KR20220104043A - G-17, pgi, pgii 연합 검출장치 및 그 제조방법 - Google Patents

G-17, pgi, pgii 연합 검출장치 및 그 제조방법 Download PDF

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KR20220104043A
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Abstract

가스트린17(G-17), 펩시노겐I(PG1), 펩시노겐II(PGII) 연합 검출장치 및 제조 방법이다. 연합 검출장치는 고체상의 고 특이성 G-17, PG1, PGII 항체 및 염소항마우스IgG 폴리클로날 항체가 설치된 니트로셀룰로오스 막(3), 금콜로이드 표기된 G-17, PG1, PGII항체가 흡착된 유리 섬유 막(2), 샘플 패드(1), 흡수 패드(4)등 기타 보조재자 접착되어 제조된다. 상기 장치는 면역 금콜로이드의 완전한 방출을 보장하는 것을 기반으로 반응 감도를 효과적으로 향상시킬 수 있으며, 동일한 임계값에서 또한 면역 금콜로이드의 사용량도 줄일 수 있어 비용을 절감하고, 샘플중의 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II 3종의 위기능, 위암 위험표지물을 동시에 검측할 수 있을뿐만 아니라, 생산조작의 복잡성도 증가하지 않았다. 상기 장치는 감도가 높고, 특이성이 강하고, 조작이 편리하고 시간을 절약하며, 실용성이 강하다.

Description

G-17, PGI, PGII 연합 검출장치 및 그 제조방법
본 출원은 2020년04월30일에 중국 특허청에 제출된, 출원번호가 202010370096.6 이고, 발명의 명칭이 "G-17, PGI, PGII 연합 검출장치 및 그 제조방법"인 중국 특허출원의 우선권을 주장하며, 그 전부 내용은 인용하는 것에 의해 본 출원에 포함된다.
본 발명은 의료 검출장비 분야에 관한 것으로, 특히, 가스트린 17, 펩신 I 및 펩신 II의 연합 검출장치 및 그 제조방법에 관한것이며, 금콜로이드 면역크로마토그래피 기술과 이중항체 샌드위치법 원리를 이용한 전혈, 혈청 및 혈장 샘플에서 인간 가스트린 17(G-17), 펩시노겐(PGI) 및 펩시노겐(PGII)의 정량 검출장치 및 그 제조방법은, 위암 위험표지물의 민감하고 특이하며 신속한 검출을 달성할 수 있다.
위 점막 병변은 약물, 알코올, 위산분비 이상, 헬리코박터 파일로리 감염 등 다양한 요인에 의해 발생하는데, 이 중 헬리코박터균 감염이 주요 원인이며; 위점막에 손상이 발생하면 그 기능도 변화하게 된다. 위암은 한 그룹의 다요소에 의해 발생하는 점진성 상피세포 악성 병변으로, 대부분이 만성 위축성 위염에서 점차 발전된 것이며, 만성 위축성 위염의 약 7%는 결국 상피내암으로 진행된다. 비정상적인 세포 증식과 HP 감염은 모두 위축성 위염의 진행 속도를 빠르게 할 수 있다. 중국은 위암 발병률이 높은 지역으로 매년 20만명 이상의 주민이 위암으로 사망한다. 근치적 절제술과 방사선 요법 및 화학 요법을 병행하면 위암 환자의 생존율을 5년 향상시킬 수 있지만 사망률을 줄이는 데는 거의 효과가 없으며; 연구에 따르면 조기 검진은 위암의 발병률과 사망률을 줄이는 관건이다.
가스트린(gastrin, GAS)은 유문동, 십이지장 및 공장 상단 점막의 G 세포에 의해 분비되는 하나의 위장 호르몬 부류이다. Edkins는 1905년에 개의 유문동에서 처음 발견되어 널리 알려지게 되었다. 인간 혈청의 가스트린은 주로 가스트린-17(gastrin-17, G-17) 및 가스트린-34(gastrin-34, G-34)의 두 가지 이성질체를 포함하며, 그 중 가스트린-17이 85~90%를 차지한다. 그래서 사람들은 통상적으로 가스트린-17을 선택하여 혈청 가스트린 수준을 나타낸다. 생리적 상태에서 가스트린은 주로 위산분비에 영향을 주어 작용되며, 한편으로 가스트린은 위벽세포를 직접 자극하여 위산을 분비하게 하고, 위산은 펩시노겐을 활성 펩신으로 활성화시켜 단백질을 분해시키고, 동시에 이런 분해 산물은 또한 되돌아 가스트린의 분비를 자극하게 되고; 다른 한편으로, 가스트린은 유사 장친화성 크롬세포의 콜레시스토키닌 수용체에도 작용하여 유사 장친화성 크롬세포가 히스타민을 분비하도록 촉진하고, 나아가 히스타민으로 벽세포를 자극하는 것을 통해 위산을 분비한다. 가스트린은 위산분비에 영향을 미치면서 식관 하단 약근의 장력을 감소시킬 수 있다. 최근의 일부 연구에서는 가스트린이 위 점막 기능의 표지물로 사용될 수 있다고 지적하였다: 만성 위축성 위염에서 가스트린-17의 수준은 정상 점막보다 현저히 높으며, 또한 가스트린-17의 혈청 수준은 총 혈청 가스트린보다 유문동 위축의 중증도를 더 정확하게 반영할 수 있다는 주장도 있다.
펩시노겐(pspsinogen, PG)은 위 점막의 주요 세포에서 분비되는 일종의 단백질 폴리펩타이드 사슬이다. 인간의 펩시노겐은 주로 생화학적 및 면역학적으로 구별되는 동질효소(PGI 및 PGII)로 나뉜다. 펩시노겐 I은 위선 주세포와 목 세포에서 분비되며, 펩시노겐 II는 분문선, 유문선 및 근위 십이지장선에서도 분비될 수 있다. 펩시노겐 자체는 생물학적 활성이 없고 위산의 작용하에 소화기능을 가진 펩신으로 활성화되어 체내에서 섭취된 단백질을 쉽게 흡수되는 저분자 펩타이드와 아미노산 등으로 분해시킨다. 대부분의 펩시노겐은 위강으로 분비되며 소량만 혈액으로 흡수될 수 있다. 우리는 통상적으로 혈청 중의 펩시노겐을 검출하여 인간의 펩신 수준을 나타낸다. 보도에 따르면 혈청 중의 펩시노겐 I 및 펩시노겐 II 수준은 위 점막 기능 및 조직학적 상태를 정확하게 반영할 수 있다. 따라서 혈청 펩시노겐은 "혈청학 생검"이라고도 한다. 혈청 펩시노겐 I 및 펩시노겐 II의 검출과 정밀 내시경 검사를 결합하여 위 질환, 특히 조기 위 점막 병변을 효과적으로 식별할 수 있다. 기존 연구에 따르면 미란성 위염, 위축성 위염, 위궤양, 위암 및 기타 위 질환에서 혈청 펩시노겐 I 및 펩시노겐 II 수준은 현저하게 비정상적이며 이러한 질환에 대한 유용한 선별 방법을 제공할 수 있다.
