JPS6345563A - 細胞分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、細胞分析方法に係り、特に細胞の免疫能を利
用して被検細胞とマーカを結びっけ、被検細胞を測定す
る方法に関する。

〔従来の技術〕

リンパ球や赤血球などの血液細胞や組繊細胞の免疫能を
利用して細胞を測定する方法は、応用研究が始まったば
かりである。

リンパ球にはＴ細胞（Ｔリンパ球）とＢ細胞（Ｂリンパ
球）とがある。両者は共に共通の骨髄幹細胞から発生し
たものであるが、互いに協調して機能し、マクロファー
ジ、単球・多核白血球らと共同して免疫反応を起こす。

各種免疫疾患において、細胞性免疫に重要な役割を演す
るＴ細胞、および液性抗体の産生をつかさどるＢ細胞の
量的異常を測定することは、診断あるいは疾患の病態を
把握する上で役立つといわれている。

血液中の細胞を測定する方法を示した第１の先行技術と
して゛日本臨床；ｖｏＱ、４０．秋小臨時増刊号、第９
８５頁（１９８２）”が知られている。この刊行物には
、Ｔ細胞とＢ細胞の測定方法が示されている。この第１
の先行技術において、Ｔ細胞は、ヒツジ赤血球（ＳＲＢ
Ｃ）と試験管内でロゼツトを形成する性質を利用して測
定する。

あるいは特異的にＴ細胞と反応する抗体（抗Ｔ！ｌｌ胞
抗体）を用いて膜蛍光抗体法で染色する。また。

Ｂ細胞は、マウス赤血球（ＭＲＢＣ）と試験管内でロゼ
ツトを形成する性質を利用して測定する。

あるいは膜表面に免疫グロブリンを保有しているので蛍
光標識抗ヒト免疫グロブリン血清を適用し。

蛍光顕微鏡（膜蛍光抗体法）で陽性細胞をａ察する。

第２の先行技術は、米国特許筒４，５１０，２４４に示
されている。この例では、蛍光粒子を結合（ｂｉｎｄ）
した抗原と、ハイブリドーマ細胞とを結合し、混合物を
含む液をセルソータに導いて１個々の蛍光標識された細
胞と、ラベルされない他の細胞とを分別することを示し
ている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

第１の先行技術におけるロゼツト形成反応を利用する方
法は、その手技操作が面倒であるうえに。

ロゼツト形成反応に長時間を要し、しかも血球計算板を
使用する検鏡が必要であるなど、Ｔ細胞。

Ｂ細胞の測定には多大の手間と長時間を必要とする。ま
た１ｗＡ蛍光蛍光法は、抗体１分子に結合させることの
できる標識化合物（蛍光物質）数に限りがあるため、検
出感度が低いという問題がある。

また、第２の先行技術の方法によっても、被検細胞を十
分な感度で検出することができない。

本発明の目的は、特定の細胞を選択的に検出し得、かつ
高感度に被検細胞を検出し得る細胞分析方法を提供する
ことにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、被検細胞の同系の抗体であってマイクロカプ
セルによって標識化された抗体と、被検細胞とを、結合
せしめた後、被検細胞と結合されたマイクロカプセルを
検出することによって、ラベルされた被検細胞を測定す
る。

〔作用〕

本発明における標識物は、光学的特性を有する物質が封
入されたマイクロカプセル（ｍｉｃｒｏ−ｃａｐｓｕｌ
ｅｓ）である。そして、本発明では、測定の際にマイク
ロカプセルを破壊することなく検出することが特徴的で
ある。

本発明の望ましい実施例では、複数種類のマイクロカプ
セルを用いることにより、複数種類の被検細胞を同じサ
ンプルについて検出することができる。この場合、種類
の異なるマイクロカプセルには異なる被検細胞と同系の
抗体が結合されており、かつ、種類の異なるマイクロカ
プセル内には。

異なる光学的特性を示し得る物質が封入されている。

本発明では、小胞体内に光学的測定を可能ｌこする標識
物質、またはその前駆体を封入しておき。

この小胞体を細胞の免疫能を利用して細胞に結合するこ
とにより細胞の識別を容易にする。小胞体内には多数の
標識分子を収容することができるので、小胞体が細胞と
結合したしきに標識物質等に基づく発光あるいは発色が
大となり、被検細胞の周ｇ！Ａ（背景）からの識別性が
増すのである。

