CN108084259A - 一种松香酸人工抗原的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种松香酸人工抗原的合成方法，其包括以下步骤：以12‑羟基松香酸(12‑HA)为半抗原，通过两步1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺(DEC)催化反应，以己二酸(AA)为偶联臂，分别与血蓝蛋白(KLH)和牛血清蛋白(BSA)偶联，合成松香酸人工抗原12‑HA‑AA‑KLH和12‑HA‑AA‑BSA。运用本发明所述合成方法制得的松香酸人工抗原免疫家兔获得的多克隆抗体具有理想的效价，可以用于畜禽肉制品中松香残留的ELISA方法的建立。
Description
技术领域
本发明涉及一种松香酸人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
松香是松树含油树脂蒸去松节油后得到的透明固体物质，是用于制造肥皂、纸张、油漆涂料等的重要化工原料。松香酸是松香的主要成分，可导致哮喘、皮肤过敏，毒理学研究表明，可引起人体肺泡上皮细胞细胞溶解，具有损伤DNA的活性。
松香加热熔融后具有良好的粘附特性，曾广泛用于鸭、鹅等水禽屠宰以及猪头(爪)等的二次脱毛加工。2009年，我国颁布《食品安全法》，禁止在畜禽屠宰加工过程中使用松香，并且推荐使用其替代品松香甘油酯。松香甘油酯是松香和甘油酯化反应的产物，但价格相对较高，脱毛效果不太理想。中小畜禽屠宰企业受利益驱动、违禁使用松香加工畜禽的现象依然十分严重，采用松香脱毛加工后，松香主要成分松香酸会残留在畜禽表皮组织中。因此，建立并实施畜禽肉制品中松香酸残留的检测方法标准，对于规范畜禽屠宰加工、确保畜禽肉制品质量安全，具有十分重要的意义。
松香的主要成分松香酸、脱氢松香酸可以通过用仪器分析方法(如HPLC-UV，LC-MS等)进行检测，但存在手续繁琐、效率低及设备昂贵等缺点。酶联免疫分析(ELISA)技术具有简便、快捷、通量高等优点，已广泛应用于化学污染物的快速分析中。目前，尚没有针对畜禽加工肉制品中松香残留的ELISA的研究报道。
松香酸是不具备免疫原性的半抗原，可以利用其羧基(-COOH)直接或间接与载体蛋白(如KLH、BSA等)偶联，转变为完全抗原。但是，松香酸与松香酸甘油酯(松香甘油酯的主要成分)的区别在于羧基是否酯化(见图1)。通过羧基与载体蛋白进行偶联、并以此为抗原免疫家兔，制备的多克隆抗体将无法区别松香酸和松香酸甘油酯。按照我国《食品安全法》规定，松香不能用于畜禽屠宰加工，但其衍生物松香甘油酯可以用于畜禽二次脱毛工艺。因此，通过保留松香酸的羧基不被酯化、并与载体蛋白偶联制备完全抗原，在此基础上获得能够区别松香酸和松香酸甘油酯的多克隆抗体，是建立畜禽加工肉制品中松香酸残留ELISA方法的前提。基于这样的要求，发明人以12-羟基松香酸(12-HA)为半抗原，开展了松香人工抗原合成的研究工作。
12-HA与松香酸的区别在于12位上有无羟基(见图1)。利用羟基(-OH)通过适当偶联臂与载体蛋白进行偶联，同时保留松香酸骨架上的羧基(-COOH)不被改变，使得免疫制备的多克隆抗体有效区别松香酸和松香酸甘油酯成为可能。含有羟基的半抗原与载体蛋白的偶联反应主要包括：琥珀酸酐法、氰脲酰氯法和N，N′-羰基二咪唑法等，其中以琥珀酸酐法更为常见。发明人前期以12-HA为半抗原、KLH和BSA为载体蛋白，通过琥珀酸酐法合成了完全抗原，但免疫家兔获得的多克隆抗体效价不理想。在此基础上，发明人选择更长碳链的己二酸作为偶联臂，采用己二酸先与蛋白偶联、再与12-HA反应的方法，成功合成了完全抗原12-HA-AA-KLH和12-HA-AA-BSA。应用12-HA-AA-KLH作为免疫抗原获得的多克隆抗体具有理想的效价，可以用于畜禽肉制品中松香残留的ELISA方法的建立。
发明内容