현재, 임상에서는 여전히 통일된 조기위암의 선별 방법이 부족하다. 종양 표지물 및 관련 단백질의 검출은 비정상적인 세포 증식을 효과적으로 반영할 수 있으며 조기 암의 선별 및 수술 후 추적 관찰에 적합하다. 위장 혈관 조영술과 흉부 투시는 주로 위궤양과 중말기 위암을 관찰하는데 사용되지만, 상피내암에 대한 민감도와 정확도가 낮고; 경하 생검은 외상성 조작으로 금기 사항이 많아 시행하기 어렵다. 가스트린 17, 펩시노겐 I, 펩시노겐 II는 위점막조직에서 분비되는 소화효소로 위저, 유문동 등 위점막 부위의 병변은 모두 그 순준의 변화를 일으킬 수 있다. 가스트린 17, 펩시노겐 I, 펩시노겐 II의 연합검출은 조기 위암 선별에 적용되는데 효과가 현저하고, 위암의 확진율을 효과적으로 향상시킬 수 있어 임상적용 및 홍보에 가치가 있다.
금콜로이드 면역 크로마토그래피 기술 (gold immunochromatography assay, GICA)은 금콜로이드 표기 기술과 단백질 크로마토그래피 기술을 결합한 미세다공성 막을 담체로 사용하는 고체상 막 면역분석 기술이다. 금콜로이드 면역 크로마토그래피 기술은 일반적으로 사용되는 면역크로마토그래피 검출 방법으로 그 조작이 간단하고, 시간이 절약되며, 제조 원가가 낮고, 결과 판독이 용이하다는 특징 때문에 현장 검출에 매우 적합하고, 생물학, 의약, 식품 등 분야에 널리 적용된다. 금콜로이드 면역 크로마토그래피 기술은 한 단계로 검출을 완료하기 때문에 검출 과정에 많은 간섭 요인이 있으며 그의 낮은 감도는 금콜로이드 면역 크로마토그래피의 적용범위를 제한하는 주요 요인이고, 전통적인 금콜로이드 면역 크로마토그래피의 검출의 한계는 ELISA 및 기타 방법에 제한된다.
금콜로이드 면역 크로마토그래피 검출에서 단백질은 테스트할 샘플의 포획 시약으로 니트로셀룰로오스 막(NC 막)에 고정된다. 검출 결과는 포획 시약이 막에 대한 우수한 흡착 효과를 달성하는지 여부에 전적으로 의존하기 때문에, 막에 대한 균일하고 양호한 단백질 흡착은 금콜로이드 검출 결과에 매우 중요하다. NC 막에 결합된 단백질의 양이 충분하지 않거나 단백질의 결합력이 충분히 강하지 않으면 많은 문제가 생기게 되고 검출결과의 검출라인에서 매우 뚜렷하다. 막에 결합된 단백질의 양이 너무 적으면 결과에서 검출라인의 발색이 약하고 검출 감도가 저하된다. 단백질이 NC 막에 단단히 흡착되지 않으면 단백질이 NC 막에 흡착되기 전에 확산되어 검출라인이 넓고, 발색이 약하여 선명하고 뚜렷하지 못하여 검출결과를 해석하기 어렵다. 극한의 조건에서 단백질과 NC 막의 물리적 흡착작용이 너무 약하면 흘러지나는 단백질 검출물과 계면활성제 용액은 NC 막에서 고착된 단백질을 세척할 수 있으며, 따라서 그 결과 감지선이 더 넓어지거나 전혀 선명하지 않게 표시되어 감지 결과를 해석하기 어렵다.
본 발명은 G-17, PGI 및 PGII 연합 검출장치 및 그의 제조방법을 제공하여 종래 기술에 존재하는 NC 막에 흡착되는 단백질 양이 불충분하고 결합력이 약한 문제를 해결하였다. 본 발명에 의해 제조된 인간 가스트린 17, 펩시노겐 및 펩시노겐에 대한 3-in-1 연합 검출장치는 위암 위험 표지물의 민감하고 특이적이고 신속한 검출을 실현할 수 있고, 위질환자의 위암 위험성에 대한 합리적 종합판정을 높여 위암 조기경보 및 위험성 판단을 빠르고 정확하게 할 수 있다.
본 발명이 채택한 기술방안은: G-17, PGI, PGII 연합 검출장치에 있어서, 샘플 패드(1), 면역 금콜로이드 유리 섬유 막(2), 면역 니트로셀룰로오스 막(3) 및 흡수 패드(4)가 각각 플라스틱 판(5)에 접착되고, 상기 면역 니트로셀룰로오스 막(3)의 양단이 각각 흡수 패드(4) 및 면역 금콜로이드 유리 섬유 막(2)과 맞물리고, 상기 면역 금콜로이드 유리 섬유 막(2)의 타단은 샘플 패드(1)와 맞물리며; 상기 면역 니트로셀룰로오스 막(3)에는 제1 검출라인(T1), 제2 검출라인(T2), 제3 검출라인(T3) 및 품질 관리 라인(C)이 설치되고; 상기 제1 검출라인(T1)에는 고체상에 고 특이성 가스트린 17 항체를 가지고 있고; 제2 검출라인(T2)에는 고체상에 고 특이성 펩시노겐I 항체를 가지고 있고; 제3 검출라인(T3)에는 고체상에 고 특이성 펩시노겐II 항체를 가지고 있으며; 상기 면역 니트로셀룰로오스 막(3)에 설치된 검출라인(T1, T2, T3)은 동일한 면역 니트로셀룰로오스 막(3)에 세로로 배열되어 하나의 연합된 검출장치를 형성할 수 있고; 상기 면역 니트로셀룰로오스 막(3)에 설치된 검출라인(T1, T2, T3)은 또한 3개의 면역 니트로셀룰로오스 막(3)에 각각 설치되어 병렬로 배열되어 연합 검출장치를 형성할 수도 있으며; 상기 품질 관리 라인 (C)에는 염소항마우스IgG 폴리클로날 항체를 스패터한다.
