CN112578112A - 一种808猩红胶体金检测卡及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种808猩红胶体金检测卡及其制备方法，包括底板，底板的顶端表面设置有依次相连接的有样品垫、免疫胶体金结合垫、免疫硝酸纤维膜和吸水垫，免疫胶体金结合垫含有胶体金标记的抗猩红单克隆抗体，免疫硝酸纤维膜上设置有检测线和质控线。本发明灵敏性高、操作简单方便，大大缩短了检测时间，为现场检测提供了方便，可对工厂、食品卫生质检部门、海关等中药材、中药饮片及食品进行808猩红成分的快速抽查。

Description

一种808猩红胶体金检测卡及其制备方法
技术领域
本发明属于中药材、中药饮片及中药制剂安全检测领域，涉及中药材、中药饮片及中药制剂中非法添加物的检测方法，特别涉及一种808猩红胶体金检测卡及其制备方法。
背景技术
808猩红(808Scarlet)为常用的染色剂之一。808猩红为偶氮类红色化工染料，常用于涂料、油墨、油漆、皮革等化工产品的着色，并非食用色素，其在机体内经生物转化分解，可形成致癌物，具有强致癌和致突变性。
随着近年来对中医药研究的深入，中药材、中药饮片及中药制剂的使用日趋广泛，但是却对中药材质量带来了挑战。采用化工染料对中药材染色的问题屡有报道。其中808猩红主要红色药材的染色，曾发现被用于朱砂、血竭、红花等中药材、中药饮片及其制剂的非法染色。病人在不知情的情况下长期使用，容易引起暂时性或持久性的病理状态，甚至危及生命，故在中药材、中药饮片和中成药中均不得检出。
目前对于中药材中非法添加808猩红的检测，主要采用薄层色谱法(TLC法)、高效液相色谱法(HPLC法)、高效液相色谱串联紫外检测(HPLC-PAD法)、高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)二级质谱对样品进行确认。高效液相色谱及液质联用色谱等方法是最先进的现代分析手段，能够很好的分离检测808猩红，并且达到一个很低的检测限，灵敏度非常高。采用标准品对照法，可以非常精确的检测出样本中808猩红的含量。
另外，市面上还未发现有808猩红的快检试剂盒，若采用上述实验方法，操作过程都比较复杂，实验时间长、实验成本高，且并不适用于现场检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种808猩红胶体金检测卡及其制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明提供了一种808猩红胶体金检测卡及其制备方法，包括底板，所述底板的顶端表面设置有依次相连接的有样品垫、免疫胶体金结合垫、免疫硝酸纤维膜和吸水垫，所述免疫胶体金结合垫含有胶体金标记的抗808猩红单克隆抗体，所述免疫硝酸纤维膜上设置有检测线和质控线。
作为本发明的一种优选技术方案，所述检测线包被有808猩红-牛血清白蛋白复合物，所述质控线包被有羊抗兔IgG。
本发明还提供了一种808猩红胶体金检测卡制备方法，该制备方法包括以下步骤：
步骤一，制作抗体，采用杂交瘤技术制备抗808猩红单克隆抗体，并采用亲和纯化法对所得抗体进行纯化；
步骤二，制备胶体金溶液，并将胶体金溶液PH值调至为8-9；
步骤三，用步骤二所得的胶体金标记抗808猩红单克隆抗体，得到胶体本金标记的抗808猩红单克隆抗体；
步骤四，制备免疫胶体金结合垫，采用玻璃纤维纸作为胶体金结合垫，将步骤二所得的胶体金溶液进行稀释后放入玻璃纤维纸，浸泡3min后取出在35-40℃的环境下烘干；
步骤五，将808猩红-牛血清白蛋白复合物和羊抗兔IgG分别喷在硝酸纤维素膜检测线和质控线的位置上，烘干备用，制得免疫硝酸纤维素膜；
步骤六，制备样品垫，采用玻璃纤维纸浸泡在处理液中5min后取出烘干；