本发明的目的在于：本发明的目的是提供一种松香酸人工抗原的合成方法。所制备的产品为畜禽肉制品中松香残留ELISA方法的建立提供必需的人工抗原，建立的ELISA分析方法可以有效地排除松香甘油酯残留的干扰。
本发明技术方案是：一种松香酸人工抗原的合成方法，其特征在于以12-羟基松香酸(12-HA)为半抗原，通过两步1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(DEC)催化反应，以己二酸(AA)为偶联臂，分别与血蓝蛋白(KLH)和牛血清蛋白(BSA)偶联，制得松香酸人工抗原12-HA-AA-KLH和12-HA-AA-BSA。用荧光光谱仪分析半抗原和人工抗原的荧光光谱，用三硝基苯磺酸滴定法对人工抗原的偶联比进行测定。
合成路线示意图见图2。
工艺步骤为：
1、载体蛋白的己二酸一酰化
按KLH∶AA∶DEC＝1∶10∶3的质量比称取相应的药品，KLH预先用无水二甲基甲酰胺(DMF)溶解，室温搅拌下缓慢加入AA和DEC，在室温下搅拌过夜。反应液转移至透析袋，在蒸馏水中透析48h，期间更换蒸馏水(4×2L)。透析过的溶液冻干，得到己二酸一酰化钥孔血蓝蛋白(AA-KLH)。
按上述方法制备己二酸一酰化牛血清蛋白(AA-BSA)，其中BSA∶AA∶DEC＝1∶4∶2(质量比)。
2、偶联
按12-HA∶AA-KLH∶DEC＝1∶2.5∶3的质量比称取相应的药品，将AA-KLH用无水DMF溶解，然后加入12-HA和DEC，在室温下搅拌过夜。反应液转移至透析袋，在蒸馏水中透析48h，期间更换蒸馏水(4×2L)。透析过的溶液冻干，得到12-HA-AA-KLH。
按上述方法制备12-HA-AA-BSA，其中12-HA∶AA-BSA∶DEC＝1∶3∶3(质量比)。
3、人工抗原的光谱分析及其偶联比测定
(1)人工抗原的荧光光谱分析
采用荧光光谱仪分析载体蛋白(KLH、BSA)和人工抗原(12-HA-AA-KLH和12-HA-AA-BSA)的荧光光谱。
(2)人工抗原偶联比测定
采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)比色法测定12-HA-AA-KLH和12-HA-AA-BSA的偶联比。
①标准曲线的建立
以L-缬氨酸作为活性氨基的标准物质，用4％(w/w)Na2CO3溶液配制10、20、50、100、150、200μmol/L系列L-缬氨酸标准溶液。取1mL标准溶液与1mL 0.1％(w/w)TNBS溶液混匀，40℃恒温水浴避光反应2h，于420nm处测定吸光值(OD)。以L-缬氨酸溶液浓度为自变量，OD为因变量，制标准曲线或回归方程。
②偶联比的测定
分别称取适量的载体蛋白和人工抗原，用一定量的4％(w/w)Na2CO3溶液溶解。分别吸取1mL与1mL 0.1％(w/w)TNBS溶液混匀，40℃恒温水浴避光反应2h，于420am处测定OD。分别从制标准曲线或回归方程计算对应的活性氨基浓度A和B。
人工抗原偶联比＝(A/W1-B/W2)×V×M×10-6…………………………(1)
其中：A、B分别为载体蛋白和人工抗原溶液的活性氨基(μmol/L)；W1、W2分别为载体蛋白和人工抗原的称样量(mg)；V为溶解载体蛋白和人工抗原的4％(w/w)Na2CO3溶液量(mL)；M为载体蛋白的分子量，KLH：400000，BSA：66430。
本发明的有益效果：本发明成功合成了松香酸的人工抗原，合成步骤简洁、有效，可用于免疫分析，为进一步开展畜禽肉制品中松香残留的免疫分析技术研究提供了方便的途径。
附图说明
图1为本发明所述松香酸人工抗原合成方法中的松香酸甘油酯、松香酸和12-羟基松香酸结构式；
图2为本发明所述松香酸人工抗原合成方法中的松香酸人工抗原合成路线图(KLH：血蓝蛋白；BSA：牛血清蛋白；AA：己二酸；12-HA：12-羟基松香酸；DEC：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)；
