JP4039739B2 - 試料中のタンパク質の分析方法及びそのキット - Google Patents
試料中のタンパク質の分析方法及びそのキット Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中に微量に含まれるタンパク質を簡便に定性・定量することができる分析方法及び分析キットに関する。分析化学、生命科学、医療の分野、特に臨床検査分野において有用である。
【０００２】
【従来の技術】
従来の最も簡便なタンパク質分析手段として、タンパク質と結合するとその色調を変える色素を担体に含浸させた試験片が挙げられる。しかし、この試験片は吸収可能な試料が数μl 〜数十μl にすぎず、タンパク質を僅かしか含まない試料については適用困難であった。その上、試料中の他の物質や非結合態色素の影響を受け、誤結果を招く場合もあった。
【０００３】
そのために近年、試料を濃縮して感度を上げ、かつ試料中の妨害物質の影響を低減させるいくつかの技術が提案されている。
【０００４】
例えば、木下ら〔分析化学 23巻，1543-1544頁，1974年〕は、試料中のタンパク質をメンブランフィルタ上に濃縮し、その後フィルタをフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で蛍光染色し、洗浄後にスポットの蛍光強度を測定する技術を報告している。しかしながら、この技術においては、タンパク質とＦＩＴＣとの反応に３０分も要し、また妨害物質を除去するために染色後には洗浄を必要とするという問題があった。
【０００５】
また、藤田ら〔分析化学 44巻，733-738頁，1995年〕は、タンパク質と色素−金属錯体との沈殿会合体をフィルタで物理的に補集した後、水酸化ナトリウム水溶液で再溶解し、この溶液の吸光度を測定する技術を報告している。しかしながら、この技術においては、沈殿物の目詰まりのため定量性が決して良好とは言えず、またフィルタ上の着色を観察するものではなく、再溶解液を測定するものであるため、簡易迅速な分析に適さないものであった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、尿中タンパク質分析のようなタンパク質を僅かしか含まない試料を濃縮して感度を上げるこれまでの技術は、洗浄工程、発色工程、抽出工程等の工程を必須とするために操作が煩雑であり、色測定まで時間がかかり、定量性にも問題があった。そこで、本発明は、工程数を極力減らし、色測定を短時間で可能とし、定量性に優れた、簡易迅速なタンパク質の分析手段を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ａ）タンパク質を含有する可能性がある試料と、ブロモクロロフェノールブルー、クマシーブリリアントブルー、テトラブロモフェノールブルー、ブロモクレゾールパープル及びブロモフェノールブルーから選ばれる色素を、該色素のｐＫａよりも低いｐＨにおいて混合し、形成される該タンパク質と該色素とのイオン会合体を沈殿させずにイオン会合体溶液を形成させる工程；ｂ）該イオン会合体溶液を疎水性フィルタに通すことにより、該イオン会合体溶液中に溶解した該会合体を該フィルタに吸着させる工程；ｃ）該フィルタを乾燥させる工程；及びｄ）該フィルタ上の該会合体を定性・定量的に分析する工程を順次行う、試料中のタンパク質の分析方法である。
なお、本発明の試料中のタンパク質の分析方法においては、色素が、ブロモクロロフェノールブルーであることが好適である。
【０００８】
また、本発明は、ブロモクロロフェノールブルー、クマシーブリリアントブルー、テトラブロモフェノールブルー、ブロモクレゾールパープル及びブロモフェノールブルーから選ばれる色素；試料と該色素とを混合したイオン会合体溶液のｐＨを該色素のｐＫａよりも低く設定することができる緩衝剤；及び疎水性フィルタを含み、場合によりイオン会合体溶液を疎水性フィルタに通すための装置を含む、前記方法に使用されるタンパク質分析キットである。イオン会合体溶液を疎水性フィルタに通すための装置としては、例えば、前記フィルタを固定可能な開口部を、その一端に有するシリンダと、シリンダ内壁に摺動して前記一端の方向に移動しうる、外部から操作可能なピストンが挙げられ、ピストンの移動により、イオン会合体溶液中のイオン会合体が該フィルタに吸着する。
【０００９】
【発明の実施の態様】
本発明で分析可能な試料は、例えば、生体試料（血液、血清、血漿、尿、髄液、精液、唾液、汗、腹水、羊水及び涙等の体液、脳、肝臓及び腎臓等の臓器の抽出液、毛髪、爪及び皮膚等の組織の抽出液並びに糞便等）、食品（穀物、野菜、果物、魚介類、加工食品等）、飲料（水、茶、牛乳、果汁、酒類等）が挙げられるが、特に限定されない。また、必要に応じて希釈や濃縮を行う。
【００１０】
本発明で使用される色素としては、それとタンパク質との会合体が沈殿しにくい性質になるような色素が好ましい。
具体的には、溶解度の高いイオン会合体を形成するようなイオン性基を有する色素が好ましい。
【００１１】
特に陰イオン性基を有する色素が好ましく、タンパク質の正荷電部位と結合して電気的な中和を行うことができる。例えば、スルホン基や水酸基等の親水性基を有する色素が挙げられる。
【００１２】
また、会合体の疎水性フィルタへの吸着性を高めるため、色素が疎水性基を有することが好ましく、特に芳香環を有する色素が好ましい。
【００１３】
このようなものとして、例えば、トリフェニルメタン系色素（例えば、ブロモクロロフェノールブルー、テトラブロモフェノールブルー、ブロモフェノールブルー、クマシーブリリアントブルー、ブロモクレゾールパープル）、アゾ色素（例えば、バッファローブラック、アシッドオレンジ１２、メチルオレンジ、オレンジＧ、アゾスルファチアゾール）、キサンテン系色素（例えば、エオシン、エリスロシン）等が挙げられる。
【００１４】
この中でも特に、ブロモクロロフェノールブルー（ＢＣＰＢ）、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）、テトラブロモフェノールブルー（ＴＢＰＢ）、ブロモクレゾールパープル（ＢＣＰ）、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）やエオシンが好ましい。
【００１５】
前記色素は、驚くべきことにほぼすべての種類のタンパク質と結合し、イオン会合体を形成する。本発明でのイオン会合体の形成機序は定かではないが、静電引力型イオン会合や疎水構造型イオン会合のいずれかであると考えられる〔本水，「総合論文 イオン会合を利用する分離・分析法の設計」，分析化学 38巻，147-170頁，1989年〕。
【００１６】
本発明では、このイオン会合体を溶媒中に完全に溶解させ、沈殿を生じさせないようにする。条件は、当業者により容易に実験的に設定可能である。
【００１７】
例えば、タンパク質含有溶液として、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）水溶液を用いた場合の条件例を表１に示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】
試料と色素を混合する際に、色素は、色素を含有する溶液の形態で混合してもよく、または粉末や固形状の形態で混合してもよい。
【００２０】
試料と色素の混合によりイオン会合体は瞬時に形成される。
このイオン会合体の色調は、色素のそれと相違することが好ましい。例えば、表１の条件下で、ＢＣＰＢ、ＴＢＰＢやＢＰＢを用いた場合、タンパク質添加前は黄色であるのに対し添加後は青色となり、目視でタンパク質の定性・定量分析が可能となる。
【００２１】
例えば、図１に示したように、ＢＣＰＢはｐＫａ2 であるｐＨ４．１以下では−１価（ＨＢＣＰＢ- ）となり黄色を示すのであるが、タンパク質と会合することにより−２価（ＢＣＰＢ2-）となって青色を示すようになる。