步骤七，将样品垫、胶体金结合垫、免疫硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在底板上，制得试剂条后进行组装。
可选地，步骤二的胶体金溶液具体制备方法为：取300mL三角烧瓶一个，加100mL双蒸水及1mL1％氯化金溶液，用0.22μm滤膜过滤，加热沸腾，之后取4mL1％柠檬酸三钠，加入等量的0～5mL1％鞣酸和0～5mL25mmol/LK2CO3，于此温度下保持一定时间，待溶液颜色变成深红色后，将溶液加热至沸腾，保持沸腾一定时间，取下三角烧瓶冷却至室温，并用双蒸水补充至原体积，制备成酒红色的胶体金溶液，经0.22μm滤膜过滤后在4℃下保存，紫外扫描得到最大吸收峰为600nm的胶体金颗粒。
可选地，胶体金颗粒大小为20-30nm。
可选地，步骤五中808猩红-牛血清白蛋白复合物和羊抗兔IgG的浓度分别为1.3ml/mL和0.8mg/mL。
可选地，步骤五中检测线包被时的缓冲液配方成分为0.09mTris缓冲液、0.3％牛血清白蛋白、0.5％聚乙二醇20000、0.06％叠氮化钠，用盐酸调节PH值至7.5±0.05；质控线包被时的缓冲液配方成分为0.09mPBS缓冲液、0.3％牛血清白蛋白、0.5％聚乙二醇20000、0.1％叠氮化钠。
可选地，步骤六中处理液为0.01M PBS、pH7.4、1％Triton X-100、1％BSA，0.09％NaN3，玻璃纤维纸取出后在放置于网格托架上，采用鼓风机加热至38℃快速干燥，烘干后的玻璃纤维纸裁切成多片3cm*10cm的长条，玻璃纤维纸边沿1cm处均弃置不用，避免产生边缘效应。
可选地，步骤七中组装所用材料为塑料外壳，且塑料外壳的表面设置有加样孔和观察窗。
可选地，加样孔位于样品垫上方，观察窗位于免疫硝酸纤维素膜上方。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明灵敏性高、操作简单方便，大大缩短了检测时间，为现场检测提供了方便，可对工厂、食品卫生质检部门、海关等中药材、中药饮片及食品进行808猩红成分的快速抽查。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明的整体结构示意图；
图2是本发明的检测结果显示图；
图中：1、底板；2、样品垫；3、免疫胶体金结合垫；4、免疫硝酸纤维膜；5、吸水垫；6、检测线；7、质控线。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
如图1所示，本发明提供一种808猩红胶体金检测卡及其制备方法，包括底板1，底板1的顶端表面设置有依次相连接的有样品垫2、免疫胶体金结合垫3、免疫硝酸纤维膜4和吸水垫5，免疫胶体金结合垫3含有胶体金标记的抗808猩红单克隆抗体，免疫硝酸纤维膜4上设置有检测线6和质控线7。
进一步的，检测线6包被有808猩红-牛血清白蛋白复合物，质控线7包被有羊抗兔IgG。
本发明还提供了一种808猩红胶体金检测卡制备方法，该制备方法包括以下步骤：
步骤一，制作抗体，采用杂交瘤技术制备抗808猩红单克隆抗体，并采用亲和纯化法对所得抗体进行纯化；
步骤二，制备胶体金溶液，并将胶体金溶液PH值调至为8-9；
步骤三，用步骤二所得的胶体金标记抗808猩红单克隆抗体，得到胶体本金标记的抗808猩红单克隆抗体；
步骤四，制备免疫胶体金结合垫，采用玻璃纤维纸作为胶体金结合垫，将步骤二所得的胶体金溶液进行稀释后放入玻璃纤维纸，浸泡3min后取出在35-40℃的环境下烘干；
步骤五，将808猩红-牛血清白蛋白复合物和羊抗兔IgG分别喷在硝酸纤维素膜检测线和质控线的位置上，烘干备用，制得免疫硝酸纤维素膜；
步骤六，制备样品垫，采用玻璃纤维纸浸泡在处理液中5min后取出烘干；
步骤七，将样品垫、胶体金结合垫、免疫硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在底板上，制得试剂条后进行组装。