본 발명은 또한 G-17, PGI, PGII 연합 검출장치의 제조방법을 더 제공하며, 다음 단계를 포함한다:
(a) 구연산삼나트륨 환원법에 의해 금콜로이드를 제조하고;
(b) 단계 (a)에서 제조된 금콜로이드를 사용하여 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II의 항체를 표기하여 면역 금콜로이드를 얻고;
(c) 금 스프레이 완충액을 사용하여 단계(b)의 면역 금콜로이드를 희석하여 면역 금콜로이드 용액을 얻고, 면역 금콜로이드 용액으로 유리 섬유 매트에 스프레하여 면역 금콜로이드 유리 섬유 막을 제조하여 얻고;
(d) 니트로셀룰로오스 막을 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 처리액으로 전처리한 후, 올레산으로 수식된 황화아연 나노입자와 결합된 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II의 항체를 검출라인로서 스패터하고, 품질 관리 라인로서 염소 항 마우스 IgG 폴리클로날 항체를 스패터하여 면역니트로셀룰로오스 막을 제조하여 얻고;
(e) 전처리된 샘플 패드, 단계(c)에서 제조된 면역 금콜로이드 유리 섬유막, 단계(d)에서 제조된 면역니트로셀룰로오스 막, 흡수지를 차례로 접착판에 붙이고 절단하여 검출 시약 스트립을 제조하여 얻고, 마지막으로 검출 시약 스트립을 플라스틱 케이스에 넣는다.
본 발명의 단계(a)에 기술된 구연산삼나트륨 환원법에 의해 제조된 금콜로이드 입자의 입자크기는 20~60nm이다.
본 발명의 단계 (c)에서 기술된 금 스프레이 완충액은 Tris-HCl 용액, 자당, 트레할로스, 소혈청 알부민 BSA로 구성되고, pH는 8.5이며, 그중 Tris-HCl의 농도는 0.02mol/L, 자당의 농도는 5~20%, 트레할로스의 농도는 1~5%, 소혈청 알부민 BSA의 농도는 0.5~1%이다.
본 발명의 단계(d)에 기술된 니트로셀룰로오스 막을 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 처리액으로 전처리하는 것은: 니트로셀룰로오스 막을 폴리에틸렌글리콜 글리세롤 처리액에 1시간 동안 담그고 저속으로 진탕한 후 꺼내어 증류수로 3번 세척하고 마지막으로 진공건조오븐에서 건조시키는 것이다.
본 발명의 단계 (d)에 기술된 황화아연 나노입자가 각각 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II의 항체와 결합하는 것은: 올레산으로 수식된 ZnS를 담체로 하고, 1mL의 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II의 항체 용액을 취하여 1시간 동안 교반한후, 각각 12000rpm, 8500rpm 및 7000rpm으로 10분 동안 원심분리한 후 수집하고 탈이온수로 2번 세척하는 것이다.
본 발명의 단계(d)에 기술된 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 처리액은 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤을 0.5% 농도로 희석하여 구성되고, 0. 22㎛의 여과막으로 여과한 후 준비해 둔다.
본 발명의 단계(d)에 기술된 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 처리액은 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤과 폴리리신(SIGMA, 150KD~300KD)을 혼합하여 구성되었고, 그중을 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤의 농도는 0.5%이고, 폴리리신의 농도는 0.5%이며, 0. 22㎛의 여과막으로 여과한 후 준비해 둔다.
본 발명의 단계(d)에 기술된 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 처리액은 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤, 폴리리신(SIGMA, 150KD~300KD), PEG20000을 혼합하여 구성되었고, 그중 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤의 농도는 0.5%이고, 폴리리신의 농도는 0.5%이고, PEG20000의 농도는 0.1%이며, 0.22㎛ 여과막으로 여과한 후 준비해 둔다.
본 발명의 단계 (d)에 기술된 올레산으로 수식된 황화아연 나노입자의 제조방법은: 올레산무수에탄올용액 15ml을 취하여 15ml의 농도가 0.3mol/L인 아세트산아연 수용액에 가입하여 40℃의 수욕 중에서 교반 후 암모니아수로 pH를 조정하고, 다시 15ml의 농도가 0.3mol/L인 황화나트륨 수용액을 가입하여 5분 동안 반응시킨 후 SDS 수용액 5ml을 가하고 균일하게 혼합한 후 해당 반응액을 90ml의 수열 케틀에 부어 넣는다. 수열 케틀을 밀봉한 후 항온 건조 오븐에 넣고 일정한 온도에서 일정한 시간 동안 항온 반응시킨다. 반응 종료 후 온도를 50℃로 낮추고 생성물을 꺼낸다. 아세톤, 탈이온수, 에탄올로 세척하고 원심분리한 후 50°C에서 2시간 동안 진공 건조하여 분체 ZnS를 얻고 저장해 둔다.
본 발명의 단계 (e)에서 기술된 전처리된 샘플 패드에 사용되는 샘플 패드 처리 용액은 Tris-HCl 용액, 소혈청 알부민 BSA, 카제인 및 계면활성제(알킬페놀 폴리옥시에틸렌 에테르)로 구성되며, 그중 Tris-HCl 용액의 농도는 0.1mol/L이고, 소혈청 알부민 BSA의 농도는 0.5~1%이고, 카제인의 농도는 0.1~0.2%이고, 계면활성제의 농도는 0.5~1%이다.
염기로 에틸렌 글리콜과 에피클로로히드린 사이의 반응을 촉진하고, 생성물을 묽은 염산으로 중화하고 사염화탄소로 추출하고 감압증류하여 얻은 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤(PEGG)은 옅은 노란색 점성 물질이다. PEGG는 물과 임의의 비율로 섞일 수 있고, 에탄올, 아세톤, 테트라히드로푸란, 클로로포름과 같은 일반적인 유기 용매에도 용해될 수 있으며, 일정한 표면활성을 가지고 있다. 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤의 구조는 결합을 위한 복수의 히드록실기를 함유하고, 활성화 과정이 간단하여 NC 막 표면에 단백질을 고정시키는데 편리하다. 일반적인 조건하에서 단위 면적당 NC 막에 결합하는 항체의 수는 제한되어 있지만, 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤을 사용하여 처리한 후 단위 면적당 NC 막에 결합하는 항체의 수가 증가하여 더 높은 검출 감도를 달성할 수 있다.