【００２２】
以上のように色調の変化が黄色から青色のように吸収波長が離れていると、色調の変化を目視にて判別しやすいので特に好ましい。
【００２３】
なお、このような場合には、緩衝剤を添加し、溶液中のｐＨを色素のｐＫａよりも低く設定するのが好ましい。
【００２４】
このイオン会合体溶液を疎水性フィルタに通すことにより、イオン会合体溶液中のイオン会合体が疎水性フィルタに吸着される。
【００２５】
このイオン会合体が疎水性フィルタに吸着される原理は定かではないが、電気的に中和された会合体が溶液中において疎水性フィルタに疎水結合的に吸着すると考えられる。
【００２６】
なお、溶媒から疎水性フィルタへの分配比が小さい色素を選択することにより、フィルタ上には会合していない色素が殆ど吸着されないので、会合していない色素の色の影響を回避することが可能となる。
【００２７】
これにより、フィルタ上の会合していない色素を除去するための洗浄操作が不要となる。例えば、表１に示したすべての組み合わせにおいて、洗浄工程は不要である（フィルタにはニトロセルロースフィルタを使用）。
【００２８】
ところで、本発明においては、混合する試料と色素の量の比によってイオン会合体が疎水性フィルタに吸着する量が変わってくる。
【００２９】
これを実験的に示したのが図２である。
なお、この実験の操作の詳細は、後の参考例２に記載した。
【００３０】
この図２において、横軸は混合した試料中のタンパク質濃度を、左の縦軸は吸光度の差を、右の縦軸は吸光度を表す。
【００３１】
そして、この図２中の「○」は、イオン会合体に特異的な６０２ｎｍにおける、疎水性フィルタに通す前のイオン会合体溶液の吸光度から疎水性フィルタを通した後のろ液の吸光度を差し引いた値（吸光度の差）、つまり、疎水性フィルタに吸着したイオン会合体の量を表す。
【００３２】
また、「■」は、イオン会合体に特異的な６０２ｎｍにおける、疎水性フィルタに通す前のイオン会合体溶液の吸光度、つまり、イオン会合体溶液中に存在するイオン会合体の量を表す。
【００３３】
この図より、試料と色素を混合したイオン会合体溶液中に形成されるイオン会合体の量は、試料中のタンパク質濃度が高くなるにつれて増加してゆくことが分かる。
【００３４】
また、疎水性フィルタに吸着するイオン会合体の量は、試料中のタンパク質濃度が約３０ｍｇ／ｌまでの間は試料中のタンパク質濃度に応じて増加するが、この濃度以上では逆に低下してゆくことが分かる。
【００３５】
また、イオン会合体溶液を疎水性フィルタに通し乾燥した後の疎水性フィルタ上の着色の強さをデンシトメータで測定する実験を行った。
この実験の結果を図３に示した。また、実験の操作の詳細を後の参考例３に記載した。
【００３６】
図３において、横軸は色素と混合した試料中のタンパク質の濃度を、縦軸はイオン会合体に特異的な６０２ｎｍにおける吸光度の高さ（吸光度のピークの面積）を表す。
【００３７】
この図３から、この実験系において、疎水性フィルタ上のイオン会合体の量を表す６０２ｎｍにおける吸光度の高さは、試料中のタンパク質濃度が約５０ｍｇ／ｌまでの間は試料中のタンパク質濃度に応じて増加するが、この濃度以上では逆に低下してゆくことが分かる。
【００３８】
つまり、本発明において、試料中のタンパク質と色素の会合体の形成時に、色素の量に対してタンパク質の量が一定範囲にある場合は、形成されたイオン会合体は疎水性フィルタに吸着するが、一定範囲を越えタンパク質量が多くなってくると、形成されるイオン会合体の量は増えるにもかかわらず疎水性フィルタには吸着しなくなってくる。
【００３９】
本発明において、使用される疎水性フィルタの材質として、例えば、ニトロセルロース、オクタデシルシリル化シリカ、オクチルシリル化シリカ、エチルシリル化シリカ、メチルシリル化シリカ、フェニルシリル化シリカ、フルオロカーボン化シリカ、グラファイトカーボン化シリカ等が挙げられる。このようなフィルタは市販されており、例えば、混合セルロースエステルフィルタA020A025A（ニトロセルロース、ポアサイズ０．２μm 、アドバンテック東洋社製）が使用しうる。
【００４０】
フィルタ上の着色の測定は、目視により行っても、デンシトメータやスポットメータ等の機器を用いてもよい。また、着色強度は、例えば、可視部の吸光度、透過率、蛍光強度を測定することによりなされる。
【００４１】
なお、本発明において、フィルタ上の着色は、疎水性フィルタにイオン会合体溶液を通した直後の疎水性フィルタがぬれている時と、疎水性フィルタが乾燥している時では色が異なる。
【００４２】
これを実験的に示したのが図４である。
なお、この実験の詳細は、後の参考例４に記載した。
【００４３】
この図４において、横軸は疎水性フィルタ上の着色の吸光度測定時の波長を、縦軸はその時の吸光度の値を表す。
そして、この図４中の実線は、イオン会合体溶液を疎水性フィルタに通した直後の疎水性フィルタがぬれている時の吸光度を、破線はこの疎水性フィルタを乾燥した時の吸光度を表す。
【００４４】
この図より、疎水性フィルタ上の着色は、疎水性フィルタがぬれている時に比べて乾燥している時は、ＨＢＣＰＢ- に特異的な４３４ｎｍ近辺（黄色）の吸光度が減少し、かつイオン会合体に特異的な６０２ｎｍ近辺（青色）の吸光度が増加していることが分かる。
【００４５】
よって、フィルタ上の着色の測定は、フィルタを乾燥した後に行うことが好ましい。
フィルタの乾燥は、放置、風を当てること、又は加温等により行えばよい。
放置により乾燥する場合は、通常は２０分間以上放置すればよい。
【００４６】
上記の参考例２、参考例３、及び参考例４の結果より、本発明における試料中のタンパク質と色素の会合体の形成、形成されたイオン会合体の疎水性フィルタへの吸着、及び着色について、以下のような作用が推察される。
【００４７】
色素はｐＫａ2 以下のｐＨでは１価（ＨＢＣＰＢ- ）となっているが、タンパク質と会合することにより色素は多価（ＢＣＰＢ2-）となる。
この時に、色素の量に対してタンパク質の量が一定以上の場合は、タンパク質に会合している色素は多価（ＢＣＰＢ2-）であって、タンパク質の限定された特定の部位に会合する。
【００４８】
また、色素の量に対してタンパク質の量が一定以下の場合、つまりタンパク質に対して色素が過剰に存在する場合は、多価の色素（ＢＣＰＢ2-）が特定の部位に会合したタンパク質に、更に過剰に存在する１価の色素（ＨＢＣＰＢ- ）が非選択的に会合して多重会合体を形成する。
【００４９】
そして、色素の量に対してタンパク質の量が一定以上の場合に形成される、多価の色素とのイオン会合体は、疎水性フィルタとの親和性が低く僅かしか吸着しない。
【００５０】
しかし、色素の量に対してタンパク質の量が一定以下の場合に形成される多重会合体は、多価の色素に加えて１価の色素が多重に会合しているため疎水性が高くなり、疎水的親和性によって疎水性フィルタへの吸着率が高くなる。
【００５１】
以上のことは、試料中のタンパク質濃度が増加するにつれ形成されるイオン会合体量が増してゆくにもかかわらず、疎水性フィルタに吸着するイオン会合体の量が一定のタンパク質濃度を境に増加から減少に転じることより推察される。（図２及び図３を参照のこと。）
【００５２】
そして、疎水性フィルタに吸着した多重会合体は、多価の色素（ＢＣＰＢ2-）〔青色〕が会合した上に１価の色素（ＨＢＣＰＢ- ）〔黄色〕が多数会合しているため黄緑色を示すのであるが、これが乾燥状態に置かれることによってｐＨ又は塩濃度等の環境が変わり、１価の色素（ＨＢＣＰＢ- ）のプロトン解離、又はタンパク質の特定の部位への会合を引き起こし、１価の色素（ＨＢＣＰＢ- ）が多価の色素（ＢＣＰＢ2-）に変換され多価の色素の色（青色）に変わる。
【００５３】
