原 14.1
实施例3合成的人工抗原 11.8
实施例4合成的人工抗原 18.2
实施例5合成的人工抗原 16.8
实施例6合成的人工抗原 15.6
实施例7合成的人工抗原 16.1
对比例1氨基他达那非衍生物的制备(n=6,m=6)
1、将1份氨基他达那非与5~13份壬二酸酐混合后,后续步骤与实施例1相同。
所得产物的结构表征为:1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.84(d,J=7.9Hz,2H),7.39(t,J=8.5Hz,1H),7.03(s,J=7.3Hz,1H),6.91–6.85(m,J=7.2Hz,2H),6.81(t,J=7.7Hz,1H),6.17(s,J=8.8Hz,1H),5.92(s,J=7.7Hz,2H),4.87(t,J=8.0Hz,1H),4.09(s,J=5.3Hz,2H),2.99(d,2H),2.35(t,J=5.3Hz,2H),2.19(t,J=4.8Hz,2H),1.59–1.53(m,4H),1.34–1.28(m,6H).
2、将1份氨基他达那非衍生物与4~10份辛二胺混合,后续步骤与实例4的步骤2相同。
所得产物的结构表征为:1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.88(d,J=8.5Hz,2H),7.43(t,J=8.1Hz,1H),6.99(s,J=7.7Hz,1H),6.93–6.88(m,J=8.0Hz,2H),6.83(t,J=8.7Hz,1H),6.13(s,J=7.8Hz,1H),5.94(s,J=7.8Hz,2H),4.94(t,J=8.2Hz,1H),4.12(s,J=4.8Hz,2H),3.04–2.98(m,4H),2.65(t,J=4.1Hz,2H),2.35(t,J=4.8Hz,2H),2.11(t,J=6.8Hz,2H),1.60–1.53(m,6H),1.33–1.26(m,16H).
3、抗原浓度的测定(其中n=6,m=6)
以对比例1制备的抗原化合物进行与试验例1相同的浓度测定,得到的结果为2.624mg/ml。
4、偶联比的测定(其中n=6,m=6)
以对比例1制备的抗原化合物进行与试验例1相同的紫外分光光度计全波谱扫描发现,当n=6、m=6时并不能顺利进行偶联反应。本对比例的BSA、氨基他达那非AT、AT-BSA(其中n=6,m=6)的紫外分光光度计全波谱扫描图见图2。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种氨基他达那非半抗原,其特征在于,其分子结构式如式I或式II所示:
其中,n为1、2或3,m为1、2或3。
2.如权利要求1式I所示氨基他达那非半抗原的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
氨基他达那非与环形酸酐反应,得到所述氨基他达那非半抗原;所述环形酸酐为丁二酸酐、戊二酸酐或己二酸酐。
3.如权利要求1式II所示氨基他达那非半抗原的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
氨基他达那非与环形酸酐反应,得到氨基他达那非衍生物;
所述氨基他达那非衍生物与脂肪类二胺反应,得到所述氨基他达那非半抗原;
所述环形酸酐为丁二酸酐、戊二酸酐或己二酸酐;
所述脂肪类二胺为丙二胺、丁二胺或戊二胺。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法,其特征在于,所述氨基他达那非与环形酸酐反应的溶剂为1,4-二氧六环,反应的条件为在弱碱性、密闭条件、40~50℃下反应10~12h。
5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述氨基他达那非衍生物与脂肪类二胺反应的温度为120~130℃,反应的时间为12~14h。
6.一种氨基他达那非人工抗原,其特征在于,其分子结构式如式III或IV所示:
其中,n为1、2或3,m为1、2或3。
7.如权利要求6所述氨基他达那非人工抗原的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
将权利要求1所述的氨基他达那非半抗原、EDC、NHS在有机溶剂中反应,得到一号反应液;
将载体蛋白与磷酸缓冲液混合,得到二号反应液;
所述一号反应液与所述二号反应液反应,得到所述氨基他达那非人工抗原。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述有机溶剂为DMF。
9.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述将氨基他达那非半抗原、EDC、NHS在有机溶剂中反应的条件为15~30℃、避光条件下搅拌反应12~14h。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的制备方法,其特征在于,所述一号反应液与二号反应液反应具体为:将一号反应液滴入二号反应液,在15~30℃、避光条件下搅拌反应30~60min,然后在3~5℃、避光条件下搅拌反应46~50h。
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