CN111781351B - 用于新型冠状病毒抗原定量检测的电化学免疫层析试纸条及其制备方法 - Google Patents

用于新型冠状病毒抗原定量检测的电化学免疫层析试纸条及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于新型冠状病毒抗原快速定量检测的电化学免疫层析试纸条及其制备方法，以双抗体夹心免疫反应为基础，利用金铂核壳纳米粒子Au@PtNPs具有类似辣根过氧化物酶的催化活性，将其标记到二抗（antibody2,Ab2）上作为电化学信号探针Au@PtNPs‑Ab2。利用侧流免疫层析反应迅速、分离方便的特点，制备了一种集成化的用于人血清新型冠状病毒抗原快速、定量检测的电化学侧流免疫层析试纸条。免疫反应后，加辣根过氧化物酶底物溶液，采用方波伏安法（SWV）测量在检测区被捕获的Au@PtNPs‑Ab2探针所产生的电流信号，实现对COVID‑19抗原的定量检测。所制备的基于低成本、高性能Au@PtNPs‑Ab2信号探针的电化学侧流免疫层析试纸可为快速和定量即时检测在COVID‑19的诊断方面提供新的方法。

Description

用于新型冠状病毒抗原定量检测的电化学免疫层析试纸条及 其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学传感技术领域，具体涉及便携式用于新型冠状病毒抗原定量检测的电化学免疫层析试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
目前临床诊断COVID-19的最常用手段是通过采集鼻咽部分泌物或血液样本，从中分离提取出病毒的遗传物质RNA，进行实时荧光RT-PCR检测。虽然核酸检测是临床确诊COVID-19的金标准，但是由于实施核酸检测需要有专门的仪器和标准的分子检测实验室，对设备场地和操作人员要求极高、操作繁琐、耗时长，并且检测人员感染风险较高。这也意味着核酸检测无法在采集的地方对样本进行分析处理，且需要对样本进行运输，而核酸样本对保存条件的要求也非常苛刻，在保存运输的过程中RNA极易裂解，影响到核酸检测的精度。此外，在大量临床应用过程中发现核酸检测还存在“假阴性”结果，这些都使得其不易完全做到早期临床诊断，也不能满足大面积筛查诊断的要求。因此，开发出新的COVID-19筛查诊断技术将有利于推动本次及今后的疫情防控工作。
侧流免疫层析技术是将层析技术与免疫分析技术结合起来的一种新技术，具有用户操作友好、分析时间短、成本低、耗样量少、多种分析物联合检测以及不需要专业技术人员等等优势，为蛋白质的分析和临床诊断提供了一种新的有效、可实现的POCT途径。和核酸检测相比，基于抗体或抗原检测的侧流层析技术可实现数分钟内出结果，不需要专业人士操作，具有成本低廉、操作简单方便，适用于大批量样本的现场快速筛查。
新冠病毒感染人体后会利用宿主的细胞制造大量的病毒蛋白，这些蛋白也会从感染的细胞中释放出来，因此，针对病毒抗原检测试剂便可用于带毒者的早期筛查和疑似患者的鉴别诊断。早期病毒性抗原检测不仅可以有效缩短抗体测定中的窗口期，还可与核酸检测试剂联合使用大大提高COVID-19的筛查或排查率。目前大多数有关侧流免疫层析试纸都是以定性或半定量的AuNPs和有机染料作为信号标记物，尽管这些基于光学检测的侧流免疫层析测试条仍是时下非常流行的POCT工具，但是由于灵敏度的限制其只能给出定性的检测结果。
发明内容
为克服上述现有技术所存在的上述不足之处，本发明的目的是提供一种用于新型冠状病毒（COVID-19）定量快速检测的电化学免疫层析试纸条及其制备方法。本发明既保留了传统胶体金试纸条的现场快速检测优点，又加入了电化学检测技术的高灵敏度、宽测量范围和仪器设备简单等特点，成为提高免疫层析方法检测性能的主要途径之一。
实现本发明目的的技术方案是：