단백질에 대한 NC 막의 흡착을 개선하는 기초하에, 단백질의 NC 막에 대한 흡착효과를 향상하는 것을 논의하는 것도 금콜로이드의 감도를 향상시키는 또 다른 방법이 기도하다. 올레산/도데실황산나트륨 수식 ZnS는 나노미터급의 입자크기를 가질 뿐만 아니라 양호한 수용성과 생물상용성을 갖고 있으며, 그 외부 표면의 작용기를 이용하여 수성 매질에 균일하게 분산되어 생물학적 거대분자와 결합할 수 있다. 황화아연 나노입자는 안정성이 좋고 제조가 용이하며 생체적합성이 좋고 면역원성이 낮다는 장점이 있어 생물의학 분야에서 널리 연구되고 있다. 그러나 금콜로이드 면역크로마토그래피 기술에서 보고된 응용은 없다. 본 연구는 황화아연 나노입자가 NC 막에 코팅된 항체에 미치는 영향을 조사했으며, 먼저, 필름 절단에 사용되는 항체를 황화아연 나노입자와 결합시키고 차단하고 원심분리 및 정제하고 결합되지 않은 항체를 제거한 다음 일정한 비율로 재용한 다음 필름 절단하고, 이러한 황화아연 입자는 복수의 항체에 결합할 수 있어 항체 코팅 효율을 높이고 감도를 크게 향상시킬 수 있다.
금콜로이드 면역크로마토그래피 기술의 감도를 향상시키기 위해, 본 발명은 상기 니트로셀룰로오스 막에 대해 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 처리액으로 전처하였으며, NC로 코팅된 항체를 황화아연 나노입자와 결합하여 시험지의 감도 향상시키는 목적을 달성하였다.
본 발명의 긍정적인 효과는 다음과 같다:
1. 본 발명의 검출장치는 구조가 간단하고 구상이 참신하며, 니트로셀룰로오스 막에 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II 항체를 코팅하여 특이성이 강하고, 생산 조작의 복잡성을 증가시키지 않으면서 샘플중의 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II을 동시에 검출할 수 있다.
2. 면역 금콜로이드의 제조 단계에서 적절한 금 스프레이 완충액 및 샘플 패드 처리 용액과 배합하여 면역 금콜로이드의 완전한 방출을 보장하는 것을 기반으로 반응 감도를 효과적으로 향상시킬 수 있으며, 동일한 임계값에서 또한 면역 금콜로이드의 사용량도 줄일 수 있어 비용을 절감한다.
3. 본 발명은 니트로셀룰로오스 막을 전처리하고 니트로셀룰로오스 막에 코팅된 항체를 수식하여 검출용 시험지의 감도 및 특이성을 향상시켰다.
4. 본 발명의 검출 장치는 특별한 장비가 필요하지 않아 검출 비용이 저렴하다.
5. 본 발명의 검출 장치는 조작이 용이하고, 전문적인 조작이 필요하지 않으며, 실용성이 강하다.
도 1은 본 발명의 구조도로서, 도면에서 면역 니트로셀룰로오스 막에 설치된 검출라인 T1, T2, T3은 동일한 면역니트로셀룰로오스 막에 세로로 배열되어 있고;
도 2는 도 1의 A-A 단면 구조의 개략도이고;
도 3은 본 발명의 또 다른 구조 개략도로서, 도면에서 검출라인 T1, T2, T3은 3개의 면역 니트로셀룰로오스 막에 각각 설치되고 나란히 배열되어 하나의 연합된 검출장치를 형성하고;
도 4는 도 3의 B-B 단면도이고;
도 5는 도 3의 C-C 단면도이고;
도 6은 도 3의 D-D 단면도이다.
아래 실시예와 도면을 결합하여 본 발명에 대해 진일보로 설명한다.
실시예1
샘플 패드(1), 면역 금콜로이드 유리 섬유 막(2), 면역 니트로셀룰로오스 막(3) 및 흡수 패드(4)가 각각 플라스틱 판(5)에 접착되고, 상기 면역 니트로셀룰로오스 막(3)의 양단이 각각 흡수 패드(4) 및 면역 금콜로이드 유리 섬유 막(2)과 맞물리고, 상기 면역 금콜로이드 유리 섬유 막(2)의 타단은 샘플 패드(1)와 맞물리며; 상기 면역 니트로셀룰로오스 막(3)에는 제1 검출라인(T1), 제2 검출라인(T2), 제3 검출라인(T3) 및 품질 관리 라인(C)이 설치되고; 상기 제1 검출라인(T1)에는 고체상에 고 특이성 가스트린 17 항체를 가지고 있고; 제2 검출라인(T2)에는 고체상에 고 특이성 펩시노겐I 항체를 가지고 있고; 제3 검출라인(T3)에는 고체상에 고 특이성 펩시노겐II 항체를 가지고 있으며; 도1과 2에 도시된 바와 같이 상기 면역 니트로셀룰로오스 막(3)에 설치된 검출라인(T1, T2, T3)은 동일한 면역 니트로셀룰로오스 막(3)에 세로로 배열되어 연합된 검출장치를 형성할 수 있고; 도3, 4, 5 및 6에 도시된 바와 같이 상기 면역 니트로셀룰로오스 막(3)에 설치된 검출라인(T1, T2, T3)은 또한 3개의 면역 니트로셀룰로오스 막(3)에 각각 설치되어 병렬로 배열되어 연합 검출장치를 형성할 수도 있으며; 상기 품질 관리 라인 (C)에는 염소항마우스IgG 폴리클로날 항체를 스패터한다.
본 발명의 G-17, PGI, PGII 연합 검출장치의 제조방법은, 정제된 고 특이성 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II 항체(검출라인 T1, T2, T3) 및 염소 항 마우스 IgG 폴리클로날 항체(대조 라인)가 고상되여 있는 니트로셀룰로오스 막, 금콜로이드로 표기된 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II 항체가 흡착되여있는 유리섬유막, 샘플 패드, 흡수지 및 기타 보조재를 붙여서 제조된다. 구체적인 단계는 다음과 같다.