本発明における小胞体（ｍｉｃｒｏ　−ｃａｐｓｕｌｅ
ｓ）には、被検細胞と特異的に反応する抗体を結合し、
マイクロカプセルを細胞と抗原抗体反応によって結びつ
ける。被検細胞と特異的に反応する抗体とは、被検細胞
自身に対しであるいは被検細胞の表面上の特定成分物質
に対して特異的に反応する同系の（ｃｏｇｎａｔｅ　）
抗体を意味する。

小胞体としては、リポソームなどの脂質膜を好適に使用
することができるが、これに限定されるものではなく、
十分量の標識化合物あるいはその前駆体を封入できるも
のであればよい、また、小胞体に封入される検出時に指
標となる標識化合物としては、蛍光物質２色素、キレー
ト鉗化合物あるいはこれらの前駆体などを使用すること
ができる。但し、ある種の蛍光物質などでは、高濃度と
すると自己消光作用により蛍光を発しなくなるような場
合がある。このため、小胞体に封入する時の標識化合物
の濃度は適宜選択される。小胞体をリポソームを例とし
て説明すると、もともと患部へのミサイル治療のための
薬剤運搬体としてその研究が進展してきたことからも明
らかなように。

リポソームは多量の内容物の収容に適している。

このようなリポソームに収容することのできる標識分子
の数は、１リポソームあたり１０”〜１０４分子とする
ことが可能である。すなわち、リポソ−ムに結合した抗
体１分子あたりで換算すると、従来の標識法に比べて少
なくとも１０”倍の増感となるのである。

本発明は、試料中に複数種の測定対象細胞が存在する場
合に、各種細胞を同時に測定することも可能にする。こ
の場合の構成は、標識物質あるいはその前駆体を封入し
た第１の小胞体に、第１の被検細胞と特異的に反応する
第１の抗体を結合させること、標識化合物あるいはその
前駆体を封入した第２の小胞体に第２の被検細胞と特異
的に反応する第２の抗体を結合させること、上記第１の
抗体を備えた第１の小胞体および上記第２の抗体を備え
た第２の小胞体をそれぞれ対応する被検細胞に結合させ
ること、上記第１小胞体の結合された第１の被検細胞お
よび上記第２小胞体の結合された第２の被検細胞を光学
的に測定することによって達成される。マイクロカプセ
ルは、懸濁液あるいは乾燥状態で供給し得る。

リポソーム内に封入する蛍光性物質は、水溶性であるこ
とが好ましく、例えば、ＦＩＴＣ，ＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅ
ｒｙｔｈｒｉｎ）　　、　　Ｔ　ＲＩ　Ｔ　Ｃ（ｔｅｔ
ｒａ　ｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）　＊ローダミ
ン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）　、エオシン（２’　　、４
’　　、５’　　、７’　　−ｔａｔｒａｂｒｏｍｏｆ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）。

アクリジンオレンジ（３、６−ｂｉｓ−ｄｉｍｅｔｈｙ
ｌａｍｉｎｏ　ａｃｒｉｄｉｎｅ）などを後述の実施例
に示すカルボキシフルオレセインに代えて用いることが
できる。

リポソーム内に封入するために適した水溶性色素および
水溶性キレート試薬としては、キレート剤と金属イオン
との錯体、エリオフロムブラックＴ、ＴＡＭＳＭＢ、ロ
ーダミンＢ、オキザミンレツドＸ、アシツドオシンジエ
、ネジレノールオレンジ、メチルキシレノールブルー、
メチルチモールブルー、　５−Ｂ　ｒ−ＰＡＰＳ、　５
−Ｂ　ｒ　−ＰＳＡＡ。

ジメチルスルホナシ−■、クロマズロールＢ、ニトロＰ
ＡＰＳ、バソフェナンドロリンなどを適宜選択すること
ができる。

〔実施例〕

本発明の望ましい実施例では、光学的測定手段として、
蛍光顕微鏡を用いているが、これに限定されるものでは
なく、標識物質の封入された小胞体が結合された細胞を
含んだ液を、細い通路のフローセルに連続的に流し、次
々にフローセルを通過する個々の細胞を識別するように
構成したフローサイトメータ方式の光度計を用いること
もできる。検出器として、”Ｈｏｗａｒｄ　ｅｔａｌ、
　　：　ＰｒａｃｔｉｃａｌＦｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔ
ｒｙｔ　ｐ　ｐ　６０　＋　Ａｌａｍ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、
　Ｉｎｃ。