上記のことは、乾燥により、１価の色素（ＨＢＣＰＢ- ）に特異的な４３４ｎｍ近辺（黄色）の吸光度が減少し、イオン会合体に特異的な６０２ｎｍ近辺（青色）の吸光度が増加することより推察される。（図４を参照のこと）
【００５４】
以上詳述したように、本発明の試料中のタンパク質の分析方法、及びタンパク質分析キットでは、分析を行う試料中のタンパク質の量に対して色素の量等を調整することにより、試料中のタンパク質が特定の濃度範囲にある時のみ、疎水性フィルタ上に着色を生じさせることができる。つまり、試料中のタンパク質が特定の濃度範囲にあることを検出することができる。
【００５５】
そして、色素の量等を調整して、着色を生じる濃度範囲を段階的に変えていった複数の濃度の色素よりなる分析キットを用いて１つの試料を分析することにより、その試料中のタンパク質の定量分析を行うことができる。
【００５６】
本発明のタンパク質分析キットであるが、図５に本発明の方法を実施するための分析キットの例（分析キット１）を示す。分析に際し、まず疎水性フィルタ２をシリンダ３の開口部に透き間なく固定する。
次に、試料と色素を混合したイオン会合体溶液を、予めシリンダ３内部に注入しておき、ピストン５を開口部４の方向に移動させて（すなわち、レバー６を押して）、イオン会合体溶液をシリンダ外部に押し出す。この際、このイオン会合体溶液中に含まれているイオン会合体が疎水性フィルタ２に吸着される。
あるいは、試料に色素を添加したイオン会合体溶液中に開口部４を導入し、ピストン５を開口部４と反対側に移動させる（すなわち、レバー６を引く）ことにより、シリンダ３内部にイオン会合体溶液を吸引して、疎水性フィルタ２にイオン会合体を吸着させる態様にしてもよい。
【００５７】
〔参考例１〕
（最適ｐＨの決定）
７．４５×１０-4M ブロモクロロフェノールブルー（ＢＣＰＢ）〔東京化成社製〕水溶液８ml及び２N ＮａＣｌ水溶液１mlを混合し、蒸留水を加え、全容を５００mlとした。
次に、４３０nmでの色素のみの吸光度、５９０nmでの色素のみの吸光度及び０．０５０４ｇのＨＳＡを混合してイオン会合体を形成させたときの６００nmでの吸光度を、ｐＨを変えて測定した。
その結果を図１に示す。
この結果から、この条件下ではｐＨ２．５付近とするのが最適である。
【００５８】
〔参考例２〕
（疎水性フィルタに吸着するイオン会合体の量の検討（１））
（１）色素溶液の調製
ＢＣＰＢ（東京化成社製）２．０３４ｍｇを蒸留水に溶解し全量１００ｍｌとして色素溶液〔３５μM ＢＣＰＢ溶液〕を調製した。
【００５９】
（２）緩衝液の調製
モノクロロ酢酸１８９ｍｇを蒸留水９０ｍｌに溶解し、塩酸でｐＨを３．１に調整した後、全量を１００ｍｌとし、緩衝液〔０．０２M モノクロロ酢酸−塩酸緩衝液（ｐＨ３．１）〕を調製した。
【００６０】
（３）試料の調製
ＨＳＡを、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００mg/lとなるように、生理食塩水（０．９% 塩化ナトリウム水溶液）に溶解し、１２種類の試料を調製した。
【００６１】
（４）測定
前記色素溶液１mlと前記緩衝液１mlを混合し、更に前記の各試料８mlを混合してイオン会合体溶液を調製した。
【００６２】
次に、これら１２種類のイオン会合体溶液それぞれの６０２ｎｍにおける吸光度を、Ｕ−２０００型分光光度計（日立製作所社製）で測定した。
【００６３】
その後、これら１２種類のイオン会合体溶液の１０mlを、それぞれニトロセルロースフィルタ（ポアサイズ：０．２μm 、直径：２５mm、製品番号：A020A025A、アドバンテック東洋社製）に上から注いで通した。
【００６４】
ここで得られた１２種類のろ液の６０２ｎｍにおける吸光度を先と同様にして測定した。
【００６５】
そして、疎水性フィルタに吸着したイオン会合体の量を算出するため、イオン会合体に特異的な６０２ｎｍにおける、疎水性フィルタに通す前のイオン会合体溶液の吸光度から疎水性フィルタを通した後のろ液の吸光度を差し引いた。
この結果を図２に示した。
【００６６】
〔参考例３〕
（疎水性フィルタに吸着するイオン会合体の量の検討（２））
（１）色素溶液の調製
ＢＣＰＢ（東京化成社製）２．０３４ｍｇを蒸留水に溶解し全量１００ｍｌとして色素溶液〔３５μM ＢＣＰＢ溶液〕を調製した。
【００６７】
（２）緩衝液の調製
モノクロロ酢酸１８９ｍｇを蒸留水９０ｍｌに溶解し、塩酸でｐＨを３．０に調整した後、全量を１００ｍｌとし、緩衝液〔０．０２M モノクロロ酢酸−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）〕を調製した。
【００６８】
（３）試料の調製
ＨＳＡを、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０mg/lとなるように、生理食塩水（０．９% 塩化ナトリウム水溶液）に溶解し、１０種類の試料を調製した。
【００６９】
（４）測定
前記色素溶液１mlと前記緩衝液１mlを混合し、これに前記の各試料１mlを混合し、更に蒸留水２mlを混合してイオン会合体溶液を調製した。
【００７０】
次に、これら１０種類のイオン会合体溶液５mlそれぞれをシリンジ内に吸引した後、シリンジの先にニトロセルロースフィルタ（ポアサイズ：０．２μm 、直径：２５mm、製品番号：A020A025A、アドバンテック東洋社製）を付け、シリンジ内のイオン会合体溶液をピストンで押してフィルタに通した。
【００７１】
これら１０種類のフィルタを４０℃の乾燥器で１０分間乾燥した後、フィルタ上の着色の６０２ｎｍにおける吸光度の高さ（吸光度のピークの面積）をＣＳ−９３００ＰＣ型デンシトメータ（島津製作所社製）で測定した。
この結果を図３に示した。
【００７２】
〔参考例４〕
（乾燥による疎水性フィルタ上の着色のスペクトル変化の検討）
（１）色素溶液の調製
ＢＣＰＢ（東京化成社製）２．０３４ｍｇを蒸留水に溶解し全量１００ｍｌとして色素溶液〔３５μM ＢＣＰＢ溶液〕を調製した。
【００７３】
（２）緩衝液の調製
モノクロロ酢酸１８９ｍｇを蒸留水９０ｍｌに溶解し、塩酸でｐＨを３．０に調整した後、全量を１００ｍｌとし、緩衝液〔０．０２M モノクロロ酢酸−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）〕を調製した。
【００７４】
（３）試料の調製
ＨＳＡを５０mg/lになるように、生理食塩水（０．９% 塩化ナトリウム水溶液）に溶解して試料を調製した。
【００７５】
（４）測定
前記色素溶液１mlと前記緩衝液１mlを混合し、これに前記の試料１mlを混合し、更に蒸留水２mlを混合してイオン会合体溶液を調製した。
【００７６】
次に、このイオン会合体溶液５mlをシリンジ内に吸引した後、シリンジの先にニトロセルロースフィルタ（ポアサイズ：０．２μm 、直径：２５mm、製品番号：A020A025A、アドバンテック東洋社製）を付け、シリンジ内のイオン会合体溶液をピストンで押してフィルタに通した。
【００７７】
このフィルタを４０℃の乾燥器で１０分間乾燥した後、フィルタ上の着色の吸光度スペクトルをＣＳ−９３００ＰＣ型デンシトメータ（島津製作所社製）でスキャンして測定した。
この結果を図４に示した。
【００７８】
【発明の効果】
本発明によれば、抽出工程、発色工程、洗浄工程が原則的に不要であるため工程数が非常に少なく、またイオン会合の原理を採用しているので色測定が短時間で可能であり、更に沈殿させないでフィルタに吸着させるので定量性に優れている、簡易迅速なタンパク質の分析手段が提供される。
【００７９】
そして、本発明の分析方法及び分析キットにおいては、試料中のタンパク質が特定の濃度範囲にあることを検出することができる。
【００８０】
更に、複数の濃度の色素よりなる分析キットを用いることにより、試料中のタンパク質の定量分析を行うこともできる。