(a) 구연산삼나트륨 환원법에 의한 금콜로이드의 제조
가열한 정제수 100ml에 빠르게 염화금을 넣고용액이 다시 끓으면 구연산삼나트륨을 빠르게 넣어 염화금: 구연산삼나트륨은 1:0.5이고, 계속 끓이면서 용액의 색상이 노란색에서 검은색으로 변하고 자주색으로 변하는 것을 관찰하고 마지막으로 안정적인 와인 레드로 변한 다음 10분 동안 계속 가열하면되며 금콜로이드 입자는 20nm이고;
(B) 면역 금콜로이드의 제조
1) 20nm 금콜로이드 용액 100ml를 취하여 pH 조절제 140μl를 넣고 잘 섞은 후 5분간 방치하고;
2) 20nm 금콜로이드 용액에 가스트린 17, 펩시노겐I, 펩시노겐II 총 1.4mg을 1밀리리터당 14㎍의 비율로 넣고 잘 섞은 후 5분간 방치하고;
3) 금콜로이드 안정제 0.4ml를 0. 4% 비율로 넣고 잘 섞은 후 5분간 방치하고;
4) 10000, 12000 및 14000 rpm로 10분간 원심분리하고 침전물을 각각 수집하고 수집된 3개의 침전물을 합하고;
(c) 개선된 금 스프레이 완충액을 사용하여 면역 금콜로이드를 희석하여 면역 금콜로이드 용액을 얻고, 면역 금콜로이드 용액으로 유리 섬유 매트에 스프레하여 면역 금콜로이드 유리 섬유 막을 제조하여 얻고; 금 스프레이 완충액은 다음을 포함한다: 농도가 20mM인 Tris-HCl 용액, 자당 농도는 5%, 트레할로스 농도는 1%, BSA 농도는 1%이고, pH는 8. 5이고;
(d) 고체상 니트로셀룰로오스 막
1) 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 처리 용액을 이용한 니트로셀룰로오스 막의 전처리
폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 처리 용액의 제조: 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤의 농도는 0.5%이고, 0. 22㎛ 여과막으로 여과한 후 준비해 두고;
폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 처리 용액을 사용한 니트로셀룰로오스 막의 전처리는: 니트로셀룰로오스 막을 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 처리 용액에 1시간 동안 담그고 천천히 흔들어서 꺼내어 증류수로 3번 씻은 후 마지막으로 진공건조오븐에서 건조시키는 것이고;
2) 황화아연 나노입자 수식 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II 항체
올레산으로 수식된 황화아연 나노입자의 제조는: 올레산무수에탄올용액 15ml을 취하여 15ml의 농도가 0.3mol/L인 아세트산아연 수용액에 가입하여 40℃의 수욕 중에서 교반 후 암모니아수로 pH를 조정하고, 다시 15ml의 농도가 0.3mol/L인 황화나트륨 수용액을 가입하여 5분 동안 반응시킨 후 SDS 수용액 5ml을 가하고 균일하게 혼합한 후 해당 반응액을 90ml의 수열 케틀에 부는 것이다. 수열 케틀을 밀봉한 후 항온 건조 오븐에 넣고 일정한 온도에서 일정한 시간 동안 항온 반응시킨다. 반응 종료 후 온도를 50℃로 낮추고 생성물을 꺼낸다. 아세톤, 탈이온수, 에탄올로 세척하고 원심분리한 후 50°C에서 2시간 동안 진공 건조하여 분체 ZnS를 얻고 저장해 둔다.
황화아연 나노입자 수식 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II 항체:
올레산으로 수식된 ZnS를 담체로 하고, 1mL의 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II의 항체 용액을 취하여 1시간 동안 교반한후, 각각 12000rpm, 8500rpm 및 7000rpm으로 10분 동안 원심분리한 후 수집하고 탈이온수로 2번 세척하는 것이다.
3) 니트로셀룰로오스 막 검출라인 및 품질 관리 라인의 항체 코팅
막 분사량이 1.4μl/cm인 경우, 황화아연 나노입자-가스트린 17 항체, 황화아연 나노입자-펩시노겐I 항체, 황화아연 나노입자-펩시노겐II 항체를 1.5mg/ml로 희석하고, 품질 관리 라인 염소항마우스 IgG 항체를 1mg/ml로 희석하고, 검출 라인과 품질 관리 라인은 각각 니트로셀룰로오스 막으로 코팅되고 실온에서 밤새 건조시키고 저장해 두고;
4) 샘플 패드 전처리
유리 섬유를 샘플 패드 처리 용액으로 10분 동안 담그고, 그중 샘플 패드 처리 용액은 다음을 포함한다: Tris-HCl 용액의 농도는 0.1M, 소혈청알부민(BSA)의 농도는 0.5%, 카제인의 농도는 0.1%, 계면활성제의 농도는 0.5%이고, 37°C에서 건조시킨 후 준비해 두고, 처리된 샘플 패드는 반응 감도를 향상시킬 수 있고;
e, 조립
전처리된 샘플 패드, 면역 금콜로이드 유리 섬유막, 면역니트로셀룰로오스 막, 흡수지를 차례로 접착판에 붙이고 절단하여 검출 시약 스트립을 제조하여 얻고, 마지막으로 검출 시약 스트립을 플라스틱 케이스에 넣는다.
f, 정량적 검출: 금콜로이드 검출기 검출을 통해 본 연합 검출장치에 의해 검출된 인간 가스트린 17의 최저 검출 농도는 0.5pg/ml, 펩시노겐I의 최저 검출 농도는 5ng/ml, 펩시노겐II의 최저 검출 농도는 5ng/ml이었다.
실시예2
40nm 크기의 금콜로이드 입자의 제조;
금 스프레이 완충액은 다음을 포함한다: 농도가 20mM인 Tris-HCl 용액, 자당 농도는 12%, 트레할로스 농도는 3%, BSA 농도는 0.7%이고, pH는 8.5이고;
폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 처리액의 제조는 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤과 폴리리신(SIGMA, 150KD~300KD)을 혼합하여 구성되고, 그중 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤의 농도는 0.5%이고, 폴리리신의 농도는 0.5%이고, 0.22㎛ 여과막으로 여과한 후 준비해 두고;
샘플 패드 처리 용액은 다음을 포함한다: Tris-HCl 용액의 농도는 0.1M, 소혈청알부민(BSA)의 농도는 0.7%, 카제인의 농도는 0.15%, 계면활성제의 농도는 0. 7%이고;
나머지는 실시예 1과 동일하다.