图3为本发明所述松香酸人工抗原合成方法中实施例的KLH和DHAM-SUC-KLH的荧光光谱(蛋白浓：KLH及全抗浓度均为0.2mg/ml；激发波长225nm；扫描250～450nm)；
图4为本发明所述松香酸人工抗原合成方法中实施例的BSA和DHAM-SUC-BSA的荧光光谱(蛋白浓度：BSA及全抗浓度均为20μg/mL；激发波长225nm；扫描250～450nm)。
具体实施方式
1、载体蛋白的己二酸一酰化
(1)KLH的己二酸一酰化
按KLH∶AA∶DEC＝1∶10∶3的质量比，分别称取50mg KLH、500mgAA和150mgDEC。KLH预先用无水二甲基甲酰胺(DMF)溶解，室温搅拌下缓慢加入AA和DEC，在室温下搅拌过夜。反应液转移至透析袋，在蒸馏水中透析48h，期间更换蒸馏水(4×2L)。透析过的溶液冻干，得到AA-KLH(47.6mg)。
(2)BSA的琥珀酸一酰化
按BSA∶AA∶DEC＝1∶4∶2的质量比，分别称取125mg BSA、500mg SUC和250mgDEC，BSA预先用无水二甲基甲酰胺(DMF)溶解，室温搅拌下缓慢加入AA和DEC，在室温下搅拌过夜。反应液转移至透析袋，在蒸馏水中透析48h，期间更换蒸馏水(4×2L)。透析过的溶液冻干，得到AA-BSA(112.4mg)。
2、偶联
(1)12-HA和AA-KLH的偶联
按12-HA∶SUC-KLH∶DEC＝1∶2.5∶3的质量比，分别称取8mg12-HA、20mg SUC-KLH和24mg DEC。将AA-KLH用5mL无水DMF溶解，然后加入12-HA和DEC，在室温下搅拌过夜。反应液转移至透析袋，在蒸馏水中透析48h，期间更换蒸馏水(4×2L)。透析过的溶液冻干，得到12-HAA-SUC-KLH(21.5mg)。
(2)12-HA和AA-BSA的偶联
按12-HA∶AA-BSA∶DEC＝1∶3∶3的质量比，分别称取8mg 12-HA、24mg AA-BSA和24mgDEC。将AA-BSA用5mL无水DMF溶解，然后加入12-HA和DEC，在室温下搅拌过夜。反应液转移至透析袋，在蒸馏水中透析48h，期间更换蒸馏水(4×2L)。透析过的溶液冻干，得到12-HA-AA-BSA(24.6mg)。
3、人工抗原的荧光光谱分析
分别称取10mg的载体蛋白和人工抗原，用50％(v/v)甲醇水溶液配制浓度为20μg/mL的BSA和12-HA-AA-BSA、以及浓度为0.2mg/mL的KLH和12-HA-AA-KLH，然后进行荧光光谱分析。激发波长：225nm，扫描范围：250-450nm。
图3、图4分别是KLH和12-HA-AA-KLH、BSA和12-HA-AA-BSA荧光光谱图。12-HA通过AA与BSA和KLH上的游离伯氨基发生反应，导致蛋白上的游离胺基数减少、荧光强度下降，表明偶联成功。
4、12-HA-AA-KLH和12-HA-AA-BSA偶联比的测定
采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)比色法测定偶联比：
(1)标准曲线的建立
以L-缬氨酸作为活性氨基的标准物质，用4％(w/w)Na2CO3溶液配制10、20、50、100、150、200μmol/L系列L-缬氨酸标准溶液。取1mL标准溶液与1mL 0.1％(w/w)TNBS溶液混匀，40℃恒温水浴避光反应2h，于420nm处测定吸光值(OD)。以L-缬氨酸溶液浓度为自变量(x)，OD为因变量(y)，得回归方程：
y＝0.0155x-0.0112(r2＝0.9972)
(2)偶联比的测定
①12-HA-AA-KLH的偶联比
分别称取15mg的KLH和12-HA-AA-KLH，用50mL4％(w/w)Na2CO3溶液溶解。分别吸取1mL与1mL 0.1％(w/w)TNBS溶液混匀，40℃恒温水浴避光反应2h，于420nm处测定OD分别为1.104和0.858。分别从标准曲线查得对应的活性氨基浓度分别为71.9μmol/L和56.1μmol/L。