可选地，步骤二的胶体金溶液具体制备方法为：取300mL三角烧瓶一个，加100mL双蒸水及1mL1％氯化金溶液，用0.22μm滤膜过滤，加热沸腾，之后取4mL1％柠檬酸三钠，加入等量的0～5mL1％鞣酸和0～5mL25mmol/LK2CO3，于此温度下保持一定时间，待溶液颜色变成深红色后，将溶液加热至沸腾，保持沸腾一定时间，取下三角烧瓶冷却至室温，并用双蒸水补充至原体积，制备成酒红色的胶体金溶液，经0.22μm滤膜过滤后在4℃下保存，紫外扫描得到最大吸收峰为600nm的胶体金颗粒。
可选地，胶体金颗粒大小为20-30nm。
可选地，步骤五中808猩红-牛血清白蛋白复合物和羊抗兔IgG的浓度分别为1.3ml/mL和0.8mg/mL。
可选地，步骤五中检测线包被时的缓冲液配方成分为0.09mTris缓冲液、0.3％牛血清白蛋白、0.5％聚乙二醇20000、0.06％叠氮化钠，用盐酸调节PH值至7.5±0.05；质控线包被时的缓冲液配方成分为0.09mPBS缓冲液、0.3％牛血清白蛋白、0.5％聚乙二醇20000、0.1％叠氮化钠。
可选地，步骤六中处理液为0.01M PBS、pH7.4、1％Triton X-100、1％BSA，0.09％NaN3，玻璃纤维纸取出后在放置于网格托架上，采用鼓风机加热至38℃快速干燥，烘干后的玻璃纤维纸裁切成多片3cm*10cm的长条，玻璃纤维纸边沿1cm处均弃置不用，避免产生边缘效应。
可选地，步骤七中组装所用材料为塑料外壳，且塑料外壳的表面设置有加样孔和观察窗。
可选地，加样孔位于样品垫上方，观察窗位于免疫硝酸纤维素膜上方
具体的，取待检测的供试品9g，剪碎加入硅藻土4.5g，研匀后取9g，加三氯甲烷20ml，超声处理20分钟，滤过后将滤液蒸干，残渣加入甲醇2ml使溶解，用微孔滤膜(0.45um)滤过，取续滤液，即得供试品溶液备用；将检测卡平放于稳定工作台面，检测卡表面对应检测线6的位置设置有字母“T”，对应质控线7的位置设置有字母“C”，用过加样吸管吸取供试品溶液，向检测卡得加样孔当中加入100微升的供试品溶液，静置5-10分钟后读取结果，试剂卡内的检测试剂条是实现808猩红检测的关键，在试剂条检测线6包被了808猩红-牛血清白蛋白复合物；在试剂条的免疫胶体金结合垫3上固定有胶体本金标记的抗808猩红单克隆抗体，当样品提取液从加样孔加入，渗透到试剂条的样品垫2上，被检样本首先与免疫胶体金结合垫3上固定有胶体本金标记的抗808猩红单克隆抗体，并通过毛细作用继续层析至免疫硝酸纤维素膜4，顺序通过免疫硝酸纤维素膜4上喷点了808猩红-牛血清白蛋白复合物的检测线和羊抗兔IgG的质控线，如果样品提取液中含有808猩红，它们将与胶体本金标记的抗808猩红单克隆抗体上有限的抗原结合位点，当808猩红浓度达到产品设计的阈值浓度以上时，它们将占据抗808猩红单克隆抗体上全部的抗原结合位点，这样就阻止了胶体金标记的抗808猩红单克隆抗体和检测线6的808猩红-牛血清白蛋白复合物结合，检测线不能捕获到胶体金颗粒而无红色色带出现，检测结果呈阳性；如果样品提取液中没有808猩红或808猩红的浓度低于阈值浓度，则抗808猩红单克隆抗体胶体金随同样品提取液运行至检测线，检测线捕获到胶体金颗粒而呈现红色色带，检测结果呈阴。
检测结果判定：
若检测线6和质控线7均显色，检测结果判定为阴性，表明样本中不含有808猩红或808猩红含量低于检测限；
若检测线6不显色而质控线7显色，检测结果判定为阳性，表明样本中水产品激素含量等于或高于检测限；
若质控线6不显色，则表示检测结果无效，表明不正确的操作或检测卡已过期失效，需要重新检测。