一种用于COVID-19抗原定量检测的电化学免疫层析试纸条，其包括底板，以及依次组装在该底板上的纸丝网印刷电极（纸SPEs）、硝酸纤维素膜（NC膜）、结合垫、样品垫以及吸水垫；
其中纸SPEs装在底板的中部，NC膜装在纸SPEs的中部，样品垫装在NC膜的左侧、二者之间为结合垫；吸水垫装在NC膜的右侧；
其中，样品垫、结合垫、NC膜以及吸水垫的局部会相互叠加；
在所述结合垫上包被有金铂核壳纳米颗粒Au@PtNPs，在Au@PtNPs上标记有待检测物的标记抗体Ab2；
在NC膜上固定有待检测物的包被抗体Ab1。
所述底板为带胶的塑料底板，组装顺序为：从带胶塑料底板的左侧至右侧依次粘贴处理后的样品垫、处理后的结合垫、纸SPEs以及处理后的NC膜，最后粘合吸水垫。
所述底板为60 mm × 30 cm、所述样品垫为20 mm × 30 cm、结合垫为8 mm ×30 cm、NC膜为25 mm × 30 cm、吸水纸为20 mm × 30 cm，组装时各部分的接触区域相互叠压1~3 mm。
所述纸SPEs是由Whatman 1号滤纸所制，纸SPEs的疏水性区域是通过光刻技术制备而成的，详细过程如下：首先取2~5 mL的SU-8光刻胶均匀的分布于滤纸上，然后将设计好的紫外光掩膜版覆盖在滤纸上，于紫外曝光灯下曝光2~30 min；
接着将曝光后的滤纸于烘胶台上95℃烘烤3~10 min，再用10~30 mL的丙酮、异丙醇依次洗涤3~5次除去滤纸上未聚合的光刻胶；
最后形成了带图案的微流控纸基分析装置；
微流控纸基分析装置上聚合了光刻胶的区域形成了疏水性屏障，被疏水性屏障包围的没有被光刻胶覆盖的区域则形成了亲水性区域；
纸SPEs的工作部分印刷在亲水性区域，接触部分印刷在疏水性区域，首先印刷用作工作电极和对电极的碳墨，然后印刷用作参比电极和导电接触头的银/氯化银墨，每层印刷完后要在干燥箱干燥20~60 min，并在室温下冷却后再进行下一步。
所述Au@PtNPs的制备步骤如下：
（1）胶体金溶液的制备：
配置0.01%~0.05%的HAuCl4溶液，于磁力搅拌下加热回流至沸腾，快速加入1%~2%的柠檬酸三钠，待溶液变为酒红色，继续加热煮沸6~15 min，停止加热，自然冷却至室温后，制得胶体金溶液；所制备的胶体金溶液用0.22 μm的滤膜过滤，得AuNPs；
（2）Au@PtNPs的制备：
取1~5 mL 1% H2PtCl6溶液加入到上述AuNPs溶液中，并将0.1 M的抗坏血酸溶液逐滴加入，反应20 min后，溶液逐渐变成暗黑色，自然冷却至室温后用超纯水离心洗涤，即得Au@PtNPs；
（3）Ab2标记Au@PtNPs的制备
以Au@PtNPs为载体，通过物理吸附在其表面标记上COVID-19的标记抗体Ab2，获得标记有COVID-19标记抗体的Au@PtNPs-Ab2；
在干净的烧杯中加入5.0 mL~50.0 mL Au@PtNPs溶液，用0.1~0.2 M K2CO3把溶液pH调至最佳，逐滴加入Ab2，磁力搅拌混匀；逐滴加入1%牛血清白蛋白BSA稳定液，混匀；9000rpm~12000 rpm低温离心10~30 min，轻轻吸除上清；所得Au@PtNPs-Ab2沉淀溶于复溶液中，复溶液为含0.5%~2% BSA的0.05 M、pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液。
所述的电化学免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：
(1)样品垫的处理
样品垫是由血细胞过滤膜制备而成，使用前预先将样品垫在样品垫处理液中浸泡3h~6h后，37℃烘干，完成样品垫的处理；
样品垫处理液为含0.2%~1.0% 吐温-20、0.5%~1.0% BSA及0.5% ~1% PVP的0.05M、pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液；