실시예3
60nm 크기의 금콜로이드 입자의 제조;
금 스프레이 완충액은 다음을 포함한다: 농도가 20mM인 Tris-HCl 용액, 자당 농도는 20%, 트레할로스 농도는 5%, BSA 농도는 1%이고, pH는 8.5이고;
폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 처리액은 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤, 폴리리신(SIGMA, 150KD~300KD), PEG20000을 혼합하여 구성되었고, 그중 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤의 농도는 0.5%이고, 폴리리신의 농도는 0.5%이고, PEG20000의 농도는 0.1%이며, 0.22㎛ 여과막으로 여과한 후 준비해 두고;
샘플 패드 처리 용액은 다음을 포함한다: Tris-HCl 용액의 농도는 0.1M, 소혈청알부민(BSA)의 농도는 1%, 카제인의 농도는 0.2%, 계면활성제의 농도는 1%이고;
나머지는 실시예 1과 동일하다.
이하, 실험을 통해 본 발명의 효과를 진일보로 설명한다.
실험예1:
1. 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 처리액의 니트로셀룰로오스 막에 대한 단백질 흡착능력의 비교
1. 1 재료 및 방법
1. 1 재료: 니트로셀룰로오스 막, 구경은 4.5μm이고, 미국 제너럴 일렉트릭 컴퍼니에서 구입
1. 2 니트로셀룰로오스 막의 처리방법
1. 2. 1 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 처리 용액의 제조
세 가지 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 처리 용액을 제조: 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 그룹, 농도가 0.5%인폴리에틸렌 글리콜 글리세롤로 구성되고; 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 처리 용액의 폴리리신 그룹, 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤의 농도는 0.5%이고 폴리리신의 농도는 0.5%이고; 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤, 폴리리신 및 PEG20000 그룹, 그중 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤의 농도는 0.5%, 폴리리신의 농도는 0.5%, PEG20000의 농도는 0.1%이고, 세 그룹의 처리 용액을 모두 0.22μm 여과막으로 여과한 후 준비해 두고;
1. 2. 2 니트로셀룰로오스 막의 처리방법
니트로셀룰로오스 막을 폴리에틸렌글리콜 글리세롤 처리액에 1시간 동안 담그고 저속으로 진탕한 후 꺼내어 증류수로 3번 세척하고 마지막으로 진공건조오븐에서 건조시키는 것이다.
1. 3 실험 방법
미처리 및 이미 처리된 니트로셀룰로오스 막을 상기 실시예의 공정흐름에 따라 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II 연합검출시험지를 제조하고, 시험 절차는 시험지의 설명서를 참조하고, 미처리 니트로셀룰로오스 막과 처리된 니트로셀룰로오스 막의 흡착능력 및 안정성 지수의 차이를 비교한다.
1. 4 결과
1. 4. 1 단백질 흡착능력의 비교
처리그룹과 미처리그룹의 시험지를 3그룹을 취하여, 시험할 샘플을 각각 첨가하고, 발색상황을 관찰하여 처리 후 막의 단백질 흡착능력을 판단하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다. 그 결과, 처리된 니트로셀룰로오스 막이 미처리 멤브레인보다 용액 침윤성 방면에서 현저히 우수하였고, 처리된 막의 스트립의 색상이 약간 진하고, 특히 농도가 낮을 때 반응 감도가 향상되어 단백질 흡착능력이 현저히 향상되고 반응 감도가 향상됨을 나타내었다. 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤-폴리리신-PEG20000 처리그룹의 흡착 효과는 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 그룹 및 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤-폴리리신 그룹보다 현저히 더 우수하였다.
니트로셀룰로오스 막의 흡착능력의 비교
그룹 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II 양성 품질제어품의 희석배수
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64
폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 그룹

 스트립의 색상이 선명하다 (+++) 스트립의 색상이 진하다(+++) 스트립의 색상이 약간 진하다(++) 스트립의 색상이 연하다(+) 무색 무색
폴리에틸렌 글리콜 글리세롤-폴리리신 그룹

 스트립의 색상이 선명하다 (+++) 스트립의 색상이 진하다(+++) 스트립의 색상이 약간 진하다(++) 스트립의 색상이 연하다(+) 스트립의 색상이 연하다(+) 무색
폴리에틸렌 글리콜 글리세롤-폴리리신-PEG20000그룹
 스트립의 색상이 선명하다 (+++) 스트립의 색상이 진하다(+++) 스트립의 색상이 진하다(+++) 스트립의 색상이 약간 연하다(+) 스트립의 색상이 연하다(+) 무색
미처리 그룹


 스트립의 색상이 선명하다 (+++) 스트립의 색상이 약간 진하다(++) 스트립의 색상이 연하다(+) 무색 무색 무색
1. 4. 2 니트로셀룰로오스 막의 안정성 비교
처리그룹과 미처리그룹의 시험지를 3그룹을 취하고, 37℃에서 가속실험을 통해 발색 상황을 관찰하여 처리 후 니트로셀룰로오스 막에 흡착된 단백질의 안정성을 판단하고, 그 결과를 표2에 나타내었다. 표 2의 결과와 표 1의 결과를 비교하면, 처리 후 니트로셀룰로오스 막의 색상 변화는 기본적으로 10일 전과 동일하고 안정성이 좋은 것을 알 수 있다.
니트로셀룰로오스 막의 가속 안정성 비교(37°C에서 10일 방치)
그룹 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II 양성 품질제어품의 희석배수
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64
폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 그룹


 스트립의 색상이 선명하다 (+++) 스트립의 색상이 약간 진하다(++) 스트립의 색상이 연하다(+) 스트립의 색상이 은은하게 보인다 (+/-) 무색 무색
폴리에틸렌 글리콜 글리세롤-폴리리신 그룹

 스트립의 색상이 선명하다 (+++) 스트립의 색상이 약간 진하다(++) 스트립의 색상이 연하다(+) 스트립의 색상이 은은하게 보인다 (+/-) 무색 무색
폴리에틸렌 글리콜 글리세롤-폴리리신-PEG20000그룹 스트립의 색상이 선명하다 (+++) 스트립의 색상이 진하다(+++) 스트립의 색상이 약간 진하다(++) 스트립의 색상이 약간 연하다(+) 스트립의 색상이 연하다(+) 무색
미처리 그룹 스트립의 색상이 진하다(++) 스트립의 색상이 연하다(+) 스트립의 색상이 은은하게 보인다 (+/-) 무색 무색 무색
실험예2:
올레산으로 수식된 황화아연 나노입자 수식 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II 항체
2. 1 재료 및 방법
2. 1. 1재료: 니트로셀룰로오스 막, 구경은 4.5μm이고, 미국 제너럴 일렉트릭 컴퍼니에서 구입
2. 1. 2 올레산으로 수식된 황화아연 나노입자의 제조
올레산무수에탄올용액 15ml을 취하여 15ml의 농도가 0.3mol/L인 아세트산아연 수용액에 가입하여 40℃의 수욕 중에서 교반 후 암모니아수로 pH를 조정하고, 다시 15ml의 농도가 0.3mol/L인 황화나트륨 수용액을 가입하여 5분 동안 반응시킨 후 SDS 수용액 5ml을 가하고 균일하게 혼합한 후 해당 반응액을 90ml의 수열 케틀에 붓는다. 수열 케틀을 밀봉한 후 항온 건조 오븐에 넣고 일정한 온도에서 일정한 시간 동안 항온 반응시킨다. 반응 종료 후 온도를 50℃로 낮추고 생성물을 꺼낸다. 아세톤, 탈이온수, 에탄올로 순차로 세척하고 원심분리한 후 50°C에서 2시간 동안 진공 건조하여 분체 ZnS를 얻고 저장해 둔다.