本发明灵敏性高、操作简单方便，大大缩短了检测时间，为现场检测提供了方便，可对工厂、食品卫生质检部门、海关等中药材、中药饮片及食品进行808猩红成分的快速抽查。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种808猩红胶体金检测卡，包括底板(1)，其特征在于，所述底板(1)的顶端表面设置有依次相连接的有样品垫(2)、免疫胶体金结合垫(3)、免疫硝酸纤维膜(4)和吸水垫(5)，所述免疫胶体金结合垫(3)含有胶体金标记的抗808猩红单克隆抗体，所述免疫硝酸纤维膜(4)上设置有检测线(6)和质控线(7)。
2.根据权利要求1所述的一种808猩红胶体金检测卡，其特征在于，所述检测线(6)包被有808猩红-牛血清白蛋白复合物，所述质控线(7)包被有羊抗兔IgG。
3.一种808猩红胶体金检测卡的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
步骤一，制作抗体，采用杂交瘤技术制备抗808猩红单克隆抗体，并采用亲和纯化法对所得抗体进行纯化；
步骤二，制备胶体金溶液，并将胶体金溶液PH值调至为8-9；
步骤三，用步骤二所得的胶体金标记抗808猩红单克隆抗体，得到胶体本金标记的抗808猩红单克隆抗体；
步骤四，制备免疫胶体金结合垫，采用玻璃纤维纸作为胶体金结合垫，将步骤二所得的胶体金溶液进行稀释后放入玻璃纤维纸，浸泡3min后取出在35-40℃的环境下烘干；
步骤五，将808猩红-牛血清白蛋白复合物和羊抗兔IgG分别喷在硝酸纤维素膜检测线和质控线的位置上，烘干备用，制得免疫硝酸纤维素膜；
步骤六，制备样品垫，采用玻璃纤维纸浸泡在处理液中5min后取出烘干；
步骤七，将样品垫、胶体金结合垫、免疫硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在底板上，制得试剂条后进行组装。
4.根据权利要求3所述的一种808猩红胶体金检测卡制备方法，其特征在于，步骤二的胶体金溶液具体制备方法为：取300mL三角烧瓶一个，加100mL双蒸水及1mL1％氯化金溶液，用0.22μm滤膜过滤，加热沸腾，之后取4mL1％柠檬酸三钠，加入等量的0～5mL1％鞣酸和0～5mL25mmol/LK2C03，于此温度下保持一定时间，待溶液颜色变成深红色后，将溶液加热至沸腾，保持沸腾一定时间，取下三角烧瓶冷却至室温，并用双蒸水补充至原体积，制备成酒红色的胶体金溶液，经0.22μm滤膜过滤后在4℃下保存，紫外扫描得到最大吸收峰为600nm的胶体金颗粒。
5.根据权利要求4所述的一种808猩红胶体金检测卡制备方法，其特征在于，胶体金颗粒大小为20-30nm。
6.根据权利要求3所述的一种808猩红胶体金检测卡及其制备方法，其特征在于，步骤五中808猩红-牛血清白蛋白复合物和羊抗兔IgG的浓度分别为1.3ml/mL和0.8mg/mL。
7.根据权利要求3所述的一种808猩红胶体金检测卡及其制备方法，其特征在于，步骤五中检测线包被时的缓冲液配方成分为0.09mTris缓冲液、0.3％牛血清白蛋白、0.5％聚乙二醇20000、0.06％叠氮化钠，用盐酸调节PH值至7.5±0.05；质控线包被时的缓冲液配方成分为0.09mPBS缓冲液、0.3％牛血清白蛋白、0.5％聚乙二醇20000、0.1％叠氮化钠。
8.根据权利要求3所述的一种808猩红胶体金检测卡及其制备方法，其特征在于，步骤六中处理液为0.01M PBS、pH7.4、1％Triton X-100、1％BSA，0.09％NaN3，玻璃纤维纸取出后在放置于网格托架上，采用鼓风机加热至38℃快速干燥，烘干后的玻璃纤维纸裁切成多片3cm*10cm的长条，玻璃纤维纸边沿1cm处均弃置不用，避免产生边缘效应。
9.根据权利要求3所述的一种808猩红胶体金检测卡及其制备方法，其特征在于，步骤七中组装所用材料为塑料外壳，且塑料外壳的表面设置有加样孔和观察窗。
10.根据权利要求9所述的一种808猩红胶体金检测卡及其制备方法，其特征在于，加样孔位于样品垫上方，观察窗位于免疫硝酸纤维素膜上方。
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