発行（１９８５）”に示されているようなフローサイト
メータを用いる場合には、次のように操作する。すなわ
ち、被検細胞を含むサンプルと、マイクロカプセルを持
っている抗体とを混合し、被検細胞にマイクロカプセル
を免疫反応で結合させる。これらの結合体が懸濁された
液を形成せしめた後、この液をフローサイトメータに導
いて、何個のマイクロカプセル（小胞体）を光学的に観
測し、被検細胞を計数する。この場合、マイクロカプセ
ル内にはフルオレセインインチオシアネート（ＦＩＴＣ
）のような蛍光性物質を封入しておく。

本発明による分析方法の対象としては、前述のＴ細胞、
Ｂ細胞などのリンパ球をはじめとした各種細胞を考える
ことができる。これらの細胞は、細胞受遊液の状態であ
ってもよいし、血液や組織などの標本であってもよい、
また、試料形態は、スライドガラス上に形成した血液塗
抹標本あるいは生体組織標本であってもよい。

以下本発明の実施例について説明する。

（実施例１） 本実施例は、Ｔ細胞の測定に関する。この例は、抗ヒト
Ｔ細胞抗体を使用した測定例である。

マイクロカプセルの準備ニ スフィンゴミエリンおよびコレステロールを含むリポソ
ームを調製した。この調製は、例えば“Ｍｅｔｈｏｄ　
ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｖｏ　ｆｌ　、　７４
　、　ｐ　ｐ　１５２〜１６１　”に記載されているよ
うな常法に従った。

リポソーム内には、蛍光性物質であるカルボキシフルオ
レセイン１００μＭ溶液を封入し、過剰の蛍光物質は透
析により除去した。次に、架橋剤として５ＰＤＰ　（す
なわち、Ｎ　−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　　３−　（
２−ｐｙｒｉｄｙｉｄｉｔｈｉｏ）　ｐｒｏｐｉｏｎａ
ｔｅ）を使用して。

市販の抗Ｔ細胞抗体に、調製されたリポソームを結合さ
せた。

サンプルの前処理： 患者より採取したヘパリン添加の末梢血液５ｍＱを２倍
に希釈し、Ｃｏｎｒａｙ　−Ｆｉｃｏｌｌ液１容に対し
希釈サンプル２容を重層した。４００ｇにて、２０分間
遠心した後、中間層の白血球を採取し、３回洗浄後細胞
数を５Ｘ１０６／ｍｆ１．に調製して末梢血単核球を分
離した。この分離して取出した単核球浮遊液０．２　ｍ
Ωを小試験管に入れ、１５０ｇにて５分間遠心し上清を
除去した。

分析操作： 単核球浮遊液に５０μＱのリポソーム標識抗ヒトＴ細胞
抗体を加えてよく混合し、４℃で６０分間免疫反応させ
た。細胞を１％牛血清アルブミン含有−０，１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，２）で３回洗浄して上清を捨てた後、
グリセリン！衝液（グリセリン１容ニリン酸緩衝液１容
）と細胞浮遊液を顕微鏡用スライドグラス上に一滴ずつ
加えてカバーグラスを包埋した。Ｔ細胞の判定は蛍光顕
微鏡を用いて行なった。励起波長４８５ｎｍ。

蛍光波長５２５ｎｍとした。蛍光を発するマイクロカプ
セルの数を計数することにより、サンプル中に含まれる
被検Ｔ細胞の数を計数した。

本実施例による測定結果と従来法による測定結果を表１
に示す。この従来法は、ＦＩＴＣ分子で標識化した抗体
と、Ｔ細胞とを結合し、未反応の細胞を洗浄除去する。

その後細胞を含む液を顕微鏡スライド上で載せて蛍光顕
微鏡で＆ｌｔ察するものである。表１によれば、本発明
を適用すると従来の１０倍以上の高感度が得られること
を示している。

表Ｉ　Ｔ細胞判定結果 （実施例２） 本実施例は、同じサンプルについてＴ細胞とＢ細胞の両
方を測定し得る方法に関する。この例では、実施例１と
違って、顕微鏡スライド上にサンプルを載せた後、被検
細胞とマイクロカプセルを結合させる。