(2)结合垫的处理
以玻璃纤维素膜为结合垫，将所得Au@PtNPs-Ab2标记抗体溶液用BIODOT点样仪的AIRJET喷头喷点在玻璃纤维素膜上，37℃晾干；
(3)NC膜的处理
将一定浓度的COVID-19包被抗体Ab1溶液用BIODOT点样仪在NC膜上的某一区域以1.0~2.0 μL/cm划线，37℃烘干，完成Ab1的包被；
(4)试纸条的组装
依次将包被Ab1的NC膜、固定Au@PtNPs-Ab2的结合垫、预处理的样品垫以及吸水垫依次组装在带胶的塑料底板上，为确保分析样品时溶液能顺利流过，各部分间有1~3 mm的重叠，将组装好的试纸条用切条机切成4.0 mm/条，然后将纸SPEs插入NC膜检测区的下方，制得电化学侧流免疫层析试纸条。
所述电化学免疫层析试纸条的检测方法，包括如下步骤：
将一定量含特定COVID-19抗原的样品溶液加到样品垫上，样品液可经样品垫、结合垫到达检测区，待免疫反应完成后，检测区形成了有红色条带的夹心免疫复合物(Au@PtNPs-Ab2)-COVID-19-Ab1；
然后，在检测区滴加电化学测试底液，反应5 min后，SWV记录反应结果；将所得SWV信号与标准信号曲线进行对比，实现对待检测试样中所含COVID-19抗原的定量检测；
SWV检测所用的电化学测试底液为含10.0 mM OPD和2.0 mM H2O2的柠檬酸缓冲液。
本发明电化学免疫层析试纸条，以双抗体夹心免疫反应为基础，利用金铂核壳纳米粒子Au@PtNPs具有类似辣根过氧化物酶的催化活性，将其标记到二抗（antibody2, Ab2）上作为电化学信号探针Au@PtNPs-Ab2。利用侧流免疫层析反应迅速、分离方便的特点，制备了一种集成化的用于人血清新型冠状病毒抗原快速、定量检测的电化学侧流免疫层析试纸条。免疫反应后，加辣根过氧化物酶底物溶液，采用方波伏安法（SWV）测量在检测区被捕获的Au@PtNPs-Ab2探针所产生的电流信号，实现对COVID-19抗原的定量检测。所制备的基于低成本、高性能Au@PtNPs-Ab2信号探针的电化学侧流免疫层析试纸可为快速和定量即时检测在COVID-19的诊断方面提供新的方法。
本发明的有益效果还体现在：
1. 本发明从提高检测灵敏度与缩短检测时间出发，将免疫层析技术与电化学分析技术优势相结合，提供一种方便快速的COVID-19抗原电化学免疫层析检测试纸条；
2、本发明结合免疫层析和电化学检测法检测样本中的COVID-19抗原；
3、本发明制备的Au@PtNPs-Ab2探针生物相容性好、灵敏度高、稳定性好，且受背景信号干扰少，将其与免疫层析试纸条结合，可以提高信噪比，增强灵敏度和稳定性，实现高灵敏度的定量检测；
4、本发明的层析试纸条检测方法，对待检测样品无需进行前处理，操作简单快捷，灵敏性较高，可现场操作，且结果准确性高。
附图说明
图1为本发明电化学免疫层析试纸条的结构示意图；
图中，纸丝网印刷电极1、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4、吸水垫5、塑料底板6、Au@PtNPs-Ab2标记抗体7、包被抗体8、碳工作电极9、碳对电极10、银/氯化银参比电极11、亲水性区域12、疏水性区域13、工作电极接触头14、对电极接触头15、参比电极接触头16。
图2 为本发明制备的Au@PtNPs的高倍透射电镜图。
图3 为本发明制备的电化学侧流免疫层析试纸检测不同浓度COVID-19抗原的电流响应：a~f, 0, 2.0, 7.5, 15, 25, 40 ng/mL。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步阐述，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明。
实施例1