按公式(1)计算12-HA-AA-KLH的偶联比为21。
③12-HA-AA-BSA的偶联比
分别称取20mg的BSA和12-HA-AA-BSA，用250mL4％(w/w)Na2CO3溶液溶解。分别吸取1mL与1mL0.1％(w/w)TNBS溶液混匀，40℃恒温水浴避光反应2h，于420nn处测定OD分别为0.998和0.756。分别从标准曲线查得对应的活性氨基浓度分别为65.2μmol/L和49.5μmol/L。
按公式(1)计算12-HA-AA-BSA的偶联比为13。
4、免疫家兔产生多克隆抗体
(1)免疫
新西兰白兔(约1.5kg)每只皮下注射2.0mL的12-HA-AA-KLH(1.75mg溶于1.0mL含有0.25mL DMSO的PBS，然后用1.25ml弗氏完全佐剂乳化)。在第21，38和50天，每只新西兰白兔采血2mL观察抗体产生情况。每次采血同时，肌肉注射1.0mL的12-HA-AA-KLH(1.0mg溶于0.5mL含有0.25mLDMSO的PBS，然后用0.75mL弗氏不完全佐剂乳化)。抗血清效价采用间接ELISA测定，其中12-HA-AA-BSA用作包被抗原。
(2)抗体效价的测定
将12-HA-AA-BSA包被抗原用碳酸缓冲液(pH 9.6)稀释成2.0μg/mL，包被96孔板，4℃条件孵育过夜，洗板3次；加入倍比稀释好的抗体，每孔100μL，37℃条件孵育1h，洗板3次；加入羊抗兔IgG-HRP，每孔100μL，37℃条件孵育40min，洗板3次；加入显色液各50μL，37℃条件显色10min，每孔加50μL终止液(2M H2SO4)，然后用酶标仪测定450nm处的吸光值。以S/N≥2.1所对应的最大稀释倍数为阳性血清的抗体效价，其中S为阳性血清的D450nm，N为阴性血清的D450nm。结果为256,000，表明该血清(抗体)具有理想的效价，可用于畜禽肉制品中松香残留免疫分析技术的进一步研究中。
Claims (1)
1.一种松香酸人工抗原的合成方法，其特征在于以12-羟基松香酸(12-HA)为半抗原，通过两步1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(DEC)催化反应，以己二酸(AA)为偶联臂，分别与血蓝蛋白(KLH)和牛血清蛋白(BSA)偶联，制得松香酸人工抗原12-HA-AA-KLH和12-HA-AA-BSA。步骤为：
1、载体蛋白的己二酸一酰化
按KLH∶AA∶DEC＝1∶10∶3的质量比称取相应的药品，KLH预先用无水二甲基甲酰胺(DMF)溶解，室温搅拌下缓慢加入AA和DEC，在室温下搅拌过夜。反应液转移至透析袋，在蒸馏水中透析48h，期间更换蒸馏水(4×2L)。透析过的溶液冻干，得到己二酸一酰化钥孔血蓝蛋白(AA-KLH)。
按上述方法制备己二酸一酰化牛血清蛋白(AA-BSA)，其中BSA∶AA∶DEC＝1∶4∶2(质量比)。
2、偶联
按12-HA∶AA-KLH∶DEC＝1∶2.5∶3的质量比称取相应的药品，将AA-KLH用无水DMF溶解，然后加入12-HA和DEC，在室温下搅拌过夜。反应液转移至透析袋，在蒸馏水中透析48h，期间更换蒸馏水(4×2L)。透析过的溶液冻干，得到12-HA-AA-KLH。
按上述方法制备12-HA-AA-BSA，其中12-HA∶AA-BSA∶DEC＝1∶3∶3(质量比)。
3、人工抗原的光谱分析及其偶联比测定
采用荧光光谱仪分析载体蛋白(KLH、BSA)和人工抗原(12-HA-AA-KLH和12-HA-AA-BSA)的荧光光谱，采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)比色法测定12-HA-AA-KLH和12-HA-AA-BSA的偶联比。
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