マイクロカプセルの準備： 実施例１と同様にして、ＦＩＴＣ封入のリポソーム結合
抗Ｔ細胞抗体と、Ｔ　Ｉ　Ｔ　Ｃ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈ
ｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１ｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａ
ｔｃ）封入のリポソーム結合抗Ｂ細胞抗体をそれぞれ調
製した。

分析操作： 患者血液の薄層塗抹標本を作成し乾燥後、ただちに固定
した。固定は、４℃８５％エタノール５分間とした。

固定した血液塗抹標本に、まずＦＩＴＣ封入のリポソー
ム結合抗Ｔ細胞抗体液を載せて３７℃。

３０分間反応させた。この後、冷リン酸緩衝液で十分洗
浄した。続いて、ＲＩＴＣ封入のリポソーム結合抗Ｂ細
胞抗体液を同じ塗抹標本に載せて３７℃、３０分間反応
させた。その後、冷リン酸緩衝液で十分洗浄した６両抗
体との反応ののち、蛍光顕微鏡を用いてＴ、Ｂ両細胞を
検出し、それぞれ計数した。Ｔ細胞の計数には、励起４
９０゜蛍光５２０ｎｍを、Ｂ細胞の計数には励起５５０
゜蛍光６２０ｎｍの各波長を使用した。結果を表２に示
す。

表２　末梢血Ｔ細胞、Ｂ細胞の百分率（％）なお、表２
中のＥ−ＲＦＣ法とは従来法であるヒツジ赤血球ロゼツ
ト形成反応ｍ、Ｍ−ＲＦＣ法とは同様のマウス赤血球ロ
ゼツト形成反応法のことである。

従来のロゼツト形成反応法は、聞定精度が高いけれども
、処理に長時間膜し、かつ操作も煩雌であるという難点
を有する。これに対し本発明に基づけばそのような難点
が解消される。

（実施例３） この実施例は、同じサンプルについて白血球と赤血球と
血小板をそれぞれ計数して分類可能にしたものである。

マイクロカプセルの準備： 色調の違う複数種類の色素を内包させたリポソームを調
製した。白血球測定用の第１のリポソーム内には、ニト
ロソＰＳＡＰとＦｅ２＋との錯体液（吸収波長７６０ｎ
ｍ）を封入した。赤血球測定用の第２のリポソーム内に
はエリオフロムブラックＴ液（吸収波長５５０ｎｍ）を
封入した。血小板測定用の第３のリポソーム内にはＴＡ
ＭＳＭＢ液（吸収波長４８５ｎｍ）を封入した１次いで
。

第１のリポソームには抗ヒト白血球抗体を、第２のリポ
ソームには抗ヒト赤血球抗体を、第３のリポソームには
抗ヒト血小板抗体を、それぞれ結合させた。

分析操作： 実施例１と同様に処理して、患者の血液サンプルに各種
のリポソームを持っている各抗体を順次混合して各被検
細胞と対応する抗体を反応させた後、細胞浮遊液を顕微
鏡用スライドに載せて標本を作成した。または、実施例
２と同様に処理して。

顕微鏡用スライド上に血液サンプルを塗抹（ｓｍｅａｒ
）した後、各種のリポソームを持った抗体を塗抹サンプ
ルに順次作用させて標本を作成した。

作成した標本を、Ｕ、　Ｓ　、　Ｐａｔｅｎｔ４，３６
２，３８６に示されているような光学顕微鏡付き分析装
置に１ｏａｄ　シ、標識化された被検細胞（複）をＭＬ
　察した。

リポソームからなるマーカーを指標としてそれぞれの細
胞を計数し、血球を分類した。測定波長は。

７６０ｎｍ、５５０ｎｍ、４８５ｎｍであり、各波長信
号を独自に処理した。

本発明において適用される前駆体としては、例えばＰＨ
指示薬を用いることができる。この場合、マイクロカプ
セルを破壊することなく被検細胞とマイクロカプセルと
の結合体の浮遊液のｐ　Ｈ値を変えることによって発色
させることができる。