【００８１】
【実施例】
〔実施例１〕
（試料中のタンパク質の分析（１））
（１）色素含有溶液の調製
ＢＣＰＢ（東京化成社製）を３７２．５μM となるように１M モノクロロ酢酸−塩酸緩衝液（ｐＨ２．０５）に溶解し、色素含有溶液を調製した。
【００８２】
（２）試料の調製
ＨＳＡを、１.０、２.５、５.０、１０、２５、５０、１００、２００、２５０、５００mg/lになるように、生理食塩水（０．９% 塩化ナトリウム水溶液）に溶解し、１０種類の試料を調製した。
また、ＨＳＡを５０mg/lとなるように尿に溶解した試料も調製した。
【００８３】
（３）測定
前記色素含有溶液０．５mlと前記の各試料２mlを混合した。その後、これら１１種類の混合液の０．５mlを、それぞれニトロセルロースフィルタ（ポアサイズ：０．２μm 、アドバンテック東洋社製）に上から注いで通した。
【００８４】
このフィルタの色を目視により測定した。
フィルタ上に青色のスポットが検出された場合、試料中にタンパク質が存在すると判定した。
【００８５】
その結果、２．５mg/lの濃度まで、目視で判定可能であった。
また、フィルタ上にＵＶランプを照射し、その蛍光（赤色）を目視により測定した。その結果、すべての濃度において目視で判定可能であった。
【００８６】
そして、フィルタの色の測定及び蛍光色の測定のいずれの手段においても、尿試料中のＨＳＡが確認された。
【００８７】
〔実施例２〕
（試料中のタンパク質の分析（２））
（１）色素溶液の調製
ＢＣＰＢ（東京化成社製）２．０３４ｍｇを蒸留水に溶解し全量１００ｍｌとして色素溶液〔３５μM ＢＣＰＢ溶液〕を調製した。
【００８８】
（２）緩衝液の調製
モノクロロ酢酸１８９ｍｇを蒸留水９０ｍｌに溶解し、塩酸でｐＨを３．０に調整した後、全量を１００ｍｌとし、緩衝液〔０．０２M モノクロロ酢酸−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）〕を調製した。
【００８９】
（３）試料の調製
ＨＳＡを、１．２５、３．７５、６．２５、１０、１２．５、１６．２５、１８．７５、２２．５、２５、３７．５、５０、７５、１００mg/lとなるように、生理食塩水（０．９% 塩化ナトリウム水溶液）に溶解し、１３種類の試料を調製した。
また、対照として、生理食塩水よりなる試料も用意した。
【００９０】
（４）測定
前記色素溶液１mlと前記緩衝液１mlを混合し、これに前記の各試料１mlを混合し、更に蒸留水２mlを混合してイオン会合体溶液を調製した。
【００９１】
次に、これら１４種類のイオン会合体溶液５mlそれぞれをシリンジ内に吸引した後、シリンジの先にニトロセルロースフィルタ（ポアサイズ：０．２μm 、直径：２５mm、製品番号：A020A025A、アドバンテック東洋社製）を付け、シリンジ内のイオン会合体溶液をピストンで押してフィルタに通した。
【００９２】
これら１４種類のフィルタを４０℃の乾燥器で１０分間乾燥した。
これらのフィルタの色を目視により測定した。
フィルタ上の着色を図６に示した。
【００９３】
この結果、試料中のタンパク質濃度が３．７５mg/l〜２２．５mg/lの場合に青色の着色が検出された。
つまり、３．７５mg/l〜２２．５mg/lの試料中のタンパク質の存在が確認された。
【００９４】
〔実施例３〕
（試料中のタンパク質の分析（３））
（１）色素溶液の調製
ＢＣＰＢ（東京化成社製）の、１０．１７ｍｇ、１４．５３ｍｇ、１５．９８ｍｇ、１７．４３ｍｇ、２０．３４ｍｇ、２１．７９ｍｇ、２３．２４ｍｇ、２９．０５ｍｇ、又は４０．６７ｍｇを蒸留水に溶解し全量１００ｍｌとして９種類の色素溶液〔１７５μM 、２５０μM 、２７５μM 、３００μM 、３５０μM 、３７５μM 、４００μM 、５００μM 、又は７００μM ＢＣＰＢ溶液〕を調製した。
【００９５】
（２）緩衝液の調製
モノクロロ酢酸１．８９ｇを蒸留水９０ｍｌに溶解し、塩酸でｐＨを３．１に調整した後、全量を１００ｍｌとし、緩衝液〔０．２M モノクロロ酢酸−塩酸緩衝液（ｐＨ３．１）〕を調製した。
【００９６】
（３）試料の調製
ＨＳＡを、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００mg/lとなるように、生理食塩水（０．９% 塩化ナトリウム水溶液）に溶解し、１１種類の試料を調製した。
また、対照として、生理食塩水よりなる試料も用意した。
【００９７】
（４）測定
前記９種類の色素溶液１mlのそれぞれと前記緩衝液１mlを混合したものを１２組用意した。
この１組ずつに前記の１２種類の試料の１種類ずつをそれぞれ１ml混合し、更に蒸留水２mlを混合して合計１０８種類のイオン会合体溶液を調製した。
【００９８】
次に、これら１０８種類のイオン会合体溶液５mlそれぞれをシリンジ内に吸引した後、シリンジの先にニトロセルロースフィルタ（ポアサイズ：０．２μm 、直径：２５mm、製品番号：A020A025A、アドバンテック東洋社製）を付け、シリンジ内のイオン会合体溶液をピストンで押してフィルタに通した。
【００９９】
これら１０８種類のフィルタを４０℃の乾燥器で１０分間乾燥した。
このフィルタの色を目視により測定した。
【０１００】
これらのフィルタ上の着色を図７に示した。
この図７において、横軸は試料中のタンパク質濃度を、縦軸は色素溶液中のＢＣＰＢ濃度を表す。
そして、この図７中の「●」は疎水性フィルタ上の着色が青色であることを、「◎」は疎水性フィルタ上の着色がうすい水色であることを、そして「○」は疎水性フィルタが着色されていないことを表す。
【０１０１】
また、図８には、ＣＳ−９３００ＰＣ型デンシトメータ（島津製作所社製）で測定した、これら１０８種類のフィルタ上の着色の６０２ｎｍにおける吸光度の高さ（吸光度のピークの面積）を示した。
【０１０２】
これらの結果より、本発明においては、分析を行う試料中のタンパク質の量に対して色素の量を調整することにより、試料中のタンパク質が特定の濃度範囲にある時のみ、疎水性フィルタ上に着色を生じさせることができる。
つまり、試料中のタンパク質が特定の濃度範囲にあることを検出することができることが確かめられた。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＨと、色素（４３０nm、５９０nm）及びイオン会合体（６００nm）の吸光度との関係を示した図である。
【図２】試料中のタンパク質濃度と疎水性フィルタに吸着するイオン会合体等の量の関係を示した図である。
【図３】試料中のタンパク質濃度と疎水性フィルタに吸着するイオン会合体の量の関係を示した図である。
【図４】疎水性フィルタがぬれている時と乾燥している時の着色のスペクトルを示した図である。
【図５】本発明に係るタンパク質分析キットである。
【図６】各タンパク質濃度の試料における疎水性フィルタの着色を示した図（写真）である。
【図７】試料中のタンパク質濃度及び色素溶液中のＢＣＰＢ濃度の両方を変えて分析を行った時の疎水性フィルタの着色を示した図である。
【図８】試料中のタンパク質濃度及び色素溶液中のＢＣＰＢ濃度の両方を変えて分析を行った時の疎水性フィルタの着色の吸光度の高さを示した図である。
【符号の説明】
１ 分析キット
２ 疎水性フィルタ
３ シリンダ
４ 開口部
５ ピストン
６ レバー
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中に微量に含まれるタンパク質を簡便に定性・定量することができる分析方法及び分析キットに関する。分析化学、生命科学、医療の分野、特に臨床検査分野において有用である。
【０００２】
【従来の技術】
従来の最も簡便なタンパク質分析手段として、タンパク質と結合するとその色調を変える色素を担体に含浸させた試験片が挙げられる。しかし、この試験片は吸収可能な試料が数μl 〜数十μl にすぎず、タンパク質を僅かしか含まない試料については適用困難であった。その上、試料中の他の物質や非結合態色素の影響を受け、誤結果を招く場合もあった。