2. 1. 3 황화아연 나노입자 수식 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II 항체
올레산으로 수식된 ZnS를 담체로 하고, 1mL의 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II의 항체 용액을 취하여 1시간 동안 교반한후, 각각 12000rpm, 8500rpm 및 7000rpm으로 10분 동안 원심분리한 후 수집하고 탈이온수로 2번 세척한다.
2. 2 실험 방법
황화아연 나노입자로 각각 수식된 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II 항체 및 미수식된 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II 항체를 상기 실시예의 공정흐름에 따라 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II 연합검출시험지를 제조하고, 시험과정은 시험지 설명서를 참조하고, 황화아연 나노입자 처리 및 미처리한 경우의 단백질에 대한 흡착 및 안정성 지수의 차이를 비교하였다.
2. 3 결과
2. 3. 1 단백질 흡착능력의 비교
황화아연 나노입자 처리그룹과 미처리 그룹시험지를 취하여, 시험할 샘플을 각각 첨가하고, 발색상황을 관찰하여 처리 후 막의 단백질 흡착능력을 판단하고, 그 결과를 표 3에 나타내었다. 그 결과, 황화아연 나노입자 수식 양성 스트립의 색상이 약간 진하고, 특히 농도가 낮을 때 반응 감도가 향상되어 단백질 흡착능력이 현저히 향상되고 반응 감도가 향상됨을 나타내었다.
황화아연 나노입자 수식의 단백질에 대한 흡착능력의 비교
그룹 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II 양성 품질제어품의 희석배수
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64
아연 황화물 나노 입자 수식 그룹
 스트립의 색상이 선명하다 (+++) 스트립의 색상이 진하다(+++) 스트립의 색상이 진하다(+++) 스트립의 색상이 약간 연하다(+) 스트립의 색상이 연하다(+) 무색
미수정 그룹 스트립의 색상이 선명하다 (+++) 스트립의 색상이 약간 진하다(++)
 스트립의 색상이 연하다(+) 무색 무색 무색
2. 3. 2 안정성 비교
황화아연 나노입자 처리그룹과 미처리 그룹의 시험지를 취하여, 37℃에서 가속실험을 통해 발색 상황을 관찰하여 황화아연 수식 후의 니트로셀룰로오스 막에 흡착된 단백질의 안정성을 판단하고, 그 결과를 표4에 나타내었다. 표 4의 결과와 표 3의 결과를 비교하면, 처리 후 니트로셀룰로오스 막의 색상 변화는 기본적으로 10일 전과 동일하고 안정성이 좋은 것을 알 수 있다.
가속 안정성 비교(37°C에서 10일방치)
그룹 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II 양성 품질제어품의 희석배수
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64
아연 황화물 나노 입자 수식 그룹
 스트립의 색상이 선명하다 (+++) 스트립의 색상이 진하다(+++) 스트립의 색상이 약간 진하다(++) 스트립의 색상이 약간 연하다(+) 스트립의 색상이 연하다(+) 무색
미수정 그룹 스트립의 색상이 진하다(++) 스트립의 색상이 연하다(+) 스트립의 색상이 은은하게 보인다 (+/-) 무색 무색 무색
이상은 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐이며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 원리를 벗어나지 않으면서 몇 가지 개선 및 수정을 가할 수 있으며, 이러한 개선 및 수정은 또한 본 발명의 보호 범위로 간주되어야 한다.

Claims (11)

  1. G-17, PGI, PGII 연합 검출장치에 있어서, 샘플 패드(1), 면역 금콜로이드 유리 섬유 막(2), 면역 니트로셀룰로오스 막(3) 및 흡수 패드(4)가 각각 플라스틱 판(5)에 접착되고, 상기 면역 니트로셀룰로오스 막(3)의 양단이 각각 흡수 패드(4) 및 면역 금콜로이드 유리 섬유 막(2)과 맞물리고, 상기 면역 금콜로이드 유리 섬유 막(2)의 타단은 샘플 패드(1)와 맞물리며; 상기 면역 니트로셀룰로오스 막(3)에는 제1 검출라인(T1), 제2 검출라인(T2), 제3 검출라인(T3) 및 품질 관리 라인(C)이 설치되고; 상기 제1 검출라인(T1)에는 고체상에 고 특이성 가스트린 17 항체를 가지고 있고; 상기 제2 검출라인(T2)에는 고체상에 고 특이성 펩시노겐I 항체를 가지고 있고; 상기 제3 검출라인(T3)에는 고체상에 고 특이성 펩시노겐II 항체를 가지고 있으며; 상기 면역 니트로셀룰로오스 막(3)에 설치된 제1 검출라인(T1), 제2 검출라인(T2), 제3 검출라인(T3)은 동일한 면역 니트로셀룰로오스 막(3)에 세로로 배열되어 연합된 검출장치를 형성할 수 있고; 혹은 상기 면역 니트로셀룰로오스 막(3)에 설치된 제1 검출라인(T1), 제2 검출라인(T2), 제3 검출라인(T3)은 각각 3개의 면역 니트로셀룰로오스 막(3)에 설치되어 병렬로 배열되어 하나의 연합 검출장치를 형성하며; 상기 품질 관리 라인 (C)에는 염소항마우스IgG 폴리클로날 항체를 스패터하는 것을 특징으로 하는 G-17, PGI, PGII 연합 검출장치.