本発明によれば、標識物質を封入した小胞体を被検細胞
に結合させることにより細胞を高感度に測定することが
でき、しかも比較的簡便な操作で行なえるので、病院等
の検査業務に大きく寄与できる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、標識物質を封入した小胞体を被検細胞
に結合させることにより細胞を高感度に測定することが
でき、しかも特定の細胞を選択的に検出できるので、病
院等の検査業務に大きく寄与できる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、標識物質あるいはその前駆体を封入した小胞体に、
   被検細胞と特異的に反応し得る抗体を結合させること、
   上記抗体を備えた小胞体を上記被検細胞に結合させるこ
   と、および上記小胞体の結合された被検細胞を光学的に
   測定することを含む細胞分析方法。 ２、標識物質あるいはその前駆体を封入した第１の小胞
   体に、第１の被検細胞と特異的に反応し得る第１の抗体
   を結合させること、標識物質あるいはその前駆体を封入
   した第２の小胞体に第２の被検細胞と特異的に反応し得
   る第２の抗体を結合させること、上記第１の抗体を備え
   た第１の小胞体および上記第２の抗体を備えた第２の小
   胞体をそれぞれ対応する被検細胞に結合させること、上
   記第１問胞体の結合された第１の被検細胞および上記第
   ２小胞体の結合された第２の被検細胞を光学的に測定す
   ることを含む細胞分析方法。 ３、（ａ）被検細胞の同系の抗体であつて、マイクロカ
   プセルを持つている抗体と、被検細胞 とを結合させること、ここで、上記マイク ロカプセル内には光学的特性を示す物質が 封入されている、 （ｂ）上記マイクロカプセルを破壊させることなく、上
   記被検細胞に結合されたマイクロ カプセルを光学的に検出すること、 を含む細胞分析方法。 ４、（ａ）被検細胞の同系の抗体であつてマイクロカプ
   セルを持つている複数種の抗体と、そ れらの抗体に対応する複数種の被検細胞と を結合させること、ここで、それぞれのマ イクロカプセル内には光学的特性を示す物 質が封入されている、 （ｂ）上記マイクロカプセルを破壊させることなく、上
   記複数種の被検細胞と結合された マイクロカプセルを光学的に検出すること、を含む細胞
   分析方法。 ５、特許請求の範囲第４項の方法において、異なる種類
   の抗体と結合されたマイクロカプセル内には、異なる光
   学的特性を有する物質が封入されていることを特徴とす
   る細胞分析方法。 ６、特許請求の範囲第５項の方法において、上記光学的
   検出の際には、各々の種類毎にマイクロカプセルを計数
   することを特徴とする細胞分析方法。 ７、（ａ）被検細胞の同系の抗体であつて、マイクロカ
   プセルを持つている抗体と、被検細胞 とを、免疫的に結合させること、ここで、 上記マイクロカプセル内には、光学的特性 を有する物質が封入されている、 （ｂ）被検細胞と結合されたマイクロカプセル内に封入
   された物質の色、又はマイクロカ プセル内に封入された物質からの蛍光を観 測すること、 を含む細胞分析方法。 ８、特許請求の範囲第７項の方法において、上記光学的
   特性を有する物質は、蛍光性物質、色素、キレート錯体
   、又はこれらの前駆体の中から選択されることを特徴と
   する細胞分析方法。 ９、（ａ）被検細胞を含むサンプルを顕微鏡用スライド
   上に載せること、 （ｂ）上記スライド上のサンプル中の被検細胞と、マイ
   クロカプセルを持つた抗体とを結 合させること、ここで、上記マイクロカプ セル内には光学的特性を示す物質が封入さ れている、 （ｃ）上記被検細胞と結合されたｍｉｃｒｏ−ｃａｐｓ
   ｕｌｅｓを光学顕微鏡で観測すること、を含む細胞分析
   方法。 １０、（ａ）被検細胞を含むサンプルと、マイクロカプ
   セルを持つている抗体とを混合し、上記 被検細胞とマイクロカプセルを結合するこ と、ここで、上記マイクロカプセル内には 光学的特性を有する物質が封入されている、（ｂ）混合
   液を顕微鏡用スライド上に載せること、 （ｃ）上記被検細胞と結合されたｍｉｃｒｏ−ｃａｐｓ
   ｕｌｅｓを光学顕微鏡で観測すること、を含む細胞分析
   方法。 １１、（ａ）被検細胞を含むサンプルと、マイクロカプ
   セルを持つている抗体とを混合すること。 ここで、上記マイクロカプセル内には光学 的特性を有する物質が封入されている、 （ｂ）上記被検細胞と、上記マイクロカプセルを持つて
   いる抗体との結合体が懸濁された 液を形成せしめること、 （ｃ）上記懸濁液をフローサイトメータに導いて、ｍｉ
   ｃｒｏ−ｃａｐｓｕｌｅｓを光学的に観測すること、 を含む細胞分析方法。