一种用于新型冠状病毒抗原定量检测的电化学免疫层析试纸条，如图1所示，其包括塑料底板6，以及依次组装在该塑料底板6上的纸丝网印刷电极1、硝酸纤维素膜4、结合垫3、样品垫2以及吸水垫5；
纸丝网印刷电极1装在塑料底板6的中部，硝酸纤维素膜4装在纸丝网印刷电极1的中部，样品垫2装在硝酸纤维素膜4的左侧、二者之间为结合垫3；吸水垫5装在硝酸纤维素膜4的右侧；样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4以及吸水垫5的局部会相互叠加；
纸丝网印刷电极1的工作部分印刷在亲水性区域12，接触部分印刷在疏水性区域13；亲水性区域12印刷有碳工作电极9、碳对电极10、银/氯化银参比电极11；疏水性区域13印刷有工作电极接触头14、对电极接触头15、参比电极接触头16。
在所述结合垫3上固定有待检测物的Au@PtNPs-Ab2标记抗体7；
在硝酸纤维素膜4上固定有待检测物的Ab1包被抗体8。
实施例2
一种用于新型冠状病毒抗原快速定量检测的免疫层析试纸条的制备，包括如下过程：
1. 纸SPEs的制备：
（1）取2.5 mL的SU-8光刻胶，在匀胶机的作用下，将其均匀分布于Whatman 1号滤纸上。首先将覆盖了光刻胶的滤纸于烤胶台上95 ℃烘烤10 min，除去滤纸上的溶剂。然后将事先设计好的紫外光掩膜版覆盖在滤纸上，贴紧，于紫外曝光灯下曝光30 min。曝光后的滤纸再于烘胶台上95℃烘烤3 min，之后先用15 mL丙酮浸泡，再用15 mL异丙醇洗涤三次彻底除去滤纸表面未聚合的光刻胶，最后便形成了带图案的微流控纸基分析装置。
（2）纸SPEs的工作部分印刷在微流控纸基分析装置的亲水性区域，接触部分印刷在疏水性区域，首先印刷用作工作电极和对电极的碳油墨，然后印刷用作参比电极和导电接触头的银/氯化银油墨，每层印刷完后都要在60 ℃干燥30 min，并在室温下冷却后再进行下一步。
1.Au@PtNPs-Ab2电化学探针的制备：
（1）AuNPs的制备
配制0.01%的HAuCl4溶液100 mL，磁力搅拌下加热回流至沸腾。快速加入新鲜配置的1.5 mL 1%的柠檬酸三钠溶液，待溶液变为酒红色，继续加热煮沸8 min。停止加热，自然冷却至室温后，所制备的酒红色的胶体金溶液用0.22 μm的滤膜过滤。
（2）Au@PtNPs的制备：
取2.5 mL 1% H2PtCl6溶液加入到上述AuNPs溶液中，并将0.1 M的抗坏血酸溶液逐滴加入。反应20 min后，溶液逐渐变成暗黑色，自然冷却至室温后用超纯水离心洗涤，即得Au@PtNPs，其透射电镜图如图2所示。
（3）Ab2标记Au@PtNPs的制备
在干净的烧杯中加入10.0 mL Au@PtNPs溶液，用0.2 M K2CO3把溶液pH调至最佳，逐滴加入Ab2，磁力搅拌混匀；接着逐滴加入1% BSA，混匀； 10000 rpm低温离心30 min，轻轻吸除上清；所得Au@PtNPs-Ab2沉淀溶于复溶液中，复溶液为含1% BSA的0.05 M、pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液。
3. 电化学免疫层析试纸条的制备：
（1）样品垫的处理
样品垫是由血细胞过滤膜制备而成，使用前预先将样品垫在样品垫处理液中浸泡4h后，37℃烘干；
样品垫处理液为含0.5%吐温-20、0.5% BSA及0.5% PVP的0.05 M、pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液。
（2）结合垫的处理
以玻璃纤维素膜为结合垫，将所得Au@PtNPs-Ab2标记抗体溶液用BIODOT点样仪的AIRJET喷头喷点在玻璃纤维素膜上，37℃烘干；
（3）NC膜的处理
将一定浓度的COVID-19包被抗体（antibody1, Ab1）溶液用BIODOT点样仪在NC膜上的某一区域以1.5 μL/cm划线，37℃烘干。
（4）试纸条的组装