【０００３】
そのために近年、試料を濃縮して感度を上げ、かつ試料中の妨害物質の影響を低減させるいくつかの技術が提案されている。
【０００４】
例えば、木下ら〔分析化学 23巻，1543-1544頁，1974年〕は、試料中のタンパク質をメンブランフィルタ上に濃縮し、その後フィルタをフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で蛍光染色し、洗浄後にスポットの蛍光強度を測定する技術を報告している。しかしながら、この技術においては、タンパク質とＦＩＴＣとの反応に３０分も要し、また妨害物質を除去するために染色後には洗浄を必要とするという問題があった。
【０００５】
また、藤田ら〔分析化学 44巻，733-738頁，1995年〕は、タンパク質と色素−金属錯体との沈殿会合体をフィルタで物理的に補集した後、水酸化ナトリウム水溶液で再溶解し、この溶液の吸光度を測定する技術を報告している。しかしながら、この技術においては、沈殿物の目詰まりのため定量性が決して良好とは言えず、またフィルタ上の着色を観察するものではなく、再溶解液を測定するものであるため、簡易迅速な分析に適さないものであった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、尿中タンパク質分析のようなタンパク質を僅かしか含まない試料を濃縮して感度を上げるこれまでの技術は、洗浄工程、発色工程、抽出工程等の工程を必須とするために操作が煩雑であり、色測定まで時間がかかり、定量性にも問題があった。そこで、本発明は、工程数を極力減らし、色測定を短時間で可能とし、定量性に優れた、簡易迅速なタンパク質の分析手段を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ａ）タンパク質を含有する可能性がある試料と、ブロモクロロフェノールブルー、クマシーブリリアントブルー、テトラブロモフェノールブルー、ブロモクレゾールパープル及びブロモフェノールブルーから選ばれる色素を、該色素のｐＫａよりも低いｐＨにおいて混合し、形成される該タンパク質と該色素とのイオン会合体を沈殿させずにイオン会合体溶液を形成させる工程；ｂ）該イオン会合体溶液を疎水性フィルタに通すことにより、該イオン会合体溶液中に溶解した該会合体を該フィルタに吸着させる工程；ｃ）該フィルタを乾燥させる工程；及びｄ）該フィルタ上の該会合体を定性・定量的に分析する工程を順次行う、試料中のタンパク質の分析方法である。
なお、本発明の試料中のタンパク質の分析方法においては、色素が、ブロモクロロフェノールブルーであることが好適である。
【０００８】
また、本発明は、ブロモクロロフェノールブルー、クマシーブリリアントブルー、テトラブロモフェノールブルー、ブロモクレゾールパープル及びブロモフェノールブルーから選ばれる色素；試料と該色素とを混合したイオン会合体溶液のｐＨを該色素のｐＫａよりも低く設定することができる緩衝剤；及び疎水性フィルタを含み、場合によりイオン会合体溶液を疎水性フィルタに通すための装置を含む、前記方法に使用されるタンパク質分析キットである。イオン会合体溶液を疎水性フィルタに通すための装置としては、例えば、前記フィルタを固定可能な開口部を、その一端に有するシリンダと、シリンダ内壁に摺動して前記一端の方向に移動しうる、外部から操作可能なピストンが挙げられ、ピストンの移動により、イオン会合体溶液中のイオン会合体が該フィルタに吸着する。
【０００９】
【発明の実施の態様】
本発明で分析可能な試料は、例えば、生体試料（血液、血清、血漿、尿、髄液、精液、唾液、汗、腹水、羊水及び涙等の体液、脳、肝臓及び腎臓等の臓器の抽出液、毛髪、爪及び皮膚等の組織の抽出液並びに糞便等）、食品（穀物、野菜、果物、魚介類、加工食品等）、飲料（水、茶、牛乳、果汁、酒類等）が挙げられるが、特に限定されない。また、必要に応じて希釈や濃縮を行う。
【００１０】
本発明で使用される色素としては、それとタンパク質との会合体が沈殿しにくい性質になるような色素が好ましい。
具体的には、溶解度の高いイオン会合体を形成するようなイオン性基を有する色素が好ましい。
【００１１】
特に陰イオン性基を有する色素が好ましく、タンパク質の正荷電部位と結合して電気的な中和を行うことができる。例えば、スルホン基や水酸基等の親水性基を有する色素が挙げられる。
【００１２】
また、会合体の疎水性フィルタへの吸着性を高めるため、色素が疎水性基を有することが好ましく、特に芳香環を有する色素が好ましい。
【００１３】
このようなものとして、例えば、トリフェニルメタン系色素（例えば、ブロモクロロフェノールブルー、テトラブロモフェノールブルー、ブロモフェノールブルー、クマシーブリリアントブルー、ブロモクレゾールパープル）、アゾ色素（例えば、バッファローブラック、アシッドオレンジ１２、メチルオレンジ、オレンジＧ、アゾスルファチアゾール）、キサンテン系色素（例えば、エオシン、エリスロシン）等が挙げられる。
【００１４】
この中でも特に、ブロモクロロフェノールブルー（ＢＣＰＢ）、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）、テトラブロモフェノールブルー（ＴＢＰＢ）、ブロモクレゾールパープル（ＢＣＰ）、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）やエオシンが好ましい。
【００１５】
前記色素は、驚くべきことにほぼすべての種類のタンパク質と結合し、イオン会合体を形成する。本発明でのイオン会合体の形成機序は定かではないが、静電引力型イオン会合や疎水構造型イオン会合のいずれかであると考えられる〔本水，「総合論文 イオン会合を利用する分離・分析法の設計」，分析化学 38巻，147-170頁，1989年〕。
【００１６】
本発明では、このイオン会合体を溶媒中に完全に溶解させ、沈殿を生じさせないようにする。条件は、当業者により容易に実験的に設定可能である。
【００１７】
例えば、タンパク質含有溶液として、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）水溶液を用いた場合の条件例を表１に示す。
【００１８】
【表１】
試料と色素を混合する際に、色素は、色素を含有する溶液の形態で混合してもよく、または粉末や固形状の形態で混合してもよい。
【００２０】
試料と色素の混合によりイオン会合体は瞬時に形成される。
このイオン会合体の色調は、色素のそれと相違することが好ましい。例えば、表１の条件下で、ＢＣＰＢ、ＴＢＰＢやＢＰＢを用いた場合、タンパク質添加前は黄色であるのに対し添加後は青色となり、目視でタンパク質の定性・定量分析が可能となる。
【００２１】
例えば、図１に示したように、ＢＣＰＢはｐＫａ2 であるｐＨ４．１以下では−１価（ＨＢＣＰＢ- ）となり黄色を示すのであるが、タンパク質と会合することにより−２価（ＢＣＰＢ2-）となって青色を示すようになる。
【００２２】
以上のように色調の変化が黄色から青色のように吸収波長が離れていると、色調の変化を目視にて判別しやすいので特に好ましい。
【００２３】
なお、このような場合には、緩衝剤を添加し、溶液中のｐＨを色素のｐＫａよりも低く設定するのが好ましい。
【００２４】
このイオン会合体溶液を疎水性フィルタに通すことにより、イオン会合体溶液中のイオン会合体が疎水性フィルタに吸着される。
【００２５】
このイオン会合体が疎水性フィルタに吸着される原理は定かではないが、電気的に中和された会合体が溶液中において疎水性フィルタに疎水結合的に吸着すると考えられる。
【００２６】