  2. 제1항에 따른 G-17, PGI, PGII 연합 검출장치의 제조 방법에 있어서,
    구연산삼나트륨 환원법에 의해 금콜로이드를 제조하는 단계(a);
    단계 (a)에서 제조된 금콜로이드를 사용하여 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II의 항체를 표기하여 면역 금콜로이드를 얻는 단계(b);
    금스프레이 완충액을 사용하여 단계(b)의 면역 금콜로이드를 희석하여 면역 금콜로이드 용액을 얻고, 면역 금콜로이드 용액으로 유리 섬유 매트에 스프레하여 면역 금콜로이드 유리 섬유 막을 제조하여 얻는 단계(c);
    니트로셀룰로오스 막을 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 처리액으로 전처리한 후, 올레산으로 수식된 황화아연 나노입자와 결합된 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II의 항체를 제1 검출라인(T1), 제2 검출라인(T2), 제3 검출라인(T3)로서 스패터하고, 품질 관리 라인로서 염소 항 마우스 IgG 폴리클로날 항체를 스패터하여 면역니트로셀룰로오스 막을 제조하여 얻는 단계(d);
    전처리된 샘플 패드, 단계(c)에서 제조된 면역 금콜로이드 유리 섬유막, 단계(d)에서 제조된 면역니트로셀룰로오스 막, 흡수지를 차례로 플라스틱판에 붙이고 절단하여 검출 시약 스트립을 제조하여 얻고, 마지막으로 검출 시약 스트립을 플라스틱 케이스에 넣는 단계(e)를 포함하는 것을 특징으로 하는 G-17, PGI, PGII 연합 검출장치의 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서, 단계(a)에서 기술된 금콜로이드 입자의 입경이 20~60nm인 것을 특징으로 하는 G-17, PGI, PGII 연합 검출장치의 제조방법.
  4. 제2항에 있어서, 단계 (c)에서 기술된 금 스프레이 완충액은 Tris-HCl 용액, 자당, 트레할로스, 소혈청 알부민 BSA로 구성되고, pH는 8.5이며, 그중 Tris-HCl의 농도는 0. 02mol/L, 자당의 농도는 5~20%, 트레할로스의 농도는 1~5%, 소혈청 알부민 BSA의 농도는 0.5~1%인 것을 특징으로 하는 G-17, PGI, PGII 연합 검출장치의 제조방법.
  5. 제2항에 있어서, 단계(d)에 기술된 니트로셀룰로오스 막을 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 처리액으로 전처리하는 것은: 니트로셀룰로오스 막을 폴리에틸렌글리콜 글리세롤 처리액에 1시간 동안 담그고 저속으로 진탕한 후 꺼내어 증류수로 3번 세척하고 마지막으로 진공건조오븐에서 건조시키고;
    단계 (d)에 기술된 올레산으로 수식된 황화아연 나노입자와 결합된 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II의 항체는: 올레산으로 수식된 ZnS를 담체로 하고, 1mL의 가스트린 17, 펩시노겐I 및 펩시노겐II의 항체 용액을 취하여 1시간 동안 교반한 후, 각각 12000rpm, 8500rpm 및 7000rpm으로 10분 동안 원심분리한 후 수집하고 탈이온수로 2번 세척하는 것을 특징으로 하는 G-17, PGI, PGII 연합 검출장치의 제조방법.
  6. 제2항 또는 제5항에 있어서, 단계(d)에 기술된 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 처리액은 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤을 0.5% 농도로 희석하여 얻어지고, 0. 22㎛의 여과막으로 여과한 후 준비해 두는 것을 특징으로 하는 G-17, PGI, PGII 연합 검출장치의 제조방법.
  7. 제2항 또는 제5항에 있어서, 단계(d)에 기술된 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 처리액은 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤과 폴리리신을 혼합하여 구성되고, 그중 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤의 농도는 0.5%이고, 폴리리신의 농도는 0.5%이고, 0.22㎛ 여과막으로 여과한 후 준비해 두는 것을 특징으로 하는 G-17, PGI, PGII 연합 검출장치의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 폴리리신은 SIGMA에서 구입하고, 분자량은 150KD~300KD인 것을 특징으로 하는 G-17, PGI, PGII 연합 검출장치의 제조방법.
  9. 제2항 또는 제5항에 있어서, 단계(d)에 기술된 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 처리액은 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤과 폴리리신, PEG20000을 혼합하여 구성되고, 그중 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤의 농도는 0.5%이고, 폴리리신의 농도는 0.5%이고, PEG20000의 농도는 0.1%이며, 0. 22㎛ 여과막으로 여과한 후 준비해 두는 것을 특징으로 하는 G-17, PGI, PGII 연합 검출장치의 제조방법.
  10. 제2항 또는 제5항에 있어서, 단계 (d)에 기술된 올레산으로 수식된 황화아연 나노입자의 제조방법은: 올레산무수에탄올용액 15ml을 취하여 15ml의 농도가 0.3mol/L인 아세트산아연 수용액에 가입하여 40℃의 수욕 중에서 교반 후 암모니아수로 pH를 조정하고, 다시 15ml의 농도가 0.3mol/L인 황화나트륨 수용액을 가입하여 5분 동안 반응시킨 후 SDS 수용액 5ml을 가하고 균일하게 혼합한 후 해당 반응액을 90ml의 수열 케틀에 부어 넣고, 수열 케틀을 밀봉한 후 항온 건조 오븐에 넣고 일정한 온도에서 일정한 시간 동안 항온 반응시키고, 반응 종료 후 온도를 50℃로 낮추고 생성물을 꺼내고 아세톤, 탈이온수, 에탄올로 세척하고 원심분리한 후 50°C에서 2시간 동안 진공 건조하여 분체의 올레산으로 수식된 ZnS를 얻고 저장해 두는 것을 특징으로하는 G-17, PGI, PGII 연합 검출장치의 제조방법.
  11. 제2항에 있어서, 단계 (e)에서 기술된 전처리된 샘플 패드에 사용되는 샘플 패드 처리 용액은 Tris-HCl 용액, 소혈청 알부민 BSA, 카제인 및 계면활성제 알킬페놀 폴리옥시에틸렌 에테르로 구성되며, 그중 Tris-HCl 용액의 농도는 0.1mol/L이고, 소혈청 알부민 BSA의 농도는 0.5~1%이고, 카제인의 농도는 0.1~0.2%이고, 계면활성제의 농도는 0.5~1%인 것을 특징으로 하는 G-17, PGI, PGII 연합 검출장치의 제조방법.
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