依次将包被Ab1的NC膜、固定Au@PtNPs-Ab2的结合垫、预处理的样品垫以及吸水垫依次组装在塑料底板上。为确保分析样品时溶液能顺利流过，各部分间有部分的重叠。将组装好的试纸条用切条机切成4.0 mm/条，然后将纸SPEs插入NC膜检测区的下方，制得电化学侧流免疫层析试纸条，结构如图1所示。
4. 电化学检测：
本发明试纸条中检测线包被有COVID-19抗原鼠单克隆抗体，结合垫固定有Au@PtNPs标记的另一COVID-19抗原鼠单克隆抗体。当样本中存在COVID-19抗原时，其首先与结合垫上的标记抗体反应，形成(Au@PtNPs-Ab2)-COVID-19抗原，依靠毛细作用在NC膜上层析，运行至检测线时，遇到包被抗体形成(Au@PtNPs-Ab2)-COVID-19-Ab1夹心免疫复合物。滴加HRP的底物溶液后，用电化学工作站检测。反应液在试纸条检测区被标记抗体复合物中的Au@PtNPs催化反应产生电流，电流大小与标记抗体复合物中Au@PtNPs的量成正比，SWV记录反应结果，如图3所示，依据标准曲线计算出样本中COVID-19抗原的浓度或含量。
SWV检测所用的电化学测试底液为含10.0 mM OPD和2.0 mM H2O2的柠檬酸缓冲溶液。
本发明试纸条中检测线包被有COVID-19抗原鼠单克隆抗体，结合垫固定有Au@PtNPs标记的另一COVID-19抗原鼠单克隆抗体。当样本中存在COVID-19抗原时，其首先与结合垫上的标记抗体反应，形成(Au@PtNPs-Ab2)-COVID-19抗原，依靠毛细作用在NC膜上层析，运行至检测线时，遇到包被抗体形成(Au@PtNPs-Ab2)-COVID-19-Ab1夹心免疫复合物。滴加HRP的底物溶液后，用电化学工作站检测。反应液在试纸条检测区被标记抗体复合物中的Au@PtNPs催化反应产生电流，电流大小与标记抗体复合物中Au@PtNPs的量成正比，依据标准曲线计算出样本中COVID-19抗原的浓度或含量。

Claims (7)

1.一种用于新型冠状病毒抗原定量检测的电化学免疫层析试纸条，其特征在于：其包括底板，以及依次组装在该底板上的纸丝网印刷电极简称纸SPEs、硝酸纤维素膜简称NC膜、结合垫、样品垫以及吸水垫；
其中纸SPEs装在底板的中部，NC膜装在纸SPEs的中部，样品垫装在NC膜的左侧、二者之间为结合垫；吸水垫装在NC膜的右侧；
其中，样品垫、结合垫、NC膜以及吸水垫的局部会相互叠加；
在所述结合垫上包被有金铂核壳纳米颗粒Au@PtNPs，在Au@PtNPs上标记有待检测物的标记抗体Ab2；
在NC膜上固定有待检测物的包被抗体Ab1。
2.根据权利要求1所述的电化学免疫层析试纸条，其特征在于：所述底板为带胶的塑料底板，组装顺序为：从带胶塑料底板的左侧至右侧依次粘贴处理后的样品垫、处理后的结合垫、纸SPEs以及处理后的NC膜，最后粘贴吸水垫。
3.根据权利要求1所述的电化学免疫层析试纸条，其特征在于：所述底板为60 mm ×30 cm、所述样品垫为20 mm × 30 cm、结合垫为8 mm × 30 cm、NC膜为25 mm × 30 cm、吸水纸为20 mm × 30 cm，组装时各部分的接触区域相互叠压1~3 mm。
4.根据权利要求1所述的电化学免疫层析试纸条，其特征在于：所述纸SPEs是由Whatman 1号滤纸所制，纸SPEs的疏水性区域是通过光刻技术制备而成的，详细过程如下：首先取2~5 mL的SU-8光刻胶均匀的分布于滤纸上，然后将设计好的紫外光掩膜版覆盖在滤纸上，于紫外曝光灯下曝光2~30 min；
接着将曝光后的滤纸于烘胶台上95 °C烘烤3~10 min，再用10~30 mL的丙酮、异丙醇依次洗涤3~5次除去滤纸上未聚合的光刻胶；
最后形成了带图案的微流控纸基分析装置；
微流控纸基分析装置上聚合了光刻胶的区域形成了疏水性屏障，被疏水性屏障包围的没有被光刻胶覆盖的区域则形成了亲水性区域；