なお、溶媒から疎水性フィルタへの分配比が小さい色素を選択することにより、フィルタ上には会合していない色素が殆ど吸着されないので、会合していない色素の色の影響を回避することが可能となる。
【００２７】
これにより、フィルタ上の会合していない色素を除去するための洗浄操作が不要となる。例えば、表１に示したすべての組み合わせにおいて、洗浄工程は不要である（フィルタにはニトロセルロースフィルタを使用）。
【００２８】
ところで、本発明においては、混合する試料と色素の量の比によってイオン会合体が疎水性フィルタに吸着する量が変わってくる。
【００２９】
これを実験的に示したのが図２である。
なお、この実験の操作の詳細は、後の参考例２に記載した。
【００３０】
この図２において、横軸は混合した試料中のタンパク質濃度を、左の縦軸は吸光度の差を、右の縦軸は吸光度を表す。
【００３１】
そして、この図２中の「○」は、イオン会合体に特異的な６０２ｎｍにおける、疎水性フィルタに通す前のイオン会合体溶液の吸光度から疎水性フィルタを通した後のろ液の吸光度を差し引いた値（吸光度の差）、つまり、疎水性フィルタに吸着したイオン会合体の量を表す。
【００３２】
また、「■」は、イオン会合体に特異的な６０２ｎｍにおける、疎水性フィルタに通す前のイオン会合体溶液の吸光度、つまり、イオン会合体溶液中に存在するイオン会合体の量を表す。
【００３３】
この図より、試料と色素を混合したイオン会合体溶液中に形成されるイオン会合体の量は、試料中のタンパク質濃度が高くなるにつれて増加してゆくことが分かる。
【００３４】
また、疎水性フィルタに吸着するイオン会合体の量は、試料中のタンパク質濃度が約３０ｍｇ／ｌまでの間は試料中のタンパク質濃度に応じて増加するが、この濃度以上では逆に低下してゆくことが分かる。
【００３５】
また、イオン会合体溶液を疎水性フィルタに通し乾燥した後の疎水性フィルタ上の着色の強さをデンシトメータで測定する実験を行った。
この実験の結果を図３に示した。また、実験の操作の詳細を後の参考例３に記載した。
【００３６】
図３において、横軸は色素と混合した試料中のタンパク質の濃度を、縦軸はイオン会合体に特異的な６０２ｎｍにおける吸光度の高さ（吸光度のピークの面積）を表す。
【００３７】
この図３から、この実験系において、疎水性フィルタ上のイオン会合体の量を表す６０２ｎｍにおける吸光度の高さは、試料中のタンパク質濃度が約５０ｍｇ／ｌまでの間は試料中のタンパク質濃度に応じて増加するが、この濃度以上では逆に低下してゆくことが分かる。
【００３８】
つまり、本発明において、試料中のタンパク質と色素の会合体の形成時に、色素の量に対してタンパク質の量が一定範囲にある場合は、形成されたイオン会合体は疎水性フィルタに吸着するが、一定範囲を越えタンパク質量が多くなってくると、形成されるイオン会合体の量は増えるにもかかわらず疎水性フィルタには吸着しなくなってくる。
【００３９】
本発明において、使用される疎水性フィルタの材質として、例えば、ニトロセルロース、オクタデシルシリル化シリカ、オクチルシリル化シリカ、エチルシリル化シリカ、メチルシリル化シリカ、フェニルシリル化シリカ、フルオロカーボン化シリカ、グラファイトカーボン化シリカ等が挙げられる。このようなフィルタは市販されており、例えば、混合セルロースエステルフィルタA020A025A（ニトロセルロース、ポアサイズ０．２μm 、アドバンテック東洋社製）が使用しうる。
【００４０】
フィルタ上の着色の測定は、目視により行っても、デンシトメータやスポットメータ等の機器を用いてもよい。また、着色強度は、例えば、可視部の吸光度、透過率、蛍光強度を測定することによりなされる。
【００４１】
なお、本発明において、フィルタ上の着色は、疎水性フィルタにイオン会合体溶液を通した直後の疎水性フィルタがぬれている時と、疎水性フィルタが乾燥している時では色が異なる。
【００４２】
これを実験的に示したのが図４である。
なお、この実験の詳細は、後の参考例４に記載した。
【００４３】
この図４において、横軸は疎水性フィルタ上の着色の吸光度測定時の波長を、縦軸はその時の吸光度の値を表す。
そして、この図４中の実線は、イオン会合体溶液を疎水性フィルタに通した直後の疎水性フィルタがぬれている時の吸光度を、破線はこの疎水性フィルタを乾燥した時の吸光度を表す。
【００４４】
この図より、疎水性フィルタ上の着色は、疎水性フィルタがぬれている時に比べて乾燥している時は、ＨＢＣＰＢ- に特異的な４３４ｎｍ近辺（黄色）の吸光度が減少し、かつイオン会合体に特異的な６０２ｎｍ近辺（青色）の吸光度が増加していることが分かる。
【００４５】
よって、フィルタ上の着色の測定は、フィルタを乾燥した後に行うことが好ましい。
フィルタの乾燥は、放置、風を当てること、又は加温等により行えばよい。
放置により乾燥する場合は、通常は２０分間以上放置すればよい。
【００４６】
上記の参考例２、参考例３、及び参考例４の結果より、本発明における試料中のタンパク質と色素の会合体の形成、形成されたイオン会合体の疎水性フィルタへの吸着、及び着色について、以下のような作用が推察される。
【００４７】
色素はｐＫａ2 以下のｐＨでは１価（ＨＢＣＰＢ- ）となっているが、タンパク質と会合することにより色素は多価（ＢＣＰＢ2-）となる。
この時に、色素の量に対してタンパク質の量が一定以上の場合は、タンパク質に会合している色素は多価（ＢＣＰＢ2-）であって、タンパク質の限定された特定の部位に会合する。
【００４８】
また、色素の量に対してタンパク質の量が一定以下の場合、つまりタンパク質に対して色素が過剰に存在する場合は、多価の色素（ＢＣＰＢ2-）が特定の部位に会合したタンパク質に、更に過剰に存在する１価の色素（ＨＢＣＰＢ- ）が非選択的に会合して多重会合体を形成する。
【００４９】
そして、色素の量に対してタンパク質の量が一定以上の場合に形成される、多価の色素とのイオン会合体は、疎水性フィルタとの親和性が低く僅かしか吸着しない。
【００５０】
しかし、色素の量に対してタンパク質の量が一定以下の場合に形成される多重会合体は、多価の色素に加えて１価の色素が多重に会合しているため疎水性が高くなり、疎水的親和性によって疎水性フィルタへの吸着率が高くなる。
【００５１】
以上のことは、試料中のタンパク質濃度が増加するにつれ形成されるイオン会合体量が増してゆくにもかかわらず、疎水性フィルタに吸着するイオン会合体の量が一定のタンパク質濃度を境に増加から減少に転じることより推察される。（図２及び図３を参照のこと。）
【００５２】
そして、疎水性フィルタに吸着した多重会合体は、多価の色素（ＢＣＰＢ2-）〔青色〕が会合した上に１価の色素（ＨＢＣＰＢ- ）〔黄色〕が多数会合しているため黄緑色を示すのであるが、これが乾燥状態に置かれることによってｐＨ又は塩濃度等の環境が変わり、１価の色素（ＨＢＣＰＢ- ）のプロトン解離、又はタンパク質の特定の部位への会合を引き起こし、１価の色素（ＨＢＣＰＢ- ）が多価の色素（ＢＣＰＢ2-）に変換され多価の色素の色（青色）に変わる。
【００５３】
上記のことは、乾燥により、１価の色素（ＨＢＣＰＢ- ）に特異的な４３４ｎｍ近辺（黄色）の吸光度が減少し、イオン会合体に特異的な６０２ｎｍ近辺（青色）の吸光度が増加することより推察される。（図４を参照のこと）
【００５４】
以上詳述したように、本発明の試料中のタンパク質の分析方法、及びタンパク質分析キットでは、分析を行う試料中のタンパク質の量に対して色素の量等を調整することにより、試料中のタンパク質が特定の濃度範囲にある時のみ、疎水性フィルタ上に着色を生じさせることができる。つまり、試料中のタンパク質が特定の濃度範囲にあることを検出することができる。
【００５５】
そして、色素の量等を調整して、着色を生じる濃度範囲を段階的に変えていった複数の濃度の色素よりなる分析キットを用いて１つの試料を分析することにより、その試料中のタンパク質の定量分析を行うことができる。
【００５６】
本発明のタンパク質分析キットであるが、図５に本発明の方法を実施するための分析キットの例（分析キット１）を示す。分析に際し、まず疎水性フィルタ２をシリンダ３の開口部に透き間なく固定する。
次に、試料と色素を混合したイオン会合体溶液を、予めシリンダ３内部に注入しておき、ピストン５を開口部４の方向に移動させて（すなわち、レバー６を押して）、イオン会合体溶液をシリンダ外部に押し出す。この際、このイオン会合体溶液中に含まれているイオン会合体が疎水性フィルタ２に吸着される。
あるいは、試料に色素を添加したイオン会合体溶液中に開口部４を導入し、ピストン５を開口部４と反対側に移動させる（すなわち、レバー６を引く）ことにより、シリンダ３内部にイオン会合体溶液を吸引して、疎水性フィルタ２にイオン会合体を吸着させる態様にしてもよい。
【００５７】
〔参考例１〕
（最適ｐＨの決定）
７．４５×１０-4M ブロモクロロフェノールブルー（ＢＣＰＢ）〔東京化成社製〕水溶液８ml及び２N ＮａＣｌ水溶液１mlを混合し、蒸留水を加え、全容を５００mlとした。
次に、４３０nmでの色素のみの吸光度、５９０nmでの色素のみの吸光度及び０．０５０４ｇのＨＳＡを混合してイオン会合体を形成させたときの６００nmでの吸光度を、ｐＨを変えて測定した。
その結果を図１に示す。
この結果から、この条件下ではｐＨ２．５付近とするのが最適である。
【００５８】
〔参考例２〕
（疎水性フィルタに吸着するイオン会合体の量の検討（１））
（１）色素溶液の調製
ＢＣＰＢ（東京化成社製）２．０３４ｍｇを蒸留水に溶解し全量１００ｍｌとして色素溶液〔３５μM ＢＣＰＢ溶液〕を調製した。
【００５９】
（２）緩衝液の調製
モノクロロ酢酸１８９ｍｇを蒸留水９０ｍｌに溶解し、塩酸でｐＨを３．１に調整した後、全量を１００ｍｌとし、緩衝液〔０．０２M モノクロロ酢酸−塩酸緩衝液（ｐＨ３．１）〕を調製した。
【００６０】
（３）試料の調製
ＨＳＡを、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００mg/lとなるように、生理食塩水（０．９% 塩化ナトリウム水溶液）に溶解し、１２種類の試料を調製した。
【００６１】
（４）測定
前記色素溶液１mlと前記緩衝液１mlを混合し、更に前記の各試料８mlを混合してイオン会合体溶液を調製した。
【００６２】
次に、これら１２種類のイオン会合体溶液それぞれの６０２ｎｍにおける吸光度を、Ｕ−２０００型分光光度計（日立製作所社製）で測定した。
【００６３】
その後、これら１２種類のイオン会合体溶液の１０mlを、それぞれニトロセルロースフィルタ（ポアサイズ：０．２μm 、直径：２５mm、製品番号：A020A025A、アドバンテック東洋社製）に上から注いで通した。
【００６４】
ここで得られた１２種類のろ液の６０２ｎｍにおける吸光度を先と同様にして測定した。
【００６５】
そして、疎水性フィルタに吸着したイオン会合体の量を算出するため、イオン会合体に特異的な６０２ｎｍにおける、疎水性フィルタに通す前のイオン会合体溶液の吸光度から疎水性フィルタを通した後のろ液の吸光度を差し引いた。
この結果を図２に示した。
【００６６】
〔参考例３〕
（疎水性フィルタに吸着するイオン会合体の量の検討（２））
（１）色素溶液の調製
ＢＣＰＢ（東京化成社製）２．０３４ｍｇを蒸留水に溶解し全量１００ｍｌとして色素溶液〔３５μM ＢＣＰＢ溶液〕を調製した。
【００６７】
（２）緩衝液の調製
モノクロロ酢酸１８９ｍｇを蒸留水９０ｍｌに溶解し、塩酸でｐＨを３．０に調整した後、全量を１００ｍｌとし、緩衝液〔０．０２M モノクロロ酢酸−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）〕を調製した。
【００６８】
（３）試料の調製
ＨＳＡを、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０mg/lとなるように、生理食塩水（０．９% 塩化ナトリウム水溶液）に溶解し、１０種類の試料を調製した。
【００６９】
（４）測定
前記色素溶液１mlと前記緩衝液１mlを混合し、これに前記の各試料１mlを混合し、更に蒸留水２mlを混合してイオン会合体溶液を調製した。
【００７０】
次に、これら１０種類のイオン会合体溶液５mlそれぞれをシリンジ内に吸引した後、シリンジの先にニトロセルロースフィルタ（ポアサイズ：０．２μm 、直径：２５mm、製品番号：A020A025A、アドバンテック東洋社製）を付け、シリンジ内のイオン会合体溶液をピストンで押してフィルタに通した。
【００７１】
これら１０種類のフィルタを４０℃の乾燥器で１０分間乾燥した後、フィルタ上の着色の６０２ｎｍにおける吸光度の高さ（吸光度のピークの面積）をＣＳ−９３００ＰＣ型デンシトメータ（島津製作所社製）で測定した。
この結果を図３に示した。
【００７２】
〔参考例４〕
（乾燥による疎水性フィルタ上の着色のスペクトル変化の検討）
（１）色素溶液の調製
ＢＣＰＢ（東京化成社製）２．０３４ｍｇを蒸留水に溶解し全量１００ｍｌとして色素溶液〔３５μM ＢＣＰＢ溶液〕を調製した。
【００７３】
（２）緩衝液の調製
モノクロロ酢酸１８９ｍｇを蒸留水９０ｍｌに溶解し、塩酸でｐＨを３．０に調整した後、全量を１００ｍｌとし、緩衝液〔０．０２M モノクロロ酢酸−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）〕を調製した。
【００７４】
（３）試料の調製
ＨＳＡを５０mg/lになるように、生理食塩水（０．９% 塩化ナトリウム水溶液）に溶解して試料を調製した。
【００７５】
（４）測定
前記色素溶液１mlと前記緩衝液１mlを混合し、これに前記の試料１mlを混合し、更に蒸留水２mlを混合してイオン会合体溶液を調製した。
【００７６】
次に、このイオン会合体溶液５mlをシリンジ内に吸引した後、シリンジの先にニトロセルロースフィルタ（ポアサイズ：０．２μm 、直径：２５mm、製品番号：A020A025A、アドバンテック東洋社製）を付け、シリンジ内のイオン会合体溶液をピストンで押してフィルタに通した。
【００７７】
このフィルタを４０℃の乾燥器で１０分間乾燥した後、フィルタ上の着色の吸光度スペクトルをＣＳ−９３００ＰＣ型デンシトメータ（島津製作所社製）でスキャンして測定した。
この結果を図４に示した。
【００７８】
【発明の効果】
本発明によれば、抽出工程、発色工程、洗浄工程が原則的に不要であるため工程数が非常に少なく、またイオン会合の原理を採用しているので色測定が短時間で可能であり、更に沈殿させないでフィルタに吸着させるので定量性に優れている、簡易迅速なタンパク質の分析手段が提供される。
【００７９】
そして、本発明の分析方法及び分析キットにおいては、試料中のタンパク質が特定の濃度範囲にあることを検出することができる。
【００８０】
更に、複数の濃度の色素よりなる分析キットを用いることにより、試料中のタンパク質の定量分析を行うこともできる。
【００８１】
【実施例】
〔実施例１〕
（試料中のタンパク質の分析（１））
（１）色素含有溶液の調製
ＢＣＰＢ（東京化成社製）を３７２．５μM となるように１M モノクロロ酢酸−塩酸緩衝液（ｐＨ２．０５）に溶解し、色素含有溶液を調製した。
【００８２】
（２）試料の調製
ＨＳＡを、１.０、２.５、５.０、１０、２５、５０、１００、２００、２５０、５００mg/lになるように、生理食塩水（０．９% 塩化ナトリウム水溶液）に溶解し、１０種類の試料を調製した。
また、ＨＳＡを５０mg/lとなるように尿に溶解した試料も調製した。
【００８３】
（３）測定
前記色素含有溶液０．５mlと前記の各試料２mlを混合した。その後、これら１１種類の混合液の０．５mlを、それぞれニトロセルロースフィルタ（ポアサイズ：０．２μm 、アドバンテック東洋社製）に上から注いで通した。