纸SPEs的工作部分印刷在亲水性区域，接触部分印刷在疏水性区域，首先印刷用作工作电极和对电极的碳墨，然后印刷用作参比电极和导电接触头的银/氯化银墨，每层印刷完后要在干燥箱干燥20~60 min，并在室温下冷却后再进行下一步。
5.根据权利要求1所述的电化学免疫层析试纸条，其特征在于：所述的Au@PtNPs的制备步骤如下：
（1）胶体金溶液的制备：
配置0.01%~0.05%的HAuCl4溶液，于磁力搅拌下加热回流至沸腾，快速加入1%~2%的柠檬酸三钠，待溶液变为酒红色，继续加热煮沸6~15 min，停止加热，自然冷却至室温后，制得胶体金溶液；所制备的胶体金溶液用0.22 μm的滤膜过滤，得AuNPs；
（2）Au@PtNPs的制备：
取1~5 mL 1% H2PtCl6溶液加入到上述AuNPs溶液中，并将0.1 M的抗坏血酸溶液逐滴加入，反应20 min后，溶液逐渐变成暗黑色，自然冷却至室温后用超纯水离心洗涤，即得Au@PtNPs；
（3）Ab2标记Au@PtNPs的制备
以Au@PtNPs为载体，通过物理吸附在其表面标记上COVID-19的标记抗体，获得标记有COVID-19标记抗体的Au@PtNPs-Ab2；
在干净的烧杯中加入5.0 mL~50.0 mL Au@PtNPs溶液，用0.1~0.2 M K2CO3把溶液pH调至最佳，逐滴加入Ab2，磁力搅拌混匀；逐滴加入1%牛血清白蛋白BSA稳定液，混匀；9000rpm~12000 rpm低温离心10~30 min，轻轻吸除上清；所得Au@PtNPs-Ab2沉淀溶于复溶液中，
复溶液为含0.5%~2% BSA的0.05 M、pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液。
6.根据权利要求1~5之一所述的电化学免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
（1）样品垫的处理
样品垫是由血细胞过滤膜制备而成，使用前预先将样品垫在样品垫处理液中浸泡3h~6h后，37℃烘干，完成样品垫的处理；
样品垫处理液为含0.2%~1.0% 吐温-20、0.5%~1.0% BSA及0.5%~1% PVP的0.05 M、pH8.0的Tris-HCl缓冲溶液；
（2）结合垫的处理
以玻璃纤维素膜为结合垫，将所得Au@PtNPs-Ab2标记抗体溶液用BIODOT点样仪的AIRJET喷头喷点在玻璃纤维素膜上，37℃晾干；
（3）NC膜的处理
将一定浓度的COVID-19包被抗体Ab1溶液用BIODOT点样仪在NC膜上的某一区域以1.0~2.0 μL/cm划线，37℃烘干，完成Ab1的包被；
（4）试纸条的组装
依次将包被Ab1的NC膜、固定Au@PtNPs-Ab2的结合垫、预处理的样品垫以及吸水垫依次组装在带胶的塑料底板上，为确保分析样品时溶液能顺利流过，各部分间有1～3 mm的重叠，将组装好的试纸条用切条机切成4.0 mm/条，然后将纸SPEs插入NC膜检测区的下方，制得电化学侧流免疫层析试纸条。
7.根据权利要求1~5之一所述电化学免疫层析试纸条的非诊断目的的检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：
将一定量含特定COVID-19抗原的样品溶液加到样品垫上，样品液可经样品垫、结合垫到达检测区，待免疫反应完成后，检测区形成了有红色条带的夹心免疫复合物(Au@PtNPs-Ab2)-COVID-19-Ab1；
然后，在检测区滴加电化学测试底液，反应5 min后，SWV记录反应结果；将所得SWV信号与标准曲线进行对比，实现对待检测试样中所含COVID-19抗原的定量检测；
SWV检测所用的电化学测试底液为含10.0 mM OPD和2.0 mM H2O2的柠檬酸缓冲液。
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