【００８４】
このフィルタの色を目視により測定した。
フィルタ上に青色のスポットが検出された場合、試料中にタンパク質が存在すると判定した。
【００８５】
その結果、２．５mg/lの濃度まで、目視で判定可能であった。
また、フィルタ上にＵＶランプを照射し、その蛍光（赤色）を目視により測定した。その結果、すべての濃度において目視で判定可能であった。
【００８６】
そして、フィルタの色の測定及び蛍光色の測定のいずれの手段においても、尿試料中のＨＳＡが確認された。
【００８７】
〔実施例２〕
（試料中のタンパク質の分析（２））
（１）色素溶液の調製
ＢＣＰＢ（東京化成社製）２．０３４ｍｇを蒸留水に溶解し全量１００ｍｌとして色素溶液〔３５μM ＢＣＰＢ溶液〕を調製した。
【００８８】
（２）緩衝液の調製
モノクロロ酢酸１８９ｍｇを蒸留水９０ｍｌに溶解し、塩酸でｐＨを３．０に調整した後、全量を１００ｍｌとし、緩衝液〔０．０２M モノクロロ酢酸−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）〕を調製した。
【００８９】
（３）試料の調製
ＨＳＡを、１．２５、３．７５、６．２５、１０、１２．５、１６．２５、１８．７５、２２．５、２５、３７．５、５０、７５、１００mg/lとなるように、生理食塩水（０．９% 塩化ナトリウム水溶液）に溶解し、１３種類の試料を調製した。
また、対照として、生理食塩水よりなる試料も用意した。
【００９０】
（４）測定
前記色素溶液１mlと前記緩衝液１mlを混合し、これに前記の各試料１mlを混合し、更に蒸留水２mlを混合してイオン会合体溶液を調製した。
【００９１】
次に、これら１４種類のイオン会合体溶液５mlそれぞれをシリンジ内に吸引した後、シリンジの先にニトロセルロースフィルタ（ポアサイズ：０．２μm 、直径：２５mm、製品番号：A020A025A、アドバンテック東洋社製）を付け、シリンジ内のイオン会合体溶液をピストンで押してフィルタに通した。
【００９２】
これら１４種類のフィルタを４０℃の乾燥器で１０分間乾燥した。
これらのフィルタの色を目視により測定した。
フィルタ上の着色を図６に示した。
【００９３】
この結果、試料中のタンパク質濃度が３．７５mg/l〜２２．５mg/lの場合に青色の着色が検出された。
つまり、３．７５mg/l〜２２．５mg/lの試料中のタンパク質の存在が確認された。
【００９４】
〔実施例３〕
（試料中のタンパク質の分析（３））
（１）色素溶液の調製
ＢＣＰＢ（東京化成社製）の、１０．１７ｍｇ、１４．５３ｍｇ、１５．９８ｍｇ、１７．４３ｍｇ、２０．３４ｍｇ、２１．７９ｍｇ、２３．２４ｍｇ、２９．０５ｍｇ、又は４０．６７ｍｇを蒸留水に溶解し全量１００ｍｌとして９種類の色素溶液〔１７５μM 、２５０μM 、２７５μM 、３００μM 、３５０μM 、３７５μM 、４００μM 、５００μM 、又は７００μM ＢＣＰＢ溶液〕を調製した。
【００９５】
（２）緩衝液の調製
モノクロロ酢酸１．８９ｇを蒸留水９０ｍｌに溶解し、塩酸でｐＨを３．１に調整した後、全量を１００ｍｌとし、緩衝液〔０．２M モノクロロ酢酸−塩酸緩衝液（ｐＨ３．１）〕を調製した。
【００９６】
（３）試料の調製
ＨＳＡを、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００mg/lとなるように、生理食塩水（０．９% 塩化ナトリウム水溶液）に溶解し、１１種類の試料を調製した。
また、対照として、生理食塩水よりなる試料も用意した。
【００９７】
（４）測定
前記９種類の色素溶液１mlのそれぞれと前記緩衝液１mlを混合したものを１２組用意した。
この１組ずつに前記の１２種類の試料の１種類ずつをそれぞれ１ml混合し、更に蒸留水２mlを混合して合計１０８種類のイオン会合体溶液を調製した。
【００９８】
次に、これら１０８種類のイオン会合体溶液５mlそれぞれをシリンジ内に吸引した後、シリンジの先にニトロセルロースフィルタ（ポアサイズ：０．２μm 、直径：２５mm、製品番号：A020A025A、アドバンテック東洋社製）を付け、シリンジ内のイオン会合体溶液をピストンで押してフィルタに通した。
【００９９】
これら１０８種類のフィルタを４０℃の乾燥器で１０分間乾燥した。
このフィルタの色を目視により測定した。
【０１００】
これらのフィルタ上の着色を図７に示した。
この図７において、横軸は試料中のタンパク質濃度を、縦軸は色素溶液中のＢＣＰＢ濃度を表す。
そして、この図７中の「●」は疎水性フィルタ上の着色が青色であることを、「◎」は疎水性フィルタ上の着色がうすい水色であることを、そして「○」は疎水性フィルタが着色されていないことを表す。
【０１０１】
また、図８には、ＣＳ−９３００ＰＣ型デンシトメータ（島津製作所社製）で測定した、これら１０８種類のフィルタ上の着色の６０２ｎｍにおける吸光度の高さ（吸光度のピークの面積）を示した。
【０１０２】
これらの結果より、本発明においては、分析を行う試料中のタンパク質の量に対して色素の量を調整することにより、試料中のタンパク質が特定の濃度範囲にある時のみ、疎水性フィルタ上に着色を生じさせることができる。
つまり、試料中のタンパク質が特定の濃度範囲にあることを検出することができることが確かめられた。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＨと、色素（４３０nm、５９０nm）及びイオン会合体（６００nm）の吸光度との関係を示した図である。
【図２】試料中のタンパク質濃度と疎水性フィルタに吸着するイオン会合体等の量の関係を示した図である。
【図３】試料中のタンパク質濃度と疎水性フィルタに吸着するイオン会合体の量の関係を示した図である。
【図４】疎水性フィルタがぬれている時と乾燥している時の着色のスペクトルを示した図である。
【図５】本発明に係るタンパク質分析キットである。
【図６】各タンパク質濃度の試料における疎水性フィルタの着色を示した図（写真）である。
【図７】試料中のタンパク質濃度及び色素溶液中のＢＣＰＢ濃度の両方を変えて分析を行った時の疎水性フィルタの着色を示した図である。
【図８】試料中のタンパク質濃度及び色素溶液中のＢＣＰＢ濃度の両方を変えて分析を行った時の疎水性フィルタの着色の吸光度の高さを示した図である。
【符号の説明】
１ 分析キット
２ 疎水性フィルタ
３ シリンダ
４ 開口部
５ ピストン
６ レバー
Claims (3)
- ａ）タンパク質を含有する可能性がある試料と、ブロモクロロフェノールブルー、クマシーブリリアントブルー、テトラブロモフェノールブルー、ブロモクレゾールパープル及びブロモフェノールブルーから選ばれる色素を、該色素のｐＫａよりも低いｐＨにおいて混合し、形成される該タンパク質と該色素とのイオン会合体を沈殿させずにイオン会合体溶液を形成させる工程；
ｂ）該イオン会合体溶液を疎水性フィルタに通すことにより、該イオン会合体溶液中に溶解した該会合体を該フィルタに吸着させる工程；
ｃ）該フィルタを乾燥させる工程；及び
ｄ）該フィルタ上の該会合体を定性・定量的に分析する工程を順次行うことを特徴とする試料中のタンパク質の分析方法。 - 色素が、ブロモクロロフェノールブルーである、請求項１記載の試料中のタンパク質の分析方法。
- ブロモクロロフェノールブルー、クマシーブリリアントブルー、テトラブロモフェノールブルー、ブロモクレゾールパープル及びブロモフェノールブルーから選ばれる色素；試料と該色素とを混合したイオン会合体溶液のｐＨを該色素のｐＫａよりも低く設定することができる緩衝剤；及び疎水性フィルタを含む、請求項１記載の方法に使用される夕ンパク質分析キット。
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